BG107844A

BG107844A - Методи за пречистване и регенерация на протеин

Info

Publication number: BG107844A
Application number: BG107844A
Authority: BG
Inventors: Sid Wolfe; Irina Esikova; Susan Babuka; Bret A. Shirley; Dennis Fordham
Original assignee: Chiron Corporation
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2003-05-23
Publication date: 2004-07-30
Also published as: CN1479627A; US7544354B2; NO20031839D0; US20090123424A1; BG66119B1; IL155577A0; NO326288B1; CZ301360B6; JP2004512343A; JP3946139B2; EP1366060B1; ES2299528T3; PT1366060E; WO2002034791A3; CA2427088C; PL206428B1; NO20031839L; DE60132366T2; US20020137895A1; WO2002034791A2

Description

Област на изобретението

Това изобретение се отнася до областта на

биохимичната техника. По-специално, изобретението обхваща подобрен биохимичен метод за регенериране при който като се рекомбинира интерферон-бета може да бъде нагънат отново и регенериран по същество в чиста и мономерна форма. Тази структура може да бъде използвана при фармацевтични състави.

Предшестващо състояние на изобретението

Естествено съществуващите интерферони са групи-

специфични протеини получени от различни клетки чрез индукция с вируси, двойно-усукани RNAs, други полинуклеотиди, антигени и митогени. Интерфероните проявяват многократни биологични активности, включващи антивирусни, антипролиферативни, имуномодулаторни и антиклетъчни активности. Изледването на тези активности предхожда идентификацията и характеризирането на най-малко три различни вида човешки интерферони, които са съобщени че съществуват като различни протеини кодирани чрез различни структурни гени. Интерферони, които често са гликопротеини, първоначално са класифицирани на база на техния клетъчен източник и по-късно класифицирани отново като алфа, бета (“β“) и гама.

Интерферон-бета (“IFN-β“) се получава чрез фибробласти и епителиални клетки. Природен интерферон-бета се получава чрез супериндуктиране на човешки фибробластни култури с супериндуктиране на човешки фибробластни култури с полирибоинозинова киселина и полирибоцитидилова киселина и изолиране и пречистване на така получения интерферон(и) чрез хроматографска и електрофоретична техники. Разноските и трудността на пречистване на интерфероните по този начин предотвратяват обширно клинично изследване и оценяване на терапевтичната стойност на интерфероните. Изолирането на интерферони от природни източници остава относително трудно и скъпо.

Неотдавна, няколко гени на човешки интерферон са били клонирани като се използва рекомбинантна DNA (“rDNA”) технология и са извлечени в Е. coli (Nagola et al. (1980) Nature 284:316; Goeddel et al. (1980) Nature 287:411; Yelverton et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:731; Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2848). Протеини или полипептиди които проявяват свойства подобни на природен интерферон-бета могат също да бъдат получени посредством rDNA технология чрез екстрахиране на поли-АвисококачестВена 12S носеща верига RNA от вирусно индуцирани човешки клетки, синтезиране на двойно-усукан cDNA използвайки mRNA като модел, въвеждане на cDNA в подходящ клониращ вектор, трансформиране на подходящи микроорганизми с вектора, като се събират микроорганизмите, и екстрахиране на интереферонбета от тях. Виж, например, European Patent Application Nos. 28033 (published may 6, 1981); 32134 (published july 15, 1981); u 34307 (published august 26, 1981), които описват различни методи за получаването на интерферон-бета като се използват rDNA техники. Извлечените протеини или полипептиди от рекомбинантни DNA клонинги се пречистват, изследват, и е намерено че проявяват свойства подобни на тези на природните интерферони. Така бактериално получени интерферони, потенциални терапевтици, се използват като антивирусни и антитуморни агенти. При получаването на интерферони чрез такива бактериални ферментации се добиват големи количества интерферон при относително ниски разходи, като чрез това се произвежда интерферон по-широко достъпен за много използвания, такива като клинични изследвания.

Използваният за клинични изследвания интерферон-бета трябва да бъде с относително висока чистота и по същество незамърсен с клетъчни компоненти от организми които хранят паразити, клетъчни остатъци, и други външни химикали въведени по време на етапите на екстракция и пречистване. Има няколко общоприети налични методи за получаването, регенерацията и пречистването на IFN-β.

Методите за пречистване и регенерация на IFN-β разкрити в US патенти 4,462,940 и 5,702,699 и подобни методи за получаване на чиста форма на IFN-β са насочени към образуване на уедрени частици в отсъствието на силни разтворители, например, натриев додецил сулфат (“SDS”). В допълнение, такива методи (1) излагат протеина на условия на високо pH, което може да въздейства неблагоприятно на биологичните свойства на протеините, и (2) като последица в съставите се съдържат остатъчни количества от SDS използван за разтваряне на протеина по време на пречистване.

Затова има необходимост от подобрена регенерация и метод за пречистване при който IFN-β да не се подлага на висока алкалност, образуването да е свободно или действително свободно orn SDS, u протеина ga е разтворим при pH подходящо за парентерално приложение. Цел на настоящото изобретение е да осигури фармацевтично приемлива проба от IFN-β, която да е с относително висока чистота и лесно да се нагъва отново по време на процеса на пречистването и регенерацията.

Същност на изобретението

Осигурени са подобрени методи полезни при получаването на фармацевтични състави HaIFN-β. Методите осигуряват мономерни, течни фармацевтични състави включващи IFN-β. Методите включват условия които усилват повторното нагъване на протеина по време на процеса на регенерация.

За да се постигнат гореспоменатите и други обекти и в съответствие с целта на настоящото изобретение, като включва и обширно описаните тук, настоящото изобретение осигурява подобрени методи за пречистване и регенерация на IFN-β. В един вариант, подобреният метод включва приготвяне на разтвор съдържащ IFN-β, изолиране в резевоар на по същество пречистения IFN-β от този разтвор, утаяване на пречистения IFN-β от този резервоар като се използва алкохол, и разтваряне на утаения IFN-β в гуанидин хидрохлорид за да се образува разтвор съдържащ отново разтворения денатуриран IFN-β. Този разтвор включващ отново разтворения денатуриран IFN-β след това се разрежда в подходящ първи буфер за да се получи разтвор съдържащ отново разтворения ренатуриран IFN-β. След това получаващия се разтвор се диафилтрува или диализира в буфер подходящ за фармацевтични цели. При този последен етап се отделя остатъчния гуанидин хидрохлорид, като се добива фармацевтичен състав включващ по същество мономерен IFN-β подходящ за парентерално прилагане.

В друг вариант, подобреният метод за пречистване и регенерация на IFN-β включва получаване на проба от по същество пречистен IFN-β и смесване на тази проба с гуанидин хидрохлорид за да се образува разтвор съдържащ разтворен денатуриран IFN-β. Този разтвор съдържащ разтворен денатуриран IFN-β след това се разрежда в подходящ първи буфер за да се получи разтвор включващ разтворен ренатуриран IFN-β. Получаващия се разтвор на разтворен ренатуриран IFN-β след това се диафилтрува или диализира в буфер подходящ за фармацевтични цели. Както е описано по-горе, при този последен етап се отделя остатъчния гуанидин хидрохлорид, като се добива фармацевтичен състав включващ по същество мономерен IFN-β подходящ за парентерално прилагане.

Друг аспект на настоящото изобретение се занимава с подобрен метод за регенерация на микробиално получен IFN-β. Като се използват методите от изобретението, е възможно да се получат фармацевтични състави на IFN-β които са свободни или действително свободни от SDS (по-малко от 10 микрограма SDS на милиграм IFN-β). Друг аспект на настоящото изобретение е, че субстанции такива като човешки серумен албумин (HSA) не са необходими за стабилен препарат на IFN-β когато се прилагат методите от настоящото изобретение. По същество мономерната форма на IFN-β може след това да бъде разредена във воден буфер за използване във фармацевтични състави. Така, откритите методи се използват при получаване на фармацевтичните състави от изобретението.

Кратко описание на диаграмите фигура 1 показва данни от HPLC хроматографско измерване събрани при следващо разреждане HaIFN-β в етапа на разтваряне на гуанидин хидрохлорида в различни буфери.

фигура 2 показва ефекта от солта и pH върху

регенерирането HaIFN-β от 0.4 М гуанидин НС1, 10 тМ NaPO4, pH 7.0 буфер.

фигура 3 показва ефекта на Tween 80 върху агрегирането на ренатуриран IFN-β получен съгласно методите от изобретението.

Подробно описание на изобретението

Настоящото изобретение е насочено към нови методи за

получаване на по същество мономерна форма на IFN-β. “По същество мономерен” означава, че болшинството от IFN-β (тегловно) присъстващ в препарата или състава е по-скоро мономерен отколкото агрегиран. Чрез “агрегиран” се означава физическо взаимодействие между полипептидните молекули които произтичат при образуването на нековалентни мултимери които могат да останат разтворими или които могат да се утаят от разтвора. Процентът (тегловен) на IFN-β който е мономерен в по същество мономерен състав или рецептура може да варира от 51 % или поголям. Методите от изобретението осигуряват получаване на състави включващи по същество мономерен IFN-β които са произведени без използването на традиционния стабилизатор HSA и koumo са свободни или действително свободни от разтворителя натриев додецил сулфат (SDS) (те. съдържащи по-малко от 10 микрограма SDS на милиграм IFN-β). Затова тези състави включващи по същество мономерен IFN-β са подходящи за използване във фармацевтични или терапевтични препарати. Мономерната форма на IFN-β полипептида остава разтворима, и оттук е споменато че съществува “разтворен” във фармацевтичните състави на настоящото изобретение. Така настоящото изобретение осигурява свободни от HSA, свободни от SDS, фармацевтични състави на IFN-β които включват най-малко около 51 % IFN-β в неговата мономерна форма, противопоставена на неговата агрегирана форма, за предпочитане най-малко около 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % 85 %, повече за предпочитане най-малко около 90 % или повече IFN-β в неговата мономерна форма.

В един вариант, съставът включващ по същество мономерен IFN-β се получава чрез утаяване по същество на пречистен IFN-β от разтвор, ресуспендиране на утайката чрез разтваряне в гуанидин хидрохлорид (НС1), отделяне на всякакъв SDS чрез филтруване където началната проба на IFN-β включва SDS, и след това се ренатурира IFN-β чрез разреждане на последвалия разтвор гуанидин НС1-IFN-β с подходящ буферен разтвор. Чрез “по същество пречистен” се означава че IFN-β в изходният материал е по същество свободен от компоненти които нормално съпътстват или взаимодействат с протеина както е открито в неговата естествено съществуваща околна среда, те. природна клетка, или клетка на организъм който храни паразити в случая на рекомбинантно получен IFN-β. IFN-β полипептид който е по същество свободен от клетъчен материал включва препарати на протеин които имат по-малко от около 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % или 1 % (сухо тегло) замърсяващ протен. Когато IFN-β полипептида или неговия биологично активен вариант е рекомбинантно получен, за предпочитане средата на културата представлява по-малко от около 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % или 1 % (сухо тегло) химически предшественици или непротеинови химикали. Така, споменато е, че “по същество пречистен” IFN-β за използване в методите от настоящото изобретение има ниво на чистота най-малко 70 %, за предпочитане ниво на чистота наймалко около 75 %, 80 %, 85 %, повече за предпочитане ниво на чистота най-малко около 90 % или по-голямо както е определено чрез SDS/PAGE анализ.

В друг вариант, съставът включващ по същество мономерен IFN-β се получава в отсъствието на етап на утаяване споменат по-горе. При този начин, пробата включваща по същество пречистен IFN-β се смесва с гуанидин НС1 за да се получи разтвор съдържащ разтворен денатуриран IFN-β; след това IFN-β се ренатурира чрез разреждане на последвалия разтвор гуанидин НС1IFN-β с подходящ буфер. Разклоняванията на етапите на тези получавания са базата за съставите включващи по същество мономерен IFN-β и методите от настоящото изобретение за получаване на инжектируеми формулировки включващи по същество мономерен IFN-β които са полезни за IFN-β терапия насочена към заболявания отзивчиви на IFN-β.

Терминът “IFN-бета” или “IFN-β“ както е използван тук се отнася до IFN-β или негови варианти, понякога публикувани като

IFN-р-подобни полипептиди. Така, например, човешки IFN-β варианти, които могат да бъдат естествено съществуващи (алеликни варианти които съществуват на мястото на IFN-β) или рекомбинантно получени, имат амино киселинни последователности, които са същите както, подобно на, или по същество подобни на последователността на напълно развит природен човешки IFN-β. Фрагменти на IFN-β или срязани форми на IFN-β, които запазват тяхната активност също са включени чрез термина “I FN-бе та” или “IFN-β“. Тези биологично активни фрагменти или срязани форми на IFN-β са получени чрез отстраняване на амино киселинни остатъци от пълнометражната последователност на IFN-β амино киселина като са използвани рекомбинантни DNA техники добре известни в областта. IFN-β полипептидите могат да бъдат гликозилирани (IFN-β-1а) или негликозилирани (ΙΡΝ-β-lb), както това е отбелязано в литературата при което гликозилирани и негликозилирани IFN-ps показват качествено подобни специфични активности и затова, гликозилните вериги не са замесени в и не допринасят за биологичната активност на IFN-β.

IFN-β варианти обхванати тук включват мутеини на последователност на природен напълно развит IFN-β (виж, например, US патент No 5,814,485, тук въведен чрез цитиране), където един или повече цистеинови остатъци, които не са по същество с биологична активност, умишлено се премахват или заместват с други амино киселини за да се отстранят места за междумолекулно структуриране или некоректно образуване на междумолекулна дисулфидна връзка. IFN-β варианти от този вид включват онези съдържащи глицин, валии, аланин, левцин, изолевцин, тирозин, фенилаланин, хистидин, триптофан, серин, треонин, или метионин заместен с цистеин открит при амино киселина 17 на напълно развита природна амино киселинна последователност. Серинът и треонинът са повече предпочитани заместители понеже са химически аналогични на цистеина. Сериновите замествания са повече предпочитани. Виж, например, IFN-β вариант където цистеинът открит в амино киселина 17 на напълно развита природна последователност е заместен със серин (US патент No. 5,814,485). Цистеин 17 също може да бъде премахнат като се използват методи известни в областта (виж, например, US патент No. 4,518,584, тук въведен чрез цитиране), от което произтича напълно развит IFN-β мутеин, който е една амино киселина по-къса от природен напълно развит IFN-β. Виж също, като примери, US патенти No. 4,530,787; 4,572,798; и 4,588,585. Така, IFN-β варианти с една или повече мутации, които подобряват, например, тяхната фармацевтична полезност са също включени чрез настоящото изобретение.

Квалифицираният специалист ще оцени, че могат да бъдат въведени допълнителни промени чрез мутация в кодирането на нуклеотидните последователности на IFN-β, чрез което се ръководят промените в IFN-β амино киселинната последователност, без да се промени биологичната активност на интерферона. Така, изолирана молекула на нуклеинова киселина кодираща IFN-β вариант който има последователност която се различава от амино киселинната последователност на природния IFN-β, може да бъде създадена чрез въвеждане на едно или повече нуклеотидни замествания, присъединявания, или премахвания в съответната нуклеотидна последователност кодираща природен IFN-β, така че едно или повече амино киселинни замествания, присъединявания или премахвания са въведени в кодиран IFN-β. Мутации могат да бъдат въведени чрез стандартни техники, такива като сайт-насочена мутагенеза и PCR-заемаща междинно положение мутагенеза. Такива варианти също са включени чрез настоящото изобретение.

Например, умерени амино киселинни замествания могат да бъдат направени в един или повече предсказани, за предпочитане несъществени амино киселинни остатъци. “Несъществен” амино киселинен остатък е остатък който може да бъде променен от див-тип последователност на IFN-β без промяна на неговата биологична активност, докато “съществен” амино киселинен остатък е необходим за биологична активност. “Умерено амино киселинно заместване” е онова при което амино киселинния остатък е заместен с амино киселинен остатък който има подобна странична верига. Групи от амино киселинни остатъц които имат подобни странични вериги са определени в областта. Тези групи включват амино киселини с алкални странични вериги (например, лизин, аргинин, хистидин), киселинни странични вериги (например, аспартанова киселина, глутаминова киселина), незаредени полярни странични вериги (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярни странични вериги (например, аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разклонени странични вериги (например, треонин, валин, изолевцин), и ароматни странични вериги (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, хистидин). Такива замествания не биха могли да бъдат направени за защитени амино киселинни остатъци, или амино киселинни остатъци съществуващи в защитена форма.

Алтернативно, вариант HaIFN-β нуклеотидни последователности могат да бъдат получени чрез въвеждане на мутации произволно по цялата или част от IFN-β последователност на кодиране, такива като мутагенеза на насищане, и резултантните мутанти могат да бъдат екранирани за IFN-β биологична активност, за се идентифицират мутанти които запазват активност. При следваща мутагенеза, кодирания протеин може да бъде изразен рекомбинантно, и активността на протеина може да бъде определена като се използват стандартни техники за анализ описани за това.

©

Биологично активните варианти HaIFN-β обикновенно имат най-малко 80 %, повече за предпочитане около 90 до 95 % или повече, и най-много за предпочитане около 99 % амино киселинна последователност идентична на амино киселинната последователност на споменатата IFN-β молекула, например, природен човешки IFN-β, който служи като база за сравнение. Чрез “идентична последователност” се означават същите амино киселинни остатъци открити във вариант на полипептид и полипептидната молекула която служи както се споменава когато точно се определя, съседен сегмент на амино киселинната последователност на варианта подреден в права линия и сравнен с амино киселинната последователност на споменатата молекула.

За целите на оптималното правилно взаимно разположение на двете последователности за определяне на идентичността на последователността, съседният сегмент на амино киселинната последователност на варианта може да има допълнителни амино киселинни остатъци или премахнати амино киселинни остатъци по отношение на амино киселинната последователност на споменатата молекула. Съседният сегмент използван за сравнение със споменатата амино киселинна последователност включва най-малко 20 съседни амино киселинни остатъци. Корекции за увеличаване идентичността на последователността свързани с включване на интервали във вариантите на амино киселинната последователност могат да бъдат направени чрез определяне на недостатъците на интервала. Методи за правилното взаимно разположение на последователността са добре известни в областта.

Q

Така, определянето на процента на идентичност между които и да са две последователности може да бъде извършено като се използва математически алгоритъм. Един предпочитан, неограничаВащ пример за математически алгоритъм използван за сравнение на последователности е алгоритъмът на Myers and Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-7. Такъв алгоритъм е използван в ALIGN програмата (версия 2.0), която е част от софтуерния пакет за правилно взаимно разположение GCG. Таблица за теглото на остатъка РАМ120, неудобство което произтича за дължина на интервала 12 или 4 може, да бъде използвана с ALIGN програмата когато се сравняват амино киселинни последователности. Друг предпочитан, неограничаващ пример за математически алгоритъм за използване при сравняване на две последователности е алгоритъмът на Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, модифициран както при Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такъв алгоритъм е въведен в NBLAST и XBLAST програмите на Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST проучвания за амино киселинна последователност могат да бъдат извършени с XBLAST програмата, линия = 50, дължина на думата = 3, за да се получи амино киселинна последователност подобна на интересуващия ни полипептид. За да се получат правилно взаимно разположени направени интервали за сравнителни цели, направени интервали BLAST могат да бъдат използвани както е описано в Altschul et al. (1997) Nucleic. Acids Res. 25:3389-3402. Алтернативно, PSI-BLAST може да бъде използвана за да се извърши интегрирано проучване което да установи далечна зависимост между молекулите. Виж Altschul et al. (1997) supra. Когато се използва BLAST, BLAST за правене на интервали, или PSI-BLAST програми, може да се използва несъблюдаване на параметрите. Виж the website for ncbi.nlm.gov. Виж също the ALIGN program (Dayhoff (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl. 3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) и програмите в the Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (налична от Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), например, GAP програмата, където са използвани несъблюдавани параметри от програмата.

Когато в зависимост от процента на еднаквост на амино киселинната последователност, позициите на някои амино киселинен остатък могат да се различават, се получават като резултат умерени амино киселинни замествания, които не въздействат на свойствата на протеиновата функция. В тези случаи процента на идентичност на последователността може да бъде нагласен по-висок като се взема предвид приликата на умерено заместените амино киселини. Такива нагласявания са добре известни в областта. Виж, например, Myers and Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17.

Биологично активни варианти на IFN-β включени чрез изобретението запазват IFN-β активности, по-специално способността да се свързват с IFN-β рецептори. Биологичната активност на IFN-β варианти може да бъде измерена чрез който и да е метод известен от областта. Примери за такива анализи могат да бъдат открити в Fellous et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:3082-3086; Czemiecki et al. (1984) J.Virol. 49(2): 490-496; Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-5666; Branca et al. (1981) Nature 277:221-223; Williams et al. (1979) Nature 282:582-586; Herberman et al. (1979) Nature 277:221-223; and Anderson et al. (1982) J. Biol. C Chem. 257(19):11301-11304.

Неограничаващи примери за IFN-β полипептиди и IFN-β полипептидни варианти включени чрез изобретението са изложени в Nagata et al. (1980) Nature 284:316-320; Goeddel et al. (1980) Nature 287:411-416; Yelverton et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:731-741; Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2848-2852; EP028033B1, u ЕР109748в1. Виж също US патенти 4,518,584; 4,569,908; 4,588,585; 4,738,844; 4,753,795; 4,769,233; 4,793,995; 4,914,033; 4,959,314; 5,545,723; и 5,814,485. Тези разкрития са въведени тук чрез цитиране. Тези ©цитирания осигуряват също насочване към остатъци и региони на IFN-β полипептиди които могат да бъдат променени без загуба на билогична активност.

Чрез “рекомбинантно получен IFN-β“ се означава IFN-β който има сравнима биологична активност спрямо природен IFN-β и който би могъл да се получи чрез рекомбинантни DNA техники. IFN-β може да бъде получен чрез отглеждане на клетка домакин трансформирана с експресионен вектор включващ нуклеотидна последователност която кодира IFN-β полипептид. Клетката домакин е някоя която може да транскрибира нуклеотидната последователност и да произведе желания протеин, и може да бъде прокариотна (например, Е. coli) или еукариотна (например дрожди, инсекти или клетка от бозайник). Примери за рекомбинантно получаване на IFN-β са дадени в Mantei et al. (1982) Nature 297:128; Ohno et al. (1982) Nucleic Acids Res. 10:967; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156, u U.S. патент 4,462,940 , 5,702,699 u 5,814485; myk въведени чрез цитиране. Виж също U.S. патент 5,795,779 където IFN-β е рекомбинантно получен в яйчникови клетки на китайски хамстер (СНО) ; тук въведен чрез цитиране. Гени на човешки интерферон се клонират като се използва рекомбинантна DNA (“rDNA”) технология и са изложени в Е. coli (Nagola et al. (1980) Nature 284:316; Goeddel et al. (1980) Nature 287:411; Yelverton et al. (1981) Nuc. Acid Res. 9:731; Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 78:2848). Алтернативно, IFN-β може да бъде получен чрез трансгенно животно или растение което е генетично конструирано да извлича интересуващия ни протеин в съответствие с методите известни в областта.

Протеини или полипептиди, които проявяват свойства подобни на природния интерферон-бета могат също да бъдат получени посредством rDNA технология чрез екстрахиране на поли-Ависококачествена 12S носеща верига RNA от вирусно индуцирани човешки клетки, синтезиране на двойно-усукан cDNA използвайки mRNA като модел, въвеждане на cDNA в подходящ клониращ вектор, трансформиране на подходящи микроорганизми с вектора, като се събират микроорганизмите, и екстрахиране на интереферонбета от тях. Виж, например, European Patent Application Nos. 28033 (published may 6, 1981); 32134 (published july 15, 1981); u 34307 (published august 26, 1981), koumo описват различни методи за получаването на IFN-β като се използват rDNA техники.

Алтернативно, IFN-β може да бъде химически синтезиран, чрез която и да е от няколкото техники които са известни на квалифицирания специалист от пептидната област. Виж, например, Li et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2216-2220, Steward and Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois), and Baraney and Merrifield (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, ed. Gross and Meinhofer, Vol.2 (Academic Press, New York, 1980), pp.3-254, discussing solid-phase peptide synthesis techniques; and Bodansky (1984) Principles of Peptide Synthesis (SpringerVerlag, Berlin) and Gross and Meinhofer, eds. (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol.l (Academic Press, New York), обсъждащи класическо решение за синтез. IFN-β също може да бъде получен химически по метода на съвместна многократна пептидна синтеза. Виж, например, Houghten (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135; and U.S. патент 4,631,211.

Получаване на съставите включващи по същество мономерен IFN-β, разкрито тук, за предпочитане се осъществява в съответствие с един от двата подобрени методи от настоящото изобретение. Първият от тези методи за пречистване включва три основни етапи: (1) утаяване на IFN-β от разтвор съдържащ по същество пречистен IFN-β; (2) разтваряне на IFN-β утайката в гуанидин хидрохлорид (НС1) за да се осъществи разтваряне отново на IFN-β; и (3) ренатуриране на IFN-β, за предпочитане чрез разреждане или диализа като се използва приемлив буфер. Този метод за пречистване произвежда IFN-β които е разтворим, стабилен и по същество в мономерна форма. Произтичащият състав може да бъде формулиран като фармацевтичен състав чрез понататъшно диафилтруване или диализа на този състав с фармацевтично приемлив буфер. Този последен етап отделя остатъчния гуанидин НС1 от разтвора съдържащ ренатуриран IFN-β и осигурява формулировката да има pH което е приемливо за парентерално прилагане.

Като се използва този метод за пречистване от

изобретението, първонално се получава утайката от IFN-β чрез утаяване по същество на пречистен IFN-β от разтвора. Утаяването се осъществява чрез редуциране на разтворимостта на IFN-β. Редукция на разтворимостта на IFN-β и утаяване на IFN-β може да бъде осъществено с използването на алкохол, например, алифатен алкохол такъв като етанол. За някои протеини, утаяване произтича от реакцията на денатуриране и/или агрегиране която е необратима, водеща към инактивиране на протеина, но в случая на утаения IFN-β от настоящото изобретение, реакцията на утаяване е обратима. Така, разтворимия IFN-β регенериран в следващите етапи на този метод на пречистване запазва биологичната си активност.

Произтичащата утайка след това се разтваря в гуанидин НС1 за да се получи разтвор съдържащ отново разтворен денатуриран IFN-β и гуанидин НС1. В тези случаи където по същество пречистения IFN-β се получава като се използва етапа на първоначално пречистване който включва използването на SDS като разтворител, SDS остава като утайка появяваща се след разтваряне с гуанидин НС1. Така утаеният SDS се отделя чрез филтруване като се използват стандартни техники за филтруване известни в областта, за предпочитане преди да се осъществят следващите етапи на този подобрен метод за пречистване. Количеството гуанидин НС1 за смесване с IFN-β утайка е количество достатъчно да разтвори утаения IFN-β в произтичащия разтвор гуанидин НС1IFN-β , т.е. около 6 М до около 10 М гуанидин НС1, за предпочитане около 6 М до около 9 М, повече за предпочитане около 6 М до около 8 М гуанидин НС1 в този произтичащ разтвор гуанидин НС1 - IFN-β. Въпреки че е разтворен, IFN-β в този разтвор е също денатуриран. Ренатуриране на протеина се осъществява чрез разреждане на разтвора гуанидин НС1 - IFN-β с буферен разтвор, чрез което се получава разтвор съдържащ отново разтворен ренатуриран IFN-β и остатъчен гуанидин хидрохлорид. IFN-β в този произтичащ разтвор е по същество мономерен, т.е. най-малко около 51 % е в неговата мономерна форма, за предпочитане най-малко около 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, повече за предпочитане най-малко около 90 % или повече е в неговата мономерна форма както е определено, например, при преценка чрез HPLC.

По време на етапите на повторното разтваряне и ренатуриране, гуанидин НС1 служи като разтварящ агент за да повиши разтворимостта на IFN-β. Чрез “увеличаване на разтворимостта” на IFN-β е означено увеличаване на количеството на IFN-β което може да бъде разтворено в разтвор при pH около 3.0 go pH около 9.0 в присъствието на гуанидин НС1 когато се сравнява с количеството на IFN-β което може да бъде разтворено при същото pH в разтвор със същите компоненти но при липса на гуанидин НС1. Способността на гуанидин НС1 да повишава разтворимостта на IFN-β може да бъде определена като се използват методи добре известни в областта, включващи тези разкрити тук.

Всеки подходящ буфер може да бъде използван в етапа на разреждане от този метод за пречистване от изобретението за да се осъществи ренатуриране на IFN-β. Подходящи буфери за използване в този етап включват тези разкрити по-долу, такива като ацетат, цитрат, фосфат, и трие НС1, изборът на който ще зависи от желаното pH на произтичащия разтвор следващ етапа на разреждането. Когато методът за пречистване включва етапа на утаяването, за предпочитане буферът използван за етапа на разреждане има pH от около 4.0 до около 8.0, включително 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 и 8.0, повече за предпочитане pH от около 5.0 до около 7.0. В следващия етап на разреждане, за предпочитане количеството на остатъчния гуанидин НС1 оставащо в разтвора на повторно разтворения ренатуриран IFN-β е около 1.6 М или по-малко, повече за предпочитане около 0.8 М или по-малко.

Произтичащият разтвор на повторно разтвореният ренатуриран IFN-β включва IFN-β по същество в неговата мономерна форма (т.е., повече от около 51 % е мономерна). В допълнение, разтворът на повторно разтворения ренатуриран IFN-β включва остатъчно количество гуанидин НС1. Този състав може да бъде използван за получаване на фармацевтични състави които са подходящи за парентерално приложение. В този начин, усилвателят на разтворимостта остатъчния гуанидин НС1 може да бъде отстранен от разтвора на повторно разтворения ренатуриран IFN-β чрез диализа или диафилтруване на този разтвор с фармацевтично приемлив буфер. Чрез “отстраняване на остатъчен гуанидин НСГ е означена фармацевтичната формулировка включваща по същество мономерен IFN-β получена като се използват етапите на този метод за пречистване включващ гуанидин НС1 с концентрация 10 тМ или по-малко, за предпочитане 5 тМ или по-малко. Може да бъде използван всеки фармацевтично приемлив буфер за да се получи фармацевтичната формулировка такава, че IFN-β да остава разтворен и по същество в неговата мономерна форма. В един вариант, фармацевтично приемливия буфер включва аргинин или натриев хлорид в количество достатъчно да увеличи добива на мономерната форма на IFN-β сравнен с добива получен в ф отсъствието на аргинин или натриев хлорид във фармацевтично приемливия буфер. За аргинина, количеството достатъчно да увеличи добива е около 0.2 М до около 1.0 М, за предпочитане около 0.4 М до около 0.8 М, включително около 0.4 М, 0.5 М, 0.6 М, 0.7 М и 0.8 М.

В един вариант, количеството на аргинина присъстващ във фармацевтично приемливия буфер е около 0.5 М. За натриевия хлорид количеството достатъчно да увеличи добива е около 0.2 М до около 1.2 М, за предпочитане около 0.2 М до около 1.0 М, повече за предпочитане около 0.5 М до около 1.0 М. В някой случай, количеството на натриевия хлорид присъстващ във фармацевтично приемливия буфер е около 1.0 М.

©

Вторият метод за пречистване при получаване на състав включващ по същество мономерен IFN-β е подобен на първия метод, но осигурява средства за получаване на този състав без етапа на утаяване. Този втори метод включва два основни етапи: (1) смесване на проба включваща по същество пречистен IFN-β с гуанидин хидрохлорид (НС1) за да се получи разтвор включващ разтворен денатуриран IFN-β; и (2) ренатуриране на IFN-β, за предпочитане чрез разреждане като се използва приемлив буфер.

Гуанидин НС1 служи като агент усилващ разтворимостта, както е отбелязано по-горе, и се използва в количество подобно на това отбелязано по-горе за първия метод на пречистване. Така, след първия етап, количеството на гуанидин НС1 в разтвора включващ разтворен денатуриран IFN-β е около 6М до около 10 М гуанидин НС1, за предпочитане около 6 М до около 9 М, повече за предпочитане около 6 М до около 8 М гуанидин НС1. Както е отбелязано по-горе, където първоначалния по същество пречистен IFN-β съдържа SDS, SDS утайките в този етап могат да бъдат ф филтрувани от разтвора като се използват стандартни техники за филтруване известни в областта.

Както в първия метод за пречистване, IFN-β се денатурира в този разтвор на гуанидин HCl-IFN-β. Ренатурирането се осъществява чрез разреждане като се използва приемлив буфер който има pH в обхвата от около 3.0 до около 5.0, за предпочитане около 3.0 до около 4.0, повече за предпочитане около 3.0. Подходящи буфери за този етап на разреждане за осъществяване ренатуриране на IFN-β включват глицин, аспарагинова киселина, глутаминоВа ©киселина, и сукцинат, ацетат, фосфат, формиат и цитрат, както и всякакви техни соли. В следващия етап на разреждане, за предпочитане количеството на остатъчния гуанидин НС1 оставащ в разтвора на разтворения ренатуриран IFN-β е около 1.6 М или помалко, за предпочитане около 0.8 М или по-малко, повече за предпочитане около 0.1 М или по-малко. В следващото ренатуриране, произтичащият състав включва по същество мономерен IFN-β, те., най-малко 51 %, за предпочитане най-малко 70 % е в неговата мономерна форма, както е определено, например, като се използва преценяване чрез HPLC, за предпочитане използвайки аналитично ултрацентрофугиране (виж, например, Liu and Shire (1999) J. Pharm. Sci. 88:1237-1241, въведено тук чрез цитиране). Остатъчният гуанидин НС1 в този разтвор на ренатуриран IFN-β може да бъде отстранен по начин подобен на този отбелязан за първия метод на пречистване за да се получи фармацевтична формулировка включваща по същестВо мономерен IFN-β. Всеки фармацевтично приемлив буфер може да бъде използван, както е отбелязано другаде тук, така че IFN-β да остава разтворен и по същество в неговата мономерна форма. В някой случай, фармацевтично приемливия буфер се избира от групата включваща глицин, аспарагинова киселина и натриев сукцинат, за предпочитане глицин, така че фармацевтичната формулировка да има pH от около 3.0 до около 5.0, за предпочитане около 3.0 до около 4.0, повече за предпочитане около 3.0.

Така, по същество мономерната форма на IFN-β осигурена чрез методите за пречистване от настоящото изобретение има няколко приложения както е разкрито в настоящото изобретение. Например, тази форма на IFN-β може да бъде използвана директно при формулиране на фармацевтични състави подходящи за парентерална употреба както е отбелязано тук. Следва етапа на диафилтруване или диализа с фармацевтично приемлив буфер по избор, за да се отстрани остатъчния гуанидин НС1, като произтичащите фармацевтични състави могат да бъдат стабилизирани срещу денатуриране и загуба на биологична активност чрез включване на стабилизатор във фармацевтичните състави, който включва но не се ограничава до протеини или карбохидрати, за предпочитане избран от групата съдържаща манитол, сорбитол, глицерол, декстроза, захароза и трехалоза, или тяхна смес. В по нататъшен аспект на настоящото изобретение, препаратът IFN-β получен от етапите на диафилтруВане (или диализа) и стабилизиране може да бъде лиофилизиран и възстановен в инертна, нетоксична, физиологично съвместима среда на носител за терапевтични и клинични приложения.

Фармацевтичните състави от изобретението са формулирани с известна концентрация на по същество мономерната форма на IFN-β, такава, че прилагането на специална доза да допринася за желан терапевтичен отговор с оглед на специфичния IFN-β отзивчив спрямо състояние подложено на терапия. Чрез “желан терапевтичен отговор” е означено подобряване на състоянието или на симптомите свързани със сътоянието.

фармацевтичните състави включващи IFN-β са полезни при терапия насочена за лечение на IFN-β отзивчиви състояния. Чрез “терапия” е означено лечение на съществуващо нормално състояние което е подобрено чрез IFN-β терапия, терапевтично лечение на ненормално състояние което е отзивчиво на IFN-β, и превантивни или профилактични процедури включващи лечение с IFN-β така както и предпазване или намаляване суровостта от съществуване на ненормално състояние. Чрез “IFN-β- отзивчиво състояние” е означено всяко състояние, което реагира позитивно или негативно на IFN-β. Така IFN-β -отзивчивото състояние може да бъде нормално състояние. Например, бозайник може да понася IFN-β терапия за да се увеличат отзиВчивостите и/или способността за имунния отговор. Такива терапии обхващат лечение за осигуряване на защита срещу или промяна на суровостта на вирусни инфекции, например, Dengue virus или Sindbis virus. В противоположност, IFN-β отзивчивото състояние може да бъде ненормално състояние такова като злокачествен меланом. Такива ненормални състояния могат да бъдат хронични, и така се явяват повече или по-малко постоянни, или такива ненормални състояния могат да бъдат акутни. IFN-β отзивчивото състояние може да бъде състояние, което е възможно да бъде характеризирано и като двете, хронично и акутно, такова като отслабващо-влошаваща се множествена склероза. Всяко IFN-β отзивчиво заболяване може да извлича полза от прилагане на IFN-β фармацевтичните състави от настоящото изобретение. Състоянията отзивчиви на IFN-β също могат да включват имунологични заболявания, такива като имунна недостатъчност, включително намалена имунна толерантност като последица от заболяване или инфекция или увреждане на имунния отговор произтичащо от околната среда или други въздействия, такива като химиотерапия или друго излагане на токсични химикали.

Следните примери са предложени, впрочем, за илюстрация а не за ограничение.

Експериментална част

Пример 1: Получаване на IFN-β

IFN-β за използване в тези експерименти се получава в

Е. coli по същество както е описано в първите няколко етапи на пречистване изложено в U.S. патент No. 4,462,940 и/или 4,816,400. Това е, че се използват трансформирани бактерии за получаване на IFN-β; клетки домакини се концентрират, и техните клетъчни стени се разкъсват. След това IFN-β се получава съгласно методите от настоящото изобретение от които следва получаване на резервоар с пречистен IFN-β.

Основната процедура е както следва:

1. Утаява се IFN-β от резервоара с пречистен IFN-β като се използва етанол. За шест части пречистен IFN-β от резервоара се използват четири части етанол. Този етап произвежда повече от 80% от интерферона като пелета която може да бъде центрофугирана.

2. След това пелетата се разтваря в 8 М гуанидин НС1

до разтвор с около 10 mg/ml протеин. Това разтваряне е бързо; присъстващото малко количество SDS е не разтворено и се отделя чрез филтруване.

3. Произтичащият разтвор на гуанидин НС1 след това се разрежда в 10 тМ буфер.

Пример 2: Параметри на разреждане за гуанидин хидрохлоридния етап

Осъществяват се първоначални експерименти за да се определят параметрите на оптималното разреждане за етапа на гуанидин хидрохлоридното разреждане. Извършва се малко-мащабен експеримент който измерва относителни добиви, както е очертано в таблица 1; най-добри резултати са получени над pH 4.0 и под 0.8 М гуанидин хидрохлорид след разреждане. Концентрацията на мономера интерферон-бета се определя като се използва преценяване чрез HPLC с буфера 400 тМ глицин, pH 3.0. Резултатите в таблица 2 и типичната група хроматограми от фигура 1 показват, че въпреки че нековалентни мултимери се получават при по-ниски pH-та, мономерен интерферон-бета се получава при pH 5.0 и повече.

Таблица 1: Относителен добив след разреждане на гуанидин НС1 (8М)

IFN (~10 mg/ml) определен чрез HPLC.

Концентрация на гуанидин НС1 след разреждане

10 тМ буфер	pH	0.2 М	0.4 М	0.8 М	1.6 М
Глицин	3	2	2.1	1	1
Натриев ацетат	4	13	12.7	6	2
Натриев ацетат	5	68	68	33	30
Натриев цитрат	6	79	62	43	42
Натриев фосфат	7	82	71	41	48
Трие НС1	8	99	83	40	38

Таблица 2: Процентни уедрявания след разреждане на гуанидин НС1 (8М)

IFN (~10 mg/ml) определен чрез HPLC.

		Концентрация на гуанидин НС1 след разреждане
10 тМ буфер Глицин Натриев ацетат Натриев ацетат Натриев цитрат Натриев фосфат Трие НС1	pH 3 4 5 6 7 8	0.2 М 78 <1 1 1 1 1	0.4 М 51 3 1 1 1 2	0.8 М 35 4 1 1 1 1	1.6 М 39 11 2 2 3 2

Пример 3: Добив от етапа на гуанидиново разреждане

Процесът е снабден със скала за да се изчисли добивът от етапа на гуанидиновото разреждане. Резултатите в таблица 3 показват, че може да бъде получен 41 % до 57 % добив с четиридесет-кратно разреждане при pH 6 до 8 с крайна протеинова концентрация около 0.15 mg/ml. Концентрациите на SDS в изследваните проби са по-малки от 10 микрограма на милиграм IFN.

Таблица 3: Регенерация на повторно сгъване от 8 М гуанидин НС1 (40х разреждане)

10 тМ буфер	рн	[IFN] mg/ml	% добив
Натриев цитрат	6	0.12	41
Натриев фосфат	7	0.17	57
Трие НС1	8	0.15	52

Пример 4: Отделяне на остатъчен гуанидин НС1, присъстващ след разреждане, чрез диализа.

Използва се диализа за да се отстрани остатъчен гуанидин НС1, присъстващ след разреждане. При pH 5 се получава най-висок добив, 83 %, без допълнително присъстващ Nad; и при pH 7.0 се получава най-висок добив, 70 %, с присъствие на 1000 тМ NaCl както е показано на фигура 2. Във всички случаи, има утаяване след диализа, обаче разтворимата фракция е мономерна, както е преценено като се използва HPLC.

Пример 5: Въздействие на разбъркването върху материала гуанидин хидрохлорид-ренатуриран IFN-β

Малък обем от IFN-β в буфер съдържащ 10 тМ фосфат (при pH 7.0) и 100 тМ NaCl се поставя в тръба върху вибратор.

След около 3 часа, около 50% от IFN-β материала се утаява. Това подсказва, че стабилизирането ще бъде повишено чрез подходящо повърхностно-активно вещество, такова като Tween 80. Добавянето на Tween 80 стабилизира интерферона и затова добивът се повишава от диализния етап. Обаче, Tween 80 може също да предизвика уедряване в зависимост от начина на концентриране, както е показано на фигура 3. Тези уедрени частици са разтворими. Други повърхностно-активни вещество могат да се представят пооптимално.

Пример 6: Ренатуриране на протеин и оптимизиране на формулирането чрез използване на факториално означено сближаване

Серии от експерименти са оценени за да се определи регенерирането на IFN-β по време на (1) денатуриране на IFN-β в 8 М гуанидин хидрохлорид; (2) повторно нагъване на IFN-β чрез бързо разреждане с буфер; и (3) диализа за да се отдели остатъчен гуанидин хидрохлорид с и без присъствие на аргинин за да се получи крайна формулировка. Съставът на формулировката и условията на етапи 1-3 се оптимизират чрез използване на полу-факториално означен експеримент. Използваните фактори са протеинова концентрация, гуанидин хидрохлоридна концентрация, pH, температура и аргининова концентрация.

Открито е, че pH, концентрацията на IFN-β, гуанидин хидрохлоридната концентрация след разреждане и аргининовата концентрация са важни моделни термини. Най-големите приноси на модела се получават от IFN-β и концентрацията на аргинин. Взаимодействието между аргинина и pH играе значителна роля. Най добрите резултати се получават с 10 тМ NaPO4 буфер с pH 7.0 съдържащ аргинин в крайния буфер. Общият добив от етапи 1-2 е над 80-100 % и добива на етап 3 е 70-80 %.

Пример 7: Отделяне на SDS и образуване на IFN-β без използването на етанолно утаяване.

Пречистен IFN-β-ΙΙ) (1 L при 1.91 mg/ml в 0.4 % SDS, 50 тМ ацетатен буфер, pH 5.5) се съхранява при 5 °C. По време на съхраняване, малко от присъстващия SDS се утаява. 250 ml от този материал (477.5 mg) се смесват с 229 g гуанидин хидрохлорид (6М, общ обем 400 ml) и се разбъркват при стайна температура за 15 минути като се използва магнитен прът за разбъркване. 6М разтвор гуанидин хидрохлорид/протеин след това се филтрува с Sartobran® Capsule (размер на порите 0.45 цт) за да се отстрани утаеният SDS. Протеиновата концентрация както е определена чрез UV при 280 пт е 1.02 mg/ml. Добивът на протеин е 406 mg или 85 %.

400 ml гуанидин хидрохлорид-обработен материал се концентрира като се използва диафилтрационната система Millipore® Labscale® IFF (Millipore, Inc.) c две полисулфонови мембрани Pellicon® XL Biomax® 0.1 cm² 10 kD (Millipore, Inc.). Обемът след етапа на концентриране е 37 ml с концентрация на протеин 10.3 mg/ml за добив след концентриране 381 mg или 93 %.

Като се използва пипета за прехвърляне, 10 ml (103 mg) концентриран разтвор гуанидин хидрохлорид/протеин постепенно се добавят към 590 ml на 5 тМ глицинов разтвор, pH 3.2. Буферът се разбърква бързо като се използва магнитен прът за разбъркване;

протеиновият разтвор се добавя директно към вихъра (който се образува при разбъркването). Това 60Х разреждане на 6 М разтвор гуанидин хидрохлорид/протеин произвежда 0.1 М разтвор гуанидин хидрохлорид/протеин при 0.17 mg/ml. Тези 600 ml се прехвърлят към инсталация с 500 ml скала за диафилтруване оборудвана с две полисулфонови мембрани Pellicon® II 10 kD, 0.1 т². Този разтвор първоначално се концентрира до -400 ml с концентрация на протеин 0.23 mg/ml, и след това се диафилтруват около 9 променени обеми (3.6 L) с тМ глицин при pH 3.2. Крайният диафилтрат (402 ml) се измерва чрез UV при 280 пт за крайна протеинова концентрация от 0.23 mg/ml с 92.46 mg или 90 % добив за етапа на диафилтруване, и сумарен добив от 72 % разтворим протеин за процеса на пречистване.

Всички публикации и патентни заявки споменати в описанието са показателни за нивото на квалифицирания специалист от областта към която принадлежи това изобретение. Всички публикации и патентни заявки са въведени тук чрез цитиране в същата степен както, ако за всяка отделна публикация или патентна заявка е специално и индивидуално отбелязано да бъде въведена чрез цитиране. Подзаглавията в описанието за включени единствено за удобство при преглеждане на документа и не са по никакъв начин означени да бъдат ограничение върху съдържанието на документа.

Въпреки, че гореизложеното изобретение е описано приблизително подробно, впрочем за илюстрация, и с примери, които целят яснота при разбирането му, очевидно е, че известни промени и модификации могат да бъдат практикувани в обхвата на изобретението.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Метод за получаване на инжектируема формулировка на интерферон-бета (INF-β) включващ:

а) приготвяне на първи разтвор съдържащ INF-β, като се изолира резервоар с пречистен INF-β от този разтвор и утаяване на споменатия INF-β от този резервоар като се използва алкохол за да се образува утайка;

Ь) разтваряне на споменатата утайка в гуанидин хидрохлорид (НС1) за да се образува втори разтвор включващ повторно разтворен денатуриран INF-β и гуанидин НС1;

с) разреждане на споменатия втори разтвор в първи буфер за да се получи трети разтвор съдържащ повторно разтворен ренатуриран IFN-бета и остатъчен гуанидин НС1; и

d) отделяне на остатъчния гуанидин НС1 от споменатия трети разтвор чрез диафилтруване или диализа на споменатия трети разтвор във втори буфер който е фармацевтично приемлив, чрез което се получава споменатата инжектируема формулировка на INF-β.
2. фармацевтичен състав включващ по същество мономерен INF-β получен по метода от претенция 1.
3. Метод съгласно претенция 1, където споменатия втори буфер съдържа аргинин или натриев хлорид.
4. Метод съгласно претенция 1, където споменатия първи буфер има pH от около 5.0 до около 8.0, и където споменатия остатъчен гуанидин НС1 присъства в споменатия трети разтвор при концентрация 1.6 М или по-малко.
5. Метод за получаване на инжектируема формулировка на интерферон-бета (INF-β), като споменатия метод включва денатуриране на INF-β с гуанидин хидрохлорид (НС1) последвано от ренатуриране на INF-β чрез разреждане в първи буфер за да се получи разтвор на ренатуриран INF-β включващ остатъчен гуанидин НС1, и отстраняване на споменатия остатъчен гуанидин НС1 от споменатия разтвор на ренатуриран INF-β чрез диафилтруване или диализа на споменатия разтвор на ренатуриран INF-β във втори буфер който е фармацевтично приемлив, чрез което се получава споменатата инжектируема формулировка на INF-β.
6. Метод съгласно претенция 5, където споменатия първи буфер има pH от около 3.0 до около 5.0, и където споменатия остатъчен гуанидин НС1 присъства в споменатия разтвор на ренатуриран INF-β при концентрация 1.6 М или по-малко.
7. Метод съгласно претенция 6, където споменатия първи буфер има pH от около 3.0 до около 4.0, и където споменатия остатъчен гуанидин HCI присъства в споменатия разтвор на ренатуриран INF-β при концентрация 0.2 М или по-малко.
8. Метод съгласно претенция 7, където споменатия първи буфер има pH от около 3.0 и където споменатия остатъчен гуанидин НС1 присъства в споменатия разтвор на ренатуриран INF-β при концентрация 0.1 М или по-малко.
9. фармацевтичен състав включващ по същество мономерен INF-β получен по метода от претенция 5.
10. Метод за получаване на състав включващ по същество мономерен интерферон-бета (INF-β), като споменатия метод включва:

a) приготвяне на утайка на по същество пречистен INF-β

b) разтваряне на споменатата утайка в гуанидин хидрохлорид (НС1) до получаване на първи разтвор съдържащ повторно разтворен денатуриран INF-β; и

с) ренатуриране на споменатия INF-β чрез разреждане на споменатия първи разтвор с буферен разтвор.
11. Метод съгласно претенция 10, където споменатия буферен разтвор има pH от около 5.0 до около 8.0.
12. фармацевтичен състав включващ по същество мономерен INF-β получен по метода от претенция 10.
13. Метод за получаване на инжектируема формулировка на интерферон-бета (INF-β), като споменатия метод включва:

а) получаване на проба включваща по същество пречистен

IFN-β;

Ь) смесване на споменатата проба с гуанидин хидрохлорид (НС1) за да се получи първи разтвор включващ разтворен денатуриран IFN-β;

c) разреждане на споменатия първи разтвор в първи буфер за да се получи втори разтвор съдържащ разтворен ренатуриран IFN-бета и остатъчен гуанидин НС1; и

d) отстраняване на остатъчния гуанидин НС1 от споменатия втори разтвор чрез диафилтруване или диализа на споменатия втори разтвор във втори буфер който е фармацевтично приемлив, чрез което се получава споменатата инжектируема формулировка на IFN-β.
14. фармацевтичен състав включващ по същество мономерен INF-β получен по метода от претенция 13.
15. Метод съгласно претенция 13, където споменатия първи буфер има pH от около 3.0 до около 5.0, и където споменатия остатъчен гуанидин НС1 присъства В споменатия втори разтвор при концентрация 1.6 М или по-малко.
16. Метод съгласно претенция 15, където споменатия първи буфер има pH от около 3.0 до около 4.0, и където споменатия остатъчен гуанидин НС1 присъства в споменатия втори при концентрация 0.2 М или по-малко.
17. Метод съгласно претенция 16, където споменатия първи буфер има pH от около 3.0 и където споменатия остатъчен гуанидин НС1 присъства в споменатия разтвор на ренатуриран INF-β при концентрация 0.1 М или по-малко.
18. Метод за получаване на състав включващ по същество мономерен интерферон-бета (INF-β), като споменатия метод включва:

a) приготвяне на проба включваща по същество пречистен INF-β;

b) смесване на споменатата проба с гуанидин хидрохлорид (НС1) за да се получи първи разтвор включващ разтворен денатуриран IFN-β; и

c) ренатуриране на споменатия INF-β чрез разреждане на споменатия първи разтвор с буферен разтвор.
19. Метод съгласно претенция 18, където споменатия буферен разтвор има pH от около 3.0 до около 5.0.
20. фармацевтичен състав включващ по същество мономерен INF-β получен по метода от претенция 18.