BR112014015820B1 - Arginase peguilada e composição farmacêutica para tratamento de uma doença relacionada com arginase - Google Patents

Abstract

ARGINASE HUMANA E ARGINASE HUMANA PEGILADA E O SEU USO. A presente invenção provê uma arginase que sofreu mutação direcionada de sítio e o seu processo de preparação, e o uso de dita arginase que sofreu mutação direcionada de sítio na preparação de um medicamento para trata-mento de uma doença relacionada com arginase. A presente invenção também provê uma arginase pegilada e o seu processo de preparação, e o uso de dita arginase pegilada em preparação de um medicamento para tratamento de uma doença relacionada com arginase.

Description

[001] Este pedido de patente reivindica prioridades a partir de pedido de patente Chinês No. 201110445965.8, depositado em 27 de dezembro de 2011, intitulado "Arginase humana e arginase humana peguilada e o seu uso", e do pedido de patente Chinês No. 201210069626.9, depositado em 16 de março de 2012, intitulado "Arginase humana e arginase humana peguilada e o seu uso", que são aqui incorporados por referência em suas totalidades.

Referência a Listagem de Sequências

[002] A cópia dura da listagem de sequências submetida com o mesmo e com a correspondente forma legível em computador são ambas aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

Campo da Invenção

[003] A presente invenção provê uma arginase, o seu processo de preparação e o seu uso no tratamento de doenças relacionadas com arginase. Especificamente, a presente invenção provê uma arginase que sofreu mutação direcionada de sítio, o seu processo de preparação e o seu uso no tratamento de doenças relacionadas com arginase. A presente invenção também provê uma arginase peguilada, seu processo de preparação e o seu uso.

Antecedentes da Invenção

[004] Arginina é um importante aminoácido em mamíferos incluindo humanos, que está envolvido em vários processos fisiológicos, incluindo proliferação e crescimento de célula. Por exemplo, arginina é um precursor imediato para a síntese da potencial molécula sinal de óxido nítrico (NO). NO funciona como um neurotransmissor, um relaxante de músculo ou um vasodilatador. A biossíntese de NO envolve reações dependentes de NADPH e Ca++ catalisadas por óxido nítrico sintase. Uma outra função de arginina é como um precursor para poliamina, espermidina ou espermina e participa em diferentes processos fisiológicos.

[005] Estudos mostraram que quando arginina é menos que 8 μM, células de câncer sofrem morte irreversível (Srorr & Burton, 1974, The effects of arginine deficiency on lymphoma cells. Br. J. Cancer 30, 50). Através de estudo de efeito sobre crescimento de célula, foi verificado que com remoção de arginina, as células normais na fase G0 de ciclo de célula podem entrar num estado de descanso e permanecerem viáveis por várias semanas sem dano significante; quando a concentração de arginina retornou para nível normal, as células podem retornar para ciclo de célula normal. Entretanto, certas células de tumor podem proceder do ponto ‘R’ da fase G1 de ciclo de célula para fase S em privação de arginina, e logo sofrerem apoptose. A apoptose de células de tumor como um resultado de deficiência de arginina é irreversível. Por isso, cientistas começam a considerar tratamento de cânceres através de controle de nível de arginina no corpo, especialmente para tumores auxotróficos como câncer de fígado e melanoma. Esta abordagem agora tem sido usada para estudar a inibição de vários tumores incluindo câncer de mama, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de próstata, linfoma e leucemia.

[006] Arginase é a enzima catalisando a hidrólise de L-arginina para ornitina e ureia. Em geral, arginase é expressa no fígado, rins e testículos dos animais produzindo ureia (mamíferos, elasmobrânquios, anfíbios e tartarugas) como uma das enzimas no ciclo ureia. Arginase catalisa a etapa final do caminho de reciclagem de ureia em mamíferos, convertendo arginina para ornitina e ureia. Na maioria dos animais, a família de arginase inclui arginase I e arginase II. Arginase I é expressa principalmente nas células de fígado, e arginase II é expressa principalmente no rim e eritrócitos.

[007] Existem dois processos para produzir arginase; dos quais um é para separar a mesma do organismo produzindo arginase, e a outra é através de técnicas de engenharia genética recombinante. As últimas têm suas vantagens. Por exemplo, experimentos mostraram que uma grande quantidade de arginase pode ser produzida por E. coli. Entretanto, podem haver problemas técnicos para produção de arginase através de técnicas de engenharia genética recombinante, como baixa atividade de enzima ou pobre estabilidade e curta meia-vida in vivo, limitando sua aplicação em prática clínica.

[008] US 7951366B2 mostrou uma composição farmacêutica e processo para o tratamento de tumor maligno humano através de esgotamento de arginina usando arginase I humana recombinante com tag-his, onde a arginase é modificada através de conjugação covalente com polietileno glicol de peso molecular de 5000 (MW5000) no N- terminal ou o grupo amina sobre a superfície da arginase. A arginase humana modificada teve uma estabilidade aumentada com uma meia- vida de 3 dias em soro humano.

[009] US20100247508A1 mostrou uma arginase humana modificada com his-tag, onde as cisteínas 168 e 303 são substituídas com serinas e a arginase é peguilada com polietileno glicol de um peso molecular de 20 KDa. Como a arginase I humana recombinante mostrada em US7951366B2, um adicional fragmento de peptídeo, His- tag é incluído na sequência de aminoácidos da arginase. As agências reguladoras de fármacos na maioria dos países não recomenda o uso destes fragmentos de peptídeos. Por exemplo, China State Food and Drug Administration indica no "Technical Quidelines on the Quality Control of Recombinant DNA Product for Human Use " que adicionais fragmentos de peptídeos como tag-His introduzidos para o propósito de simplificação de processo de produção devem ser removidos tanto quanto possível do produto final.

[0010] WO 2011/008495A2 mostrou uma arginase modificada direcionada de sítio, na qual as três cisteínas foram retidas e um outro resíduo cisteína é introduzido substituindo o terceiro resíduo de aminoácido do N-terminal, e então peguilado com metóxi polietileno glicol maleimida de peso molecular de 20 KDa. Uma vez que a dita arginase humana ainda transporta os três resíduos cisteína originais, seu produto de peguilação é propenso a heterogêneo e baixo em rendimento, o que também adiciona dificuldades para purificação.

[0011] O presente campo técnico tem a necessidade de uma melhor arginase ou seus derivados, para o tratamento de doenças ou distúrbios relacionados com arginina.

Sumário da Invenção

[0012] A presente invenção provê uma arginase isolada e substancialmente pura. Arginase é a enzima na etapa final do caminho de reciclagem de ureia na síntese de ureia em mamíferos, convertendo arginina em ornitina e ureia. Na maioria dos mamíferos, a família de arginina se inclui arginase I e arginase II. Estudos sobre arginase I de várias origens mostraram que arginase I de diferentes origens têm um lote de regiões conservadas e sítios ativos, embora sua sequência possa ser diferente. Como reportado por Haraguchi, Y., etc., 1987, Proc. Natl. Acad. Sc1.84, 412-415, arginase I humana tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, que compreende três cisteínas nas posições de aminoácidos 45, 168 e 303. A arginase I humana tipo selvagem tem uma sequência de ácidos nucléicos de SEQ ID NO. 2.

[0013] Na presente invenção, o termo "isolada" refere-se a uma forma não-natural. O termo "substancialmente puro" significa que o produto pode compreender outros componentes derivados de produção ou modificação de proteína, ainda que tais outros componentes não estejam substancialmente presentes ou somente presentes em uma pequena razão.

[0014] Na presente invenção, a descrição sobre a localização de sítio de aminoácido é comumente usada por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a frase "em posição 45 da sequência de SEQ ID NO.x" ou "Cys (cisteína) em posição 45 da sequência de SEQ ID NO.x" ou "Cys45" todas referem-se ao 45o resíduo de aminoácido na sequência amino ou a cisteína na posição 45.

[0015] Em um aspecto, a presente invenção provê uma arginase mutante, que é uma arginase I humana compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, onde qualquer uma, duas ou três das cisteínas em posições 45, 168 e 303 sofreu/sofreram mutação, ou (2) uma sequência de aminoácidos onde substituição, supressão, inserção, adição ou inversão de um ou mais aminoácidos é introduzida na sequência de aminoácidos definida em (1), e que tem atividade arginase.

[0016] Em um aspecto, as cisteínas na arginase da presente invenção sofrem mutação para aminoácidos não-polares. De acordo com as propriedades de sua cadeia lateral, os aminoácidos podem ser classificados como aminoácidos polares ou não-polares. Aminoácidos tendo cadeias laterais sendo não-carregadas ou fracamente polarizadas são chamados aminoácidos não-polares, tais como, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano e prolina.

[0017] Em um aspecto, as cisteínas na arginase da presente invenção sofrem independentemente mutação para glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina. Preferivelmente, as cisteínas sofrem independentemente mutação para alanina. A presente invenção inesperadamente verificou que a atividade enzimática de arginase I humana é significantemente aumentada quando a cisteína, que é um aminoácido polar não-iônico sofre mutação para um aminoácido não-polar (tal como alanina). Uma das possíveis razões é que a ligação entre a arginase mutante e o substrato é aperfeiçoada.

[0018] Em um aspecto, uma das cisteínas nas posições 45, 168 e 303 da arginase da presente invenção sofre mutação. Ainda em um aspecto da presente invenção, cisteína na posição 303 sofre mutação. Preferivelmente, a dita cisteína sofre mutação para glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina; e mais preferivelmente, a dita cisteína sofre mutação para alanina.

[0019] Em um aspecto, quaisquer duas das cisteínas em posições 45, 168 e 303 da arginase da presente invenção sofrem mutação. Ainda em um aspecto da presente invenção, cisteínas em posições 45 e 303 sofrem mutação. Preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina; e mais preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para alanina. Em um aspecto, cisteínas em posições 168 e 303 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 na arginase da presente invenção sofrem mutação. Preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina; e mais preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para alanina. Em um aspecto, cisteínas em posições 45 e 303 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 na arginase da presente invenção sofrem mutação. Preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina; e mais preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para alanina.

[0020] Em um aspecto, cisteínas em posições 45, 168 e 303 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 na arginase da presente invenção sofrem mutação. Preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina, e mais preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para alanina.

[0021] A arginase da presente invenção tem atividade enzimática maior que a arginase tipo selvagem. A arginase da presente invenção genericamente tem uma atividade específica de pelo menos cerca de 500 U/mg; preferivelmente, a atividade é de pelo menos cerca de 700 U/mg; e mais preferivelmente, a atividade é pelo menos cerca de 800 U/mg. Arginase da presente invenção genericamente tem atividade enzimática maior que a arginase tipo selvagem.

[0022] Em um aspecto da presente invenção, a arginase tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, onde pelo menos um códon para o resíduo de aminoácido cisteína em posições 45, 168 e 303 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 está substituído. Preferivelmente, um, dois ou três dos códons para cisteína é/são substituídos. Aminoácidos são codificados por polinucleotídeos. Um códon de três nucleotídeos em um RNA mensageiro define um aminoácido simples. Em um aspecto da presente invenção, a substituição de nucleotídeo é o códon TGT substituído por um códon codificando glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina. Preferivelmente, o códon TGT é substituído por um códon codificando alanina.

[0023] Em um aspecto da presente invenção, os ditos códons codificando alanina são GCT, GCC, GCA, GCG, e preferivelmente é GCT.

[0024] Em um aspecto, a presente invenção provê um processo para preparação de arginase mencionada acima, incluindo expressão de gene da arginase ou arginase mutante em um hospedeiro que é capaz de expressar a proteína. O processo de preparação para a arginase da presente invenção genericamente inclui as seguintes etapas principais. Desejados genes ou fragmentos de nucleotídeos são obtidos por PCR ou processo sintético. O fragmento de DNA com o desejado gene é ligado a um vetor, tal como um plasmídeo, fago ou vírus, que pode replicar independentemente e tem um marcador de seleção para formar moléculas de DNA recombinante. A ligação de fragmentos de DNA em um vetor é principalmente através de caudas de homopolímeros, extremidades coesivas, extremidade - embotada ou ligador artificial. DNA recombinante tem de ser introduzido na célula hospedeira de modo a ser multiplicado e expresso. De acordo com diferentes propriedades dos vetores, transfecção, transformação, transdução são realizadas de modo que as moléculas de DNA recombinante são introduzidas em uma célula hospedeira e multiplicadas. Apropriados hospedeiros de engenharia genética são conhecidos na técnica, os quais incluem Escherichia coli, levedura, células de inseto e semelhantes.

[0025] A presente invenção também provê uma arginase peguilada isolada e substancialmente pura. A arginase na dita arginase peguilada é como previamente definida. Em um aspecto, uma, duas ou três das cisteínas em posições 45, 168 e 303 de dita arginase da presente invenção na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 sofre/sofrem mutação, preferivelmente, a dita cisteína(s) sofre/sofrem mutação para aminoácidos não-polares; mais preferivelmente, a dita cisteína(s) sofre/sofrem mutação para alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, ou prolina, e mais preferivelmente, a dita cisteína(s) sofre mutação para alanina. A arginase peguilada da presente invenção é obtida por peguilação da dita arginase. Na dita arginase peguilada, moléculas de polietileno glicol está covalentemente ligada com os resíduos de aminoácidos da arginase. Na presente invenção, cada uma arginase está ligada com pelo menos uma molécula de polietileno glicol para formar a arginase peguilada.

[0026] Em um aspecto, a presente invenção provê uma arginase peguilada, onde a arginase é uma arginase I humana que compreende: uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, onde uma ou duas das cisteínas em posições 45, 168 e 303 sofre/ sofrem mutação, ou (2) uma sequência de aminoácidos onde substituição, supressão, inserção, adição ou inversão de um ou mais aminoácidos é introduzida na sequência de aminoácidos definida em (1), e que tem atividade arginase.

[0027] Em um aspecto, as cisteínas na arginase peguilada da presente invenção sofrem independentemente mutação para aminoácido não-polar. As estruturas dos 20 aminoácidos são diferentes devido à diferença de sua cadeia lateral. Aminoácidos tendo grupos sendo carregados ou fracamente polarizados pertencem a aminoácidos não-polares, tais como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano e prolina.

[0028] Em um aspecto da invenção, a arginase I peguilada não compreende uma sequência tag para uso na purificação, tal como uma sequência tag-His adicionada no C ou N-terminal. Proteína de fusão de tag-His é o meio mais comum de expressão de proteína, que tem a vantagem de facilidade para purificação e sem significante efeito para a atividade da proteína. Produtos de expressão de proteína tanto em forma sólida como em corpo de inclusão pode ser purificada através de cromatografia de afinidade de íon de metal imobilizado. Por outro lado, devido à potencial propriedade de imunogenicidade, China State Food and Drug Administration indica no " Technical Quidelines on the Quality Control of Recombinant DNA Product for Human Use " que adicionais fragmentos de peptídeos tais como tag-His introduzidos para o propósito de simplificação de processo de produção devem ser removidos tanto quanto possível do produto final.

[0029] Na presente invenção, a peguilação da arginase pode ser obtida através de modificação química, a dita modificação pode ser realizada através de conjugação covalente de uma molécula de polietileno glicol com arginase usando um derivado polietileno glicol com um agente de acoplamento (também referido como um reagente de peguilação). Molécula comum de polietileno glicol tem um grupo hidroxila em cada uma sua extremidade. Um metóxi polietileno glicol (mPEG) é um polietileno glicol bloqueado em uma extremidade com um grupo metoxi. Os reagentes de peguilação mais comumente estudados usados na modificação de peptídeos ou proteínas são derivados de metóxi polietileno glicol (mPEG). A modificação principalmente inclui aquela do grupo amino, grupo carboxila ou o grupo tiol. Um processo de peguilação comum é ligar covalentemente polietileno glicóis ou reagentes de peguilação com ε-NH2 de lisina de superfície ou α-NH2 N- terminal da proteína, tal como succinimidil butirato de metóxi polietileno glicol (mPEG-SBA), mPEG-propionato de succinimidila (mPEG-SPA), mPEG-succinato de succinimidila (mPEG-SS), mPEG-carbonato de succinimidila (mPEG-SC), mPEG-glutarato de succinimidila (mPEG- SG), mPEG-N-hidroxil succinimida (mPEG-NHS), mPEG-tresilato e mPEG-aldeído. Devido à alta propriedade nucleofílica de grupo tiol, um outro processo de peguilação comum é o suo seletivo de polietileno glicóis ou reagentes de peguilação que possam ser especificamente conjugados com o grupo tiol de proteínas, tais como mPEG-maleimida, mPEG - dissulfeto de orto - piridila, mPEG - vinil sulfona e mPEG - iodo acetamida para modificar o grupo tiol de peptídeos ou proteínas. Arginase humana tem três resíduos cisteína localizados em posições 45, 168 e 303 da sequência de aminoácidos, que podem ser modificadas direcionadas para sítio através de conjugação covalente com a molécula de PEG alvejando em grupo tiol.

[0030] A sequência de aminoácidos da arginase I da presente invenção compreende 24 lisinas e grupo amino N-terminal como potenciais sítios para peguilação de grupo amino; cada um tem diferente grau de peguilação devido à diferente localização na estrutura tridimensional da proteína. A partir de análise de estrutura tridimensional de arginase por PyMOL ou Swiss-PdbViewer, 12 de 24 grupos amino-ε são difíceis de serem peguilados devido a impedimento estéreo ou as ligações de hidrogênio formadas com os grupos circundantes. Grupos amino-ε de K4, K33, K41, K75, K89, K150, K155, K191, K224, K284, K313, e K322 são acessíveis para reações com reagentes PEG alvejando em grupo amino, e grupos amino-ε de K191, K224, K89, K284 são os sítios mais facilmente acessíveis para peguilação.

[0031] Em um aspecto da presente invenção, o dito reagente de peguilação é selecionado de metóxi polietileno glicol - propionato de succinimidila (mPEG-SPA), mPEG - butirato de succinimidila (mPEG- SBA), mPEG - succinato de succinimidila (mPEG-SS), mPEG - carbonato de succinimidila (mPEG-SC), mPEG - glutarato de succinimidila (mPEG-SG), mPEG - N-hidroxil succinimida (mPEG- NHS), mPEG - tresilato e mPEG - aldeído. Ainda em um aspecto da presente invenção, o dito reagente de peguilação é metóxi polietileno glicol - propionato de succinimidila, preferivelmente o dito reagente de peguilação é metóxi polietileno glicol - propionato de succinimidila 5000 com um peso molecular médio de 5 K

[0032] A seleção de peso molecular do PEG deve realizar uma consideração compreensiva da bioatividade e as propriedades fármaco - cinéticas. Estudos mostraram que o tempo de atuação das drogas de proteína modificada no corpo está correlacionado com os números e peso de molécula de PEG conjugada. Proteínas modificadas com moléculas de PEG muito grandes podem perder alguma de sua atividade. O PEG usado para a presente invenção tem um peso de molécula variando de 5 K a 40K, linear ou ramificada. O PEG usado para a presente invenção pode ser derivados de PEG usados no campo técnico. O PEG usado para a presente invenção não é limitado a certos tipos especificados.

[0033] Em um aspecto da presente invenção, o peso molecular total das moléculas de PEG conjugadas com cada molécula de dita arginase é cerca de 20-70 K, e preferivelmente, o peso molecular total é cerca de 30-60K.

[0034] Em um aspecto da presente invenção, cada molécula de PEG usada na peguilação tem um peso molecular médio de cerca de 240 K; preferivelmente o peso molecular médio é cerca de 5-20K; e mais preferivelmente, o peso molecular médio é cerca de 5K.

[0035] Em um aspecto da presente invenção, cada molécula de PEG usada na peguilação tem um peso molecular médio de cerca de 5K; e cada molécula de arginase é conjugada com cerca de 4-13 moléculas de PEG; e preferivelmente, cada molécula de arginase é conjugada com 6-12 moléculas de PEG.

[0036] O número de moléculas de PEG conjugadas com cada molécula de arginase pode ser controlado através de ajuste de parâmetros afetando reação de peguilação, tais como a razão de proteína/reagente PEG, tempo de reação, e temperatura. Por exemplo, cada molécula de arginase pode ser controlada para ser conjugada com cerca de 4-13 moléculas de PEG, e preferivelmente com 6-12 moléculas.

[0037] Em um aspecto, a arginase peguilada da presente invenção é formada por conjugação covalente dos reagentes PEG reativos com amina com os grupos amino-ε das lisinas sobre a superfície da arginase, tal como o grupo amino em K191, K224, K89, K284, ou o grupo amino-α no N-terminal, ou ainda peguilado nos sítios de K4, K33, K41, K75, K150, K155, K313 e K322. O número de moléculas de PEG conjugadas com cada molécula de arginase pode ser controlado para cerca de 4-13 moléculas de PEG, preferivelmente 6-12 moléculas através de ajuste de parâmetros afetando reação de peguilação, tal como a razão de proteína/reagente PEG, tempo de reação ou temperatura.

[0038] Em um aspecto da presente invenção, uma das três cisteínas em posições 45, 168 e 303 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (por exemplo, cisteína 45, cisteína 168, ou cisteína 303) da arginase peguilada sofre mutação para alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina, e preferivelmente, a dita cisteína sofre mutação para alanina, onde cada molécula de PEG da dita arginase peguilada tem um peso molecular médio de cerca de 5K; e cada molécula de arginase de dita arginase peguilada está conjugada com cerca de 4-13 moléculas de PEG, e preferivelmente com 6-12 moléculas. Ainda em um aspecto da presente invenção, a dita peguilação é realizada usando metóxi polietileno glicol - propionato de succinimidila 5000.

[0039] Em um aspecto da presente invenção, cisteínas em posições 168 e 303 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 da arginase peguilada independentemente sofrem mutação para alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina; e preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para alanina, onde cada molécula de PEG da dita arginase peguilada tem um peso molecular médio de cerca de 5K, e cada molécula de arginase da dita arginase peguilada está conjugada com cerca de 4-13 moléculas de PEG, e preferivelmente com 6-12 moléculas. Ainda em um aspecto da presente invenção, a dita peguilação é realizada usando metóxi polietileno glicol - propionato de succinimidila 5000.

[0040] Em um aspecto da presente invenção, cisteínas em posições 45 e 303 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 da arginase peguilada independentemente sofrem mutação para alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina; e preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para alanina onde cada molécula de PEG de arginase peguilada tem um peso molecular médio de cerca de 5K, e cada molécula de arginase de arginase peguilada está conjugada com cerca de 4-13 moléculas de PEG, e preferivelmente com 6-12 moléculas de PEG. Ainda em um aspecto da presente invenção, a dita peguilação é realizada usando metóxi polietileno glicol - propionato de succinimidila 5000.

[0041] Em um aspecto da presente invenção, cisteínas em posições 45 e 168 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 da arginase peguilada independentemente sofrem mutação para alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina; e preferivelmente, a as ditas cisteínas sofrem mutação para alanina onde cada molécula de PEG de dita arginase peguilada tem um peso molecular médio de cerca de 5K, e cada molécula de arginase de dita arginase peguilada está conjugada com cerca de 4-13 moléculas de PEG, e preferivelmente com 6-12 moléculas. Ainda em um aspecto da presente invenção, a dita peguilação é realizada usando metóxi polietileno glicol - propionato de succinimidila 5000.

[0042] Em um aspecto da presente invenção, cisteína em posição 45, 168 e 303 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 da arginase peguilada independentemente sofre mutação para alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina, e preferivelmente a dita cisteína sofre mutação para alanina, onde cada molécula de PEG da dita arginase peguilada tem um peso molecular médio de cerca de 5K, e cada molécula de arginase de dita arginase peguilada está conjugada com cerca de 4-13 moléculas de PEG, e preferivelmente com 6-12 moléculas. Ainda em um aspecto da presente invenção, a dita peguilação é realizada usando metóxi polietileno glicol - propionato de succinimidila 5000.

[0043] A arginase peguilada da presente invenção é substancialmente homogênea. Ser substancialmente homogênea significa que o produto contém substancialmente a arginase peguilada, mas ele pode conter pequenas quantidades de proteína não-reagida (isto é, não peguilada) ou arginase peguilada polimérica. A presente invenção provê arginase peguilada tendo uma pureza de mais que 90%, preferivelmente mais que 95%, e mais preferivelmente mais que 98%. Na presente invenção, o termo "pureza de arginase peguilada" significa a porcentagem da arginase peguilada (isto é, arginase ligada covalentemente com PEG) na arginase total (arginase ligada covalentemente com PEG, arginase não ligada covalentemente com PEG e arginase peguilada polimérica). Genericamente, o produto ainda necessita purificação porque ele compreende arginase que não está ligada covalentemente com PEG e arginase na forma polimérica. Meios comumente usados de técnica de purificação são conhecidos na técnica, incluindo a cromatografia de troca de cátions e filtração de fluxo tangencial.

[0044] A arginase peguilada da presente invenção tem uma meia- vida de pelo menos 0,5 dia; preferivelmente, a dita arginase tem uma meia-vida de pelo menos 2,5 dias; e mais preferivelmente a dita arginase tem uma meia-vida de pelo menos 3,5 dias no sangue ou soro. A meia-vida da arginase pode ser medida com o processo conhecido e comumente usado na técnica. Há certa relação entre os dados medidos para a meia - vida de arginase no sangue ou soro e o modelo animal usado. Os dados de meia-vida obtidos em um animal com maior taxa metabólica (por exemplo, rato) são genericamente menores que aqueles com menor taxa metabólica (por exemplo, humanos).

[0045] A presente invenção provê um processo para a preparação de uma arginase peguilada. A dita peguilação é obtida através de conjugação de molécula de PEG com o resíduo de aminoácido da arginase. Na arginase peguilada da presente invenção, cada molécula de arginase está ligada com moléculas de PEG para formar a arginase peguilada.

[0046] Na presente invenção, peguilação direcionada de sítio é obtida através de modificação química, onde a dita modificação é realizada através de conjugação covalente de grupos sobre a arginase com reagentes PEG. A dita modificação química pode ser específica, ou seja, a molécula de PEG conjuga somente com específico resíduo de aminoácido da arginase usando reagentes que se ligam com grupo específico.

[0047] A presente invenção também provê a aplicação/uso da arginase ou a arginase peguilada mencionadas acima ou a composição farmacêutica contendo as mesmas no tratamento de uma doença relacionada com arginase. As ditas doenças relacionadas com arginase conhecidas no campo incluem condições/doença/distúrbios relacionados com nível de arginina no corpo de mamíferos. Tais condições/doença/distúrbios incluem hiperargininemia. Devido a deficiência de arginase, a arginina no corpo de um sujeito não pode ser degradada em ureia e participar no ciclo de metabolismo de ornitina, de modo que o nível de arginina no sangue pode ser 7 a 10 vezes maior que o valor no sangue normal, ao mesmo tempo em que o nível de arginina no fluido cérebro - espinhal e urina e excreção de ureia de creatinina também são aumentadas. Além disso, as ditas condições/doença/distúrbios incluem hiperplasia ou tumor dependente de arginina. Através de estudo de efeito sobre crescimento de célula, foi verificado que com remoção de arginina, as células normais na fase G0 de ciclo de célula podem entrar em um estado de repouso e permanecerem

[0048] viáveis por várias semanas sem dano significante; quando a concentração de arginina retornou para nível normal, as células podem retornar para ciclo de célula normal. Células em proliferação ou tumores, entretanto, podem proceder depois do ponto ‘R’ da fase G1 do ciclo de célula para entrarem na fase S na privação de arginina, e logo sofrerem apoptose. A apoptose de células de hiperplasia ou células de tumor como um resultado de deficiência de arginina é irreversível. Por isso, cientistas começam a considerar tratamento de hiperplasia ou tumor através de controle de nível de arginina no corpo.

[0049] A presente invenção também provê uma composição farmacêutica, onde o ingrediente ativo da dita composição farmacêutica da presente invenção é a arginase ou a arginase peguilada como descrita acima. A formulação de dita composição farmacêutica pode estar na forma de sólido, soluções, emulsões, dispersões, micelas, lipossomas, onde a formulação contém uma ou mais da arginase ou arginase peguilada humana da presente invenção como ingrediente ativo e misturada com carreador ou excipiente orgânico ou inorgânico apropriado para aplicações parenterais. Além disso, adjuvantes, estabilizadores, espessantes, agentes corantes e perfumes podem ser incluídos.

[0050] Uma ou mais arginases ou arginases peguiladas humanas isoladas e substancialmente puras da presente invenção são compreendidas como ingrediente ativo em uma quantidade suficiente para produzir o desejado efeito sobre as condições ou doenças. As composições farmacêuticas podem ser formuladas em formas apropriadas para administração oral, tais como comprimidos, pílulas, losangos, suspensões baseadas em óleo ou hidratação, pulverizados ou grânulos dispersos, emulsões, cápsulas duras e moles, ou xaropes. Formulações para administração oral podem ser encapsuladas de acordo com técnicas conhecidas para diminuir a decomposição e absorção no trato gastrointestinal, pelo que provendo efeitos sustentados por um maior tempo. A formulação também pode ser uma forma de suspensão ou solução injetável estéril. A dita suspensão pode ser preparada de acordo com processos conhecidos na técnica através de uso de agentes de dispersão ou umectantes e agentes de suspensão.

[0051] A composição farmacêutica da presente invenção ainda pode ser formulada em uma forma sólida, líquida, suspensão, micela ou lipossoma. Em um aspecto da presente invenção, a composição farmacêutica é formulada em uma forma oral ou injetável.

Breve Descrição dos Desenhos

[0052] A Figura 1 mostra a sequência de nucleotídeos de arginase I tipo selvagem.

[0053] A Figura 2 mostra análise de eletroforese de gel de poliacrilamida - SDS de arginase I humana sob condição redutora.

[0054] A Figura 3 mostra a expressão de arginase humana através de análise de cromatografia líquida de alta pressão.

[0055] A Figura 4 mostra os resultados de testes de arginase I mutante e tipo selvagem com eletroforese de gel de poliacrilamida - SDS redutora e não-redutora.

[0056] A Figura 5 mostra análise de eletroforese de gel de poliacrilamida - SDS de arginase I mutante purificada (rhArgI-A303, rhArgI-A168/303 e rhArgI-A45/303) sob condições redutoras e não- redutoras.

[0057] A Figura 6 mostra análises de eletroforese de gel de poliacrilamida - SDS de arginase I mutante purificada (rhArgI-A45/168 e rhArgI-A45/168/303) sob condições redutoras e não-redutoras.

[0058] A Figura 6a mostra análises de eletroforese de gel de poliacrilamida - SDS não-redutoras de arginase I mutante purificada (rhArgI-A45/168 e rhArgI-A45/168/303).

[0059] A Figura 6b mostra análises de eletroforese de gel de poliacrilamida - SDS redutora de arginase I mutante purificada (rhArgI- A45/168 and rhArgI-A45/168/303).

[0060] A Figura 7 mostra análise de eletroforese de gel de poliacrilamida - SDS não-redutora de arginase I humana peguilada.

[0061] A Figura 8 mostra análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada.

[0062] A Figura 8a mostra análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada A168/303-Y40K.

[0063] A Figura 8b mostra análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada: A45/303-Y40K.

[0064] A Figura 8c mostra análise de espectrometria de massa de aginase I peguilada: RP-V-J5K.

[0065] A Figura 8d mostra análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada: RP-M2-J5K.

[0066] A Figura 8e mostra análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada: RP-M3-J5K.

[0067] A Figura 8f mostra análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada:RP-M4-J5K.

[0068] A Figura 8g mostra analise de espectrometria de massa de arginase I peguilada: RP-M7-J5K.

[0069] A Figura 9 mostra as figuras consolidadas de análise de espectrometria de massa de arginase peguilada.

Descrição Detalhada de Realizações Preferidas da Invenção

[0070] Esta invenção ainda será ilustrada usando as realizações descritas abaixo. Deve ser entendido que embora estas realizações ilustrem as realizações preferidas da presente invenção, elas são somente dadas por meio de amostras ilustradas. Com referência à descrição e realizações acima, aqueles versados na técnica podem determinar as características essenciais da invenção, mudar e modificar a invenção em várias maneiras em adaptação para outros usos e condições sem se desviar do espírito e escopo da invenção. Por isso, outras que não aquelas aqui mostradas e descritas, de acordo com anterior, quaisquer mudanças/modificações feitas para esta invenção serão aparentes para aqueles versados na técnica e estas modificações também são pretendidas formarem parte do escopo das reivindicações apostas.

Exemplo 1: Expressão e construção de plasmídeo pET30a (+)- rharginase de arginase I humana recombinante livre de tag-His

[0071] Sequência gene arginase I humana foi publicada em 1987 (Haraguchi. Y. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, 84, 412-415). Gene arginase humana foi amplificado por reação de cadeia polimerase (PCR) usando biblioteca de cDNA plus estiramento 5’ de fígado humano (Clontech) como molde e iniciadores ARG-V (+) e ARG-V (-) projetados de acordo com a sequência de arginase I mencionada anteriormente. Iniciador ARG-V (+) contém um sítio de endonuclease de restrição NdeI, e um iniciador ARG-V (-) contém um sítio de endonuclease de restrição XhoI. Usando técnicas comuns de laboratório de biologia molecular, produto de PCR de arginase I humana foi obtido e confirmado através de eletroforese de gel ágarose. O produto de PCR de arginase I humana amplificado e vetor de expressão comercialmente disponível pET30a (+) foram digeridos com endonucleases de restrição, NdeI e XhoI (Promega) separadamente a 37oC por 1,5 horas. Os fragmentos digeridos foram ligados por toda noite a 16oC por T4 DNA ligase, e o resultante plasmídeo recombinante ligado foi transformado em células competentes de E. coli DH5α. As células transformadas foram selecionadas através de revestimento e cultura sobre uma placa de ágar LB contendo canamicina (30 μg/mL). Plasmídeos contendo a inserção correta foram identificados através de ensaio de digestão com endonuclease de restrição. O correto plasmídeo de expressão de arginase I humana recombinante, a seguir conhecido como pET30a (+)- rharginase-V, foi analisado por sequenciamento para assegurar a sequência correta e inserção de gene arginase I humana. O tamanho de inserção é de 969 pares de bases em comprimento. Como mostrado na Figura 1, ela tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2. ARG-V(+) (SEQ ID NO: 3): 5' GGAATTCCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATAG 3' NdeI ARG-V(-) (SEQ ID NO: 4): 5' CCGCTCGAGTTATTACTTAGGTGGGTTAAGGTAGTCAATAGG 3' XhoI

Exemplo 2: Expressão de plasmídeo DNA pET30aa (+)-rharginase-V de arginase I humana recombinante livre de tag-His e purificação de proteína alvo

[0072] Cem microlitros de células BL21(DE3) competentes foram descongelados sobre gelo. Um microlitro de plasmídeo recombinante pET30a (+)-V foi adicionado às células competentes e incubados sobre gelo por 30 minutos. A mistura foi então tratada com choque térmico em um banho de água a 42oC por 90 s seguido por ainda incubação sobre gelo por 2 minutos. Quinhentos microlitros de caldo LB foram adicionados às células transformadas e cultivadas - agitadas a 37oC, 150 rpm por 1 hora. Após incubação, 200 microlitros da suspensão de células transformadas foram revestidos e espalhados sobre uma placa de ágar LB canamicina, que foi então incubada de cabeça para baixo em uma incubadora a 37oC por 16 horas.

[0073] Colônias simples transformadas com plasmídeo recombinante foram selecionadas, transferidas em 25 mL de caldo LB e cultivadas - agitadas a 37oC, 150 rpm até a densidade ótica em 600 nm (OD600nm) atingir 0,6-0,8. Uma concentração final de IPTG 0,2 mM foi adicionada à cultura para induzir expressão de proteína alvo por 3 horas. Expressão de proteína alvo dos clones selecionados foi analisada usando eletroforese de gel de poliacrilamida - SDS (SDS - PAGE). Os clones com maior expressão de proteína foram estocados em estoque de glicerol como bactérias engenheiradas.

[0074] As células de bactérias engenheiradas foram alimentadas - cultivadas em batelada em um fermentador de 15 L. Quando OD600nm atinge 12-13, uma concentração final de IPTG de 0,2 mM foi adicionada na cultura para induzir expressão de proteína alvo por 3-4 h. Células de bactérias induzidas foram coletadas e lisadas. O lisado de células foi centrifugado e o sobrenadante foi coletado para subsequente separação e purificação de proteína alvo.

[0075] Purificação de proteína alvo foi realizada usando cromatografia líquida de cátion CM. Tris-HCl foi usado para equilibrar a coluna antes de carga de amostra. O sobrenadante lisado de células bacterianas foi carregado na coluna, seguido por lavagem com três volumes de coluna de tampão de equilíbrio para remover impurezas associadas fracamente ou ligadas não-especificamente. Quando a leitura de UV280nm estabilizou, a proteína alvo foi eluída usando um tampão de eluição contendo Tris-HCl e NaCl. Os picos de proteínas eluídas da coluna foram coletados e analisados por SDS-PAGE e cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

[0076] Resultados experimentais foram ilustrados em Figuras 2 e 3.

[0077] A Figura 2 mostra o resultado de análise SDS-PAGE de nível de expressão de arginase I humana. As amostras em cada faixa são como se seguem: padrão de peso molecular de proteína; 2. sobrenadante de lisado de bactérias; 3. arginase I humana livre de tag-His; 4. fluxo através de coluna de troca de cátions CM.

[0078] A Figura 3 mostra o resultado de análise de HPLC de arginase I humana purificada.

[0079] Como mostrado em Figuras 2 e 3, a pureza de arginase obtida via o procedimento de cromatografia acima é de mais que 90%.

Exemplo 3: Mutagênese de sítio direcionado de arginase I humana (rhArgI)

[0080] Mutações de sítio direcionado foram introduzidas em posições 45, 168 e 303 de sequência de aminoácidos de arginase I humana usando QuickChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene). Plasmídeo recombinante pET30a-rharginase I-V contendo arginase humana tipo selvagem foi usado como molde. Códons que codificam cisteína (TGT) em posições 45, 168 e 303 sofreram independentemente mutação para códons que codificam alanina (GCT), resultando em mutações de sítio simples, duplas ou triplas. Os iniciadores pretendidos para introdução de códon GCT de substituição em posições 45, 168, e 303 sofreram independentemente mutação para códons que codificam alanina (GCT), resultando em mutações de sítio simples, duplo ou triplo. Os iniciadores pretendidos para introduzirem o códon de substituição GCT em posições 45, 168, e 303 de arginase I humana são mostrados abaixo. ARG-m45(+) (SEQ ID NO: 5): 5' GAGAAACTTAAAGAACAAGAGGCTGATGTGAAGGATTATGGGG 3' ARG-m45(-) (SEQ ID NO: 6): 5' CCCCATAATCCTTCACATCAGCCTCTTGTTCTTTAAGTTTCTC 3' ARG-m168(+) (SEQ ID NO: 7): 5' GATTCTCCTGGGTGACTCCCGCTATATCTGCCAAGGATATTG 3' ARG-m168(-) (SEQ ID NO: 8): 5' CAATATCCTTGGCAGATATAGCGGGAGTCACCCAGGAGAATC 3' ARG-m303(+) (SEQ ID NO: 9): 5' GTTGCAATAACCTTGGCTGCTTTCGGACTTGCTCGGG 3' ARG-m303(-) (SEQ ID NO: 10): 5' CCCGAGCAAGTCCGAAAGCAGCCAAGGTTATTGCAAC 3'

[0081] PCR foi conduzida de acordo com as instruções providas no kit de mutagênese. Molde DNA parente sem mutação foi digerido com endonuclease de restrição DpnI. Os plasmídeos que sofreram mutação foram então transformados em células competentes e confirmados por sequenciamento. Clones que foram transformados com o plasmídeo de arginase mutante contendo a mutação de códon codificando cisteína (TGT) para códon codificando alanina (GCT) foram selecionados e expandidos em caldo de cultura LB. Plasmídeos mutantes alvos foram isolados usando Wizard Plus mini prep kit.

[0082] Arginase I humana mutante com mutação simples de cisteína para alanina em posição de aminoácido 303, 168 ou 45 foi representada como rhArgI-A303, rhArgI-A168 ou rhArgI-A45, respectivamente. Arginase I humana mutante com mutações duplas de cisteína para alanina em posições de aminoácidos 168 e 303, em posições de aminoácidos 45 e 303 e em posições de aminoácidos 45 e 168 foram representadas como rhArgI-A168/303, rhArgI-A45/303 e rhArgI-A45/168, respectivamente. Arginase I humana mutante com três mutações cisteína para alanina em posições de aminoácidos 45, 168 e 303 foi representada como rhArgI-A45/168/303. Plasmídeos contendo as inserções mutantes de arginase acima foram representados como pET30a(+)-rhArgI-A303, pET30a(+)-rhArgI- A168, pET30a(+)-rhArgI-A45, pET30a(+)-rhArgI-A168/303, pET30a(+)-rhArgI- A45/303, pET30a (+)-rhArgI-A45/168 ou pET30a(+)-rhArgI- A45/168/303.

[0083] Cem microlitros de células BL21(DE3) competentes foram descongelados sobre gelo. Um microlitro da construção mutante foi adicionado às células competentes BL21(DE3) e incubadas sobre gelo por 30 minutos. A mistura foi então tratada com choque térmico a 42oC por 90 s, seguido por ainda incubação sobre gelo por 2 minutos. Quinhentos microlitros de caldo LB foram adicionados às células transformadas e cultivadas - agitadas a 37oC, 150 rpm por 1 hora. Após incubação, 200 microlitros da suspensão de células transformadas foram revestidos e espalhados sobre uma placa de ágar LB canamicina e incubada de cabeça para baixo a 37oC por 16 horas.

[0084] Colônia simples transformada com plasmídeo recombinante foi selecionada, transferida em 25 mL de caldo LB, e cultivada - agitada a 37oC, 150 rpm, até a densidade ótica em 600 nm (OD600nm) atingir 0,6-0,8. Uma concentração final de 0,2 mM de IPTG foi adicionada à cultura para induzir expressão de proteína alvo por 3 horas. Expressão de proteína alvo nos clones selecionados foi analisada usando SDS- PAGE. Os clones com maior expressão de proteína foram estocados em estoque de glicerol como bactérias engenheiradas.

Exemplo 4: Expressão e purificação de proteína de arginase I que sofreu mutação específica de sítio

[0085] Células de E. coli engenheiradas transformadas com plasmídeos arginase I mutante (rhArgI) (pET30a(+)-rhArgI-A303, pET30a (+)-rhArgI-A168, pET30a(+)-rhArgI-A45, pET30a(+)-rhArgI- A168/303, pET30a(+)-rhArgI- A45/303, pET30a(+)-rhArgI-A45/168 oupET30a(+)-rhArgI-A45/168/303) foram cultivada batelada - alimentadas em um fermentador de 15 L. Quando OD600nm atingiu 1213, uma concentração final de 0,2 mM de IPTG foi adicionada à cultura para induzir expressão de proteína alvo por 3-4 horas. As células bacterianas foram coletadas e lisadas O lisado de células foi centrifugado e o sobrenadante foi coletado para subsequente isolamento e purificação de proteína.

[0086] Purificação de proteína alvo foi realizada usando coluna de troca de cátions CM. Tris-HCl foi usado para equilibrar a coluna antes de carga de amostra. O sobrenadante de lisado de células bacterianas foi carregado na coluna, seguido por lavagem com três vezes o volume de coluna de tampão de equilíbrio para remover impurezas fracamente associadas ou ligadas não-especificamente. Quando a leitura de UV280nm estabilizou, proteína alvo foi eluída usando um tampão de eluição contendo Tris-HCl e NaCl. Os picos de proteínas eluídas da coluna foram coletados para obter arginase I mutante rhArgI-A303, rhArgI-A168, rhArgI-A45, rhArgI-A168/303, rhArgI-A45/303, rhArgI- A45/168 e rhArgI-A45/168/303.

[0087] Pureza das amostras de proteínas coletadas foi analisada por SDS-PAGE e HPLC. Usando o procedimento de cromatografia acima, a pureza de arginase foi determinada ser mais de 90%.

Exemplo 5: Atividade de arginase I mutante específica de sítio (rhArgI)

[0088] A atividade de arginase foi determinada através de um ensaio espectrofotométrico acoplado com urease e glutamato desidrogenase, que é mostrado através de diagrama esquemático abaixo. NADPH tem absorbância ótima no comprimento de onda de 340 nm. Quando NADPH é oxidada a NADP+, a absorbância em 340 nm diminui. A atividade de arginase pode ser correlacionada e determinada através de monitoração de diminuição em absorbância em 340 nm junto com o coeficiente de extinção molar de NADPH (ΔE340 = 6220 M-1 cm- 1).

[0089] Uma unidade (U) de atividade arginase foi definida como a liberação de 1 μmol de ureia sob a condição de 30oC, pH 8,3.

[0090] Atividade específica de arginase foi calculada usando a seguinte equação: Atividade Específica (U/mg) = [(ΔA/Δt) x (1/ε) x 106 x (1/2)]/[E] ΔA = Diferenças em absorbâncias em 340 nmnm ε = constante Michaelis - Menten (Km) NADPH (6220M-1cm-1) [E] = concentração de enzima na mistura de reação (mg/mL)

[0091] Usando o ensaio acima, as atividades específicas de várias arginases I (rhArgI-A303, rhArgI-A168/303, rhArgI-A45/303, rhArgI- A45/168 and rhArgI-A45/168/303) foram determinadas serem 747 +/- 63 U/mg, 814 +/- 91 U/mg, 786 +/- 58 U/mg, 782 +/- 19 U/mg, e 759 +/- 68, respectivamente. A atividade específica de arginase I humana tipo selvagem foi determinada ser 491 +/- 42 U/mg, demonstrando um significante aumento de atividade arginase após as cisteínas aminoácidos não-polares em posições 168/303, 45/303, 45/168 e 45/168/303 sofrerem mutação para aminoácidos não-polares alaninas.

Exemplo 6: Análise SDS-PAGE de arginase I tipo selvagem e mutante (rhArgI)

[0092] O gel de poliacrilamida foi preparado usando processo tradicional. Amostras foram tratadas sob condição redutora (isto é, beta-mercapto etanol foi incluído no tampão de carga de amostra para destruir ligações dissulfeto inter e intra moleculares) ou não-redutora antes de análise para decifrar a formação de ponte dissulfeto intramolecular de arginase I tipo selvagem e vários mutantes usando eletroforese de gel poliacrilamida 12% (Figura 4, 5, 6A, 6B).

[0093] A Figura 4 mostra o resultado de análise SDS-PAGE de arginase I tipo selvagem após tratamento sob condições redutoras e não-redutoras. As amostras nas faixas são como se segue: Faixas 1 e 3: sobrenadante de lisado de células bacterianas; Faixa 2: arginase livre de tag-His purificada (não-redutora); M: padrão de peso molecular de proteína; Faixa 4: arginase I humana livre de tag-His (redutora).

[0094] A Figura 5 mostra o resultado de análise SDS-PAGE de arginase I mutante purificada (rhArgI-A303, rhArgI-A168/303 e rhArgI- A45/303) sob condições redutoras e não-redutoras. As amostras em cada faixa são como se segue: Faixa 1: arginase I mutante, rhArhI-A303 (não-redutora); Faixa 2: arginase I mutante, rhArgI-A168/303 (não- redutora); Faixa 3: arginase I mutante, rhArgI-A45/303 (não-redutora); M: padrão de peso molecular de proteína; Faixa 4: arginase I mutante, rhArgI-A303 (redutora); Faixa 5: arginase I mutante, rhArgI-A168/303 (redutora); Faixa 6: arginase I mutante, rhArgI-A45/303 (redutora).

[0095] A Figura 6a mostra o resultado de análise SDS-PAGE de arginase I mutante purificada (rhArgI-A45/168 e rhArgI-A45/168/303) sob condição não-redutora. As amostras em cada faixa são como se segue: M: padrão de peso molecular de proteína; Faixa 1: arginase I mutante, rhArgI-A45/168/303; Faixa 2: arginase I mutante, rhArgI- A45/168.

[0096] A Figura 6b mostra o resultado de análise SDS-PAGE de arginase I mutante purificada (rhArgI-A45/168 e rhArgI-A45/168/303) sob condição redutora. As amostras em cada faixa são como se segue: M: padrão de peso molecular de proteína; Faixa 1: arginase I mutante, rhArgI-A45/168/303; Faixa 2: arginase I mutante, rhArgI-A45/168.

[0097] Como revelado a partir das análises SDS-PAGE de arginase I sob condições redutoras e não-redutoras, arginase I humana tipo selvagem tem outras conformações sob as condições experimentais estabelecidas desta invenção. Sob tal condição, quando cisteína na posição 303 sofreu mutação para alanina, outras conformações também estiveram presentes. Entretanto, quando quaisquer dois (rhArgI-A168/303, rhArgI-A45/303, ou rhArgI-A45/168) ou todos os três resíduos cisteína em posições de aminoácidos 45, 168 e 303 sofreram mutação para alanina, somente uma conformação foi detectada sob condição não-redutora (Figura 5 e Figura 6A). Não sendo limitado por quaisquer teorias conhecidas, o inventor acredita que a presença de múltiplas conformações para a arginase I humana tipo selvagem em SDS-PAGE não-redutor é provavelmente devida à formação de ligação dissulfeto intramolecular que é contribuída por cisteínas 45, 168 e 303 sob certas condições. Quando somente cisteína 303 sofreu mutação para alanina, tal conformação de arginase I mutante também pode ser detectada por SDS-PAGE sob condição não-redutora possivelmente devido à formação de ligações dissulfeto intramoleculares entre cisteínas 45 e 168 que não sofreram mutação. Quando tanto duas como todos os três resíduos cisteína em posições 45, 168 e 303 sofreram mutação (rhArgI-A168/303, rhArgI- A45/303, rhArgI-A45/168 ou rhArgI-A45/168/303) todas as possibilidades de formação de ligação dissulfeto foram abolidas, resultando em somente uma conformação sendo detectada na análise SDS-PAGE.

Exemplo 7: Peguilação de arginase | mutante (rhArgI) e purificação de proteína peguilada

[0098] Peguilação usando metóxi polietileno glicol maleimida (mPEG-MAL 40000).

[0099] Mutantes arginase I específicos de sítio (rhArgI-A303, rhArgI- A168/303 ou rhArgI-A45/303) foram misturados separadamente com metóxi polietileno glicol maleimida em uma faixa de razão molar de 1:5 - 1:10 em tampão PBS 20 mM (pH 7,0). A dita metóxi polietileno glicol maleimida foi ramificada com forma de Y, consistindo em duas cadeias polietileno glicol com um peso molecular de 40 kDa. A reação de peguilação foi realizada em temperatura ambiente por 2-4 horas. No final da reação, os produtos finais foram estocados em um refrigerador a 4oC.

[00100] Arginase I humana peguilada específica de sítio foi isolada e purificada usando coluna de troca de cátions Macro SP matriz para remover proteínas e PEGs não-reagidos residuais. Tampão fosfato e tampão fosfato contendo NaCl (1M) foram usados como tampão de equilíbrio e eluição, respectivamente. Antes de carga de amostra, amostras de proteína peguilada foram diluídas com água destilada até a condutividade elétrica de amostra ser idêntica àquela do tampão de equilíbrio; e a coluna foi equilibrada com cinco vezes o volume de coluna de tampão de equilíbrio. Após carga de amostra, a coluna foi ainda lavada com cinco vezes volume de coluna de tampão de equilíbrio e eluída com tampão de eluição 35%. O eluente contendo picos de proteína foi coletado e sais retirados usando coluna G25. Proteínas alvos foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE.

[00101] Peguilação de proteína usando metóxi polietileno glicol propionato de succinimidila (mPEG-SPA 5000) e purificação de proteína peguilada.

[00102] Modificação de peguilação de arginase I tipo selvagem e mutante específica de vários sítios (rhArgI-A303/168, rhArgI-A303/45, rhArgI-A45/168, e rhArgI-A45/168/303) foi conduzida. As condições de reação foram como se seguem: arginase I tipo selvagem ou várias mutações específicas de sítio, na concentração de proteína de 8 mg/mL, foi misturada separadamente com metóxi polietileno glicol propionato de succinimidila (mPEG-SPA 5000) na faixa de razão molar de 1:20-1:30 em tampão PBS 20 mM (pH 8,5-9,0) por 2 horas em temperatura ambiente. Os produtos finais foram estocados em um refrigerador a 4oC.

[00103] Os produtos peguilados acima foram purificados por ultrafiltração com membrana de ultrafiltraçãode 100 KDa para remoção de metóxi (poli(etileno glicol) propionato de succinimidila não-reagido. Os produtos de peguilação foram misturados com tampão PBS 10 mM (pH 7,5) em uma razão de volume 1:1 e ultrafiltrados para o volume original. O processo foi repetido 15 vezes e proteínas alvos foram coletadas e analisadas por eletroforese.

[00104] SDS-PAGE e análise atividade enzimática de arginase I humana peguilada

[00105] A arginase I peguilada mPEG-MAL-40K purificada e arginase I peguilada mPEG-SPA-5K foram resolvidas e analisadas por SDS-PAGE 8%.

[00106] Os resultados são mostrados na Figura 7.

[00107] Figura 7: Análise SDS-PAGE de arginase I peguilada. As amostras em cada faixa são como se segue: M: padrão de peso molecular de proteína; RP-V-J5K: arginase I tipo selvagem recombinante foi reagida com metóxi poli etileno glicol propionato de succinimidila (mPEG-SPA 5000). A arginase I humana peguilada (RP-M2-J5K) foi purificada usando membrana de ultrafiltração de 100 kDa e a pureza é de mais que 95%.

[00108] RP-M3-J5K: arginase I que sofreu mutação específica de sítio (rhArgI-A45/303) foi reagida com succinimidil propionato de metóxi polietileno glicol (mPEG-SPA 5000). A arginase I humana peguilada (RP-M3-J5K) foi purificada usando membrana de ultrafiltração de 100 kDa e a pureza é de mais que 95%.

[00109] RP-M4-J5K: arginase I que sofreu mutação específica de sítio (rhArgI-A45/168/303) foi reagida com metóxi polietileno glicol propionato de succinimidila (mPEG_SPA 5000). A arginase I humana peguilada (RP-M4-J5K) foi purificada usando membrana de ultrafiltração de 100 kDa e a pureza é de mais que 95%.

[00110] RP-M7-J5K: arginase I que sofreu mutação específica de sítio (rhArgI-A45/168) foi reagida com succinimidil propionato de metóxi polietileno glicol (mPEG-SPA 5000). A arginase I humana peguilada (RP-M7-J5K) foi purificada usando membrana de ultrafiltração de m100 kDa e a pureza é de mais que 95%.

[00111] A168/303-Y40K: arginase I que sofreu mutação específica de sítio (rhArgI-A168/303) foi reagida com polietileno glicol maleimida ramificada com forma de Y de 40K (Y-MAL-40K). Arginase I humana peguilada foi purificada por coluna de troca de cátions Macrocap SP matriz; A proteína arginase I peguilada conjugada com uma cadeia PEG Y-MAL-40K em cisteína 45 (A168/303-Y40K) totaliza mais que 85% dos produtos de reação totais.

[00112] A45/303-Y40K: arginase I que sofreu mutação específica de sítio (rhArgI-A45/303) foi reagida com polietilenoglicol maleimida ramificada com forma de Y de 40K (Y-MAL-40K). Arginase I humana peguilada foi purificada por coluna de troca de cátions Macrocap SP matrix. A proteína arginase I peguilada conjugada com uma cadeia PEG Y-MAL-40K em cisteína 168 (A45/303-Y40K) totaliza mais que 85% dos produtos de reação totais.

[00113] Usando o ensaio espectrofotométrico acoplado previamente descrito, a atividade de diferentes arginases I humanas peguiladas foi medida e determinada através de mudanças em absorbância de NADPH. Os resultados de testes mostraram que os produtos peguilados preservaram a atividade arginase, onde as específicas atividades de A168/303-Y40K e A45/303- Y40K foram 551 ± 68 U/mg e 595 ± 41 U/mg respectivamente, enquanto as atividades específicas de RP-M2-J5K, RP-M3-J5K, RP-M4-J5K e RP-M7-J5K foram 726 ± 66 U/mg, 747 ± 72 U/mg, 712 ± 69 U/mg, e 838 ± 8 U/mg respectivamente. A atividade específica de arginase I humana tipo selvagem peguilada (RP-V-J5K) foi determinada ser 537 +/- 55 U/mg.

[00114] Análise de distribuição de massa molecular de arginase I humana peguilada

[00115] Arginase I humana peguilada em diferentes sítios usando diferentes processos de peguilação foi analisada através de espectrometria de massa de tempo de vôo de dessorção/ionização de laser auxiliada - matriz (MALDI-TOF-MS) para determinar a distribuição de massa molecular das amostras de testes. Todos os experimentos foram realizados em um sistema Bruker Daltonics autoflex TOF/TOF baseado em tempo de vôo e equipado com um laser de nitrogênio para dessorver e ionizar as amostras. O instrumento foi operado no modo linear íon - positivo com um potencial de aceleração de +20 kV.

[00116] Resultados experimentais foram mostrados em Figuras 8 e 9.

[00117] A Fig. 8a mostra os resultados da análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada, A168/303-Y40K, mostrando que o peso molecular de A168/303-Y40K é de aproximadamente 77 kDa.

[00118] A Fig. 8b mostra os resultados da análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada, A45/303-Y40K, mostrando o peso molecular de A45/303-Y40K sendo aproximadamente de 77 kDa.

[00119] A Fig. 8c mostra os resultados de análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada, RP-V-J5K.

[00120] A Fig. 8d mostra os resultados da análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada, RP-M2-J5K.

[00121] A Fig. 8e mostra os resultados da análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada, RP-M3-J5K.

[00122] A Fig. 8f mostra os resultados de análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada, RP-M4-J5K.

[00123] A Fig. 8g mostra os resultados da análise de espectrometria de massa de arginase I peguilada, RP-M7-J5K.

[00124] A Fig. 9 mostra as figuras consolidadas de arginase I peguilada, RP-V-J5K, RP-M2-J5K, RP-M3-J5K, RP-M4-J5K, e RP-M7- J5K, mostrando que peguilação de arginase I usando mPEG-SPA 5000 produz produtos com faixa de peso molecular entre 65 e 95 kDa, isto é, cada molécula de arginase I conjugada com 6-12 moléculas de PEG, cada uma com um peso molecular de 5000.

[00125] Exemplo 8: análise fármaco - cinética e fármaco - dinâmica in vivo de arginase I humana peguilada específica de sítio

[00126] Perfis fármaco - cinéticos e fármaco - dinâmicos de diferentes arginases I humanas peguiladas foram avaliados após administração intravenosa simples para ratos Sprague Dawley em uma dosagem de 3 mg/kg. Estes estudos foram conduzidos por Pharmalegacy Laboratories Limited (Shanghai). Amostras de sangue foram coletadas pré-dose, 2 minutos, 1 hora, 4 horas, 24 horas, 72 horas, 120 horas, 168 horas e 240 horas após dosagem para análises de arginase e arginina em soro. Aproximadamente 0,4 mL de amostras de soro foram coletados em cada ponto de tempo a partir de veia orbital após anestesia através de isoflurano e transferidos para um tubo de centrífuga de 2 mL. Amostras foram colocadas em temperatura ambiente por 30 minutos até centrifugação em 4000 g por 15 minutos a 4oC.

[00127] Concentrações de arginase I em soro foram determinadas através de um ensaio imuno de sanduíche de enzima quantitativo com kits providos por Shanghai ExCell Biology, Inc. Anticorpo monoclonal arginase I anti-humana foi revestido sobre a superfície das cavidades da placa de ELISA. Amostras ou padrões de proteínas de arginase I humana foram adicionados separadamente nas cavidades da placa ELISA (100 microlitros/cavidade), que foi então coberta com uma fita selante e incubada a 37oC por 90 minutos para permitir formação de imuno complexo entre anticorpo monoclonal e arginase I humana. Após incubação, a placa foi lavada cinco vezes e anticorpos policlonais de Coelho anti-arginase I humana (100 microlitros/cavidade) foram adicionados às cavidades. Ela foi coberta novamente com fita selante e ainda incubada a 37oC por 60 minutos. Após a segunda incubação, a placa foi novamente lavada por cinco vezes, IgG de cabra anti-coelho conjugado-HRP (100 microlitros/cavidade) foi adicionada a cada cavidade e co-incubada por 30 minutos. Após outras lavagens por cinco vezes, substrato cromogênico foi adicionado nas cavidades e incubado no escuro por 10-15 minutos. Solução de interrupção foi adicionada a cada cavidade e bem misturada. A densidade ótica em 450 nm foi medida dentro de 10 minutos após adição de solução de interrupção. A curva padrão foi gerada usando processo de adaptação quadrática para equação de regressão e a concentração de arginase I de cada amostra foi calculada usando o valor OD medido. Os parâmetros PK foram derivados usando WinnoLin com um processo de ensaio não- compartimentai. Os valores de meia - vida (T1/2) de várias formas de arginase I humana peguilada específica para sítio, A168/303-Y40K, A45/303-Y40K, RP-M2-J5K, RP-M3-J5K, RP-M4-J5K e RP-M7-J5K foram determinados serem 27,2 ± 3,8h, 15,1 ± 0,6h, 40,7 ± 13,2h, 53,5 ± 14,2h, 59,5 ± 9,9h, e 50,5 ± 13,0h respectivamente. A meia- vida (T1/2) de arginase I humana tipo selvagem peguilada, RP-V-J5K, foi determinada ser 43,8 +/- 4,4 h. Tabela 1: Os parâmetros fármaco - cinéticos (media +/- desvio padrão; n = 6) de administração de dose única de arginase I humana peguilada em rato

[00128] Concentração de arginina em soro foi medida usando HPLC - Espectrometria de Massa (Agilent 1200 HPLC acoplado com API 4000 triple - quadrupole MS). Uma alíquota de soro de rato foi diluída com 490 microlitros de água deionizada. Acetonitrila (380 microlitros) foi adicionada e misturada com 20 microlitros de amostra de soro diluída. A mistura foi centrifugada em 14 000 rpm por 14 minutos e o sobrenadante foi carregado e analisado por LC-MS/MS. A HPLC foi realizada usando coluna Venusil HILIC/VH951002-0 com TFA 0,1% como fase móvel A e acetonitrila 95% como fase móvel B em uma taxa de fluxo de 0,3 mL/minuto. Níveis de arginina em soro foram determinados antes de dosagem e 2 minutos, 1 hora, 4 horas, 24 horas, 72 horas, 120 horas, 168 horas e 240 horas após dosagem. Resultados mostraram que níveis de arginina no soro em todos os animais testados caíram para uma concentração abaixo de limite de detecção (0,5 μg/mL) dentro de uma estrutura de tempo muito curto (5 minutos) e mantiveram um nível de arginina sustentável baixo por certo tempo, embora os artigos testes fossem peguilados em diferentes maneiras. Após isto, nível de arginina em soro aumentou gradualmente, mas em diferentes taxas. Comparado aos grupos estudos tratados com RP-M2-J5K, RP- M3-J5K, RP-M4-J5K, ou RP-M7-J5K, nível de arginina em soro aumentou mais rápido nos grupos de estudos tratados 168/303-Y40K ou A45/303-Y40K. Em 72 horas após dosagem, o nível de arginina em retornou para 15%-20% do nível pré-dose em animais tratados com dose única de 168/303-Y40K ou A45/303-Y40K. Em 120 h após dosagem, o nível de arginina em soro quase retornou para o nível pré- dose em animais tratados com A45/303-Y40K. Embora o nível de arginina em soro de animais tratados com RP-M2-J5K, RP-M3-J5K , RP-M4-J5K ou RP-M7-J5K pode manter um nível baixo sustentável por um período de tempo maior. Em 72 horas após dosagem, a arginina em soro ainda se manteve em um nível menor que 5% do nível de pré-dose. [00129] Esta invenção usa mutagênese direcionada para sítio para realizar mutação de um, dois ou todos os três resíduos cisteína em posições 45, 168 e 303 de arginase I humana, para outros aminoácidos, particularmente alanina, para obter arginase humana com maior atividade específica. A arginase humana nesta invenção não contém qualquer sequência de proteína his-tag potencialmente imunogênica. Em adição, esta invenção provê uma arginase humana peguilada usando poli(etileno glicol) reativo com amina para modificar o N-terminal α-NH2 ou ε-NH2 de lisina de superfície. Tal modificação aumenta significantemente sua meia - vida em mamíferos, que pode ser tão longa como 40-60 horas em soros de ratos.

Claims (13)

1. Arginase, caracterizada pelo fato de que a dita arginase é arginase I humana consistindo em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; em que quaisquer duas ou todas as cisteínas nas posições 45, 168 e 303 ou a cisteína na posição 303 da dita SEQ ID NO: 1 é/são mutadas para alanina; em que a dita arginase apresenta atividade.

2. Arginase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita arginase apresenta uma atividade de pelo menos 500 U/mg.

3. Arginase peguilada que compreende a arginase como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita arginase é conjugada com polietileno glicol (PEG) através de modificação de peguilação.

4. Arginase peguilada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o peso molecular total da dita molécula de PEG conjugada com cada molécula da dita arginase peguilada é de 20-70K.

5. Arginase peguilada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de PEG apresenta um peso molecular médio de 2-40K.

6. Arginase peguilada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de PEG apresenta um peso molecular médio de 5K

7. Arginase peguilada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que quaisquer duas ou todas das ditas cisteínas nas posições 45, 168 e 303 ou a cisteína na posição 303 da dita SEQ ID NO: 1 é/são mutada para alanina.

8. Arginase peguilada de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de PEG conjugada com a dita molécula de arginase apresenta um peso molecular médio de 5K, e cada uma das ditas moléculas de arginase é conjugada com 6-12 moléculas de PEG.

9. Arginase peguilada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que cada uma das ditas moléculas de arginase peguilada é conjugada com 4-13 moléculas de PEG.

10. Arginase peguilada de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que cada uma das ditas moléculas de arginase peguilada está conjugada com 6-12 moléculas de PEG.

11. Arginase peguilada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a pureza da dita arginase peguilada está acima de 90%.

12. Composição farmacêutica para tratamento de uma doença relacionada com arginase, caracterizada pelo fato que compreende uma arginase peguilada como definida na reivindicação 3, em que a dita doença é selecionada de hiperargininemia e hiperplasia ou tumor dependente de arginina.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a dita hiperplasia ou tumor dependente de arginina é selecionado de câncer de fígado, melanoma, câncer de mama, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de próstata, linfoma ou leucemia.

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