CN101056890A - 脱酰胺基干扰素－β - Google Patents

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Abstract

按照天然干扰素－β编号的25位天冬酰胺脱酰胺基的干扰素－β类似物显示的天然人干扰素－β生物学活性升高并且无需HA来稳定蛋白质。脱酰胺基产物适合于大规模生产，可用于掺入含HA或不含HA的治疗剂以治疗包括多发性硬化症在内的疾病。内切蛋白酶－C肽图技术能利用酶学消化，然后采用RP－HPLC得到蛋白质指纹分布图，该技术也可作为脱酰胺基产物的ID和/或定量测定检验而用于质控。

Description

脱酰胺基干扰素-β
                            背景
1.技术领域
本发明总体处于生物学活性蛋白质化学领域。更具体地说，本发明涉及因半胱氨酸、天冬酰胺和其它残基的取代、缺失或修饰而不同于天然蛋白质的突变和化学改变的干扰素β类似物。
2.背景技术
发现干扰素β能用于治疗人类疾病，包括多发性硬化症。多发性硬化症(MS)是在环绕神经纤维的保护性鞘破坏时发生的一种中枢神经系统慢性疾病，其往往致残。约30％的MS患者具有复发-缓解形式的该疾病，在该形式中症状在发作后可完全或部分消失，然后是持续数月或数年的稳定期。已证实给予β干扰素(干扰素-β或IFN-β)能降低MS发作的频率。因此，干扰素-β药物成为控制和治疗MS的重要工具。
已开发了重组DNA(rDNA)技术来促进大规模生产干扰素-β药物。这些技术特别需要解决的问题是人β干扰素(其氨基酸序列见图1(SEQ ID NO：1))在17、31和141位含有半胱氨酸残基(Gene，(1980)，10：11-15和Nature，(1980)，285：542-547)，这些残基中至少一些对其活性不重要，但能随意形成不希望的分子间或分子内连接。在采用rDNA技术进行IFN-β的微生物制备过程中，观察到在含有高浓度的IFN-β的提取物中因分子间连接而形成IFN-β的二聚体和寡聚体。形成这种多聚体使得IFN-β的纯化和分离费力费时，在纯化和分离过程中需要数个额外步骤，例如在纯化过程中还原蛋白质，再氧化使其恢复其原始构象，从而可能增加不正确二硫键的形成。此外，该多聚体与低特异性生物学活性相关。
为解决此问题，开发了精细rDNA技术改变微生物产生的生物学活性IFN-β蛋白质类似物，所述技术对蛋白质类似物活性没有不利影响但能降低或消除它们形成分子间交联或分子内键从而使得蛋白质采取不良四级结构(例如，降低蛋白质活性的构象)的能力。已成功地采用定向诱变技术来形成突变(方式)改变的生物学活性蛋白质类似物(本文用“蛋白质类似物”指其中一个或多个氨基酸经遗传和/或化学修饰并保留母体蛋白质的生物学活性的合成蛋白质)，所述类似物保留了其母体蛋白质的所需活性但缺乏形成分子间交联或不良分子内二硫键的能力。发现17位的半胱氨酸残基缺失或被另一氨基酸取代的IFN-β生物学活性蛋白质的合成蛋白质类似物具有所需活性和特征。
具体地说，干扰素-β1b(IFN-β1b)是IFN-β的一种合成重组蛋白质类似物，其是17位的半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代的生物学活性蛋白质。作为微生物产生的蛋白质，IFN-β1b是非糖基化的。其也具有N-末端甲硫氨酸缺失。IFN-β1b已配制为显示能有效治疗和控制MS的成功药物，以Betaseron投入市场。以下许多美国专利和申请描述了此蛋白质类似物、用于其制备的材料和技术、其作为治疗剂的制剂及其治疗MS的应用并要求了权益：1982年10月19日提交的申请号435,154；1986年5月13日授权的专利号4,588,585；1988年4月12日授权的专利号4,737,462；和1990年9月25日授权的专利号4,959,314；各份文献有关这些特征的内容纳入本文作为参考。
也从哺乳动物来源，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行了用作药物的IFN-β大规模生产。称为IFN-β1a的此IFN-β类似物不具有IFN-β1b的Ser17突变，而且是糖基化的。IFN-β1a配制为治疗性产品，以Avonex和Rebith投入市场。
对于大多数治疗剂，不断需要鉴定和生产更有效的生物学活性药物。以IFN-β药物为例，需要生物学活性增加的IFN-β类似物。
此外，一些IFN-β药物制剂(包括Betaseron)含有人白蛋白(HA或HSA)，一种常规的蛋白质稳定剂。HA是人血产品，其供应量日益下降。因此，近年来需要不含HA的药物制剂，最好是稳定和有效的不含HA的IFN-β制剂。
发明概述
本发明通过使干扰素-β脱酰胺基解决了这些需求。脱酰胺基IFN-β是其25位(根据天然干扰素-β编号)的天冬酰胺脱酰胺基的人干扰素-β蛋白质类似物。脱酰胺基产物显示的天然人干扰素-β的生物学活性水平升高且无需HA来稳定蛋白质。
在一具体的实施方案中，脱酰胺基IFN-β是合成的人干扰素-β1b蛋白质类似物，其17位(根据天然干扰素-β编号)半胱氨酸缺失或为中性氨基酸，特别是丝氨酸取代，其25位天冬酰胺脱酰胺基从而形成环状酰亚胺、天冬氨酸或异天冬氨酸残基。与其IFN-β母体蛋白质相比，脱酰胺基的产物显示所需的天然人干扰素-β的生物学活性(例如，细胞病变效应或抗增殖活性，例如显示与多发性硬化症发作频率降低相关)水平升高。此外，在该蛋白质类似物的不含HA制剂中观察到生物学活性升高。
也提供了治疗性组合物中活性蛋白质类似物化合物的制剂及制备和使用方法。
此外，提供了内切蛋白酶-C肽图技术，该技术在较低pH时对还原的蛋白质样品进行酶消化，然后层析分辨肽片段以得到蛋白质的指纹分布图，该技术可作为脱酰胺基产物的ID检验而用于质控。
阅读以下发明详述结合附图可更全面地了解本发明的这些和其它目的及特征。
                        附图说明
图1是IFN-β的氨基酸序列。
图2是IFN-β1b的氨基酸序列，其表明本发明脱酰胺基的位点和性质。
图3参考本发明INF-βAsn25脱酰胺基说明Asn脱酰胺基途径。
图4-11显示了本发明一方面的各种不含HA的IFN-β稳定性药物和产品批次中脱酰胺基IFN-β1b的效力与含量的图。
图12A显示了本发明一方面的不含HA的IFN-β稳定性样品的Glu-C肽图。
图12B显示了图12A的一部分的放大图。
图13显示了不含HA的IFN-β对照样品的RP-HPLC分布情况(时间(分钟)与应答(mV))。
图14显示了本发明一方面的不含HA的IFN-β1b药物产品批次稳定性样品的RP-HPLC分布情况。
图15是本发明一方面的不含HA的IFN-β稳定性样品的RP-HPLC级分(fraction)的CPE活性图。
图16A显示了本发明一方面的不含HA的IFN-β稳定性样品的RP-HPLC级分对Hs294T的抗增殖活性结果。
图16B显示了本发明一方面的不含HA的IFN-β稳定性样品的RP-HPLC级分对Daudi的抗增殖活性结果。
                本发明具体实施方案描述
现在将参考数个实施方案描述本发明的化合物、组合物、物质和相关的技术及应用。教材的结构中说明了所述实施方案的重要特性和特征。尽管结合这些实施方案描述了本发明，但应该知道本发明不限于这些实施方案。相反，应涵盖包含在附加的权利要求所确定的本发明构思和范围内的改变形式、改进形式和等价形式。为全面理解本发明，以下描述给出了许多具体细节。本发明的实施可不利用这些具体细节中的某些或全部。在其它情况中，未详细描述熟知的过程操作以免不必要地混淆本发明。
引言
本发明提供脱酰胺基干扰素-β。脱酰胺基IFN-β是其中25位(根据天然干扰素-β编号)的天冬酰胺脱酰胺基的人干扰素-β蛋白质类似物。Asn经环状酰亚胺中间体脱酰胺基为Asp或异-Asp。脱酰胺基产物显示的天然人干扰素-β的生物学活性水平升高且无需HA来稳定蛋白质。也提供了治疗性组合物中的活性蛋白质类似物化合物的制剂及其制备和使用方法。
本文用“蛋白质类似物”指合成蛋白质，其中一个或多个氨基酸经遗传和/或化学修饰并且保留了母体蛋白质的生物学活性，例如致细胞病变效应或抗增殖活性。这种生物学活性显示与特定生物学活性，例如多发性硬化症发作频率降低相关。
在一具体实施方案中，脱酰胺基的IFN-β是纯化和分离的合成人干扰素-β1b蛋白质类似物，其中17位(根据天然干扰素-β编号)的半胱氨酸缺失或被中性氨基酸，特别是丝氨酸取代，25位的天冬酰胺脱酰胺基。在具体的实施方案中，Asn25脱酰胺基为天冬氨酸、异天冬氨酸或环状酰亚胺残基(例如，分别是IFN-βSer17，asp25、βSer17，异-asp25、或IFN-βSer17，环状酰亚胺25)。与IFN-β1b相比，脱酰胺基产物显示的天然人干扰素-β的生物学活性水平升高。此外，在蛋白质类似物的不含HA制剂中观察到生物学活性升高，从而能得到不含HA的IFN-β1b治疗剂。
在本发明的合成蛋白质类似物中，半胱氨酸17残基可能被丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代。在一具体的实施方案中，所述取代是丝氨酸17。天冬酰胺25残基被天冬氨酸、异天冬氨酸或环状酰亚胺取代。图2说明了本发明的IFN-β1b蛋白质类似物的一级(氨基酸序列(SEQ ID NO：2))和二级(折叠，交联)结构。在25位，天然Asn残基脱酰胺基。天冬酰胺经环状酰亚胺中间体发生脱酰胺基。此途径描述于图3。如下文所详述的，Glu-C肽图结果表明脱酰胺基的主要形式是异-Asp(IFN-βSer17，异-asp25)和环状酰亚胺(IFN-βSer17，环状酰亚胺25)。
可联用重组合成和化学修饰技术制备蛋白质类似物。如本申请以上“背景技术”部分引用的专利中所述，最初一般通过重组DNA定向诱变技术制备IFN-β1b合成蛋白质类似物。定向诱变技术是熟知的，Lather，R.F.和Lecoq，J.P.在《遗传工程》(Genetic Engineering)，Academic Press，(1983)，第31-50页对其进行了总结。寡核苷酸-定向诱变具体由Smith，M.和Gillam，S综述于《遗传工程：原理和方法》(Genetic Engineering：Principles and Methods)，Plenum Press(1981)3：1-32。
然后化学处理IFN-β1b蛋白质类似物使25位的天冬酰胺残基脱酰胺基。许多可能的脱酰胺基技术有效且适合于大规模药物产生，可采用任何能实现脱酰胺基同时保留天然生物学活性(最好生物学活性升高)的技术。泛泛而言，取决于诸条件，可通过在中温至高温(例如，约25-60℃)和低(例如，约0-4)、中(例如，约4-10)到高(例如，约10-14)的各种pH下，以约1分钟到约90天或更长的反应时间培育来实现IFN-β蛋白质的脱酰胺基。例如，可通过在最高60℃，或约25和40℃之间(例如40℃)，约pH4时培育IFN-β(例如，IFN-β1a或IFN-β1b)至少24小时(例如，最多40天)来实现脱酰胺基。通过升高pH，例如升至约7到最高14的中性到碱性pH，如约8-12(如约8.5)可缩短反应时间和/或降低反应温度。在一个实例中，在pH8.4，2-8℃处理14天后IFN-β1b样品的生物学活性(CPE)升高至少两倍，达到约4.5IU/mg。在中温(例如，室温)到高温(例如，37-40℃)处理14-40天也观察到活性有实质性升高。
制备脱酰胺基IFN-β蛋白质类似物的技术可产生部分或基本上纯的产物。例如，产物中至少25％、至少50％、至少75％或基本上所有合成蛋白质类似物在25位(按照天然干扰素-β编号)脱酰胺基。然而，当不是基本上所有产物均脱酰胺基时，该产物仍显示生物学活性升高和不含HA的稳定性。在一些实例中，最好纯化和分离产物中的脱酰胺基蛋白质类似物。可通过阳离子交换HPLC实现此纯化和分离，例如采用以下条件：
层析固定相：Pharmacia Mono S HR 5/5或与之相当的固定相；
洗脱剂缓冲液：含0.5％Empigen的20mM Tris-HCl，pH7.0；
梯度：洗脱剂缓冲液中NaCl线性梯度最高达200mM或更高。可大规模实施此技术以进行生产。
在一优选的实施方案中，当合成蛋白质由微生物产生时，其未糖基化。该蛋白质类似物也具有N-末端甲硫氨酸缺失。在其它实施方案中，可在哺乳动物细胞中产生蛋白质类似物，因而是糖基化的。
如下文所详述的，与它们的母体IFN-β蛋白质相比，各种活性试验证实脱酰胺基IFN-β1b蛋白质类似物的生物学活性升高。利用不含HA的样品获得的稳定性结果表明本发明的脱酰胺基IFN-β蛋白质类似物适合于用作治疗剂的不含HA制剂。为制备治疗性组合物，可将上述部分或基本上纯的蛋白质类似物与药学上可接受的载体介质(例如此类型治疗性产品所熟知的)混合。
虽然本发明组合物显示不含HA的稳定性是有利的特性，但也可对含HA的制剂脱酰胺基，这些情况不能排除在本发明范围以外。此外，虽然本文主要参考IFN-β1b蛋白质类似物描述了本发明，但本发明也适用于其它IFN-β类似物，包括IFN-β1a类似物。
本发明的IFN-β蛋白质类似物和组合物能显示生物学活性提示其能在许多应用中用作治疗剂，包括调节患者的细胞生长、治疗患者的病毒性疾病和刺激患者的天然杀伤细胞活性。一种具体应用是治疗患者的多发性硬化症，特别是复发-缓解性MS。就这点而言，本发明的治疗剂可用于治疗以降低多发性硬化症的发作频率。脱酰胺基IFN-β蛋白质类似物的生物学活性水平升高表明其作为治疗剂，例如用于治疗和控制MS的疗效升高。
本发明的另一方面提供了内切蛋白酶-C(Glu-C)肽图技术。肽图通过在较低pH进行还原型蛋白质样品的酶消化，然后采用液相层析(例如，RP-HPLC)分辨消化产物片段得到蛋白质的指纹分布图。制作肽图可作为本发明脱酰胺基IFN-β蛋白质类似物产物的ID检验而用于质控。它也是监测蛋白质在因氧化或脱酰胺基(而发生)的诸如剪接、突变和降解的情况中微小一级结构修饰的有利工具。
已知脱酰胺基IFN-β的一种变体含有环状酰亚胺，脱酰胺基的中间体形式。发现在稳定性样品中此环状酰亚胺形式增加。用于IFN-β的常规肽图的大多数酶(包括Lys-C在内)在中性到高pH处消化蛋白质最佳。在中到高pH，环状酰亚胺不稳定，进一步脱酰胺基被人工诱导。因此，监测样品中环状酰亚胺和其它脱酰胺基形式(Asp，异-Asp)的天然水平需要在还原和消化过程中将样品维持于低pH环境。
内切蛋白酶-C(Glu-C)肽图与在pH8以下，例如约3-8(如约3、4、5、6、7或8或介于其间的pH)起作用的还原剂联用(couple)。合适的还原剂是三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)。可利用在pH约3-8起作用的其它还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、2-巯基乙胺和硫代乙醇酸。对于其酶活性，Glu-C肽图具有两个最佳pH，pH7.8和pH4.0。如上所述，已知TCEP在pH8.0以下起作用。在一个实施方案中，新型Glu-C肽图所利用的样品制备包括通过TCEP还原和在4.0的低pH处消化，该pH在保留样品中脱酰胺基形式，例如环状酰亚胺的天然水平的最佳pH范围内。可利用该新型肽图技术来特征鉴定IFN-β样品中含脱酰胺基形式(包括环状酰亚胺)的消化产物片段。
可通过Glu-C肽图检验IFN-β样品来鉴定脱酰胺基位点及其形式(例如，Asp、异Asp、环状酰亚胺)。可利用TCEP还原缓冲制剂中的蛋白质样品(例如2-500mM(或在一些情况中是50-100mM)盐缓冲液的制剂缓冲液配制的浓度为0.1-10，如0.5mg/ml的0.5ml蛋白质样品)，例如蛋白质与TCEP的摩尔比为1∶2-1∶30，如1∶3、1∶4、1∶5、1∶10或1∶20，如1∶10，所述盐是，例如天冬氨酸盐、碳酸氢盐(如，碳酸氢铵)、碳酸盐(如碳酸铵)、乙酸盐(如乙酸铵)、磷酸盐(如磷酸钠)、柠檬酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、MES、PIPES、ACES、MOPS、MOPSO、HEPES、TES、TRIS-HCl、BIS-TRIS、BIS-TRIS丙烷、ADA、BES、DIPSO、TAPSO、HEPPSO、POPSO、EPPS、TEA等，本领域技术人员知道为所需的pH而合适地选择和利用这些盐(例如，2mM天冬氨酸，pH4)。培育样品，例如在约30-40℃(如37℃)直至样品物质被还原。取决于样品的不稳定性，合适的培育时间可以从约5分钟-24小时，例如3小时。然后用(例如)1-10，如4mg/ml Glu-C消化还原的物质，在约30-40℃(如37℃)培育直至样品物质被消化，其中蛋白质与Glu-C的质量比是1∶1-20∶1(或任何合适的中间比例，包括2∶1、3∶1、4∶1、10∶1等)，例如5∶1。取决于样品的不稳定性，合适的消化时间可以从约5分钟-24小时，例如4小时。可采用液相层析，例如RP-HPLC分辨肽片段。
以下实施例章节描述了具体的肽图实验及其结果。
实施例
以下实施例描述了本发明的各方面，但不是以任何方式限制本发明。在各种这些实施例中，对显示效力升高的两种主要的可识别种类：环状酰亚胺和其它脱酰胺基形式(Asp和异Asp)进行了区分。所有的形式都是脱酰胺基形式，但当要区别环状酰亚胺和其它脱酰胺基形式(Asp和异Asp)时，有时将前者称为“环状酰亚胺”，而有时将后者称为“脱酰胺基的”或“脱酰胺基”，特别是在附图标记中。
实施例1：不含HA的IFN-β1b稳定性样品的效力升高
概述
在不含HA的IFN-β1b稳定性样品中观察到效力升高。致细胞病变效应(CPE)生物试验显示在不含HA的IFN-β25℃稳定性样品中效力随时间(T＝0-6个月)升高。在25℃稳定性样品中也观察到最终脱酰胺基产物及其中间体，环状酰亚胺增加。
制作Glu-C肽图鉴定了位于Asn25的脱酰胺基位点，该肽图显示不含HA的IFN-β1b稳定性样品中脱酰胺基的主要形式是异-Asp和环状酰亚胺类似物，而Asp形式略有增加。
从RP-HPLC方法获得的结果表明不含HA的IFN-β稳定性样品中脱酰胺基形式(环状酰亚胺、Asp和异Asp)明显增加。
CPE和抗增殖试验显示不含HA的IFN-β稳定性样品中的脱酰胺基形式的生物学活性高于母体(酰胺化)IFN-β。
根据这些发现，认为脱酰胺基(形成Asp、异Asp和环状酰亚胺类似物)提高了不含HA的IFN-β的生物学活性。因此，可制备IFN-β的脱酰胺基形式来提高IFN-β治疗剂的生物学活性，既可以不含HA也可以含HA。可通过在中温至高温和/或在低、中或高pH培育IFN-β溶液(既可以不含HA也可以含HA)来制备脱酰胺基类似物。本发明的脱酰胺基产物可降低所需的临床剂量，增加室温下液体IFN-β制剂的稳定性。降低临床剂量可减少发生不利免疫反应(例如，中和抗体)的患者比例。
以下提供了从各种稳定性研究和IFN-β1b制品分析得到的证实本发明的数据：
1.不含HA的IFN-β稳定性数据
如下表1(药物物质：2mM天冬氨酸，pH4.0配制)和表2(药物产品：2mM天冬氨酸，pH4.0，9％海藻糖配制)所示，致细胞病变效应(CPE)生物试验显示不含HA的IFN-β1b 25℃稳定性样品的效力随时间增加(T＝0-6个月)：
               表1不含HA的干扰素-β1b药物物质的CPE生物试验稳定性数据
  分析方法：CPE试验
  接受标准：1.3-5.1×107IU/mg
  批号   检验运行   TA2040   TA2085   检验运行   TA2040   TA2085
  描述：   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml
  研究编号：   1402   1411   1414   1403   1412   1415
  保存：   5℃   5℃   5℃   25℃/60％RH   25℃/60％RH   25℃/60％RH
  方向：   正放(upright)   正放   正放   正放   正放   正放
  月   IU/mg×107   IU/mg×107   IU/mg×107   IU/mg×107   IU/mg×107   IU/mg×107
  0   2.8   2.8   2.9   2.8   2.8   2.9
  1.5   ND   ND   ND   4.2   3.5   3.6
  3   3.0   2.9   2.8   44.6   4.2   4.1
  4.5   ND   ND   ND   5.7   4.9   5.0
  6   3.3   3.1   2.9   6.3   5.4   4.8
  ND：未做；RH：相对湿度
                表2不含HA的干扰素-β1b药物产品的CPE生物试验稳定性数据
  批号   14159-49(非临床)   25FEB03(检验运行)   TA2158   TA2451
  描述：   1.2ml；0.25mg/ml   1.2ml；1.0mg/ml   1.2ml；1.0mg/ml   1.2ml；1.0mg/ml
  研究编号：   1335   1438   1442   1444
  保存：   25℃/60％RH   25℃/60％RH   25℃/60％RH   25℃/60％RH
  方向：   倒置(inverted)   倒置   倒置   倒置
  月   IU/mg×107   IU/mg×107   IU/mg×107   IU/mg×107
  0   2.8   2.7   2.7   2.6
  1.5   3.2   3.7   3.5   3.6
  3   4.3   4.4   4.4   4.2
  4.5   4.1   4.8   4.6   4.6
  6   4.6   5.3   5.5   5.4
如下表3和4所示，阳离子交换(CEX)-HPLC证实药物物质和药物产品的25℃样品的稳定性数据也分别显示脱酰胺基作用增加(D-IFN-β)：
                表3不含HA的干扰素-β1b药物物质的CEX-HPLC稳定性数据
  分析方法：CEX HPLC
  接受标准：报道％脱酰胺基作用
  批号   检验运行   TA2040   TA2085   检验运行   TA2040   TA2085
  描述：   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml
  研究编号：   1402   1411   1414   1403   1412   1415
  保存：   5℃   5℃   5℃   25℃/60％RH   25℃/60％RH   25℃/60％RH
  方向：   正放   正放   正放   正放   正放   正放
  月   脱酰胺基％   脱酰胺基％   脱酰胺基％   脱酰胺基％   脱酰胺基％   脱酰胺基％
  0   6   6   6   6   6   6
  1.5   ND   ND   ND   10   10   9
  3   7   6   7   14   14   13
  4.5   ND   ND   ND   20   20   18
  6   5   6   6   22   22   20
  ND：未做
          表4不含HA的干扰素-β1b药物产品的CEX-HPLC稳定性数据
  批号   14159-49(非临床)   25FEB03(检验运行)   TA2158   TA2451
  描述：   1.2ml；0.25mg/ml   1.2ml；1.0mg/ml   1.2ml；1.0mg/ml   1.2ml；1.0mg/ml
  研究编号：   1335   1438   1442   1444
  保存：   25℃/60％RH   25℃/60％RH   25℃/60％RH   25℃/60％RH
  方向：   倒置   倒置   倒置   倒置
  月   脱酰胺基％   脱酰胺基％   脱酰胺基％   脱酰胺基％
  0   4   7   7   7
  1.5   7   11   13   12
  3   12   18   18   17
  4.5   16   24   24   22
  6   18   371   351   401
  10   结束   IP   IP   IP
  结束
下表5和6显示利用反相(RP)-HPLC技术分别在药物物质和药物产品的25℃样品中也观察到峰D(代表脱酰胺基的环状酰亚胺中间体形式)随时间增加：
                表5不含HA的干扰素-β1b药物物质的RP-HPLC稳定性数据
  分析方法：RP HPLC
  接受标准：报道％峰面积
  批号   检验运行   TA2040   TA2085
  描述：   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml   6ml；2mg/ml
  研究编号：   1403   1412   1415
  保存：   25℃/60％RH   25℃/60％RH   25℃/60％RH
  方向：   正放   正放   正放
  月   峰A   主峰(D+B)   峰D   峰B   其它   峰A   主峰(D+B)   峰D   峰B   其它   峰A   主峰(D+B)   峰D   峰B   其它
  0   2   96   12   85   2   2   96   11   85   2   2   96   11   86   2
  1.5   2   95   17   78   3   2   96   17   79   2   2   96   16   80   3
  3   1   93   20   73   6   1   92   19   73   7   1   92   19   73   7
  4.5   2   91   24   67   7   2   90   24   66   8   1   91   23   68   8
  6   2   93   26   67   5   1   93   25   68   5   1   94   23   68   5
                    表6不含HA的干扰素-β1b药物产品的RP-HPLC稳定性数据
  分析方法：RP HPLC
  接受标准：报道％峰面积
  批号   25FEB03(检验运行)   TA2158   TA2451
  描述：   1.2ml；1.0mg/ml   1.2ml；1.0mg/ml   1.2ml；1.0mg/ml
  研究编号：   1438   1442   1444
  保存：   25℃/60％RH   25℃/60％RH   25℃/60％RH
  方向：   倒置   倒置   倒置
  月   峰A   主峰(D+B)   峰D   峰B   其它   峰A   主峰(D+B)   峰D   峰B   其它   峰A   主峰(D+B)   峰D   峰B   其它
  0   1   93   12   81   6   1   93   11   82   6   1   93   12   81   6
  1.5   1   92   16   76   6   1   92   17   74   7   1   91   17   75   8
  3   2   90   22   68   8   2   91   21   69   8   2   91   21   70   7
  4.5   2   94   23   71   5   1   94   22   72   5   1   94   22   72   4
  6   1   94   24   70   5   1   94   24   71   5   1   95   24   71   4
  结束
图4-11显示了本发明一方面的各种不含HA的IFN-β稳定性药物物质和产物批次中脱酰胺基的IFN-β1b(“D-IFN％”或“峰D％”)的效力与含量。这些数据证实效力升高与不含HA的IFN-β的脱酰胺基水平相关。
2.不含HA的IFN-β稳定性样品的特征鉴定
图3显示了IFN-β1b的一级序列。发现脱酰胺基发生在Asn25。下述试验研究了该脱酰胺基作用的性质和脱酰胺基产物的特性：
2.1Glu-C肽图
肽图利用酶消化，然后采用RP-HPLC得到蛋白质的指纹分布图。制作肽图可作为ID检验而通常用于质控。它也是监测蛋白质因氧化或脱酰胺基(而发生)的诸如剪接、突变和降解的情况中微小一级结构修饰的有利工具。已知不含HA的IFN-β含有环状酰亚胺，脱酰胺基的中间体形式。此环状酰亚胺是不含HA的IFN-β的关键降解变体，发现它在稳定性样品中含量增加。目前不含HA的IFN-β肽图所用的大多数酶(包括Lys-C)在中高pH消化蛋白质最佳。环状酰亚胺在中高pH不稳定，可人工诱导脱酰胺基。因此，监测样品中环状酰亚胺和脱酰胺基作用需要在还原和消化过程中将样品维持在低pH环境中。
开发了与作为还原剂的三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)联用的新型内切蛋白酶-C(Glu-C)肽图来特征鉴定不含HA的IFN-β中含有脱酰胺基形式(包括环状酰亚胺)的片段。已知Glu-C肽图具有两个对其酶活性最佳的pH，pH7.8和pH4.0。已知TCEP在pH8.0以下起作用。开发了能利用样品制品的新型Glu-C肽图，该样品制品包括还原和在4.0的低pH处消化，该pH在保留样品中脱酰胺基形式，例如环状酰亚胺的天然水平的最佳pH范围内。由于本文开发的肽图利用低pH样品制品，因而能成功地精确监测不含HA的IFN-β中脱酰胺基形式的天然水平。
采用Glu-C肽图检验了不含HA的IFN-β1b药物产品批次TA2451的稳定性样品(25℃，3、6和9个月)来鉴定脱酰胺基位点及其形式(例如，Asp、异Asp、环状酰亚胺)。利用TCEP还原用2mM天冬氨酸，pH4.0的制剂缓冲液配制的浓度为0.5mg/ml的各0.5ml蛋白质样品。37℃培育样品与TCEP3小时，蛋白质和TCEP的摩尔比为1∶10。然后用4mg/ml Glu-C消化还原的物质(蛋白质和Glu-C的质量摩尔比为5∶1)，37℃培育4小时。采用RP-HPLC层析(ThermoHypersil BioBasic C18，150×4.6mm，5μm)，利用0.1％三氟乙酸配制的乙腈梯度作为洗脱缓冲液，流速为1.0ml/分钟和柱温为38℃来分辨肽片段。
图12A显示了本发明一方面的不含HA的IFN-β稳定性样品的Glu-C肽图。图12B显示了图12A所述肽图中22-26分钟RT部分的放大图。
如附图所示，片段E1的峰随时间降低，而代表异-Asp、环状酰亚胺和Asp的峰升高。那些峰是片段E1中25位Asn的脱酰胺基形式。对通过赖氨酰内切肽酶消化E1相关片段得到的E1亚片段进行质谱和Edman测序来特征鉴定该峰。在氨基酸序列中Asn25残基后是甘氨酸。已知此Asn-Gly序列的脱酰胺基速率快。
根据此Glu-C肽图结果，不含HA的IFN-β稳定性样品中脱酰胺基的主要形式鉴定为异-Asp和环状酰亚胺。Asp形式的水平也略有升高。
2.2RP-HPLC
RP-HPLC根据疏水性分离这些化合物。通过RP-HPLC方法检验不含HA的IFN-β1b样品来特征鉴定IFN-β1b变体(例如，Asp、异-Asp、环状酰亚胺)。将检验样品注射到Zorbax 300SB-CN，150×4.6mm，3.5μm粒径的层析柱上，利用0.1％三氟乙酸洗脱缓冲液配制的乙腈梯度分离IFN-β1b变体。对照样品的结果见图13。
通过在线LC/质谱分析(RP-HPLC/Q-TOF/ESI-MS)进行附图所示的峰鉴定。分出HPLC流出液的约1∶20，以约50ul/分引入质谱仪的离子源。所述质谱仪是装有电喷雾离子源的Micromass Q-TOF2仪器。离子电压设置在3200，锥孔电压设置在50。利用飞行时间(TOF)分析仪收集m/z 300和2500之间的数据。在线LC/质量数据显示在一些RP-HPLC峰中有多种蛋白质变体共同洗脱。
图14显示不含HA的IFN-β1b药物产品批次稳定性样品(25℃约10个月)的RP-HPLC分布图。如图所示，该分布图不同于对照样品(图13)，不含HA的IFN-β1b中环状酰亚胺(峰D)和脱酰胺基形式(Asp和/或异-Asp)(中峰)显著增加。观察到多种次要的其它脱酰胺基和环状酰亚胺变体。这些变体是因其不同的疏水特性而得到分离的具有其它结构和化学修饰的脱酰胺基和环状酰亚胺变体。
2.3CPE生物试验
IFN-β能在哺乳动物细胞中诱导抗病毒状态，其中抑制了一些病毒类型的复制和导致细胞的致细胞病变效应(CPE)。利用A549人肺癌细胞和鼠脑心肌炎(EMC)病毒评估从不含HA的IFN-β1b药物产品批次的稳定性样品(25℃约10个月)获得的RP-HPLC级分的生物学活性。
将细胞培养在96-孔板中，利用IFN-β1b的连续稀释液处理过夜，再加入病毒。然后培育培养液合适的时间以使病毒复制。用充足的IFN-β1b处理的细胞受到保护免遭病毒攻击，保持存活。未受保护的细胞发生致细胞病变改变，死亡。采用染色技术和从细胞活力(光密度检测)与IFN-β浓度图制作的剂量反应曲线定量测定干扰素剂量依赖性CPE。IFN-β活性计算为半最大细胞保护所需的浓度(EC50浓度)。
如图15所示，脱酰胺基级分(中峰，级分16)中CPE活性明显高于母体IFN-β1b级分(峰B，级分18)。环状酰亚胺级分(峰D，级分15)也显示CPE活性高于母体IFN-β1b级分。
2.4抗增殖试验
IFN-β显示对从人肿瘤开发的许多细胞系有抗增殖活性。利用两种细胞系(Hs294T-人黑色素瘤细胞系和Daudi-衍生自伯基特淋巴瘤的人B成淋巴细胞系)评估从不含HA的IFN-β1b药物产品批次的稳定性样品(25℃约10个月)获得的RP-HPLC级分的生物学活性。
在96-孔板中连续稀释IFN-β测试样品。在组织培养基中制备效应细胞，将其加入试验平板。培育3天后，用Alamar蓝染色细胞或用Coulter计数器计数来检测生长反应。细胞生长以剂量依赖性方式对IFN-β起反应而受到抑制。从细胞数目(光密度检测)与IFN-β浓度图制作剂量反应曲线。IFN-β活性计算为半最大细胞生长所需的浓度(ED50浓度)。
如图16A(Hs294T)和16B(Daudi)所示，脱酰胺基级分(中峰，级分16)和环状酰亚胺级分(峰D，级分15)中的抗增殖活性明显高于母体IFN-β级分(峰B，级分18)。
3.结论
根据上述研究获得的稳定性数据和结果，脱酰胺基作用(Asp、异Asp和环状酰亚胺取代25位的Asn)提高了IFN-β的生物学活性。因此，可有意制备IFN-β例如IFN-β1b的脱酰胺基形式，来提高该化合物的生物学活性。可在中高温度或在低、中或高pH环境中通过培育IFN-β来制备脱酰胺基形式。本发明的脱酰胺基产物可降低所需的临床剂量，增加室温下液体IFN-β制剂(包括不含HA和含HA的IFN-β制剂)的稳定性。降低临床剂量可减少发生不利免疫反应(例如，中和抗体)的患者比例。
实施例2：可制造性数据
如上所述，进行了各实验来证实各种脱酰胺基技术。从CPE生物试验获得的数据证明采用适合于大规模药物生产的方法不难制备脱酰胺基IFN-β。具体地说，在中(例如，室温)到高(例如，37-40℃)温度下培育14-40天的按照优质生产规范(GMP)生产的各种样品中观察到生物活性明显升高；在室温和pH8.8培育GMP样品约1小时，和在2-8℃ pH8.4培育约14天使得生物活性几乎增加两倍。
CPE生物试验结果
测试1
  样品名称   IU/mg
  TR090602散装(Bulk)   2.79E+07
  TR090602稳定性室温120天   3.87E+07
  TR090602稳定性37℃20天   4.11E+07
  受应力(Stressed)，不含HA，对照   2.95E+07
  受应力，不含HA，碱pH2   4.52E+07
  受应力，不含HA，40℃，30天   5.06E+07
  IFN CPE试验对照   2.94E+07
测试2
  样品名称   IU/mg
  TR090602散装   3.62E+07
  TR090602，稳定性，室温，40天   6.52E+07
  TR090602，稳定性，37℃，40天   1.56E+08
  GMP1#散装   2.67E+07
  GMP1#散装，稳定性，37℃，40天   3.51E+07
  GMP1#散装，pH8.83   4.79E+07
  受应力，不含HA，对照   2.26E+07
  受应力，不含HA，40℃，14天   3.44E+07
  受应力，不含HA，40℃，30天   4.05E+07
  IFN CPE试验对照   2.93E+07
1)室温
2)样品在pH8.4，2-8℃培育14天
3)样品在pH8.8，室温培育1小时
结论
虽然为清晰理解的目的详细描述了上述发明，但应知道可在附加的权利要求范围内实施某些改变和改进。应该注意有许多备选方式可执行本发明方法和组合物。因此，应认为本发明的实施方案是说明性而非限制性，本发明不限于本文给予的这些细节，而可在附加的权利要求的范围和等价体内加以改进。
本文引用的所有文献出于所有目的全文纳入本文作为参考。

Claims (28)

1.一种纯化和分离的合成人干扰素-β蛋白质类似物，其中
按照天然干扰素-β编号的第25位的天冬酰胺被脱酰胺基，和
所述蛋白质类似物显示天然人干扰素-β的生物学活性。
2.如权利要求1所述的合成蛋白质类似物，其特征在于，按照天然干扰素-β编号的第17位的半胱氨酸缺失或被中性氨基酸取代。
3.如权利要求2所述的合成蛋白质类似物，其特征在于，所述半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代。
4.如权利要求3所述的合成蛋白质类似物，其特征在于，所述天冬酰胺残基被选自天冬氨酸、异天冬氨酸和环状酰亚胺的残基取代。
5.如权利要求4所述的合成蛋白质类似物，其特征在于，所述蛋白质类似物未糖基化。
6.如权利要求5所述的合成蛋白质类似物，其特征在于，所述蛋白质类似物具有N-末端甲硫氨酸缺失。
7.如权利要求4所述的合成蛋白质类似物，其特征在于，所述蛋白质类似物的生物学活性高于IFN-βser17。
8.一种具有IFN-β活性的治疗性组合物，其含有治疗有效量的权利要求4所述合成蛋白质类似物，该类似物与药学上可接受的载体介质混合。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，至少50％的合成蛋白质类似物在按照天然干扰素-β编号的第25位脱酰胺基。
10.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，基本上所有的合成蛋白质类似物在按照天然干扰素-β编号的第25位脱酰胺基。
11.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物不含HA。
12.一种制备脱酰胺基的IFN-β类似物的方法，包括：
在约25-60℃的中至高温的合适条件下培育IFN-β蛋白质；
纯化和分离脱酰胺基的蛋白质类似物。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，包括：
在约40℃的温度培育约14天。
14.如权利要求13所述的方法，还包括在pH至少为4进行所述培育。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，包括在pH 7-14培育。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，包括在pH 8-9培育约14天。
17.一种治疗患者的方法，包括给予所述患者有效量的权利要求8所述的组合物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述治疗是调节患者的细胞生长，所述有效量是调节细胞生长的所述组合物用量。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述治疗是用于患者的病毒性疾病，所述有效量是抑制病毒性疾病的所述组合物用量。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述治疗是用于刺激患者的天然杀伤细胞活性，所述有效量是刺激天然杀伤细胞的所述组合物用量。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述治疗是用于患者的多发性硬化症，所述有效量是所述组合物的治疗有效量。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述治疗包括降低多发性硬化症发作的频率。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述多发性硬化症是复发缓解类型。
24.一种制作肽图的方法，包括：
在含有还原剂的pH 8以下的缓冲溶液中培育蛋白质样品；
用内切蛋白酶-C消化所培育的样品；和
通过液相层析分辨消化产物的肽片段。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述还原剂是三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，在pH约4进行所述培育。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述液相层析是RP-HPLC。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述蛋白质样品是脱酰胺基的IFN-β。
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