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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft das Gebiet der Biotechnologie. Die Erfindung
betrifft insbesondere einen verbesserten biochemischen Gewinnungsprozess,
bei dem rekombinantes Interferon-beta zurückgefaltet und in im Wesentlichen
reiner und monomerer Form gewonnen werden kann. Diese Zusammensetzung
kann in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Natürlich vorkommende
Interferone sind Spezies-spezifische Proteine, die von verschiedenen
Zellen bei einer Induktion durch Viren, doppelsträngige RNAs,
durch andere Polynukleotide, Antigene und Mitogene produziert werden.
Interferone zeigen vielfältige
biologische Aktivitäten,
einschließlich
antivirale, antiproliferative, immunmodulatorische und andere zelluläre Aktivitäten. Die
Erforschung dieser Aktivitäten
hat zur Identifizierung und Charakterisierung von mindestens drei
verschiedenen Arten von humanen Interferonen geführt, von denen berichtet wird,
dass es sich um verschiedene Proteine handelt, die durch einzelne
Strukturgene kodiert werden. Interferone, die oftmals Glykoproteine
sind, wurden ursprünglich
auf Basis ihres zellulären
Ursprung klassifiziert, und sie wurden später als alpha, beta ("β") und gamma reklassifiziert.
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Interferon-beta
("IFN-β") wird durch Fibroblasten
und Epithelzellen produziert. Natives Interferon-beta wurde durch
Superinduktion von Kulturen humaner Fibroblasten mit Polyriboinosylsäure und
Polyribocytidylsäure
und Isolierung und Aufreinigung des (der) auf diese Weise erzeugten
Interferons (Interferone) durch chromatographische und elektrophoretische
Methoden hergestellt. Die Kosten und die Schwierigkeit einer auf diese
Weise erfolgenden Aufreinigung der Interferone haben eine umfangreiche
klinische Untersuchung sowie eine Bewertung des therapeutischen
Werts der Interferone verhindert. Die Isolierung der Interferone
aus natürlichen
Quellen bleibt relativ schwierig und kostenintensiv.
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Kürzlich sind
mehrere humane Interferon-Gene unter Verwendung eines Verfahrens
mit rekombinanter DNA ("rDNA") kloniert und in
E. coli exprimiert worden (Nagola et al. (1980) Nature 284: 316;
Goeddel et al. (1980) Nature 287: 411; Yelverton et al. (1981) Nature
Acids Res. 9: 731; Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78: 2848) exprimiert worden. Proteine oder Polypeptide, die
native Interferon-beta-ähnliche
Eigenschaften aufweisen, können
ebenfalls mit der rDNA-Technologie
hergestellt werden, indem man poly-A-reiche 12S-Boten-RNA aus viral induzierten humanen
Zellen extrahiert, unter Verwendung der mRNA als Matrize doppelsträngige cDNA
synthetisiert, die cDNA in einen geeigneten Klonierungsvektor einbringt,
geeignete Mikroorganismen mit dem Vektor transformiert, die Mikroorganismen
erntet und das Interferon-beta aus diesen Mikroorganismen extrahiert.
Siehe beispielsweise Europäische
Patentanmeldung Nr. 28033 (veröffentlicht
am 6. Mai 1981); 32134 (veröffentlicht
am 15. Juli 1981) und 34307 (veröffentlicht
am 26. August 1981), in denen verschiedene Verfahren zur Herstellung
von Interferon-beta unter Verwendung von der rDNA-Methode beschrieben
werden. Die von rekombinanten DNA-Klonen exprimierten Proteine oder
Polypeptide wurden gereinigt und untersucht, und es wurde herausgefunden,
dass sie Eigenschaften aufweisen, die denjenigen von nativen Interferonen ähnlich sind.
Bakteriell hergestellte Interferone haben somit eine potentielle
therapeutische Verwendung als antivirale Mittel und als Antitumormittel.
Die Herstellung von Interferonen durch solche bakteriellen Fermentationen
ergibt hohe Mengen von Interferon zu verhältnismäßig geringen Kosten, wodurch
die Herstellung von Interferon in stärkerem Maße für zahlreiche Verwendungen,
wie z. B. für
klinische Studien, verfügbar
wird.
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Interferon-beta
zur Verwendung in klinischen Studien muss von verhältnismäßig hoher
Reinheit und im Wesentlichen unkontaminiert von toxischen Bestandteilen
der Wirtszelle, Zelltrümmern
und anderen fremden Chemikalien sein, die während der Extraktions- und
Aufreinigungsschritte eingebracht werden. Es gibt mehrere Verfahren,
die gegenwärtig
für die
Herstellung, Gewinnung und Aufreinigung von IFN-β verfügbar sind.
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Die
Verfahren zur Aufreinigung und Gewinnung von IFN-β, die in
US-Patent Nr. 4,462,940 und
5,702,699 beschrieben sind,
sowie ähnliche
Verfahren führen
zu einer reine Form von IFN-β,
die dazu neigt, in Abwesenheit von stark solubilisierenden Mitteln,
z. B. Natriumdodecylsulfat ("SDS") dazu neigen, Aggregate zu
bilden. Darüber
hinaus (1) wird das Protein bei solchen Verfahren hohen pH-Bedingungen
ausgesetzt, die die biologischen Eigenschaften des Proteins negativ
beeinflussen können,
und (2) führen
die Verfahren zu Zusammensetzungen, die Restmengen an SDS enthalten,
das für
die Solubilisierung des Proteins während der Aufreinigung verwendet
wurde.
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Somit
besteht ein Bedürfnis
nach einem verbesserten Verfahren zur Gewinnung und Aufreinigung,
bei dem das IFN-β keinen
starken alkalischen Bedingungen unterzogen wird, die Formulierung
frei oder im Wesentlichen frei von SDS ist, und das Protein bei
einem pH-Wert löslich
ist, der für
die parenterale Verabreichung geeignet ist. Es ist ein Ziel der
vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutisch akzeptable Probe von
IFN-β bereitzustellen,
die von verhältnismäßig hoher
Reinheit ist und problemlos während
des Verfahrens der Aufreinigung und Gewinnung zurückgefaltet
wird.
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Lee
et al., Korean Biochemical Journal, 23(2), 161–171 (1990) offenbaren die
Aufreinigung von Interferon-beta, das durch ein Verfahren, welches
eine Präzipitation,
eine Solubi lisierung und eine Verdünnung des Proteins in Natriumphosphatpuffer
mit einem pH-Wert von 7,2 umfasst, aus rekombinantem Escherichia
coli erhalten wird.
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EP-A-0 360 937 offenbart
die Aufreinigung von rekombinantem Interferon-beta durch ein Verfahren, das
eine Präzipitation
mit Sucrose, eine Solubilisierung des Präzipitats mit Guanidin-HCl sowie
eine Dialyse der Lösung
zur Entfernung des Guanidins umfasst.
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Pepinsky,
Anal Biochem., 195(1), 177–181
(1991) beschreibt die selektive Präzipitation von Proteinen aus
Guanidin-Hydrochlorid-enthaltenen
Lösungen
mit Ethanol.
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Van
Oss, J. Protein Chem., 8(5), 661–668 (1989) beschreibt ein
Verfahren zur Präzipitation
von Plasmaproteinen durch das Verfahren mit kaltem Ethanol.
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Russel-Harde
et al., J. Interferon Cytokine Res., 15(1), 31–37 (1995) offenbaren ein Verfahren
für die Aufreinigung
von rekombinantem Interferon-beta Ser-17 (Betaseron). In Bakterien
produziertes Betaseron wird mit einem nicht-denaturierenden Detergens
bei einem pH-Wert von 12 solubilisiert. Das Detergens wird entfernt,
wobei sowohl eine Ionenaustausch- als auch eine Größenausschlusschromatographie
verwendet wird. Schließlich
wird das gereinigte Betaseron durch Dialyse gegen einen nicht-reduzierenden
Puffer zurückgefaltet.
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WO 98/27211 offenbart die
Herstellung und Aufreinigung von rekombinantem, humanem beta-cis-Interferon
durch Solubilisierung des aggregierten Interferons mit Guanidin-HCl
und anschließender
Nickel-NTA-Chromatographie.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
werden verbesserte Verfahren bereitgestellt, die nützlich bei
der Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen von IFN-β sind. Die
Verfahren stellen monomere, flüssige
pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die IFN-β umfassen.
Die Verfahren umfassen Bedingungen, welche die Rückfaltung des Proteins während des
Gewinnungsprozesses verbessern.
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Um
das oben Genannte sowie weitere Ziele zu erreichen, stellt die vorliegende
Erfindung gemäß dem Zweck
der Erfindung, wie er vorliegend verwirklicht und umfänglich beschrieben
wird, verbesserte Verfahren zur Aufreinigung und Gewinnung von IFN-β bereit.
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In
einer weiteren Ausführungsform,
umfasst das verbesserte Verfahren zur Aufreinigung und Gewinnung
von IFN-β das
Erhalten einer Probe von im Wesentlichen gereinigtem IFN-β und das
Mischen dieser Probe mit Guanidin-Hydrochlorid, wobei eine Lösung gebildet
wird, die solubilisiertes, denaturiertes IFN-β umfasst. Diese Lösung, die
solubilisiertes, denaturiertes IFN-β umfasst, wird dann in einem
geeigneten ersten Puffer verdünnt,
wobei eine Lösung
erhalten wird, die solubilisiertes, renaturiertes IFN-β umfasst.
Die resultierende Lösung
mit solubilisiertes renaturiertem IFN-β wird anschließend diafiltriert
oder in einen Puffer dialysiert, der für pharmazeutische Zwecke geeignet
ist. Wie oben angemerkt, entfernt dieser letzte Schritte das restliche
Guanidin-Hydrochlorid, was zu einer pharmazeutischen Formulierung
führt,
die für
die parenterale Verabreichung geeignet ist und im Wesentlichen monomeres
IFN-β umfasst.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
Daten einer Größen-HPLC-Chromatographie,
die nach Verdünnen
von IFN-β aus
dem Guanidin-Hydrochlorid-Solubilisierungsschritt mit verschiedenen
Puffer gesammelt wurden.
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2 zeigt
die Wirkung von Salz und pH-Wert auf die Gewinnung von IFN-β aus einem
Puffer von 0,4 M Guanidin-HCl, 10 mM NaPO4,
pH 7,0.
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3 zeigt
die Wirkung von Tween 80 auf die Aggregation von renaturiertem IFN-β, das nach
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zur Herstellung einer
im Wesentlichen monomeren Form von IFN-β. Mit "monomer" ist gemeint, dass der Großteil des
in einer Zubereitung oder in einer Zusammensetzung vorhandenen IFN-β (nach Gewicht)
monomer statt aggregiert ist. Mit "aggregiert" ist eine physikalische Interaktion
zwischen den Polypeptidmolekülen
gemeint, die zur Bildung von nicht-kovalenten Multimeren führt, welche
löslich
bleiben können
oder aus der Lösung
präzipitieren
können.
Der prozentuale Anteil (nach Gewicht) von IFN-β, das in einer monomeren Zusammensetzung
oder in einer monomeren Formulierung monomer ist, kann 51% oder
mehr betragen. Die erfindungsgemäßen Verfahren
ermöglichen
die Herstellung von Zusammensetzungen, die monomeres IFN-β umfassen
und ohne Verwendung des herkömmlichen stabilisierenden
Mittels HSA hergestellt wurden und frei oder im Wesentlichen frei
vom solubilisierenden Mittel Natriumdodecylsulfat (SDS) sind (d.
h. sie enthalten weniger als 10 μg
SDS pro Milligramm IFN-β).
Diese Zusammensetzungen, die monomeres IFN-β umfassen, sind daher zur Verwendung
in pharmazeutischen oder therapeutischen Zubereitungen nützlich.
Die monomere Form des IFN-β-Polypeptids
bleibt löslich
und wird daher als in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen "solubilisiert" bezeichnet. Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
somit die Herstellung von HSA-freien,
SDS-freien pharmazeutischen IFN-β-Zusammensetzungen,
die mindestens 51% des IFN-β in
seiner monomeren Form umfassen, und nicht in seiner aggregierten
Form, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,
wobei es stärker
bevorzugt wird, dass mindestens 90% oder mehr des IFN-β in seiner
monomeren Form vorliegt.
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In
einem Beispiel, das zum Zwecke eines verbesserten Verständnisses
der Erfindung bereitgestellt wird, und das keine Ausführungsform
der Erfindung darstellt, wird die monomeres IFN-β umfassende Zusammensetzung
hergestellt, indem man im Wesentlichen gereinigtes IFN-β aus einer
Lösung
präzipitiert,
das Präzipitat
durch Lösen
in Guanidin-Hydrochlorid (HCl) resuspendiert, sämtliches restliches SDS durch
Filtration entfernt, wobei die Ausgangsprobe von IFN-β SDS umfasst,
und anschließend
das IFN-β durch
Verdünnung der
resultierenden Guanidin-HCl-IFN-β-Lösung mit
einer geeigneten Pufferlösung
renaturiert. Mit "im
Wesentlichen gereinigt" ist
gemeint, dass das IFN-β im
Ausgangsmaterial im Wesentlichen frei von Bestandteilen ist, die
normalerweise das Protein, wie es in seiner natürlichen Umgebung (d. h. eine
native Zelle oder eine Wirtszelle im Falle des rekombinant hergestellten
IFN-β) vorgefunden
wird, begleiten oder mit diesem interagieren. Ein IFN-β-Polypeptid,
das frei von zellulärem
Material ist, umfasst Zubereitungen des Proteins mit weniger als 30%,
25%, 20%, 15%, 10%, 5% oder 1% (nach Trockengewicht) an kontaminierendem
Protein. Wenn das IFN-β-Polypeptid
oder eine biologisch aktive Variante davon rekombinant hergestellt
wird, stellt das Kulturmedium vorzugsweise weniger als 30%, 25%,
20%, 15%, 10%, 5% oder 1% (nach Trockengewicht) der chemischen Vorläufer oder
der Chemikalien, bei denen es sich nicht um das Protein von Interesse
handelt, dar. Somit besitzt ein "im
Wesentlichen gereinigtes" IFN-β zur Verwendung
in den erfindungsgemäßen Verfahren
einen Reinheitsgrad von mindestens 70%, vorzugsweise einen Reinheitsgrad
von mindestens 75%, 80%, 85%, wobei ein Reinheitsgrad von mindestens
90% oder mehr bevorzugt wird, wobei dieser durch SDS/PAGE-Analyse bestimmt
wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird die Zusammensetzung, die monomeres IFN-β umfasst, in Abwesenheit des
oben erwähnten
Präzipitationsschritts
hergestellt. Auf diese Weise wird eine Probe, die im Wesentlichen
gereinigtes IFN-β umfasst,
mit Guanidin-HCl gemischt, wobei eine Lösung erhalten wird, die solubilisiertes,
denaturiertes IFN-β umfasst;
das IFN-β wird
anschließend
durch Verdünnen
der resultierenden Guanidin-HCl-IFN-β-Lösung mit
einem geeigneten Puffer renaturiert. Die Auswirkungen dieser Herstellungsschritte
sind die Basis für
die erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung von injizierbaren Formulierungen, die im Wesentlichen
monomeres IFN-β umfassen,
und die für
die IFN-β-Therapie,
welche sich auf Erkrankungen richtet, die auf IFN-β reagieren,
nützlich
sind.
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Der
Begriff "IFN-beta" oder "IFN-β" bezeichnet wie vorliegend
verwendet IFN-β oder
Varianten davon, die manchmal als IFN-β-ähnliche Polypeptide bezeichnet
werden. Daher weisen beispielsweise humane IFN-β-Varianten, die natürlich vorkommend
sein können
(z. B. allelische Varianten, die am Locus von IFN-β-vorkommen) oder rekombinant
hergestellt sein können,
Aminosäuresequenzen
auf, die der reifen nativen humanen IFN-β-Sequenz entsprechen oder dieser ähnlich oder
im Wesentlichen ähnlich
sind. Fragmente von IFN-β oder
trunkierte Formen von IFN-β,
die ihre Aktivität
beibehalten, sind ebenfalls vom Begriff "IFN-β" oder "IFN-beta" umfasst. Diese biologisch
aktiven Fragmente oder trunkierten Formen von IFN-β werden hergestellt,
indem man Aminosäurereste
aus der IFN-β-Aminosäuresequenz
vollständiger Länge unter
Verwendung im Stand der Technik bekannter rekombinanter DNA-Verfahren
entfernt. IFN-β-Polypeptide
können
glycosyliert (IFN-β-1a)
oder unglycosyliert (IFN-β-1b)
sein, da in der Literatur berichtet wurde, dass sowohl die glcosylierten
als auch die unglycosylierten IFN-βs qualitativ ähnliche
spezifische Aktivitäten
zeigen, und aus diesem Grunde die Glycosylreste nicht an der biologischen
Aktivität
von IFN-β beteiligt
sind und nicht zu dieser beitragen.
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Die
vorliegend umfassten IFN-β-Varianten
schließen
Muteine der nativen, reifen IFN-β-Sequenz
ein (siehe beispielsweise
US-Patent
Nr. 5,814,485 ), bei denen ein oder mehrere Cysteinreste,
die nicht essentiell für
die biologische Aktivität
sind, freiwillig entfernt wurden oder gegen andere Aminosäuren ausgetauscht
wurden, um Stellen für
intermolekulare Verbindungen oder für inkorrekte intramolekulare
Disulfidbrückenbildung zu
eliminieren. IFN-β-Varianten
dieser Art umfassen diejenigen, die ein Glycin, Valin, Alanin, Leucin,
Isoleucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Tryptophan, Serin, Threonin
oder Methionin enthalten, das gegen den Cysteinrest ausgetauscht
wurde, der als Aminosäure
17 in der reifen nativen Aminosäuresequenz
vorgefunden wird. Serin und Threonin sind aufgrund ihrer chemischen
Analogie zu Cystein beim Austausch bevorzugt. Serin-Substitutionen
sind am stärksten
bevorzugt. Siehe beispielsweise die IFN-β-Variante, bei der das Cystein an
Aminosäureposition
17 der reifen, nativen Sequenz gegen ein Serin ausgetauscht ist
(
US-Patent Nr. 5,814,485 ).
Das Cystein 17 kann darüber
hinaus unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren
deletiert werden (siehe beispielsweise
US-Patent Nr. 4,518,584 ), was zu einem
reifen IFN-β-Mutein führt, das
um eine Aminosäure
kürzer
ist als das native, reife IFN-β.
Siehe als. Beispiele auch die
US-Patent Nrn.
4,530,787 ;
4,572,798 ;
und
4,588,585 . Somit
sind IFN-β-Varianten
mit einer oder mit mehreren Mutationen, die beispielsweise ihre
pharma zeutische Verwendbarkeit verbessern, ebenfalls von der vorliegenden
Erfindung umfasst.
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Der
Fachmann wird erkennen, dass durch Mutation weitere Änderungen
in die für
IFN-β kodierende Nukleotidsequenz
eingebracht werden können,
was zu Veränderungen
der IFN-β-Aminosäuresequenz
führt, ohne
die biologische Aktivität
des Interferons zu verändern.
Daher kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für eine IFN-β-Variante mit einer Sequenz
kodiert, welche von der Aminosäuresequenz
des nativen IFN-β abweicht,
erzeugt werden, indem eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen,
-additionen oder -deletionen in der entsprechenden Nukleotidsequenz,
die für
natives IFN-β kodiert,
eingebracht werden, sodass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen,
-additionen oder -deletionen in das kodierte IFN-β eingebracht
werden. Mutationen können
durch Standardverfahren, wie beispielsweise durch zielgerichtete
Mutagenese und PCR-vermittelte
Mutagenese eingebracht werden. Solche IFN-β-Varianten sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung
umfasst.
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Beispielsweise
können
konservative Aminosäuresubstitutionen
an einem oder an mehreren vorhergesagten, vorzugsweise nicht-essentiellen Aminosäureresten
durchgeführt
werden. Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest
ist ein Rest, der ausgehend von der Wildtypsequenz von IFN-β verändert werden
kann, ohne die biologische Aktivität zu verändern, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest
für die
biologische Aktivität erforderlich
ist. Eine "konservativer
Aminosäuresubstitution" ist ein solche,
bei der der Aminosäurerest
gegen einen Aminosäurerest
mit einer ähnlichen
Seitenkette ausgetauscht wird. Familien von Aminosäureresten
mit ähnlichen
Seitenketten sind im Stand der Technik definiert worden. Diese Familien
umfassen Aminosäuren
mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), mit
sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), mit
ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin,
Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), mit nicht-polaren Seitenketten (z. B. Alanin,
Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan),
mit beta-verzweigten
Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und mit aromatischen
Seitenketten (z. B., Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin).
Solche Substitutionen würden
für konservierte
Aminosäurereste
oder für
Aminosäurereste,
die in einem konservierten Motiv liegen, nicht durchgeführt werden.
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Alternativ
dazu können
Varianten-IFN-β-Nukleotidsequenzen
durch Einbringen von zufälligen
Mutationen entlang der gesamten oder eines Teils der für IFN-β kodierenden
Sequenz hergestellt werden, wie beispielsweise durch Sättigungsmutagenese;
die resultierende Mutanten können
im Hinblick auf ihre biologische IFN-β-Aktivität mittels Screening werden,
um Mutanten zu identifizieren, welche die Aktivität beibehalten.
Nach der Mutagenese kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert
werden, und die Aktivität
des Proteins kann unter Verwendung der vorliegend beschriebenen
Standard-Assay-Verfahren bestimmt werden.
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Biologisch
aktive Varianten von IFN-β werden
im Allgemeinen mindestens 80%, stärker bevorzugt 90 bis 95% oder
mehr, und am stärksten
bevorzugt 99% Aminosäuresequenzidentität zu der
Aminosäuresequenz des
IFN-β-Referenzmoleküls aufweisen,
das als Basis für
den Vergleich dient, wie beispielsweise zu nativem, humanem IFN-β. Mit "Sequenzidentität" ist gemeint, dass
dieselben Aminosäurereste
innerhalb des Varianten-Polypeptids und des Polypeptid-Moleküls, das
als Referenz dient, gefunden werden, wenn ein bestimmtes zusammenhängendes
Segment der Aminosäuresequenz
der Variante der Aminosäuresequenz
des Referenzmoleküls
gegenübergestellt
und mit diesem verglichen wird.
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Zum
Zwecke eines optimalen Alignments der zwei Sequenzen zur Bestimmung
der Sequenzidentität kann
das zusammenhängende
Segment der Aminosäuresequenz
der Variante zusätzliche
Aminosäurereste oder
deletierte Aminosäurereste
in Bezug auf die Aminosäuresequenz
des Referenzmoleküls
aufweisen. Das zusammenhängende
Segment, das für
den Vergleich mit der Referenz-Aminosäuresequenz
verwendet wird, wird mindestens 20 zusammenhängende Aminosäurereste
umfassen. Korrekturen zur Erhöhung
der Sequenzidentität,
die mit der Einbringung von Lücken
(gaps) in die Aminosäuresequenz
der Variante verbunden sind, können
unter Zuweisung einer Strafwerts für Lücken (gap penalty) durchgeführt werden.
Verfahren zum Alignment von Sequenzen sind im Stand der Technik
hinreichend bekannt.
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Somit
kann die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei beliebigen
Sequenzen unter Verwendung einer mathematischen Algorithmus erreicht
werden. Ein bevorzugtes, nicht beschränkendes Beispiel für einen
mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen
verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (1988)
Comput. Appl. Biosci. 4: 11–7.
Ein solcher Algorithmus wird in dem ALIGN-Programm (Version 2.0)
verwendet, das Teil des GCG-Alignment-Software-Pakets ist. Eine PAM120 Gewichtungstabelle
für Reste,
einen Lückenlängen-Strafwert
von 12 sowie einen Lücken-Strafwert
von 4 können
mit dem ALIGN-Programm verwendet werden, wenn Aminosäuresequenzen
miteinander verglichen werden. Ein weiteres bevorzugtes, nicht beschränkendes
Beispiel für
einen mathematischen Algorithmus zum Vergleich von zwei Sequenzen
ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90: 5873–5877,
der wie in Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90: 5873–5877
beschrieben modifiziert wurde. Ein solcher Algorithmus ist in den
Programmen NBLAST und XBLAST von Altschul et al. (1990) J. Mol.
Biol. 215: 403–410
enthalten. Aminosäuresequenzrecherchen
mit BLAST können
mit dem XBLAST-Programm, Wert = 50, Wortlänge = 3 durchgeführt werden,
um Aminosäuresequenzen
zu erhalten, die zu dem Polypeptid von Interesse ähnlich sind.
Um Alignments mit Lücken
zum Zwecke des Vergleichs zu erhalten, kann "gapped BLAST" wie in Altschul et al. (1997) Nucleic
Acids Res. 25: 3389–3402
beschrieben verwendet werden. Alternativ dazu kann PSI-BLAST verwendet
werden, um eine integrierte Recherche durchzuführen, die entfernte Verwandtschaften
zwischen Molekülen
nachweist. Siehe Altschul et al. (1997), oben. Bei der Verwendung
der Programme BLAST, gapped BLAST oder PSI-BLAST können die
voreingestellten Parameter verwendet werden. Siehe Website der ncbi.nlm.nih.gov.
Siehe ferner das ALIGN-Programm (Dayhoff (1978) in Atlas of Protein
Sequence and Structure 5: Suppl. 3, National Biomedical Research
Foundation, Washington, D.C.) sowie die Programme im Wisconsin Sequence
Analysis Package, Version 8 (erhältlich
von Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), z. B. das GAP-Programm,
bei dem voreingestellte Parameter des Programms verwendet werden.
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Wenn
der prozentuale Wert der Aminosäuresequenzidentität betrachtet
wird, können
einige Aminosäurerestepositionen
als Ergebnis von konservativen Aminosäuresubstitutionen unterschiedlich
sein, wobei diese die Eigenschaften der Proteinfunktion nicht beeinflussen.
In diesen Fällen
kann die prozentuale Sequenzidentität nach oben angepasst werden,
um der Ähnlichkeit
in Bezug auf die konservativ substituierten Aminosäuren Rechnung
zu tragen. Solche Anpassungen sind im Stand der Technik hinreichend
bekannt. Siehe beispielsweise Myers und Miller (1988) Comput. Appl.
Biosci. 4: 11–17.
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Biologisch
aktive Varianten von IFN-β,
die erfindungsgemäß umfasst
sind, sollten die Aktivitäten
von IFN-β beibehalten,
insbesondere die Fähigkeit,
an IFN-β-Rezeptoren
zu binden. Diese biologische Aktivität von IFN-β-Varianten kann durch beliebige
im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Beispiele
für solche
Assays können
in Fellous et al. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3082–3086; Czerniecki et
al. (1984) J. Virol. 49(2): 490–496;
Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662–5666; Branca
et al. (1981) Nature 277: 221–223;
Williams et al. (1979) Nature 282: 582–586; Herberman et al. (1979)
Nature 277: 221–223;
und Anderson et al. (1982) J. Biol. Chem. 257(19): 11301–11304 gefunden
werden.
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Beispiele
für erfindungsgemäß umfasste
IFN-β-Polypeptide
und IFN-β-Varianten-Polypeptide
werden in Nagata et al. (1980) Nature 284: 316–320; Goeddel et al. (1980)
Nature 287: 411–416;
Yelverton et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9: 731–741; Streuli
et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2848–2852;
EP 028033 B1 und
EP 109748 B1 beschrieben.
Siehe auch
US-Patent Nrn. 4,518,584 ;
4,569,908 ;
4,588,585 ;
4,738,844 ;
4,753,795 ;
4,769,233 ;
4,793,995 ;
4,914,033 ;
4,959,314 ;
5,545,723 und
5,814,485 . Diese Referenzen geben auch
Aufschluss in Bezug auf die Reste und Regionen des IFN-β-Polypeptids,
die ohne Verlust der biologischen Aktivität verändert werden können.
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Mit "rekombinant hergestelltem
IFN-β" ist IFN-β gemeint,
das eine zu nativem IFN-β vergleichbare
biologische Aktivität
aufweist und mittels rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt wurde.
IFN-β kann
hergestellt werden, indem man eine Wirtszelle kultiviert, die mit
einem Expressionsvektor transformiert ist, welcher eine Nukleotidsequenz
umfasst, die für
ein IFN-β-Polypeptid kodiert.
Die Wirtszelle ist eine Zelle, die die Nukleotidsequenz transkribieren
und das gewünschte
Protein produzieren kann, und sie kann prokaryontisch (beispielsweise
E. coli) oder eukaryontisch (beispielsweise eine Hefe-, eine Insekten-
oder eine Säugetierzelle) sein.
Beispiele für
die rekombinante Herstellung von IFN-β sind in Mantei et al. (1982)
Nature 297: 128; Ohno et al. (1982) Nucleic Acids Res. 10: 967;
Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156, und in
US-Patent Nrn. 4,462,940 ,
5,702,699 und
5,814,485 beschrieben. Siehe darüber hinaus
US-Patent Nr. 5,795,779 ,
in der IFN-β-1a
rekom binant in Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (Chinese
hamster ovary (CHO)cells) produziert wird. Humane Interferon-Gene sind unter Verwendung
von Verfahren mit rekombinanter DNA ("rDNA") kloniert
und in E. coli exprimiert worden (Nagola et al. (1980) Nature 284:
316; Goeddel et al. (1980) Nature 287: 411; Yelverton et al. (1981)
Nuc. Acid Res. 9: 731; Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 78: 2848). Alternativ dazu kann IFN-β durch ein transgenes Tier oder
durch eine transgene Pflanze hergestellt werden, das (die) genetisch
verändert
wurde, um das IFN-β-Protein
von Interesse nach im Stand der Technik bekannten Verfahren zu produzieren.
-
Proteine
oder Polypeptide, die native Interferon-beta-ähnliche
Eigenschaften aufweisen, können ebenfalls
mittels rDNA-Verfahren hergestellt werden, indem man poly-A-reiche
12S-Boten-RNA von viral induzierten humanen Zellen extrahiert, doppelsträngige cDNA
unter Verwendung der mRNA als Matrize synthetisiert, die cDNA in
einem geeigneten Klonierungsvektor einbringt, geeignete Mikroorganismen
mit dem Vektor transformiert, die Mikroorganismen erntet, und das
Interferon-beta aus diesen Mikroorganismen extrahiert. Siehe beispielsweise
Europäische
Patentanmeldung Nrn. 28033 (veröffentlicht
am 6. Mai 1981); 32134 (veröffentlicht
am 15. Juli 1981) und 34307 (veröffentlicht
am 26. August 1981), die verschiedene Verfahren zur Herstellung
von Interferon-beta unter Verwendung von rDNA-Methoden beschreiben.
-
Alternativ
dazu kann IFN-β durch
ein beliebiges von mehreren Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet
der Peptidchemie bekannt sind, chemisch synthetisiert werden. Siehe
beispielsweise Li et al. (1983; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2216–2220, Steward
und Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical
Company, Rockford, Illinois) und Baraney und Merrifield (1980) The
Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Hrsg. Gross und Meinhofer,
Band 2 (Academic Press, New York, 1980), Seiten 3–254, die
Festphasen-Peptid-Syntheseverfahren
diskutieren; und Bodansky (1984) Principles of Peptide Synthesis
(Springer-Verlag, Berlin) und Gross und Meinhofer, Hrsg. (1980)
The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Band I (Academic Press,
New York), die eine klassische Synthese in Lösung diskutieren. IFN-β kann darüber hinaus chemisch
durch das Verfahren der gleichzeitigen Synthese von mehreren Peptiden
hergestellt werden. Siehe beispielsweise Houghten (1984) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82: 5131–5135;
und
US-Patent Nr. 4,631,211 .
-
Die
Herstellung der Zusammensetzungen, die monomeres IFN-β umfassen,
erfolgt vorzugsweise gemäß einem
der beiden Aufreinigungsverfahren. Das erste dieser Aufreinigungsverfahren,
das vorliegend zum Zwecke eines besseren Verständnisses der Erfindung bereitgestellt
wird und keine Ausführungsform
der Erfindung darstellt, umfasst drei grundlegende Schritte: (1)
Präzipitieren
von IFN-β aus
einer Lösung,
die gereinigte IFN-β umfasst;
(2) Lösen
des IFN-β-Präzipitats
in Guanidin-Hydrochlorid (HCl), um eine Resolubilisierung von IFN-β zu erreichen;
und (3) Renaturieren von IFN-β,
vorzugsweise mittels einer Verdünnung
oder mittels einer Dialyse unter Verwendung eines akzeptablen Puffers.
Dieses Aufreinigungsverfahren erzeugt IFN-β, das löslich und stabil ist und in
monomerer Form vorliegt. Die resultierende Zusammensetzung kann
als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden, indem die
Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Puffer diafiltriert
oder dialysiert wird. Dieser finale Schritt entfernt restliches
Guanidin-HCl aus der Lösung,
die renaturiertes IFN-β umfasst,
und stellt eine Formulierung mit einem pH-Wert bereit, der für eine parenterale
Verabreichung akzeptabel ist.
-
Bei
der Anwendung des erfindungsgemäßen Aufreinigungsverfahrens
wird zunächst
ein IFN-β-Präzipitat
erzeugt, indem gereinigtes IFN-β aus
einer Lösung
präzipitiert
wird. Die Präzi pitation
wird durch Verringerung der Löslichkeit
von IFN-β erreicht.
Die Verringerung der Löslichkeit
von IFN-β und
die Präzipitation
von IFN-β können durch
Verwendung eines Alkohols, wie beispielsweise eines aliphatischen
Alkohols wie Ethanol, erreicht werden. Bei einigen Proteinen resultiert
die Präzipitation
aus einer Denaturierungs- und/oder Aggregationsreaktion, die irreversibel
ist, was zu einer Inaktivierung des Proteins führt, wobei jedoch im Falle
des präzipitierten
IFN-β der
vorliegenden Erfindung die Präzipitationsreaktion
reversibel ist. Somit erhält
das lösliche
IFN-β, das
in den anschließenden
Schritten dieses Aufreinigungsverfahrens gewonnen wird, seine biologische
Aktivität.
-
Das
resultierende Präzipitat
wird anschließend
in Guanidin-HCl
aufgelöst,
wobei eine Lösung
erhalten wird, die resolubilisiertes, denaturiertes IFN-β und Guanidin-HCl
umfasst. In den Fällen,
in denen das gereinigte IFN-β unter
Verwendung eines anfänglichen
Aufreinigungsschritts erhalten wurde, der die Verwendung von SDS
als solubilisierendes Mittel umfasst, verbleibt das SDS nach Lösen mit
Guanidin-HCl als Präzipitat.
Dieses präzipitierte
SDS wird durch Filtration unter Verwendung von im Stand der Technik
bekannten Standardfiltrationsverfahren entfernt, vorzugsweise bevor
die anschließenden
Schritte des verbesserten Aufreinigungsverfahrens durchgeführt werden.
Die Menge an Guanidin-HCl, die mit dem IFN-β-Präzipitat gemischt werden soll,
ist eine Menge, die ausreicht, um das präzipitierte IFN-β in der resultierenden
Guanidin-HCl-IFN-β-Lösung zu solubilisieren, d.
h. 6 M bis 10 M Guanidin-HCl, vorzugsweise 6 M bis 9 M, und stärker bevorzugt
6 M bis 8 M Guanidin-HCl in der resultierenden Guanidin-HCl-IFN-β-Lösung. Obwohl
es solubilisiert ist, ist das IFN-β in dieser Lösung auch denaturiert. Die
Renaturierung des Proteins wird erreicht, indem die Guanidin-HCl-IFN-β-Lösung mit
einer Pufferlösung
verdünnt
wird, wodurch eine Lösung
erhalten wird, die resolubilisiertes, renaturiertes IFN-β und einen
Rest an Guanidin- Hydrochlorid
umfasst. Das IFN-β in
der resultierenden Lösung
ist monomer, d. h. mindestens 51% liegen in seiner monomeren Form
vor; vorzugsweise liegen mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, stärker bevorzugt
mindestens 90% oder mehr in seiner monomeren Form vor, wie beispielsweise
durch Größenbestimmungs-HPLC
bestimmt wird.
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Während der
Resolubilisierungs- und Renaturierungsschritte dient Guanidin-HCl
als solubilisierendes Mittel, um die Löslichkeit von IFN-β zu erhöhen. Mit "Erhöhung der
Löslichkeit" von IFN-β ist die
Erhöhung
der Menge von IFN-β gemeint,
die in einer Lösung
bei pH 3,0 bis pH 9,0 in Gegenwart von Guanidin-HCl im Vergleich zur Menge von IFN-β, die beim
selben pH-Wert in einer Lösung
mit denselben Bestandteilen, jedoch ohne Guanidin-HCl, gelöst werden
kann. Die Fähigkeit
von Guanidin-HCl, die Löslichkeit
von IFN-β zu
erhöhen,
kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren
bestimmt werden, einschließlich derjenigen,
die vorliegend offenbart werden.
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Ein
beliebiger geeigneter Puffer kann bei dem Verdünnungsschritt des vorliegenden
erfindungsgemäßen Aufreinigungsverfahrens
verwendet werden, um eine Renaturierung von IFN-β zu erreichen. Geeignete Puffer
zur Verwendung bei diesem Schritt umfassen diejenigen, die nachstehend
offenbart werden, wie beispielsweise Acetat, Citrat, Phosphat und
Tris-HCl, wobei die Auswahl des Puffers von dem gewünschten pH-Wert
der resultierenden Lösung
nach dem Verdünnungsschritt
abhängen
wird. Wenn das Aufreinigungsverfahren den Präzipitationsschritt umfasst,
weist der für
den Verdünnungsschritt
verwendete Puffer vorzugsweise einen pH-Wert von 4,0 bis 8,0 auf,
einschließlich
4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 und 8,0, stärker bevorzugt
einen pH-Wert von 5,0 bis 7,0. Nach diesem Verdünnungsschritt ist die Menge
von restlichem Guanidin-HCl, die in der resolubilisierten, renaturierten
IFN-β-Lösung verbleibt,
vor zugsweise 1,6 M oder weniger, stärker bevorzugt 0,8 M oder weniger.
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Die
resultierende resolubilisierte, renaturierte IFN-β-Lösung umfasst das IFN-β in seiner
monomeren Form (d. h. mehr als 51% ist monomer). Darüber hinaus
umfasst die resolubilisierte, renaturierte IFN-β-Lösung eine Restmenge an Guanidin-HCl. Diese Zusammensetzung
kann für
die Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden,
die für
die parenterale Verabreichung geeignet sind. Auf diese Weise kann der
restliche Guanidin-HCl-Löslichkeitsverstärker aus
der resolubilisierten, renaturierten IFN-β-Lösung durch Dialyse oder Diafiltration
dieser Lösung
mit einem pharmazeutisch akzeptablen Puffer entfernt werden. Mit "Entfernen von restlichem
Guanidin-HCl" ist
gemeint, dass die pharmazeutische Formulierung, welche das im Wesentlichen
monomere IFN-β umfasst,
und welche unter Verwendung der Schritte des vorliegenden Aufreinigungsverfahrens
hergestellt wurde, Guanidin-HCl in einer Konzentration von 10 mM
oder weniger, vorzugsweise 5 mM oder weniger umfasst. Ein beliebiger
akzeptabler Puffer kann verwendet werden, um die pharmazeutische
Formulierung herzustellen, solange das IFN-β solubilisiert und im Wesentlichen
in seiner monomeren Form bleibt. In einer Ausführungsform umfasst der pharmazeutisch
akzeptable Puffer Arginin oder Natriumchlorid in einer Menge, die
ausreicht, um die Ausbeute der monomeren Form von IFN-β im Vergleich
zur Ausbeute, die in Abwesenheit von Arginin oder Natriumchlorid
in dem pharmazeutisch akzeptablen Puffer erhalten wird, zu erhöhen. Im
Falle von Arginin ist die Menge, die ausreicht, um die Ausbeute
zu erhöhen,
0,2 M bis 1,0 M, vorzugsweise 0,4 M bis 0,8 M, einschließlich 0,4
M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M und 0,8 M. In einer Ausführungsform ist die Menge an
Arginin, die in dem pharmazeutisch akzeptablen Puffer vorliegt,
0,5 M. Im Falle von Natriumchlorid ist die Menge, die ausreicht,
um die Ausbeute zu erhöhen,
0,2 M bis 1,2 M, vorzugsweise 0,2 M bis 1,0 M, stärker bevorzugt 0,5
M bis 1,0 M. In einer Ausführungsform
beträgt
die Menge an Natriumchlorid, die in dem pharmazeutisch akzeptablen
Puffer vorhanden ist, 1,0 M.
-
Das
zweite Aufreinigungsverfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung,
die monomeres IFN-β umfasst, ähnelt dem
ersten Verfahren, stellt jedoch ein Mittel zur Herstellung dieser
Zusammensetzung ohne den Präzipitationsschritt
bereit. Dieses zweite Verfahren basiert auf zwei grundlegenden Schritten:
(1) Mischen einer Probe, die gereinigtes IFN-β mit Guanidin-Hydrochlorid (HCl)
umfasst, wobei eine Lösung
erhalten wird, die solubilisiertes, denaturiertes IFN-β umfasst;
und (2) Renaturieren des IFN-β,
vorzugsweise mittels Verdünnen
unter Verwendung eines akzeptablen Puffers. Das Guanidin-HCl dient
wie oben angemerkt als ein die Löslichkeit
verstärkendes
Mittel, und es wird in Mengen verwendet, die denjenigen ähneln, die
oben im Zusammenhang mit dem ersten Aufreinigungsverfahren genannt
wurden. Somit beträgt
die Menge von Guanidin-HCl in der Lösung, die solubilisiertes denaturiertes
IFN-β umfasst,
nach dem ersten Schritt 6 M bis 10 M Guanidin-HCl, vorzugsweise
6 M bis 9 M, stärker
bevorzugt 6 M bis 8 M Guanidin-HCl. Wenn das anfänglich verwendete, im Wesentlichen
gereinigte IFN-β SDS
enthält,
präzipitiert
das SDS wie oben angemerkt in diesem Schritt und kann unter Verwendung
von Standardfiltrationsverfahren, die im Stand der Technik bekannt
sind, aus der Lösung
filtriert werden.
-
In
dem ersten Aufreinigungsverfahren ist das IFN-β in der Guanidin-HCl-IFN-β-Lösung denaturiert.
Die Renaturierung wird durch Verdünnen unter Verwendung eines
akzeptablen Puffers mit einem pH-Wert im Bereich von 3,0 bis 5,0,
vorzugsweise 3,0 bis 4,0, stärker
bevorzugt 3,0 erreicht. Geeignete Puffer für diesen Verdünnungsschritt
zur Erreichung der Renaturierung des IFN-β umfassen Glycin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und
Succinat, Acetat, Phosphat, Formiat und Citrat sowie beliebige Salze
davon. Nach diesem Verdünnungsschritt
ist die Menge des restlichen Guanidin-HCl, das in der solubilisierten,
renaturierten IFN-β-Lösung verbleibt,
vorzugsweise 1,6 M oder weniger, vorzugsweise 0,8 M oder weniger,
stärker
bevorzugt 0,1 M oder weniger. Nach der Renaturierung umfasst die
resultierende Zusammensetzung im Wesentlichen monomeres IFN-β, d. h. mindestens
51%, vorzugsweise mindestens 70% liegen in der monomeren Form vor,
wie beispielsweise unter Verwendung einer Größenbestimmungs-HPLC bestimmt
wird, vorzugsweise unter Verwendung einer analytischen Ultrazentrifugation
(siehe beispielsweise Liu und Shire (1999) J. Pharm. Sci. 88: 1237–1241, die
vorliegend durch Bezugnahme umfasst ist). Das restliche Guanidin-HCl
in dieser renaturierten IFN-β-Lösung kann
in einer Weise entfernt werden, die ähnlich zu derjenigen ist, die
im Zusammenhang mit dem ersten Aufreinigungsverfahren genannt worden
ist, um eine pharmazeutische Formulierung herzustellen, die ein
im Wesentlichen monomeres IFN-β umfasst.
Wie bereits angemerkt kann vorliegend ein beliebiger pharmazeutisch
akzeptabler Puffer verwendet werden, solange das IFN-β solubilisiert
und im Wesentlichen in seiner monomeren Form bleibt. In einer Ausführungsform
ist der pharmazeutisch akzeptable Puffer ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Glycin, Asparaginsäure
und Natriumsuccinat, vorzugsweise Glycin, sodass die pharmazeutische
Formulierung einen pH-Wert von 3,0 bis 5,0, vorzugsweise von 3,0
bis 4,0 und am stärksten
bevorzugt von 3,0 aufweist.
-
Somit
weist die im Wesentlichen monomere Form des IFN-β, die durch die Aufreinigungsverfahren
der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, mehrere Anwendungen
auf, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung offenbart werden.
Beispielsweise kann, wie vorliegend ausgeführt wird, diese Form von IFN-β direkt für die Formulierung
von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die für eine parenterale Verabreichung
geeignet sind. Nach dem Diafiltrations- oder Dialyse schritt mit
einem pharmazeutisch akzeptablen Puffer nach Wahl zur Entfernung
des restlichen Guanidin-HCl können
die resultierenden pharmazeutischen Zusammensetzungen gegen Denaturierung
und Verlust der biologischen Aktivität durch Einbringen eines Stabilisators
in die pharmazeutischen Zusammensetzungen stabilisiert werden, einschließlich (jedoch nicht
beschränkt
auf) Proteine oder Kohlenhydrate, vorzugsweise ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Mannitol, Sorbitol, Glycerol, Dextrose,
Sucrose und Trehalose oder eine Mischung davon. In einem weiteren Aspekt
der vorliegenden Erfindung kann die aus der Diafiltration (oder
Dialyse) und den Stabilsierungsschritten erhaltende IFN-β-Zubereitung
lyophilisiert und in einem inerten, nicht-toxischen physiologisch
kompatiblen Trägermedium
für therapeutische
und klinische Anwendungen rekonstituiert werden.
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen werden mit einer bekannten Konzentration der im
Wesentlichen monomeren Form von IFN-β formuliert, sodass die Verabreichung
einer bestimmten Dosis eine gewünschte
therapeutische Reaktion in Bezug auf einen Zustand, der auf IFN-β anspricht
und auf den sich die Therapie richtet, fördert. Mit "gewünschte
therapeutische Reaktion" ist
eine Verbesserung in Bezug auf den Zustand oder in Bezug auf die
Symptome gemeint, die mit diesem Zustand assoziiert sind.
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die IFN-β umfassen,
sind im Rahmen einer Therapie nützlich,
die sich auf die Behandlung von Zuständen richtet, welche auf IFN-β ansprechen.
Mit "Therapie" ist die Behandlung
eines existierenden, normalen Zustands gemeint, der durch eine IFN-β-Therapie
verstärkt
wird, die therapeutische Behandlung eines anormalen Zustands, der
auf IFN-β anspricht,
sowie präventive
oder prophylaktische Verfahren, welche die Behandlung mit IFN-β umfassen,
sodass das Ausmaß eines
Auftretens eines abnormalen Zustands verhindert oder verringert
wird. Mit "Zustand,
der auf IFN-β anspricht" ist ein beliebiger
Zustand gemeint, der entweder positiv oder negativ auf IFN-β anspricht.
Ein solcher Zustand, der auf IFN-β anspricht,
kann ein normaler Zustand sein. Beispielsweise kann sich ein Säugetier
einer IFN-β-Therapie unterziehen,
um das Ansprechen und/oder die Fähigkeit
der Immunantwort zu erhöhen.
Solche Therapien umfassen die Behandlung zur Bereitstellung eines
Schutzes gegen virale Infektionen oder zur Modulierung des Ausmaßes von
viralen Infektionen, beispielsweise Dengue-Virus oder Sindbis-Virus. Im Gegensatz
dazu kann der auf IFN-β ansprechende
Zustand ein anormaler Zustand sein, wie beispielsweise ein malignes
Melanom. Solche anormalen Zustände
können
chronisch sein und demgemäß mehr oder
weniger kontinuierlich auftreten, oder solche anormalen Zustände können akut
sein. Der auf IFN-β ansprechende
Zustand kann ein Zustand sein, der möglicherweise sowohl als chronisch
als auch als akut charakterisiert werden kann, wie beispielsweise
die schubförmig
verlaufende multiple Sklerose (remitting-relapsing multiple sclerosis).
Eine beliebige auf IFN-β ansprechende
Störung
kann von der Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen IFN-β-Zusammensetzungen
profitieren. Zustände,
die auf IFN-β ansprechen,
können
ferner immunologische Störungen
wie beispielsweise Immundefizienzen umfassen, einschließlich verringerter
Immuntoleranz als Ergebnis einer Erkrankung oder einer Infektion
oder einer Schädigung
des Immunsystems, welche aus Umwelteinwirkungen oder anderen Wirkungen
resultiert, wie beispielsweise einer Chemotherapie oder einer anderweitigen
Einwirkung von toxischen Chemikalien.
-
Die
nachfolgenden Beispiele werden zum Zwecke der Veranschaulichung
aufgeführt.
-
EXPERIMENTELLER TEIL
-
Die
Beispiele 1 und 7 sowie die 3 stellen
keine Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung dar, sondern werden lediglich für ein besseres
Verständnis
der Erfindung aufgeführt.
-
Beispiel 1: Herstellung von IFN-β
-
IFN-β zur Verwendung
in diesen Experimenten wurde in E. coli hergestellt, wie es im Wesentlichen
in den ersten Aufreinigungsschritten von
US-Patent Nrn. 4,462,940 und/oder
4,816,400 beschrieben wird.
Dies bedeutet, dass transformierte Bakterien verwendet wurden, um
IFN-β herzustellen;
die Wirtszellen wurden aufkonzentriert, und ihre Zellwände wurden
aufgeschlossen. Das IFN-β wurde
anschließend
nach den erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt, gefolgt von der Herstellung einer Vereinigung (pool)
aus gereinigtem IFN-β.
-
Das
grundlegende Verfahren war das Folgende:
- 1.
Präzipitiere
IFN-β aus
einer Vereinigung (pool) aus gereinigtem IFN-β unter Verwendung von Ethanol. Sechs
Teile der einer Vereinigung aus gereinigtem IFN-β werden für vier Teile Ethanol verwendet.
Dieser Schritt ergibt mehr als 80% des Interferons als Pellet, das
zentrifugiert werden kann.
- 2. Das Pellet wird anschließend
in 8 M Guanidin-HCl gelöst,
wobei die Lösung
etwa 10 mg/ml Protein enthält.
Die Solubilisierung verläuft
schnell; die kleine Menge an vorhandenem SDS wird nicht solubilisiert,
und sie wird durch Filtration entfernt.
- 3. Die resultierende Guanidin-HCl-Lösung wird anschließend in
einem Puffer von 10 mM verdünnt.
-
Beispiel 2: Verdünnungsparameter für den Guanidin-Hydrochlorid-Schritt
-
Die
anfänglichen
Experimente wurden ausgeführt,
um die optimalen Verdünnungsparameter
für den Guanidin-Hydrochlorid-Verdünnungsschritt
zu bestimmen. Ein Experiment im kleinen Maßstab, das die relativen Ausbeuten
bestimmte, wurde wie in Tabelle 1 gezeigt durchgeführt; die
besten Ergebnisse wurden oberhalb von pH 4,0 und unterhalb von 0,8
M Guanidin-Hydrochlorid
nach Verdünnung
erhalten. Die Konzentration des Interferon-β-Monomers wurde unter Verwendung
einer Größenbestimmungs-HPLC
mit einem 400 mM Glycinpuffer mit pH 3,0 bestimmt. Die Ergebnisse
in Tabelle 2 und eine typische Gruppe von Chromatogrammen in
1 zeigen,
dass monomeres Interferon-β bei
pH 5,0 und oberhalb dieses Wertes erhalten wurde, obwohl nicht-kovalente
Multimere bei niedrigeren pH-Werten erhalten wurden. TABELLE 1: Relative Ausbeute nach Verdünnung von
Guanidin-HCl (8 M) IFN (~10 mg/ml), geschätzt mittels HPLC
| | | Guanidin-HCl
Konzentration nach Verdünnung |
| 10
mM-Puffer | pH | 0,2
M | 0,4
M | 0,8
M | 1,6
M |
| Glycin | 3 | 2 | 2,1 | 1 | 1 |
| Natriumacetat | 4 | 13 | 12,7 | 6 | 2 |
| Natriumacetat | 5 | 68 | 68 | 33 | 30 |
| Natriumcitrat | 6 | 79 | 62 | 43 | 42 |
| Natriumphosphat | 7 | 82 | 71 | 41 | 48 |
| Tris-HCl | 8 | 99 | 83 | 40 | 38 |
TABELLE 2: Prozentualer Anteil der Aggregate
nach Verdünnung
von Guanidin-HCl (8 M) IFN (~10 mg/ml), bestimmt mittels HPLC
| | | Guanidin-HCl
Konzentration nach Verdünnung |
| 10
mM-Puffer | pH | 0,2
M | 0,4
M | 0,8
M | 1,6
M |
| Glycin | 3 | 78 | 51 | 35 | 39 |
| Natriumacetat | 4 | < 1 | 3 | 4 | 11 |
| Natriumacetat | 5 | 1 | 1 | 1 | 2 |
| Natriumcitrat | 6 | 1 | 1 | 1 | 2 |
| Natriumphosphat | 7 | 1 | 1 | 1 | 3 |
| Tris-HCl | 8 | 1 | 2 | 1 | 2 |
-
Beispiel 3: Ausbeute des Guanidin-Verdünnungsschritts
-
Dieses
Verfahren wurde hinsichtlich seines Maßstabs vergrößert, um
die Ausbeute des Guanidin-Verdünnungsschritts
zu bewerten. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass eine Ausbeute
von 41% bis 57% mit einer 40-fachen Verdünnung bei pH 6 bis 8 mit einer
Protein-Endkonzentration von etwa 0,15 mg/ml erhalten werden kann.
Die SDS-Konzentrationen in den getesteten Proben betrugen weniger
als 10 Mikrogramm pro Milligramm IFN. TABELLE 3: Erreichen einer Rückfaltung
ausgehend von 8 M Guanidin-HCl (40× Verdünnung)
| 10
mM Puffer | pH-Wert | [IFN]
mg/ml | %
Ausbeute |
| Natriumcitrat | 6 | 0,12 | 41 |
| Natriumphosphat | 7 | 0,17 | 57 |
| Tris-HCl | 8 | 0,15 | 52 |
-
Beispiel 4: Entfernung von restlichem
Guanidin-HCl, das nach der Verdünnung
vorhanden ist, durch Dialyse
-
Es
wurde eine Dialyse verwendet, um restliches Guanidin-HCl, das nach der
Verdünnung
vorhanden war, zu entfernen. Bei pH 5 wurde die höchste Ausbeute
(83%) ohne zusätzliches
vorhandenes NaCl erhalten, und bei pH 7 wurde die höchste Ausbeute
(70%) in Gegenwart von 1000 mM NaCl erhalten, wie in 2 gezeigt
wird. In allen Fällen
erfolgte nach der Dialyse eine Präzipitation, wobei jedoch die
lösliche
Fraktion monomer war, wie unter Verwendung einer Größenbestimmungs-HPLC
festgestellt wurde.
-
Beispiel 5: Wirkung von Bewegung auf das
mittels Guanidin-Hydrochlorid
renaturierte IFN-β-Material
-
Ein
kleines Volumen von IFN-β in
Puffer, der 10 mM Phosphat (bei einem pH-Wert von 7,0) und 100 mM
NaCl enthielt, wurde in ein Röhrchen
auf einem End-over-End-Schüttler
gestellt. Nach etwa 3 Stunden waren etwa 50% des IFN-β-Materials
präzipitiert.
Dies verweist darauf, dass eine Stabilisierung durch ein geeignetes
Tensid, wie beispielsweise Tween 80, verstärkt wird. Die Zugabe von Tween
80 stabilisiert Interferon und erhöht dadurch die Ausbeute aus
dem Dialyseschritt. Tween 80 kann jedoch auch in konzentrationsabhängiger Weise
eine Aggregation induzieren, wie in 3 gezeigt
ist. Diese Aggregate sind löslich.
Andere Tenside könnten
sich besser verhalten.
-
Beispiel 6: Protein-Renaturierung und
Optimierung der Formulierung durch Verwendung eines faktoriell gestalteten
Ansatzes
-
Eine
Reihe von Experimenten wurde ausgewertet, um die Gewinnung von IFN-β während (1)
der Denaturierung von IFN-β in 8
M Guanidin-Hydrochlorid; (2) der Rückfaltung von IFN-β durch schnelle
Verdünnung mit
Puffer; und (3) der Dialyse zur Entfernung des restlichen Guanidin-Hydrochlorids
mit und ohne vorhandenes Arginin zur Bereitstellung einer finalen
Formulierung zu schätzen.
Die Zusammensetzung der Formulierung und die Bedingungen der Schritte
1 bis 3 wurden unter Verwendung eines halb-faktoriell erstellten
Experiments optimiert. Die verwendeten Faktoren waren Proteinkonzentration,
Guanidin-Hydrochlorid-Konzentration, pH-Wert, Temperatur und Arginin-Konzentration.
-
Es
wurde herausgefunden, dass der pH-Wert, die IFN-β-Konzentration, die Guanidin-Hydrochlorid-Konzentration
nach Verdünnung
und die Arginin-Konzentration signifikante Modellbedingungen darstellten. Die
stärksten
Auswirkungen des Modells wurden vom IFN-β und von der Arginin-Konzentration
erhalten. Die Interaktion zwischen Arginin und dem pH-Wert spielte
eine signifikante Rolle. Die besten Ergebnisse wurden mit 10 mM
NaPO4-Puffer pH 7,0 erhalten, der Arginin
in dem finalen Puffer enthielt. Die Gesamtausbeute aus den Schritten
1–2 betrug
bis zu 80–100%,
und die Ausbeute aus Schritt 3 betrug 70–80%.
-
Beispiel 7: Entfernen von SDS und Formulierung
von IFN-β ohne
Verwendung der Ethanol-Präzipitation
-
Gereinigtes
IFN-β-1b
(1 l mit 1,91 mg/ml in 0,4% SDS, 50 mM Acetatpuffer, pH 5,5) wurde
bei 5°C
gelagert. Während
der Lagerung präzipitierte
einiges von dem vorhandenen SDS. 250 ml dieses Materials (477,5 mg)
wurden mit 229 g Guanidin Hydrochlorid (6 M, Gesamtvolumen 400 ml)
gemischt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten unter Verwendung
eines magnetischen Rührers
gerührt.
Die 6 M Guanidin-Hydrochlorid/Protein-Lösung
wurde dann mit einer Sartobran® P-Kapsel (0,45 μm Poren größe) gefiltert,
um das präzipitierte
SDS zu entfernen. Die mittels UV bei 280 nm bestimmte Proteinkonzentration
betrug 1,02 mg/ml. Die Proteinausbeute betrug 406 mg oder 85%.
-
Die
400 ml des mit Guanidin-Hydrochlorid behandelten Materials wurden
unter Verwendung eines Millipore® Labscale® TFF-Diafiltrationssystems
(Millipore, Inc.) mit zwei Pellicon® XL
Biomax® 0,1
cm2 10 kD Polysulfonmembranen (Millipore,
Inc.) aufkonzentriert. Das Volumen nach dem Konzentrationsschritt
betrug 37 ml mit einer Proteinkonzentration von 10,3 mg/ml für eine Ausbeute
nach Aufkonzentrierung von 381 mg oder 93%.
-
Unter
Verwendung einer Transferpipette wurden 10 ml (103 mg) der aufkonzentrierten
Guanidin-Hydrochlorid/Protein-Lösung schrittweise
zu einer Lösung
von 590 ml 5 mM Glycin, pH 3,2 zugesetzt. Der Puffer wurde unter
Verwendung eines Magnetrührers
schnell gerührt;
die Protein-Lösung
wurde direkt beim Vortexen zugesetzt. Diese 60-fache Verdünnung der
6 M Guanidin-Hydrochlorid/Protein-Lösung ergab eine 0,1 M Guanidin-Hydrochlorid/Protein-Lösung mit
0,17 mg/ml. Diese 600 ml wurden auf eine 500 ml Diafiltrationseinheit mit
einer Größe von 500
ml überführt, die
mit zwei Pellicon® II 10 kD, 0,1 m2 Polysulfonmembranen ausgestattet war. Diese
Lösung
wurde zunächst
auf ~400 ml mit einer Proteinkonzentration von 0,23 mg/ml aufkonzentriert
und anschließend
gegen 9 Volumen Austausche (3,6 l) 5 mM Glycin pH 3,2 diafiltriert.
Das endgültige Diafiltrat
(402 ml) wurde mittels UV bei 280 nm gemessen für eine Proteinendkonzentration
von 0,23 mg/ml mit einer Ausbeute von 92,46 mg oder 90% für den Diafiltrationsschritt
und einer Gesamtausbeute von 72% des löslichen Proteins für den Aufreinigungsprozess.