CN101885767B

CN101885767B - 一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法

Info

Publication number: CN101885767B
Application number: CN 201010202366
Authority: CN
Inventors: 何社辉; 何毅华; 陈克尧; 何询
Original assignee: Shenzhen Kexing Biotech Co ltd
Current assignee: Shenzhen Kexing Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-06-13
Filing date: 2010-06-13
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2030-06-13
Also published as: CN101885767A

Abstract

一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法，用于从可溶性表达重组人干扰素α1b的大肠杆菌工程菌中提取重组人干扰素α1b，包括细菌破碎、扩张床吸附、疏水柱层析、阴离子柱层析和凝胶过滤层析等步骤。本发明方法无需采用单克隆抗体胶，避免了单抗脱落造成的污染，利用Q Sepharose HP离子交换介质，应用缓慢的pH梯度能进一步分离干扰素相关蛋白质、异构体，使原液质量达到反相高效液相色谱法RP-HPLC检测单一主峰的纯度。采用该纯化方法提高了生产效率，降低了生产成本，提升了原液质量。

Description

一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法

技术领域本发明涉及含肽的医药配制品，特别是涉及蛋白质的分离纯化技术，尤其是涉及取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法。

背景技术干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，其主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。目前，干扰素已经广泛应用于临床，在传染病领域，IFN-α主要用于慢性乙型肝炎、丙型肝炎的治疗。根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、序列的同源性、抗原性和细胞来源，干扰素可分为I型与II型，II型只包括一个成员，即IFN-γ，而I型干扰素则是多基因家族，包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω等。现在公认IFN-β和IFN-γ只有一个亚型，而IFN-α有约二十余个亚型。

中国科学家的研究发现，中国人白细胞经病毒刺激后，诱生的所有干扰素中最主要的亚型是α1b，所以α1b更符合中国人的自然状态。候云德教授等人于1982年成功克隆了人IFNα1b基因，并在大肠杆菌中实现高效表达，使干扰素产业化成为可能。IFN-α1包括IFN-α1a、IFN-α1b、IFN-α1c、IFN-α1d等亚型。这些亚型相互之间仅相差一个或两个氨基酸。IFN-α1b仅在中国获得批准上市使用，国外只有IFN-α2a和IFN-α2b两个亚型获准在临床使用，没有IFN-α1b，因此，国内外对IFN-α1b的生产工艺研究并不多。

专利申请号为CN200410069391.9的专利文献公开了一种重组人干扰素α1b的纯化工艺方法，从该专利申请获知，其重组人干扰素α1b在质粒构建时，使用的载体与之前的可溶性表达菌种使用的载体不一样，其工程菌在发酵表达过程中，形成包涵体，而不是大肠杆菌胞内可溶表达，其纯化过程包括包涵体离心、沉淀、包涵体变性和包涵体复性等步骤。其疏水柱层析使用Phenyl Sepharose FF，分辨率不高，使用盐梯度洗脱，不能分离重组人干扰素α1b相关蛋白质、异构体。

本申请人的中国发明专利ZL200410050936.1公开了一种重组人干扰素α1b的纯化工艺方法。其特征是利用扩张床吸附、单克隆抗体亲和层析等步骤分离纯化可溶性表达的重组人干扰素α1b。这种利用单克隆抗体亲和层析的方法具有昂贵、可能有鼠IgG脱落等不足，该方法获得的重组人干扰素α1b原液用分子筛高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测只有一个主峰，但是用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测有两个或两个以上的主峰，即重组人干扰素α1b峰及重组人干扰素α1b相关蛋白/异构体峰。这种原液符合《中国药典》的标准，但如果参考《欧洲药典》的标准，则达不到单一主峰纯度的标准。因此，急需发明新的方法，以获得符合类似《欧洲药典》干扰素α标准的重组人干扰素α1b，满足临床应用的需要。

综上，现有技术的干扰素生产存在以下缺陷：生产工艺步骤复杂；强酸强碱处理使得蛋白得率很低；单抗亲和虽然具有高选择性，但单抗胶价格昂贵，使用次数有限，且容易脱落造成产品污染；现有技术生产的干扰素原液经RP-HPLC检测，存在两个主峰，一个为干扰素α1b，另外一个为干扰素α1b的相关蛋白质、异构体。为了克服现有技术工艺的不足，提高生产效率，很有必要探索一种新的干扰素纯化工艺。

发明内容本发明要解决的技术问题在于避免上述现有技术的不足之处，而对现有技术做进一步的改进，提出一种能够提高生产效率和原液质量，又能降低生产成本的取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法。

本发明解决所述技术问题实际采用的技术方案是：提出一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法，用于从可溶性表达重组人干扰素α1b的大肠杆菌工程菌中提取重组人干扰素α1b，包括如下步骤：

A.利用高压匀浆机破碎含有重组人干扰素α1b的菌体；

B.将步骤A获得的破碎菌体上样至Streamline扩张床吸附柱，使用NaCl盐梯度洗脱或一步法洗脱得到目标蛋白，优选采用一步法洗脱；

C.将步骤B处理后得到的目标蛋白添加NaCl到2M至2.5M，经疏水柱层析，高盐浓度上样、低盐浓度洗脱；

D.将步骤C处理后得到目标蛋白经阴离子柱层析，利用缓慢的pH梯度将重组人干扰素α1b与其相关蛋白质、异构体分离；

E.采用Sephacryl凝胶过滤层析，去除高分子蛋白，获得重组人干扰素α1b原液。

上述步骤A中细菌破碎过程是在Tris-EDTA缓冲液中进行，缓冲液pH为7.0-8.0，优选pH值为7.2。

上述步骤B中扩张床吸附采用Streamline DEAE凝胶；采用Tris-HCl缓冲液，其pH为7.0-8.0，优选pH值为7.2。

上述步骤B中使用NaCl盐梯度洗脱采用0.4M的NaCl；采用一步法洗脱则使用0.12-0.15M的NaCl，优选为0.12M的NaCl。

上述步骤C中疏水柱层析采用苯基或丁基作为配基的疏水介质；步骤C中疏水柱层析采用Phenyl Sepharose HP凝胶，平衡液采用pH为6.0的PBS、2.5M的NaCl；洗脱液采用pH为6.0的PBS；采用梯度洗脱方法，梯度程序为0-100％B，15个柱床体积。

上述步骤D中阴离子柱层析采用Q Sepharose离子交换介质；步骤D中阴离子柱层析采用Q Sepharose HP凝胶，平衡液采用pH为5.5的40mM NH₄Ac；洗脱液采用pH为4.0的40mMNH₄Ac；梯度程序为0-100％B，20-30个柱床体积。该梯度程序可以是分步梯度程序，为先0-20％B、5min，后20-50％B、20个柱床体积。

上述步骤E中Sephacryl凝胶过滤层析采用Sephacryl S-100凝胶，pH为6.5-8.0的PBS，优选pH为7.0。

同现有技术相比较，本发明的有益效果在于：纯化周期缩短了20％，无需使用单抗亲和层析，避免了单抗脱落造成的污染；且利用pH梯度洗脱分离了干扰素α1b的相关蛋白质、异构体，原液反相HPLC检测达到单一主峰的纯度；进一步提高了生产效率，降低了生产成本，提升了原液质量。

附图说明

图1是本发明取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法采用QHP柱层析的图谱；

图2是所述本发明获得的重组人干扰素α1b原液反相高效液相色谱法RP-HPLC分析图。

具体实施方式以下结合附图对本发明作进一步详述。

为了表述简洁方便，本说明书实施例及其他部分中的部分化学物质名称采用了代号或行业内简称来替代，声明如下：

TE缓冲液：即Tris-EDTA，Tris为三羟甲基氨基甲烷，EDTA为乙二胺四乙酸；

Tris-HCl：用盐酸调整pH的三羟甲基氨基甲烷溶液；

PBS：磷酸盐缓冲液；

CV：Column Volume柱床体积

Streamline Buffer A：pH7.0-8.0，优选pH 7.2的40mM Tris-HCl；

Streamline Buffer B：pH7.0-8.0，优选pH7.2的40mM Tris-HCl和0.12M NaCl；

Phenyl Buffer A：pH6.0的磷酸盐缓冲液PBS和2.5M NaCl；

Phenyl Buffer B：pH6.0的磷酸盐缓冲液PBS；

QHP Buffer A：pH 5.5的40mM醋酸铵CH₃COONH₄，CH₃COONH₄可简写为NH₄Ac；

QHP Buffer B：pH4.0的40mM醋酸铵CH₃COONH₄，CH₃COONH₄可简写为NH₄Ac；

实施例1干扰素纯化工艺小试

1、菌体破碎：取100克菌体，加入pH为7.0-8.0，优选7.2的TE缓冲液1000ml，悬浮菌体，然后冰浴超声破菌(优选采用广州市辛诺超声设备有限公司的直插式超声波处理器)，设置为每次两分钟，间隔10秒，共15次。绢布过滤除去颗粒和碎片。

2、扩张床吸附层析：

采用直径5cm pharmacia柱，Streamline DEAE凝胶，柱床体积为200ml。

扩张床吸附柱柱塞上升，用Streamline Buffer A平衡3-5个柱床体积CV，柱床体积扩张。将超声破碎液用纯化水对倍稀释，记录溶液电导、pH值，以24ml/min的流速上柱。上样结束后用Streamline Buffer A再平衡3-5个CV，至紫外吸收值接近基线，下降柱塞至胶面，用Streamline Buffer B以10ml/min的流速洗脱，收集洗脱目标峰。洗脱方式用0.4M NaCl线性梯度洗脱或0.12M的NaCl一步法洗脱，优选采用0.12M NaCl一步法洗脱。

3、疏水(HIC)柱层析：采用直径5cm pharmacia柱，Phenyl Sepharose HP凝胶，装柱体积为150ml。Phenyl HP柱用Phenyl Buffer A平衡5个CV。扩张床吸附收集液用纯化水稀释5倍后，边搅拌边缓慢滴加饱和NaCl使溶液含2.5M NaCl，此时电导达200ms/cm，pH约6.0，以15ml/min的流速上柱。上样结束后用Phenyl Buffer A再平衡5-8个CV，至紫外吸收值接近基线，以15ml/min的流速开始梯度洗脱。梯度洗脱采用Phenyl Buffer B，梯度程序(0-100％B，15个CV)收集目标峰。

4、QHP层析：采用直径5cm pharmacia柱，Q Sepharose HP凝胶，柱床体积为120ml。

QHP柱用QHP Buffer A平衡3-5个CV。将HIC层析收集液用纯化水稀释至电导4.0ms/cm以下，以15ml/min的流速开始上柱。上样结束后用QHP Buffer A再平衡3-5个CV，至紫外吸收值接近基线，以15ml/min的流速开始梯度洗脱。与本领域技术人员通常使用的盐浓度梯度洗脱不同，本发明克服技术偏见，使用缓慢的pH梯度洗脱，成功地把重组人干扰素α1b的相关蛋白质、异构体分离，达到RP-HPLC检测单一主峰的纯度，获得了意想不到的效果。梯度洗脱用QHP Buffer B，梯度程序为0-100％B，30个柱床体积，可优选采用分步梯度程序(先0-20％B 5min，后20％-50％B 20个CV)。收集液用0.5M Na₂HPO₄调至pH7.0左右。

5、超滤浓缩：将QHP层析收集液超滤浓缩至合适体积。

6、凝胶过滤(分子筛或分子排阻)层析：采用直径5cm pharmacia柱，Sephacryl S-100凝胶，装柱体积为1500ml，S-100柱用PBS平衡3个柱床体积。以3ml/min的流速上S-100柱。收集目标峰即为重组人干扰素α1b原液。

所获得的干扰素α1b原液的质量指标完全满足《中国药典》的规定，这些指标包括：比活、HPLC、电泳纯度、内毒素、外源DNA、宿主蛋白和IgG。此外，反相HPLC检测指标达到单一主峰的标准。

实施例2干扰素纯化工艺中试

1、菌体破碎：取1000克菌体，按质量/体积(1/10)加入pH为7.0-8.0，优选7.2的TE缓冲液10升，悬浮菌体，然后用APV均质机，50Mp匀浆两次，绢布过滤除去颗粒和菌体碎片。

2、扩张床吸附层析：采用直径10cm pharmacia柱，Streamline DEAE凝胶，装柱体积为2000ml。扩张床吸附柱柱塞上升，用Streamline Buffer A平衡3-5个CV，凝胶向上扩散，柱床体积扩大。将匀浆上清用纯化水对倍稀释，记录溶液电导、pH值，上样。上样结束后用Streamline Buffer A再平衡3-5个CV，至紫外吸收值接近基线，柱塞下降，用Streamline BufferB洗脱，收集洗脱目标峰。

3、HIC层析：采用直径10cm Index柱，Phenyl Sepharose HP凝胶，柱床体积为1400ml。Phenyl HP柱用Phenyl Buffer A平衡5个CV。扩张床吸附收集液用纯化水稀释5倍后，边搅拌边缓慢滴加饱和NaCl使溶液含2.5M NaCl，此时电导达200ms/cm，pH约6.0，上样。上样结束后用Phenyl Buffer A再平衡5-8个CV，至紫外吸收值接近基线，以25ml/min的流速开始梯度洗脱。梯度洗脱采用Phenyl Buffer B，梯度程序(0-100％B，15个CV)收集目标峰。

4、QHP层析：采用直径10cm Index柱，Q Sepharose HP凝胶，柱床体积为1000ml。QHP柱用QHP Buffer A平衡3-5个CV。将HIC层析收集液用纯化水稀释至电导4.0ms/cm以下，开始上样。上样结束后用QHP Buffer A再平衡3-5个CV，至紫外吸收值接近基线，以25ml/min的流速开始pH梯度洗脱。梯度洗脱采用QHP Buffer B。为了更好地把重组人干扰素α1b与其相关蛋白质、异构体分离，使用缓慢的pH分步梯度程序(先0-20％B 5min，后20％-50％B，20个CV)，收集液用0.5M Na₂HPO₄调至pH7.0左右。QHP柱层析图谱如图1所示。

5、超滤浓缩：将QHP层析收集液超滤浓缩至合适体积。

6、凝胶过滤(分子筛)层析：采用直径10cm pharmacia柱，Sephacryl S-100凝胶，装柱体积为6000ml，S-100柱用PBS平衡3倍柱床体积，上样。收集目标蛋白，即为干扰素原液。

所获得的干扰素原液的质量指标完全满足《中国药典》的规定，这些指标包括：比活、HPLC、电泳纯度、内毒素、外源DNA、宿主蛋白和IgG。此外，反相HPLC检测指标达到单一主峰的标准，其检测工艺条件及过程见实施例3。

实施例3反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测方法(Vydac柱)

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；应用Vydac C18柱，4.6mm×250mm，CV＝4.15ml，孔径30nm，粒径5μm。流动相A：70％H₂O+30％ACN(乙腈)+0.1％TFA(三氟乙酸)，0.45μm滤膜抽滤，除去溶液中的杂质；流动相B：20％H₂O+80％ACN(乙腈)+0.1％TFA(三氟乙酸)，0.45μm滤膜抽滤，除去溶液中的杂质。流速：1.0ml/min，在室温条件下，进行梯度洗脱，梯度设置见表1。进样量40～100μl(相当于20～40μg)，检测波长210nm。按面积归一化法计算重组人干扰素α1b纯度。检测结果为单一主峰，如图2所示。

时间(min)	流动相B％(V/V)
		0-1	31
1-5	31-35
		5-20	35-39
20-30	39-45
		30-40	45-60
40-42	60
		50-50.1	60-31
50.1-60	31

表1

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干推演或替换，都应视为属于本发明所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims

1.一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法，用于从可溶性表达重组人干扰素α1b的大肠杆菌工程菌中提取重组人干扰素α1b，包括如下步骤：

A.利用高压匀浆机破碎含有重组人干扰素α1b的菌体；

B.将步骤A获得的破碎菌体上样至Streamline扩张床吸附柱，扩张床吸附柱采用Streamline DEAE凝胶、用Streamline Buffer A，即pH为7.0-8.0 40mM的Tris-HCl缓冲液平衡3-5个柱床体积，使用Streamline Buffer B，即pH7.0-8.0 40mM Tris-HCl 0.12M-0.15M的NaCl一步洗脱得到目标蛋白；

C.将步骤B处理后得到的目标蛋白添加NaCl到2M至2.5M，经疏水柱层析，疏水柱采用Phenyl Sepharose HP凝胶、用Phenyl Buffer A，即pH6.0的磷酸盐缓冲液PBS 2.5M NaCl平衡5个柱床体积，目标蛋白加入饱和NaCl使其含2.5M NaCl后上样、并采用Phenyl Buffer B，即pH6.0的磷酸盐缓冲液PBS进行梯度洗脱，梯度程序为0-100％Phenyl Buffer B，15个柱床体积；

D.将步骤C处理后得到目标蛋白经阴离子柱层析，阴离子柱层析采用Q Sepharose HP凝胶，平衡液采用QHP BufferA，即pH为5.5的40mM NH₄Ac；采用QHP BufferB，即pH为4.0的40mM NH₄Ac的洗脱液；梯度程序为0-100％QHP Buffer B，20-30个柱床体积，以流速为15ml/min的pH梯度洗脱将重组人干扰素α1b与其相关蛋白质、异构体分离；

E.采用Sephacryl凝胶过滤层析，采用Sephacryl S-100凝胶，使用pH为6.5-8.0的磷酸盐缓冲液，去除高分子蛋白，获得重组人干扰素α1b原液。

2.根据权利要求1所述的一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法，其特征在于：步骤A的细菌破碎过程是在Tris-EDTA缓冲液中进行，该缓冲液pH为7.0-8.0。

3.根据权利要求2所述的一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法，其特征在于：所述Tris-EDTA缓冲液pH值为7.2。

4.根据权利要求1所述的一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法，其特征在于：所述步骤B中Tris-HCl缓冲液pH值为7.2。

5.根据权利要求1所述的一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法，其特征在于：所述步骤B中使用Streamline Buffer B，即pH7.0-8.0 40mM Tris-HCl 0.12M-0.15M的NaCl一步洗脱替换为pH7.0-8.0 40mM Tris-HCl 0.4M的NaCl线性梯度洗脱。

6.根据权利要求1所述的一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法，其特征在于：所述步骤B中Streamline Buffer B，即pH7.0-8.0 40mM Tris-HCl 0.12M-0.15M的NaCl一步洗脱采用pH7.2 40mM Tris-HCl 0.12M的NaCl做洗脱液。

7.根据权利要求1所述的一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法，其特征在于：所述步骤D中梯度程序采用分步梯度程序，为先0-20％QHP Buffer B，即pH为4.0的40mM NH₄Ac、5min，后20-50％QHP Buffer B，即pH为4.0的40mM NH₄Ac、20个柱床体积。

8.根据权利要求1所述的一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法，其特征在于：所述步骤E中磷酸盐缓冲液PBS的pH为7.0。