CN1745847A - 用精氨酸酶治疗肝炎的药物组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用聚乙二醇修饰的人精氨酸I酶治疗肝炎的方法及其制药方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及药物组合物及其使用方法。具体地说,本发明涉及一种能够治疗肝炎的药物组合物。
背景技术
治疗肝炎的抗病毒药物有很多,目前多用以下几种:(1)干扰素:是一种广谱抗病毒剂,并不直接杀伤或抑制病毒,而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白,从而抑制乙肝、丙肝病毒复制,同时还可以增强自然杀伤细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力,从而起到免疫调节作用并增强抗病毒能力。(2)白细胞介素-2:即T细胞生长因子,具有调节免疫、抗病毒、抗肿瘤作用。(3)核苷类化合物:如阿昔洛韦是一种合成的无环嘌呤核苷类化合物,可抑制多种脱氧核糖核酸病毒的增殖。(4)阿糖腺苷类:体内、体外均证明对乙肝病毒有潜在的作用。经观察用药期间部分患者的脱氧核糖核酸聚合酶阴转,生化和肝组织异常也有好转。(5)其他:促肝细胞生长素、胸腺肽、抗乙肝核糖核酸、病毒唑、左旋咪唑、香菇多糖、强力宁及植物血凝素等。然而,以上药物的疗效仍未臻理想,且易引起不良副作用。
发明内容
因此,本发明的一个方面提供一种更有效的肝炎治疗药物。具体地说,本发明提供一种选择性降低患者体内精氨酸水平的药物来治疗肝炎。
本发明的另一个方面是提供一种可降解精氨酸的酶(即精氨酸降解酶)在制药方面的应用。在一个优选的实施方案中,本发明的精氨酸降解酶是精氨酸酶或精氨酸脱亚胺酶。在一个优选的实施方案中,本发明的精氨酸降解酶是一种分离的且基本上纯化的重组精氨酸酶。在一个更优选的实施方案中,本发明的精氨酸酶是人精氨酸酶I。在更优选的实施方案中,本发明的人精氨酸酶I基本上具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2基本上相同的核苷酸序列,其中,所述核苷酸序列编码具有与SEQ IDNO:3基本上相同的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中,本发明的重组精氨酸酶的纯度为80-100%。在更优选的实施方案中,本发明的重组精氨酸酶的纯度为90-100%。
在又一个实施方案中,本发明的精氨酸酶经修饰具有足够高的酶活性和稳定性以在患者体内保持3天的“足够的精氨酸剥夺”(adequatearginine deprivation,以下简称AAD)。一个优选的修饰方法是将本发明的精氨酸酶氨基末端连接6个组氨酸。另一个优选的修饰为聚乙二醇化(pegylation)以提高所述酶的稳定性使患者发生的免疫反应性最小。在更优选的实施方案中,本发明的聚乙二醇化包括透过一个偶联剂将精氨酸酶与至少一个聚乙二醇组份共价结合。在最优选的实施方案中,偶联剂是2,4,6-三氯-s-三嗪(三聚氰氯,CC)或琥珀酰亚胺丙酸(SPA)。经过修饰的精氨酸酶具有至少250I.U./mg的酶活性。更优选的是具有至少300-350I.U./mg的酶活性,最优选的是至少500I.U./mg的酶活性。在另一个实施方案中,所述酶被修饰成在血清或血浆中具有足够稳定性,并有大约至少三日的半衰期。
在另一个优选的实施方案中,本发明提供的制药应用所制备的药品可用来治疗肝炎。在一个更优选的实施方案中,本发明提供的制药应用所制备的药品可用来治疗乙型肝炎。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物,包含一种分离的且基本上纯化的重组精氨酸酶。在一个具体的实施方案中,本发明的药物组合物包含的重组精氨酸酶的纯度为80-100%。在一个优选的实施方案中,重组人精氨酸酶是任何一种可降解精氨酸的酶,例如精氨酸脱亚胺酶或人精氨酸酶I。在更优选的实施方案中,所述酶是基本上具有核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的人精氨酸酶I,其中,所述核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在优选的实施方案中,所述的精氨酸酶具有足够高的酶活性和稳定性已在患者体内保持至少3天AAD。在最优选的实施方案中,所述精氨酸酶还通过聚乙二醇化修饰以改良稳定性使免疫反应最小化。
在另一个优选的实施方案中,本发明的药物组合物能够降低患者体内精氨酸水平。在一个更优选的实施方案中,本发明的可调节肝炎。在一个最优选的实施方案中,本发明的药物组合物可以治疗乙型肝炎。在另一个实施方案中,本发明的药物组合物进一步被制备成固体、液体、乳状液、悬浮液、微胶粒、或微脂体的形式。在另一个实施方案中,本发明的药物组合物的配方是适用于口服或注射的形式。
附图说明
图1A,1B和1C是人精氨酸酶I的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。
图1A是质粒pAB101的EcoRI/MunI至XbaI位点的核苷酸序列(SEQID NO:1)。核苷酸(nt)1-6,EcoRI/MunI位点;nt481-486,启动子1的-35区域;nt504-509,启动子1的-10区域;nt544-549,启动子2的-35区域;nt566-571,启动子2的-10区域;nt600-605,核糖体结合位点;nt614-616,起始密码子;nt632-637,NdeI位点;nt1601-1603,终止密码子;nt1997-2002,XbaI位点。
图1B是经修饰的人精氨酸酶的编码核苷酸序列(SEQ ID NO:2)及其相应编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。图1A中核苷酸614-1603是修饰的精氨酸酶氨基酸序列的编码区。N末端的6组氨酸(SEQ ID NO:4)标记以下划线标示。翻译终止密码子以*标示。
图1C是正常人精氨酸酶I的编码核苷酸序列(SEQ ID NO:8)及其相应编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。
具体实施方案
本发明所用术语“聚乙二醇化精氨酸酶”是指通过聚乙二醇化修饰的本发明精氨酸酶I(见专利申请WO2004/001048的说明书),以提高所述酶的稳定性及使免疫反应性最小化。
本发明所用术语“基本相同”无论是针对DNA的核苷酸序列,RNA的核糖核苷酸序列,还是蛋白质的氨基酸序列,均是指与本发明所揭示的实际序列有微小的及非相因而生的序列变化的序列。具有基本相同序列的种类被认为与所揭示序列相等价并包含在所附权利要求范围内。在此方面,“微小的及非相因而生的序列变化”是指与本文所揭示的和/或权利要求的DNA,RNA或蛋白质基本相同的序列与本文揭示的和/或权利要求的序列功能等价。功能等价序列以基本相同的方式起作用,产生与本文所揭示的和权利要求的核酸和氨基酸组合物基本相同的组合物。特别地,功能相等的DNA编码与本文所揭示的那些蛋白质相同的蛋白质,或者编码具有保守氨基酸变化的蛋白质,所述变化如用一个非极性残基取代另一个非极性残基,或者用一个带电残基取代另一个相似带电的残基。这些变化包括本领域技术人员已知的那些基本不改变蛋白质三级结构的变化。术语“足够高的酶活性”是指重组人精氨酸酶的酶比活性为至少250I.U./mg,优选至少300-350I.U./mg,更优选至少500I.U./mg。在一个优选的实施方案中,所述精氨酸酶的比活性为500-600I.U./mg。术语“稳定性”是指所述精氨酸酶在体外的稳定性。更优选地,所述稳定性是指在体内的稳定性。酶活性降低率与分离的纯化的重组人精氨酸酶的血浆稳定性成反比。这种关系可从人精氨酸酶在血浆中的半衰期反映出来。
本发明所用术语“足够的精氨酸剥夺(AAD)”是指体内精氨酸水平为10μM或低于10μM。本发明所用术语“半衰期”是指所述精氨酸酶在体外人血浆中的浓度降至一半所需的时间。
所有其他本说明书未提及的技术手段与术语释义等资料,皆可在专利申请WO2004/001048和WO2004/000349的说明书找到。
为研究精氨酸酶的抗乙型肝炎病毒的作用,本发明在乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系2.2.15细胞中,研究了精氨酸酶对细胞的毒性,对HBsAg和HBeAg分泌以及对HBV-DNA的抑制作用。并以英国葛兰素威康公司生产的抗乙型肝炎病毒药拉米夫定作为阳性对照进行了比较。结果显示:聚乙二醇化重组精氨酸酶的半数中毒浓度(TC50)CPE法加药8天为40IU/ml,最大无毒浓度(TC0)为20±0IU/ml。无毒浓度20IU/ml二批实验对细胞HBeAg的分泌抑制率为68.69±8.89,IC50为6.37±0.45IU/ml,SI为6.30±0.45。对细胞HBsAg的分泌抑制率为29.81±27.35,IC50为10.72IU/ml(一批实验),SI为3.73(一批实验)。对细胞培养上清液内HBV-DNA斑点杂交IC50为13.18±0.45IU/ml,选择指数为3.19±0.98。对细胞内的HBV-DNA Southern Blot Sum的IC50为19.79±7.95IU/ml,选择指数为2.91±0.88。对细胞内的HBV-DNA SouthernBlot In Lane的IC50为20.06±1.96IU/ml,选择指数为2.00±0.20。阳性对照拉米夫定的半数中毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)分别为1198.97±97.50和800±0μg/ml。最大无毒浓度药液800μg/ml加入2.2.15细胞培养8天,对HBeAg和HBsAg的分泌无明显抑制作用。对细胞培养上清液的HBV-DNA斑点杂交的IC50为113.76μg/ml,选择指数SI为10.54。对细胞的HBV-DNA Southern Blot Sum抑制的IC50为88.78±6.37μg/ml,选择指数SI为13.54±0.97,与多次实验和文献一致,说明实验可靠。结果提示:精氨酸酶对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg以及细胞HBV-DNA明显抑制作用。
实施例1 试验材料的准备
1.1受试药
名称:聚乙二醇化重组人精氨酸酶(BCT-100),以下简称“精氨酸酶”。所述酶具有图1A,1B和1C所表示的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。
制备方法:请参考WO2004/001048说明书实施例1-8。在WO2004/001048的最早申请日之前,可向Ikemoto Masaki教授于日本的实验室取得重组人精氨酸酶(京都大学;通信地址:53 Kawahara-cho,Shogoin,Sakyo-ku,Kyoto-shi,Kyoto 606-8507 Japan)。待测药物实验时根据所设计剂量组浓度用MEM培养液配制。
保存条件:4℃冰箱保存。
1.2阳性对照药:拉米夫定英国葛兰素威康公司生产,批号:B008923,每片含量100mg,药物经培养液浸泡、溶解,离心去沉淀。实验时根据所设计剂量组浓度用MEM培养液配制。保存条件:4℃冰箱保存。
1.3 2.2.15细胞:乙型肝炎病毒(HBV)基因转染人肝癌细胞(Hep G2)的2.2.15细胞系,美国Mount Sinai医学中心构建,我室引进后自行传代培养。
1.4试剂:EaglesMEM干粉、G-418(Geneticin)、酵母t-RNA、蛋白酶K,美国GIBCO公司产品;
胎牛血清,美国Hyclone Lab公司产品;
L-谷氨酰胺,京科化学试剂公司进口分装;
HBsAg、HBeAg固相放免测定盒,中国同位素公司北方免疫试剂研究所;
卡那霉素,华北制药厂产品;
聚乙二醇,瑞典Fluka产品;
二甲基亚砜,SIGMA公司产品
d-32p-dCTP,北京亚辉生物医学工程公司产品;
1.5实验用品及仪器:培养瓶,丹麦Tunclon TM;
培养板96孔板、24孔板、6孔板美国Corning公司产品;
二氧化碳孵箱,美国Shel-Lab产品;
γ-计数仪,德国BECKMAN产品;
扫描仪:MICROTEK产品;
gel-pro analyzer软件:MEDIA Cybemetice产品;
1.6细胞培养液及试剂配制
MEM培养液100ml:含胎牛血清10%,谷氨酰胺0.03%,G418380μg/ml,卡那霉素50μg/ml。
1.7 2.2.15细胞培养
在长满2.2.15细胞的培养瓶内加0.25%胰酶,37℃消化10分钟,加培养液吹散,1∶3传代,10天长满。
实施例2:精氨酸酶对细胞毒性试验
实验分对照组和不同药物浓度药物组。细胞消化,配制成每毫升20万个细胞,接种培养板,96孔板每孔100μl,37℃5%CO2培养24小时,细胞长成单层后进行实验。精氨酸酶用培养液配制成40IU/ml溶液,2倍稀释20、10、5、2.5IU/ml加入96孔细胞培养板,共5个稀释度,每浓度3孔,每4天换同浓度药液,以观察细胞病变为指标,8天或4天显微镜下观察细胞病变,完全破坏为4;75%为3;50%为2;25%为1;无病变为0。按Reed-Muench法计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。
A=log>50%药物浓度B=log<50%药物浓度C=log稀释倍数
实施例3:精氨酸酶对HBeAg、HBsAg抑制试验
试验设HBsAg、HBeAg阳性对照组,阴性对照组,细胞对照组及不同药物浓度药物组。2.2.15细胞每毫升20万个接种24孔细胞培养板,每孔1ml,37℃5%CO2培养24小时,实验药液无毒浓度以下2倍稀释,5个稀释度分别为精氨酸酶20、10、5、2.5、1.25IU/ml,拉米夫定为800、400、200、100、50μg/ml,每浓度4孔,37℃5%CO2培养,每4天换原浓度药液培养,第8天时收获培养液,-20℃冰冻保存。试验重复二批,分别测定HBsAg和HBeAg。用γ-计数仪测定每孔cpm值。
药物效果计算:计算细胞对照及实验药每浓度cpm均值及标准差,P/N值和抑制百分率(%),半数有效浓度(IC50)及选择指数(SI)。
②计算药物抑制抗原半数有效浓度(IC50):
A=log>50%药物浓度B=log<50%药物浓度C=log稀释倍数
③精氨酸酶在2.2.15细胞培养内对HBsAg和HBeAg的选择指数(SI),按其对细胞毒性指标细胞病变(SI)计算。
④以t检验法计算各稀释度HBsAg、HBeAg和对照组间cpm差别的统计学意义。
实施例4:精氨酸酶对2.2.15细胞DNA抑制实验
2.2.15细胞上清中HBV-DNA提取:2.2.15细胞每毫升20万个接种24孔细胞培养板,每孔1ml,接种后24小时加入药物,每4天换原浓度药液培养,加药后培养第8天收取上清液,经聚乙二醇沉淀、蛋白酶K裂解、苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提、无水乙醇沉淀核酸等步骤,真空抽干,重溶于TE缓冲液中作样品。
斑点杂交:点样:取20ul(DNA含量25ug),经变性、中和,并以20XSSC缓冲液对倍稀释至1∶8倍稀释于硝酸纤维素膜上,并经干烤、预杂交、杂交、洗膜、放射自显影等步骤。以常规方法冲洗X光片。扫描仪扫描光片,用gel-pro软件测定密度,计算抑制率及IC50。
Southernblot:2.2.15细胞内HBV-DNA提取:2.2.15细胞加药后培养8天,吸除培养液收取细胞,细胞经裂解液裂解,等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次,加无水乙醇沉淀核酸,真空抽干,重溶于20ulTE缓冲液中,加入DNA样品缓冲液,将样品加于琼脂糖胶上电泳。电泳后依次经变性、中和、转膜后。同斑点杂交膜一同进行烤膜、杂交、暴光。扫描仪扫描光片,以gel-pro凝胶分析软件分析相对密度,计算抑制率及IC50。
结果
细胞培养毒性按Reed-Muench法计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。对HBsAg和HBeAg抑制效果按所列公式计算,对HBV-DNA抑制效果以gel-pro凝胶分析软件分析光片相对密度,计算抑制率及IC50。
1.精氨酸酶在2.2.15细胞培养中的细胞毒性
为观察精氨酸酶对乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌2.2.15细胞的毒性,在接种2.2.15细胞后24小时,加2倍稀释药液。40IU/ml开始:20、10、5、2.5IU/ml,4天换一次药液,维持8天,用显微镜观察细胞病变,镜检CPE,结果:精氨酸酶对乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌2.2.15细胞毒性实验CPE法(加药8天):二批实验半数中毒浓度(TC50)为40IU/ml,最大无毒浓度(TC0)为20±0μg/ml。阳性对照拉米夫定半数中毒浓度(TC50)为:1198.97±97.50μg/ml。最大无毒浓度(TC0)为:800±0μg/ml。(见表1A.)
2.精氨酸酶对HBeAg、HBsAg抑制试验
精氨酸酶和阳性对照药拉米夫定最大无毒浓度加入2.2.15细胞培养中,第8天测定HBsAg和HBeAg表达的cpm值,计算药物抑制效果。实验结果见表2.。
2.1.精氨酸酶对HBeAg的抑制率
精氨酸酶两批实验:自最大无毒浓度20IU/ml,2倍稀释10、5、2.5、1.25IU/ml各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBeAg的平均抑制率分别为:20IU/ml抑制68.69±8.89%;10IU/ml抑制60.73±17.49%;5IU/ml抑制53.96±20.36%;2.5IU/ml抑制51.83±14.16%;1.25IU/ml抑制37.34%。平均半数有效浓度(IC50)为6.37±0.45IU/ml,选择指数(SI)为6.30±0.45。
2.2.精氨酸酶对HBsAg的抑制率
精氨酸酶第1批实验:20、10、5、2.5、1.25IU/ml各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBsAg的抑制率分别为49.16%,47.97%,42.29%和37.18%,半数有效剂量(IC50)为10.72IU/ml,选择指数为3.7.3。但第2批试验抑制率较低,最大无毒浓度20IU/ml对HBsAg抑制%未达50%,IC50>20IU/ml。
2.3.拉米夫定对HBsAg和HBeAg的作用
拉米夫定自最大无毒浓度800μg/ml开始2倍稀释、400、200、100、50μg/ml加入2.2.15细胞培养体系中,第8天测定培养液HBsAg和HBeAg滴度,计算抑制效果(见表1B)。
2.4.拉米夫定对HBeAg的抑制率
两批试验拉米夫定800、400、200、100、50μg/ml各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBsAg的平均抑制率为:8.23±3.02%、12.99±0.46%、17.83±2.09%、15.84±2.33%、14.10±1.27%。无明显抑制作用。
2.5.拉米夫定对HBsAg的抑制率
两批试验拉米夫定800、400、200、100、50μg/ml各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBeAg的平均抑制率分别为:4.65±6.58%、4.05±5.73%、5.67±4.70%、8.60±4.88%、3.45±3.95%。无明显抑制作用。
表1A.精氨酸酶在2215细胞培养内对HBsAg和HBeAg的抑制作用(%)
药物名 | 实验批次 | 加药天 | 药物浓度IU/ml | HBeAg(CPM) | HBsAg(CPM) | ||||
抑制% | IC50IU/ml | SI | 抑制% | IC50IU/ml | SI | ||||
精氨酸酶 | 1 | 8 | 20 | 74.9808 | 6.69 | 5.98 | 49.1558 | 10.72 | 3.73 |
10 | 73.0985 | 47.9651 | |||||||
5 | 68.3484 | 42.2871 | |||||||
2.5 | 61.8387 | 37.1787 | |||||||
2 | 8 | 20 | 62.4033 | 6.05 | 6.61 | 10.4731 | >20.00- | - | |
10 | 48.3596 | 6.0761 | |||||||
5 | 39.5618 | 1.4739 | |||||||
2.5 | 41.8149 | 2.6703 | |||||||
1.25 | 37.3426 | 4.463 | |||||||
二批实验平均 | 20 | 68.69±8.89 | 6.37±0.45 | 6.30±0.45 | 29.81±27.35 | 第1批10.72第2批>20未平均 | |||
10 | 60.73±17.49 | 27.02±29.62 | |||||||
5 | 53.96±20.36 | 21.88±28.86 | |||||||
2.5 | 51.83±14.16 | 19.92±24.40 | |||||||
1.25 | 37.34 | 4.46 |
表1B.拉米夫定在2215细胞培养内对HBsAg和HBeAg的抑制作用(%)
药物 | 实验批次 | 加药 | 药物浓度μg/ml | HBeAg(CPM) | HBsAg(CPM) | ||||
抑制% | IC50μg/ml | SI | 抑制% | IC50μg/ml | SI | ||||
拉米夫定 | 1 | 8 | 800 | 6.10 | >800 | 0 | >800 | ||
400 | 12.67 | 8.10 | |||||||
200 | 16.35 | 2.35 | |||||||
100 | 17.48 | 12.05 | |||||||
50 | 13.20 | 6.24 | |||||||
2 | 8 | 800 | 10.37 | >800 | 9.299 | >800 | |||
400 | 13.32 | 0 | |||||||
200 | 19.31 | 8.99 | |||||||
100 | 14.19 | 5.15 | |||||||
50 | 14.99 | 0.65 | |||||||
二批实验平均 | 8 | 800 | 8.23±3.02 | >800±0最大无毒浓度800μg/ml无明显抑制 | 4.65±6.58 | >800±0最大无毒浓度800μg/ml无明显抑制作 | |||
400 | 12.99±0.46 | 4.05±5.73 | |||||||
200 | 17.83±2.09 | 5.67±4.7 | |||||||
100 | 15.84±2.33 | 8.6±4.88 | |||||||
50 | 14.10±1.27 | 3.45±3.95 |
3.精氨酸酶和拉米夫定对2.2.15细胞培养上清液HBV-DNA的抑制作用
3.1精氨酸酶在2.2.15细胞培养上清液中HBV-DNA斑点杂交
精氨酸酶在2.2.15细胞培养上清液中对HBV-DNA的作用,加药后培养8天两批实验原液对HBV-DNA的IC50分别为16.04、10.31IU/ml,平均IC50为13.18±4.05IU/ml,选择指数分别为2.49、3.88,平均:3.19±0.98。结果见(表2.)。
表2.精氨酸酶在2.2.15细胞培养上清液中对HBV-DNA的作用
实验批次 | 加药天数 | 药物浓度(μg/ml) | 细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/抑制率% | |||
原液(IOD) | 抑制率% | IC50(μg/m1) | SI | |||
1 | 8 | 20 | 1643.3 | 30.8113 | 16.04 | 2.49 |
10 | 1680.6 | 29.2409 | ||||
5 | 2090.38 | 11.9877 | ||||
2.5 | 1783.34 | 24.9152 | ||||
细胞对照 | 2375.1 | |||||
2 | 8 | 20 | 2430.14 | 47.7577 | 10.31 | 3.88 |
10 | 2881.48 | 38.0549 | ||||
5 | 2613.11 | 43.8243 | ||||
2.5 | 4118.31 | 11.466 | ||||
1.25 | 3917.78 | 15.7769 | ||||
细胞对照 | 4651.67 | |||||
两批平均 | 13.18±4.05 | 3.19±0.98 |
3.2拉米夫定在2.2.15细胞培养中对上清液中HBV-DNA的作用
拉米夫定一批实验对2.2.15细胞上清液内HBV-DNA的作用,IC50为113.76μg/ml,TC50为1198.97±97.50μg/ml,选择指数为10.54。结果见表3。
药物名称 | 加药天数 | 药物浓度(μg/ml) | 细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/抑制率% | |||
CPM | 抑制率% | IC50(μg/ml) | SI | |||
拉米夫定 | 8 | 80040020010050细胞对照 | 663.013795.6281080.031465.312831.213808.34 | 82.590579.108371.640461.523725.6576 | 113.76 | 10.54 |
表3.拉米夫定在2.2.15细胞培养中对上清液中HBV-DNA的作用
3.3.精氨酸酶和拉米夫定在2.2.15细胞内对HBV-DNA Southern Blot的抑制作用
3.3.1精氨酸酶在2.2.15细胞内对HBV-DNA的Southern Blot抑制作用
结果表明:精氨酸酶加药后培养8天对2.2.15细胞内总HBV-DNASouthem印迹测定的总的抑制作用:二批实验IC50分别为25.42、14.17IU/ml,平均IC50为19.79±7.95IU/mI,选择指数分别为1.57、2.82,平均:2.19±0.88。对2.2.15细胞内总HBV-DNA Southern印迹测定的InLane的抑制作用:二批实验IC50分别为21.45、18.67IU/ml,平均IC50为20.06±1.96IU/ml,选择指数分别为1.86、2.14,平均:2.00±0.20。结果见表4.
表4.精氨酸酶在2.2.15细胞内HBV-DNA Southern Blot的抑制作用
实验批次 | 加药天数 | 药物浓度IU/ml | Sum(IOD) | 抑制率% | IC50μg/ml | SI | In Lane(IOD) | 抑制率% | IC50IU/ml | SI |
1 | 8 | 201052.5细胞对照 | 2501124234201042165029421 | 14.989317.630331.667926.4131 | 25.42 | 1.57 | 3143632499287962876242082 | 25.298222.772231.571731.6525 | 21.45 | 1.86 |
2 | 8 | 20 | 34433 | 47.9416 | 14.17 | 2.82 | 46760 | 38.6255 | 18.67 | 2.14 |
1052.5细胞对照 | 46884462836861966143 | 29.117230.02590 | 66241616558835076188 | 13.055919.075238.6255 |
3.3.2拉米夫定在2.2.15细胞内HBV-DNA的Southern Blot抑制作用
结果表明:拉米夫定对2.2.15细胞培养的细胞内总HBV-DNASouthern印迹测定总的抑制作用,两批实验IC50分别为:84.27和93.28μg/ml,平均为88.78±6.37μg/ml,TC50为1198.97μg/ml,SI分别为14.23和12.85,平均为13.54±0.97(见表5)。
表5.拉米夫定在2.2.15细胞内HBV-DNA Southern Blot的抑制作用
实验批次 | 加药天数 | 药物浓度(μg/ml) | Sum(IOD) | 抑制率% | IC50μg/ml | SI |
1 | 8 | 800μg/ml40020010050细胞对照 | 143.91317.332366.35491.77748.911514.08 | 90.5070.0475.8067.5250.54 | 84.27 | 14.23 |
2 | 8 | 800μg/ml40020010050细胞对照 | 509.85804.63589.011002.21710.2392428.92 | 79.0166.8775.7558.7470.76 | 93.28 | 12.85 |
两批平均 | 88.78±6.37 | 13.54±0.97 |
讨论
本试验在乙型肝炎病毒转染人肝癌细胞2215细胞系培养中观察了精氨酸酶和抗乙型肝炎病毒阳性对照药物拉米夫定加药后培养8天对细胞的毒性,对HBsAg和HBeAg分泌及细胞培养上清和细胞内HBV-DNA的抑制作用,总结见表6。
表6.精氨酸酶和拉米夫定在2.2.15细胞培养内对HBV抑制作用总结表
药品 | 细胞毒性IU/ml | HBeAg | HBsAg | 细胞上清HBV-DNA | 细胞HBV-DNA(Southern Blot) | |||||||
TC50 | TC0 | IC50IU/ml | SI | IC50IU/ml | SI | IC50μg/ml | SI | IC50μg/ml | SI | IC50μg/ml | SI | |
精氨酸酶 | 40 | 20±0 | 6.37±0.45 | 6.30±0.45 | ①10.72②>20 | ①3.73②≤1 | 13.18±4.05 | 3.19±0.98 | 19.79±7.95 | 2.19±0.88 | 20.06±1.96 | 2.00±0.20 |
拉米夫定 | 1198.97±97.50 | 800±0μg/ml | >800μg/ml | - | - | >800μg/ml | - | 113.76 | 10.54 | 88.78±6.37 | 13.54±0.97 |
注:①第1批实验,②第2批实验
1.精氨酸酶对2.2.15细胞培养的毒性
精氨酸酶半数中毒浓度(TC50)为:40IU/ml,无毒浓度(TC0)为20±0IU/ml。
阳性对照拉米夫定的半数中毒浓度(TC50)为:1198.97±97.50μg/ml;无毒浓度(TC0)为:800±0μg/ml。
2.精氨酸酶和拉米夫定在2.2.15细胞培养内对HBsAg和HBeAg的分泌的抑制作用
精氨酸酶最大无毒浓度20IU/ml以下2倍稀释4个浓度分别加入2.2.15细胞培养8天,两批实验平均对HBeAg分泌的抑制率为68.69±8.89%,对HBeAg的半数有效浓度(IC50)为:6.37±0.45IU/ml,选择指数(SI)为:6.30±0.45。对HBsAg分泌的抑制率为29.81±27.35%,对HBsAg的半数有效浓度(IC50):第1批为:10.72IU/ml,选择指数(SI)为:3.73,第2批20IU/ml。
抑制率未达50%,IC50>20IU/ml,SI:≤1。两批试验未作平均。
拉米夫定最大无毒浓度药液800μg/ml加入2.2.15细胞培养8天,对HBeAg和HBsAg的分泌无明显抑制作用。不能计算半数有效浓度和选择指数。
3.精氨酸酶和拉米夫定在2.2.15细胞培养内对HBV-DNA抑制作用
结果表明:精氨酸酶对细胞培养上清内HBV-DNA斑点杂交加药8天IC50为13.18±4.05IU/ml,选择指数为3.19±0.98。对细胞内的HBV-DNASouthern Blot加药8天Sum的IC50为19.79±7.95IU/ml,选择指数为2.19±0.88。对细胞内的HBV-DNASouthern Blot加药8天In Lane的IC50为20.06±1.96μg/ml,选择指数为2.00±0.20。
拉米夫定对细胞培养上清的HBV-DNA斑点杂交的IC50为113.76μg/ml,SI为:10.54。Southern印迹测定总的抑制作用,两批实验IC50分别为:84.27和93.28μg/ml,平均为88.78±6.37μg/ml,TC50为1198.97μg/ml,SI分别为14.23和12.85,平均为13.54±0.97。
必需注意本文所用的及在权利要求中所用的单数形式术语“一个”“这个”除非特别指出,还包括复数形式。因此,例如“一种药物制品”包括不同制品的混合物,“治疗方法”包括本领域技术人员已知的等价的步骤和方法等等。
除非另外指出,本文所用所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或相同的任何方法和材料可以用于本发明的实践和测试中,但本文描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物在此并入参考,以阐述和揭示与所引用的内容相关联的特殊内容。本发明已经充分地进行了描述,本领域技术人员可以在本发明范围内对其加以修改。所有这种修改包含在本发明的范围内。
本发明的药物组合物的配方可以是固体,溶液,乳液,分散液,胶囊,脂质体等形式使用,其中在本发明的实际应用中所得配方含有一或多种修饰的人精氨酸酶作为活性成分,与适于肠道或非肠道施用的有机或无机载体或赋形剂混合。所述活性成分可以是精氨酸酶,例如伴有用于片剂、小丸、胶囊、栓剂、溶液、乳液、悬浮液和适于生产固体、半固体或液体形式制剂的任何其它形式的常规非毒性的药物可接受的载体。除了辅助剂之外,还可以使用稳定剂,增稠剂和色素及香味剂。所述药物配方中包含的一或多种精氨酸酶活性成分的量足以对靶过程、症状或疾病产生所需作用。
含有本发明活性成分的药物配方可以是适于口服形式的,例如片剂,口含片(troches),锭剂,水性或油性悬浮液,分散粉末或颗粒,乳液,硬或软胶囊,或糖浆或酏剂。口服配方可以根据本领域己知生产药物配方的任何方法制备。片剂可以无包衣,或者可以通过已知技术包衣,以延迟在胃肠道中的崩解和吸收,从而在更长的时间内提供持续作用。它们也可以包衣形成渗透性治疗片剂以控制释放。
在一些情况中,口服配方可以是硬明胶胶囊,其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙,磷酸钙,高岭土等混合。它们也可以是软明胶胶囊形式,其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
所述药物配方也可以是无菌注射溶液或悬浮液。这种悬浮液可以根据已知方法配制,使用适当的分散或增湿剂或悬浮剂。所述无菌注射制品也可以是在无毒肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液,例如于1,4-丁二醇中的溶液。无菌的不易发挥的油常规用作溶剂或悬浮介质。为此目的可以应用任何柔和的不易挥发油,包括合成的甘油一酯或甘油二酯,脂肪酸(包括油酸),天然植物油如芝麻油,椰子油,花生油,棉花子油,或者合成的脂肪酸载体,如油酸乙酯等。如果需要,可以掺入缓冲剂,葡萄糖溶液防腐剂,抗氧化剂等或者它们可以用作溶质以溶解可溶的酶。
所述药物配方也可以作为辅助治疗剂,与其它化疗剂一起使用。
Claims (29)
1.一种精氨酸降解酶在制备治疗肝炎药品中的应用。
2.如权利要求1的应用,其中,所述酶是一种分离的且基本上纯化的重组精氨酸酶。
3.如权利要求1的应用,其中,所述重组精氨酸酶的纯度为80-100%。
4.如权利要求3的应用,其中,所述重组精氨酸酶是人精氨酸酶I。
5.如权利要求3的应用,其中,所述重组精氨酸酶是精氨酸脱亚胺酶。
6.如权利要求4的应用,其中,所述酶具有与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2基本上相同的核苷酸序列,其中,所述核苷酸序列编码具有与SEQ ID NO:3基本上相同的氨基酸序列。
7.如权利要求4的应用,其中,所述酶具有至少250I.U/mg的酶活性。
8.如权利要求4的应用,其中,所述酶被修饰成在血清或血浆中具有足够稳定性,并有大约至少三日的半衰期。
9.如权利要求8的应用,其中,所述修饰为聚乙二醇化。
10.如权利要求9的应用,其中,所述聚乙二醇化包括透过一个偶联剂将所述酶与至少一个聚乙二醇组份共价结合。
11.如权利要求9的基本上纯化的重组人精氨酸酶,其中,所述偶联剂是2,4,6-三氯-s-三嗪(三聚氰氯,CC)或琥珀酰亚胺丙酸(SPA)。
12.如权利要求4的应用,其中所述人精氨酸酶I的氨基末端连接6个组氨酸。
13.如权利要求1的应用,其中,所述肝炎为乙型肝炎。
14.一种药物组合物,其包含一种精氨酸降解酶。
15.如权利要求14的药物组合物,其中,所述精氨酸降解酶是一种分离的且基本上纯化的重组精氨酸酶。
16.如权利要求15的药物组合物,其中,所述酶的纯度为80-100%。
17.如权利要求15的药物组合物,其中,所述重组精氨酸酶是人精氨酸酶I。
18.如权利要求15的药物组合物,其中,所述重组精氨酸酶是精氨酸脱亚胺酶。
19.如权利要求17的药物组合物,其中,所述酶基本上具有基本上与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同的核苷酸序列,其中,所述核苷酸序列编码具有基本上与SEQ ID NO:3相同的氨基酸序列。
20.如权利要求17的药物组合物,其中,所述酶具有至少250I.U./mg的酶活性。
21.如权利要求17的药物组合物,其中,所述酶在患者血浆中的半衰期至少为3天。
22.如权利要求17的药物组合物,其中,所述酶在患者血浆中的半衰期至少为1天。
23.如权利要求17的药物组合物,其中,所述酶经聚乙二醇化的方法修饰。
24.如权利要求17的应用,其中所述酶的氨基末端连接6个组氨酸。
25.如权利要求14的药物组合物,其中所述酶能够降低患者体内精氨酸水平。
26.如权利要求14的药物组合物,其中所述酶可调节肝炎。
27.如权利要求24的药物组合物,其中所述肝炎为乙型肝炎。
28.如权利要求14的药物组合物,其中所述组合物进一步被制备成固体、液体、乳状液、悬浮液、微胶粒,或微脂体的形式。
29.如权利要求14的药物组合物,其中所述组合物的配方是适用于口服或注射的形式。
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