CN112110982B - 一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白修饰技术领域，具体的更涉及一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法。一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法，在维生素和/或辅酶存在下，使相对于蛋白质质量的3～7倍量的5kD‑40kD的聚乙二醇衍生物与蛋白质进行反应。本发明采用新的修饰方法，来进行rhG‑CSF的PEG化修饰，反应条件温和，反应后生成NADP+，无有害物质生成，同时该制备方法聚乙二醇修饰产率较高，产率达80％以上，均一性高，修饰位点为与蛋白rhG‑CSF的N端第一个氨基酸甲硫氨酸Met，稳定性好，此外，修饰反应终止可直接调酸终止，终止工艺简单，大大降低商业化生产成本。

Description

一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白修饰技术领域，具体的更涉及一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法。
背景技术
随着生物技术的飞跃发展，越来越多的重组蛋白质药物被成功应用到人类疾病的治疗中。重组人粒细胞刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulatingfactor,rhG-CSF)是非常成功的基因工程药物。人粒细胞刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，G-CSF)由单核细胞及成纤维细胞产生，可刺激粒细胞集落形成，对中性粒细胞有刺激作用，常被用于接受放/化疗的癌症患者及骨髓移植后白血病患者的辅助治疗，Amgen公司1991年获得FDA批准上市，但由于rhG-CSF较短的体内半衰期、容易产生免疫原性反应等，在临床使用中受到了很大限制。为了解决这些问题，改善其在人体内的药代动力学，Amgen公司利用聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)修饰技术对G-CSF进行了修饰，延长了其体内半衰期，提高生物利用度，PEG-rhG-CSF于2002年获得FDA批准上市，取得了很好的临床效果和巨大的经济效益。
聚乙二醇化修饰可通过多种方法与蛋白质相连接，如通过与蛋白质表面的氨基(如赖氨酸的ε-氨基或N-末端上的氨基)、巯基、羟基、羧基等反应而连接到蛋白质上。目前采用较多方法是利用还原性烷基化反应将聚乙二醇醛衍生物定点偶联到蛋白质的N-末端氨基上，首先PEG衍生物的醛基跟蛋白质N-末端氨基生成亚胺(席夫碱)，然后再被催化剂还原成胺，从而将PEG连接到蛋白质上，此方法可保证产品的均一性和稳定性。通常此烷基化反应在弱酸条件下进行，氰基硼氢化钠常被用作催化剂，PEG化修饰蛋白质产率高，被大家广泛应用。
通常此聚乙二醇化修饰反应在弱酸条件下进行，反应中采用氰基硼氢化钠，但氰基硼氢化钠是剧毒物质，保存条件严格，且在反应中最终生产氢氰酸和硼氢化钠，造成产品安全性存在巨大风险，因此为了保证用药安全和用药成本，研究替代氰基硼氢化钠来完成蛋白质的PEG化修饰的制备方法将产生较大的社会价值。
发明内容
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。本发明中未提及的组分的来源均为市售。
本发明人通过在反应体系中添加特定的维生素和/或辅酶，尤其是NADPH，并且使其在适量的无机盐的存在下来进行rhG-CSF的PEG化修饰，反应条件温和，反应后生成NADP+，无有害物质生成，同时该制备方法聚乙二醇修饰产率较高，简化了修饰反应终止工艺，大大降低商业化生产成本。
本发明第一个方面提供了一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法，在维生素和/或辅酶存在下，使相对于蛋白质质量的3～7倍量的5kD-40kD的聚乙二醇衍生物与蛋白质进行反应。
在本发明，适合本发明的方法的蛋白质优选重组人粒细胞刺激因子(recombinanthuman granulocyte colony stimulating factor,rhG-CSF)，是非常成功的基因工程药物。
在一些实施方式中，优选聚乙二醇衍生物选自PEG琥珀酰亚胺碳酸酯、PEG对硝基苯碳酸酯、PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯、PEG碳酰咪唑、PEG苯并三唑碳酸酯、PEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯、甲氧聚乙二醇醛如甲氧聚乙二醇丙醛、甲氧聚乙二醇丁醛、聚乙二醇巯基中的至少一种。
为了使修饰后的蛋白在体内具有更好的长效缓释性，优选使用甲氧聚乙二醇醛，该甲氧聚乙二醇醛的分子量为5kD-40kD，可以是单一分子量，也可以是不同分子量的至少一种甲氧聚乙二醇醛混合而成的。更优选的，所述甲氧聚乙二醇醛为甲氧聚乙二醇丙醛，可以是单一分子量的甲氧聚乙二醇丙醛，也可以是不同分子量的甲氧聚乙二醇丙醛混合而成，其中，优选以相对于蛋白质质量的3～7倍量的5kD-40kD的聚乙二醇衍生物进行投料，更优选5倍量。在生物化学、分子生物学和蛋白组学中经常用D或KD，蛋白质是大分子，所以常用kDa(千道尔顿)来表示。
甲氧聚乙二醇丙醛分子量太大，反应较慢，而且在对蛋白质修饰时分子量大的甲氧聚乙二醇丙醛容易包覆在蛋白质表面使其在生物体内难以释放，分子量较小则在生物体内无法长效缓释。采用特定分子量的甲氧聚乙二醇丙醛修饰后，得到的PEG-rhG-CSF能起到隔绝遮挡的作用使其难以在体内与其他的酶比如蛋白水解酶相接触，此外，该特定分子量修饰能很好的避免肾的过滤作用，使PEG-rhG-CSF不容易被代谢出体外，从而在体内发挥药效。
在一些实施方式中，反应体系内包括至少一种无机盐，无机盐包括但不限于碳酸钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、过碳酸钠、氯化钙、磷酸钠、无水磷酸钠、碳酸钾、无水碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、无水磷酸钾、硫酸钠、无水硫酸钠、过硫酸铵等，但本发明并不限于此。可作为本发明的无机盐优选为配置缓冲体系的无机盐，具体的说，最优选磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。
适合本发明方法的反应体系通常为缓冲体系，缓冲体系可保证蛋白的活性以及蛋白的结构稳定性，因此使蛋白在修饰过程中始终保持最佳的可溶性和活性是修饰的前提。
针对于此，设计较佳的缓冲体系较为重要，而目的蛋白的不同，在对蛋白的稳定性方面却又不同，从而影响蛋白的修饰率，通常多数蛋白在pH7.4时能稳定存在，通过验证针对本发明的rhG-CSF蛋白更适合的pH4.5-5.5，优选的缓冲体系为50-150mM磷酸钠，pH4.5-5.5；更优选100mM磷酸钠，pH5.0。
现有技术中采用氰基硼氢化钠通常用pH5-7，这是因为其在强酸下氰基硼氢化钠容易分解；而本发明中采用rhG-CSF蛋白适合的pH条件下反应时采用氰基硼氢化钠显然要避免其强酸水解性，此为矛盾点所在；在研究中发明人针对这一问题，在特定的维生素和/或辅酶的存在下，研究了不同pH条件下的不同添加量的特定的维生素和/或辅酶，最终成功得到修饰率高，且均一性以及稳定性优异的PEG-rhG-CSF。
缓冲体系的配制方法可以是本领域人员熟知的任一种方法，本发明对具体的配制方法不做任何限定。优选的，在反应过程中，为确保蛋白较好的反应性，蛋白在缓冲体系中的浓度为1-5mg/ml，优选3mg/ml。此外为进一步提高蛋白的修饰率，反应温度通常在较低的温度下进行，适合本发明的反应体系的温度可以是2-8℃，反应时间通常为8-15h，优选10-11h。
在反应体系中除了包含至少一种无机盐之外，还包含维生素和/或辅酶，也即是说可以是维生素或辅酶单独与无机盐共同存在，也可以是维生素和辅酶与无机盐一起共同存在，无机盐主要作为缓冲体系存在。维生素或辅酶在反应体系中可选择其中任一种单独存在，当其单独存在时，所选择的维生素或辅酶的浓度为20-60mM，优选40mM；而当其混合共同存在时，其用量一般保持与上述的非混合物中的单独存在的浓度相同。
适合本发明的维生素选自A族维生素、其衍生物及盐；C族维生素、其衍生物及盐；D族维生素、其衍生物及盐；E族维生素、其衍生物及盐中的至少一种。
作为A族维生素、其衍生物及盐例如视黄醇、脱氢视黄醇、醋酸视黄醇酯、棕榈酸视黄醇酯、视黄醛、视黄酸和维生素A油；类胡萝卜素及其衍生物例如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、隐黄素、虾青素和岩藻黄质。
作为B族维生素、其衍生物及盐，例如吡哆醇、吡哆醛、吡哆醛-5-磷酸酯和吡哆胺。
作为C族维生素、其衍生物及盐，例如抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸二棕榈酸酯和抗坏血酸磷酸镁。
作为D族维生素、其衍生物及盐，例如麦角钙化甾醇、胆钙化醇和1，2，5-二羟基-胆钙化醇。
作为E族维生素、其衍生物及盐，例如α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、生育酚乙酸酯和生育酚烟酸酯。
从获得更好的蛋白修饰率以及高效的均一性出发，本发明的维生素优选B族维生素，具体的说，特别优选维生素B6，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，反应体系中无机盐的存在可形成磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺，其在体系中能互相转化，在转化的过程中产生还原氢，起到递氢的作用对rhG-CSF上的亚胺还原。
辅酶是一大类有机辅助因子的总称，可以将化学基团从一个酶转移到另一个酶上的有机小分子，与酶较为松散地结合，对于特定酶的活性发挥是必要的。
辅酶包括烟酰胺类、辅酶I、核黄素类等。适合本发明的辅酶优选衍生自腺嘌呤核苷酸，更优选的，衍生自腺嘌呤核苷酸为选自经过磷酸化、糖基化、乙酰化或甲基化处理的腺嘌呤核苷酸。
具体的说，腺嘌呤核苷酸包括腺嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤核糖核苷酸，因此，作为适合本发明的辅酶可以是腺嘌呤脱氧核苷酸经过至少一种磷酸化、糖基化、乙酰化或甲基化处理的腺嘌呤脱氧核苷酸，也可以是腺嘌呤核糖核苷酸经过至少一种磷酸化、糖基化、乙酰化或甲基化处理的腺嘌呤脱氧核苷酸。最优选的，所述辅酶为经过磷酸化处理的腺嘌呤核糖核苷酸。例如作为此类最优选的辅酶，包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、烟酸腺嘌呤单核苷酸(NaMN)、烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)。
rhG-CSF蛋白质上有四个赖氨酸侧链，采用现有的氰基硼氢化钠得到的不仅会有N末端修饰以及侧链N修饰，因此得到的最终产物趋于混合物。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的羟基被磷酸化，在酸性条件下NADPH上的H被转移，起到氢供体的作用，氢负离子与亚胺正离子接触被还原，而席夫碱反应和还原反应在本发明的方法中同步发生，在采用NADPH后，反应过程中产生的NAD+与磷酸基团正负离子对的结构，可能是位阻关系导致反应最终向期望单一高选择性的产物进行。
通常在反应结束后，可调节pH至3.5-4.5，优选4.0，可采用本领域常规使用的任一种酸进行调节，例如包括但不限于盐酸。
有益效果：本发明采用新的修饰方法，来进行rhG-CSF的PEG化修饰，反应条件温和，反应后生成NADP+，无有害物质生成，同时该制备方法聚乙二醇修饰产率较高，产率达80％以上，均一性高，修饰位点为与蛋白rhG-CSF的N端第一个氨基酸甲硫氨酸Met，稳定性好。此外，修饰反应终止可直接调酸终止，终止工艺简单，大大降低商业化生产成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：使用维生素B6得到的PEG-rhG-CSF的稳定性测试图；
图2：反应8小时的RP-HPLC典型图谱；
图3：反应11小时的RP-HPLC典型图谱；
图4：使用NADPH得到的PEG-rhG-CSF的稳定性测试图；
图5：供试品(PEG-rhG-CSF)酶解产物经液质检测的质谱图谱(上：UV；中：TIC；下：BPI)；
图6：供试品PEG-rhG-CSF的PEG修饰肽段一级质谱图(上)及二级质谱图；
图7：供试品酶解后PEG修饰肽段收集色谱图；
图8：供试品PEG-rhG-CSF的PEG-肽段的分子量检测结果；
图9：标准品校准测试图谱；
图10：供试品PEG-rhG-CSFPEG修饰肽段的N-端序列测试图谱；
图11：供试品在小鼠放化疗模型上的药效测试图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，以下实施例只能用于本发明做进一步说明，并不能理解为本发明保护的限制，该领域的专业技术人员根据上述发明的内容作出的非本质的改正和调整，仍属于本发明的保护的范围。
<实施例>
实施例1
rhG-CSF反应溶液(40ml，浓度为3mg/ml)，内含100mM磷酸钠，pH5.0，还含有120mMVB6(维生素B6)，将其充分搅拌冷冻(4℃)后，加入5倍蛋白质量的甲氧聚乙二醇丙醛(MPEG-PALD)(平均分子量为20kDa)。反应混合物在相同温度下持续搅拌。
反应过程中蛋白质的修饰率用RP-HPLC来对其监测，RP-HPLC使用的是C18 250×4.6mm 5μm柱(phenomenex)，用0.1％三氟乙酸水溶液，0.1％三氟乙酸乙腈，以1.0ml/min流速进行梯度洗脱。
分别于8、9、10、11小时RP-HPLC分析结果如表1所示：
Figure BDA0002700306310000061
Figure BDA0002700306310000071
实施例2
rhG-CSF反应溶液(40ml，浓度为3mg/ml)，内含100mM磷酸钠，pH5.0，还含有40mMNADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，将其充分搅拌冷冻(4℃)后，加入5倍蛋白质量的甲氧聚乙二醇丙醛(MPEG-PALD)(平均分子量为20kDa)。反应混合物在相同温度下持续搅拌。
反应过程中蛋白质的修饰率用RP-HPLC来对其监测，RP-HPLC使用的是C18 250×4.6mm 5μm柱(phenomenex)，用0.1％三氟乙酸水溶液，0.1％三氟乙酸乙腈，以1.0ml/min流速进行梯度洗脱。
分别于8、9、10、11小时RP-HPLC分析结果如表1所示：
时间 RP-HPLC修饰率(％)
8 77.5
9 84.4
10 86.0
11 85.8
实施例3
rhG-CSF反应溶液(40ml，浓度为3mg/ml)，内含300mM磷酸钠，pH7.0，还含有40mMNADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，将其充分搅拌冷冻(4℃)后，加入5倍蛋白质量的甲氧聚乙二醇丙醛(MPEG-PALD)(平均分子量为20kDa)。反应混合物在相同温度下持续搅拌。
反应过程中蛋白质的修饰率用RP-HPLC来对其监测，RP-HPLC使用的是C18 250×4.6mm 5μm柱(phenomenex)，用0.1％三氟乙酸水溶液，0.1％三氟乙酸乙腈，以1.0ml/min流速进行梯度洗脱。
分别于8、9、10、11小时RP-HPLC分析结果如表1所示：
时间 RP-HPLC修饰率(％)
8 72.3
9 75.1
10 79.5
11 80.8
实施例4
rhG-CSF反应溶液(40ml，浓度为3mg/ml)，内含50mM磷酸钠，pH4.0，还含有40mMNADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，将其充分搅拌冷冻(4℃)后，加入5倍蛋白质量的甲氧聚乙二醇丙醛(MPEG-PALD)(平均分子量为20kDa)。反应混合物在相同温度下持续搅拌。
反应过程中蛋白质的修饰率用RP-HPLC来对其监测，RP-HPLC使用的是C18 250×4.6mm 5μm柱(phenomenex)，用0.1％三氟乙酸水溶液，0.1％三氟乙酸乙腈，以1.0ml/min流速进行梯度洗脱。
分别于8、9、10、11小时RP-HPLC分析结果如表1所示：
时间 RP-HPLC修饰率(％)
8 75.1
9 80.6
10 81.8
11 81.9
实施例5
rhG-CSF反应溶液(40ml，浓度为3mg/ml)，内含100mM磷酸钠，pH5.0，还含有10mMNADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，将其充分搅拌冷冻(4℃)后，加入5倍蛋白质量的甲氧聚乙二醇丙醛(MPEG-PALD)(平均分子量为20kDa)。反应混合物在相同温度下持续搅拌。
反应过程中蛋白质的修饰率用RP-HPLC来对其监测，RP-HPLC使用的是C18 250×4.6mm 5μm柱(phenomenex)，用0.1％三氟乙酸水溶液，0.1％三氟乙酸乙腈，以1.0ml/min流速进行梯度洗脱。
分别于8、9、10、11小时RP-HPLC分析结果如表1所示：
时间 RP-HPLC修饰率(％)
8 75.4
9 80.2
10 84.2
11 85.5
<稳定性测试>
测试方法：采取与实施例1或实施例2相同的方法，反应在10h后加入盐酸将pH调至4得到聚乙二醇修饰的重组人粒细胞刺激因子，记为PEG-rhG-CSF；用RP-HPLC来对其稳定性做监测，RP-HPLC使用的是C18 250×4.6mm 5μm柱(phenomenex)，用0.1％三氟乙酸水溶液，0.1％三氟乙酸乙腈，以1.0ml/min流速进行梯度洗脱。
图1给出了分别将实施例1的PEG-rhG-CSF在1月19日、2月27日、3月23日、6月19日所测得到的RP-HPLC的典型图谱数据。图2给出了在反应8h后实施例2的RP-HPLC的典型图谱；图3给出了在反应11h后实施例2的RP-HPLC的典型图谱；图4给出了分别将实施例2的PEG-rhG-CSF在1月19日、2月27日、3月23日、6月19日所测得到的RP-HPLC的典型图谱数据。
<修饰位点均一性测试>
1、实验原理和方法
以下供试品为按照实施例2反应10h后得到的PEG-rhG-CSF。
A)实验原理
本实验是基于现在质谱技术，对蛋白质多肽分子的氨基酸修饰进行分析。首先使用蛋白酶对供试品酶解处理；然后使用液质检测对酶解后的肽段样品进行分析，并使用软件对液质检测原始文件进行分析，获得肽段覆盖率和翻译后修饰(N端Q环化，Met和Trp氧化，Asn脱酰胺等)信息。通过手动查看一级质谱图来指证PEG-肽段，再通过二级质谱图进行denovo解谱，得到部分氨基酸序列，初步判断PEG修饰位点。最后使用LC-UV收集PEG修饰肽段，通过Edman测序确认PEG修饰位点。
B)实验方法
a)供试品准备
取适量供试品，加入至GdnHCl，Tris-HCl缓冲液中，加入适量DTT，37℃孵育90分钟。加入适量IAA，室温避光孵育30min。用Zeba spin column置换buffer至Urea/Tris-HCl缓冲液。再加入适量的Glu-C蛋白酶，37℃孵育18h进行酶切。
b)液质检测
酶解样品采用UPLC液相系统进行分离。液相A液为0.1％FA水溶液，B液为0.1％FA乙腈溶液，液相色谱梯度见表1。供试品酶解产物由自动进样器上样，再经色谱柱分离后使用高分辨质谱仪进行检测扫描质谱分析。质谱采集时间：65min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z。一级质谱分辨率：70,000at m/z 200。二级质谱分辨率：17,500atm/z 200。
表1.液相色谱梯度设置
Figure BDA0002700306310000101
c)数据分析
所得质谱原始数据用Unifi(Waters)软件进行分析。选择供试品理论序列为数据库。
d)PEG-肽段的收集及MALDI-TOF分子量验证
供试品经(Glu-C)还原酶解的肽段样品进行LC收集，梯度见表3。收集的PEG-肽段经低温干燥减，进行MALDI-TOF检测(基质：CHCA)。
表3.PEG-肽段收集色谱梯度
Time(min) B％
0.01 3
5 3
10 30
50 70
55 90
60 90
60.01 3
70 3
e)Edman测序
供试品处理：加40μL甲醇到Prosorb装置的PVDF膜上，待滤过后；加入40μL 0.1％TFA溶液，待滤过后；再加入供试品，供试品的量需大于50pmol，滤过后；再分别加入两次600μL 0.1％TFA进行滤过。将Prosorb放入已预热至50℃的加热器中烘干，用ProSorbTM Punch切下PVDF膜，上样。测试样品：将剪切好的PVDF膜供试品放置到反应器中，组装好反应器后将其放置于仪器固定位置，通过软件PPSQ-30Analysis设置：样品名称、样品号、测试循环数、选择方法文件，设置完成后开始测试。数据及图谱处理：PPSQ-33A产生的原始数据及图谱由PPSQ-30Data Processing软件识别标峰并导出对应图谱。
2、实验结果和分析
1)液质检测
供试品经还原酶解(Glu-C)和液质检测，相关图谱见图5，图5为供试品酶解产物经液质检测的质谱图谱(上：UV；中：TIC；下：BPI)。由图可得，供试品酶解较充分，肽段色谱分离较好，质谱相应信号较强，可以进行后续数据分析。
2)PEG修饰肽段质谱分析
PEG为乙二醇的线性聚合物(-CH2CH2O-)n，无唯一分子量且分子量分布范围较宽。通过活化基团与蛋白N-末端氨基以共价反应修饰而成的PEG修饰，经过蛋白酶解得到的肽段也无法测得唯一分子量。PEG-肽段高度疏水，HPLC出峰时间较晚(约61min)，质谱采集得到的图谱显示没有唯一分子量(见图6)。利用MSe采集模式(一级质谱数据采集时使用低碰撞能量6eV)，可以检测到PEG修饰肽段的特征峰，相邻质量数差44Da(-CH2CH2O-)见图6。
MSe采集模式下将所有PEG-肽段母离子进行碎裂产生子离子，PEG修饰在肽段的N-端，则只能产生y离子，而b离子由于和PEG偶联分子量较大且不均一所以不能被检测到。通过对供试品PEG-rhG-CSFMSe采集模式的子离子(40-60eV碎裂能量)进行解析如图6，只能检测到y离子，且子离子对应氨基酸序列为TPLGPASSLPQSFLLKCLE，可以初步判断PEG修饰位于PEG-rhG-CSF的N-端(N-ter_MTPLGPASSLPQSFLLKCLE)。
3)PEG修饰肽段的HPLC收集及MALDI-TOF确证
供试品经溶液内酶解，酶解产物经HPLC分离的色谱图见图7。由于PEG修饰肽段的分子量较大与色谱柱的结合力较强，需要高比例有机相洗脱，供试品PEG-rhG-CSF的PEG修饰肽段在HPLC色谱峰图中洗脱时间在47-49min。收集供试品在RT 47-49min的色谱峰，进行MALDI-TOF分子量检测和Edman法N-端测序。
采用MALDI-TOF对纯化后的PEG修饰肽段进行分子量检测，结果见图8。供试品PEG-rhG-CSFPEG修饰肽段的MALDI-TOF测定分子量约23kD，PEG修饰肽段理论分子量约20kD，两者数据一致，可以确定HPLC收集的肽段是PEG修饰肽段，且纯度较高，可以进行Edman测序分析。
4)PEG修饰肽段N-端序列分析
采用Edman降解法对HPLC纯化后的PEG修饰肽段进行N-端序列分析。通过测试19种PTH-氨基酸对色谱系统进行校准，19种PTH氨基酸的混合标准品色谱图见图9。
PTH氨基酸混合标准品校准测试完成后，测试供试品PEG修饰肽段的N-端序列，进行10个循环测试，相关图谱见图10。
根据以上供试品的LC-MS数据和Edman测序数据，可以得出以下结论：
3、结论
供试品酶解后经LC-MS分析，通过质谱MSe数据采集模式，可以确认存在PEG修饰；并且根据PEG修饰肽段的二级质谱子离子，能够准确匹配出TPLGPASSLPQSFLLKCLE序列，可以推断PEG修饰发生于N-末端(MTPLGPASSLPQSFLLKCLE)，首位Met由于发生PEG修饰导致y离子无法进行匹配。PEG-rhG-CSF的PEG修饰位点位于蛋白rhG-CSF的(MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP)N端第一个氨基酸甲硫氨酸Met。
<药效测试>
BALB/c小鼠经检疫合格后，按体重随机选取6只作为正常对照组，其余小鼠给予60Co全身照射，剂量为2.5Gy，照射后当天腹腔注射化疗药卡铂，剂量为50mg/kg。根据造模动物体重随机分为4组，分别为：模型组、G-CSF组、PEG-rhG-CSF低剂量组、PEG-rhG-CSF高剂量组，每组6只，分组后每隔2天内眦静脉采血，采用自动血球分析仪测定外周血白细胞。
造模后次日(D1)，正常对照组和模型组皮下注射溶媒(2ml/kg)，其他组注射相应的对照品或供试品，给药后第12天安乐死动物。具体分组如下表所示(溶媒为醋酸钠缓冲液；给药方式为皮下注射；供试品为按照实施例2反应10h后得到的PEG-rhG-CSF)：
Figure BDA0002700306310000121
Figure BDA0002700306310000131
实验结果见图11，可以看出PEG修饰的蛋白经过单次给药后可以快速升高小鼠的白细胞数量，并且在整个治疗周期内可以持久的维持白细胞在一个相对高的水平上，更加有利于小鼠的康复。未经PEG修饰的蛋白需要多次给药才能勉强维持白细胞水平处于一个中等数量。

Claims (2)

1.一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法，其特征在于，在维生素或辅酶存在下，使相对于蛋白质质量的3～7倍量的5kD-40kD的聚乙二醇衍生物与蛋白质进行反应；
所述维生素为维生素B6；
所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；
所述聚乙二醇衍生物为甲氧聚乙二醇丙醛；
所述蛋白质溶解在缓冲液中；
所述缓冲液的pH为4.5-5.5；
所述缓冲液为50-150mM磷酸钠；
所述蛋白质在反应体系中的浓度为2-5mg/ml；
所述蛋白质为重组人粒细胞刺激因子，修饰位点为与蛋白rhG-CSF的N端第一个氨基酸甲硫氨酸Met。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇衍生物的分子量为10kD-30kD。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
WO2006116948A1 (fr) * 2005-04-30 2006-11-09 Chengdu Institute Of Biological Products Conjugue de polyethylene glycol et d’interleukine-6 et son procede de preparation et son utilisation
CN101143894A (zh) * 2007-06-22 2008-03-19 中国药科大学 高效抑制血管生成多肽及其物理化学修饰方法和应用
CN101185762A (zh) * 2007-12-11 2008-05-28 北京生物制品研究所 聚乙二醇类聚合物修饰的睫状神经营养因子及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
CN103184208B (zh) * 2011-12-27 2015-09-16 拜奥生物科技（上海）有限公司 人精氨酸酶和定点聚乙二醇化人精氨酸酶及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
WO2006116948A1 (fr) * 2005-04-30 2006-11-09 Chengdu Institute Of Biological Products Conjugue de polyethylene glycol et d’interleukine-6 et son procede de preparation et son utilisation
CN101163716A (zh) * 2005-04-30 2008-04-16 成都生物制品研究所 白细胞介素-6聚乙二醇结合物及其制备方法和应用
CN101143894A (zh) * 2007-06-22 2008-03-19 中国药科大学 高效抑制血管生成多肽及其物理化学修饰方法和应用
CN101185762A (zh) * 2007-12-11 2008-05-28 北京生物制品研究所 聚乙二醇类聚合物修饰的睫状神经营养因子及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化化学;姜忠义等;《有机化学》;20031231(第12期);第1340-1347+1325页 *
重组人干扰素α-2b的新型制备方法及其长效制剂研究;赵鑫;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)医药卫生科技辑》;20170215;E079-177 *

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