具体实施方式
以下对本发明作进一步详尽说明。
为什么要选用扩张床吸附技术?
对纯化工艺的改进首先在于纯化策略和思路的变化。重组蛋白纯化的传统思路是将纯化分为初步纯化和高度纯化两部分,这种思路的出发点是从生产管理的角度来安排纯化生产工作,其弊端在于,从工艺技术的角度,这种分割并不具有明确的含义,分界处在那里?哪个单元是初步纯化,哪个单元是高度纯化。初步和高度纯化的概念很难用来确定一条工艺路线,从菌体开始逐步纯化获得符合各种要求的目标蛋白。一种新的纯化策略是从技术的角度出发,将重组蛋白从菌体到纯品的纯化工艺分成三部分:目标蛋白捕获→中间纯化→精制。它的思路是首先从复杂的初始物料中将目标蛋白捕获出来,不要求高的纯度,而要求高回收率和大副减少处理体积,以及去除杂质颗粒。第二步中间纯化是提高纯度的关键步骤,将无颗粒和大幅减少体积后的物料采用高效的纯化手段,去除大部分杂质,大幅度提高目标蛋白纯度。第三步精制是将可能存在的小量杂质如聚体和异构体,以及前期纯化中可能带入的新杂质去除,以达到要求的纯度。
基于捕获→中间纯化→精制的纯化策略,和现有纯化工艺存在的问题,我们发现重要的是将原来低效复杂的初步纯化工艺以高效简单的手段代替。我们选用了Pharmacia的EBA系统(Expanded Bed Adsorption扩张床吸附)来进行此项改进。
自从1993年问世以来,扩张床吸附已广泛应用于基因工程产品的研究开发和生产。无论是大肠杆菌、酵母菌还是哺乳动物细胞,都有大量应用的实例。1998年,日本绿十字公司更将大规模扩张床吸附用于迄今为止最大的基因工程产品-重组白蛋白的生产,可见其应用之广泛。
采用EBA系统后,我们可以将干扰素的纯化工艺简化为:
细菌破碎→EBA→亲和层析→分子筛
在细菌破碎后,只需要三步柱层析即可完成干扰素的分离纯化工作,获得符合质量要求的干扰素纯品。整个纯化工艺从原来的13步简化为4步,其中,EBA1步代替了旧工艺中的10步:离心1→酸化→离心2→碱中和→盐析1→离心3→盐析2→离心4→脱盐→离子交换。整个纯化工艺被大大简化,生产效率得以提高。
与我们的纯化策略相一致,三步柱层析分别对应纯化策略的三个阶段。其中,EBA代替了离心、酸化、盐析、脱盐和离子交换的步骤,起到了样品澄清、浓缩和初步纯化的作用,将目标干扰素有效捕获,去除了细胞碎片等颗粒和部分杂蛋白、核酸,并且大大减少了物料体积。亲和层析作为一种高效的纯化手段,去除了大部分杂蛋白、核酸、内毒素等杂质,并进一步浓缩干扰素样品。最后一步分子筛则起到精制作用,去除了干扰素残存的少量杂蛋白、干扰素二聚体和可能从亲和层析脱落的IgG,并且起到交换缓冲液的作用。
如何具体运用扩张床吸附技术?
我们通过一系列实验进行摸索,以确定有关的技术参数和指标。
实施例1:扩张床吸附凝胶选择和层析参数优化
EBA的操作需要特殊的层析柱以产生稳定的扩张床。在工艺开发初期,首先采用装填床的形式进行实验摸索。采用装填床进行凝胶选择和参数优化,是因为,虽然扩张床的吸附效果比较好,但两种方式凝胶吸附所需的条件是保持一致的,对于选择凝胶和层析参数没有影响,而且可以节省小规模扩张床系统的投资。采用装填床,由于不能去除颗粒杂质,需要将样品先进行离心分离,以获得澄清物料。
实验方案在XK16×10(mm×cm)层析柱内进行,柱床体积20ml。分别选择一种阳离子凝胶STREAMLINE SP和一种阴离子凝胶STREAMLINE DEAE在不同的缓冲系统和不同的pH及离子强度条件下进行优化,结果如下表:
凝胶 |
实验号 |
层析柱mm*cm |
缓冲体系 |
上样量 |
洗脱点 |
收集 |
种类 |
PH |
浓度/mM |
体积ml |
盐浓度M |
活性得率% |
SP |
P1 |
16×10 |
柠檬酸 |
4.7 |
20 |
200 |
0.35 |
24.5 |
P2 | 16×10 |
醋酸 |
4.7 |
40 |
200 |
0.32 |
27.0 |
P3 |
16×10 |
醋酸 |
4.7 |
50 |
200 |
0.30 |
9.8 |
P4 |
16×10 |
磷酸 |
6.0 |
50 |
200 |
0.29 |
16.3 |
P5 |
16×10 |
磷酸 |
6.4 |
50 |
200 |
0.36 |
45.9 |
P6 |
16×10 |
磷酸 |
6.4 |
50 |
100 |
0.37 |
43.8 |
DEAE |
D1 |
16×10 |
磷酸 |
6.4 |
50 |
200 |
0.26 |
16.7 |
D2 |
16×10 | Tris | 7.4 | 50 | 200 | 0.40 | 53.9 |
D3 |
16×10 | Tris | 7.4 | 50 | 100 |
0.35 |
50.2 |
D4 | 16×10 |
Tris |
7.8 |
20 |
200 |
0.21 |
35.0 |
D5 |
16×10 |
Tris |
7.8 |
20 |
100 |
0.26 |
45.0 |
其中,STREAMLINE SP凝胶采用pH4.7的柠檬酸及醋酸缓冲液,pH6.0、pH6.4的磷酸缓冲液进行了多次实验。可见:最好的结果是采用pH6.4的磷酸缓冲液做为上样及洗脱条件,二次实验得率分别为45.9%以及43.8%,平均44.8%。
STREAMLINE DEAE在pH6.4的磷酸缓冲液,pH7.4和7.8的Tris缓冲液条件下进行了多次实验。可见:pH7.8的两次实验,得率分别为35%和45%。PH7.4的两次实验,得率分别为54%和50.2%,平均52.1%,回收率较高,且较稳定。
分析以上实验结果,可知:pH6.4的STREAMLINE SP和pH7.4的STREAMLINE DEAE都可以获得较好的结果,并且两者相比,pH7.4的STREAMLINE DEAE得率相对高出16%。选择何种条件,还要考虑的一个问题是前后工艺配合问题。由于菌体破碎是在pH7.8的Tris缓冲液中进行,匀浆液最终pH在7.4左右,正与STREAMLINE DEAE条件相符,而且在pH中性环境下,干扰素应最稳定。因此,pH7.4的STREAMLINE DEAE是理想条件。从另一个角度看,如果选用pH6.4的STREAMLINE SP,则匀浆需要更换缓冲体系,在酸性条件下,会出现蛋白沉淀,也可能存在其它意料不到的问题。因此,决定选用DEAE-STEAMLINE凝胶,并使用pH7.4的Tris-HCl作为层析缓冲液。
实施例2:使用STREAMLINE DEAE装填床小柱进行干扰素纯化工艺摸索
在实验室规模,使用XK16×10柱以装填床的形式,选用STREAMLINE DEAE和pH7.4的Tris缓冲液,用与旧工艺相同批的菌体匀浆液沿新工艺路线生产至干扰素纯品。新旧工艺比较中,旧工艺的数据取自实际生产。
实验材料:
1.设备:层析柱:XK16×10,凝胶:STREAMLINE DEAE,层析系统:Pharmacia GP-250梯度控制仪
2.缓冲液:平衡液:pH7.4 50mM Tris-HCl,洗脱液:0-0.5MNaCl pH7.450mM Tris-HCl实验程序:
1.装柱:采用20ml/min的流速在平衡缓冲液体系中装柱,装柱体积20ml
2.平衡:采用10ml/min的流速,10个柱床体积的平衡液平衡柱床
3.上样:菌体匀浆液1000ml在10ml/min流速下上样,收集流穿
4.清洗:采用平衡液在10ml/min的流速下清洗柱床,洗至紫外吸收接近基线
5.洗脱:采用0-0.5MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl进行梯度洗脱,收集主峰
6.再生:采用多种CIP清洗液再生凝胶
7.保存:采用20%乙醇保存凝胶
实验结果见下表,新工艺比旧工艺平均提高得率108%。
其中,Yn/Yo:新工艺得率/旧工艺得率 At:总活性
实验 | |
匀浆液 |
离子交换 |
亲和层析 |
凝胶过滤 |
总得率 |
Yn/Yo |
At×108IU |
At×107IU |
At×106IU |
At×106IU |
% |
T1 |
新工艺 |
1.02 |
4.64 |
12.50 |
26.40 |
25.9 |
2.18 |
旧工艺 |
1.02 |
1.57 |
7.87 |
12.10 |
11.9 |
T2 |
新工艺 |
0.38 |
1.72 |
6.45 |
11.50 |
30.3 |
2.17 |
旧工艺 |
0.38 |
1.35 |
7.30 |
5.30 |
13.9 |
T3 |
新工艺 |
1.02 |
3.65 |
24.00 |
17.30 |
17.0 |
1.77 |
旧工艺 |
1.02 |
1.34 |
8.04 |
9.80 |
9.6 |
T4 |
新工艺 |
1.74 |
13.70 |
35.80 |
52.80 |
30.3 |
2.16 |
旧工艺 |
1.74 |
3.90 |
21.70 |
24.40 |
14.0 |
实施例3:扩张床吸附手动纯化系统的建立
在由实验规模向生产规模放大的过程中,面临着建立扩张床吸附纯化系统的问题。基于降低投资的考虑,我们与层析柱供应商一起建立扩张床吸附的手动纯化系统。
根据图2扩张床吸附操作原理图,扩张床吸附的步骤包括平衡扩张、样品上样、柱清洗、沉降洗脱,柱再生。为同时实现扩张和层析两个功能,必须采用双泵系统。一个泵负责柱床的扩张和沉降,另一个泵负责平衡、上样、洗脱、再生。同时,由于存在多种液体的更换,因此,需要较为复杂的阀门和管路系统。另外,需要基本的检测和记录系统。
根据以上分析,首先是确定在不同层析状态下,各种流体的流程图。如图2-1到2-8,分别包括初始状态、平衡扩张、柱塞上升、上样、清洗、柱塞下降、洗脱、再生等不同状态的流程图。其中,1-9为手动阀。A指初始缓冲液,B指洗脱缓冲液。在所有流程图中,黑线及箭头表示的路径是液体在该状态下的流动路程。如图2-4,上样流程图中,样品经过阀3、阀2、泵1、阀4、阀5、阀6、阀8进入层析柱内,上样产生的流穿从柱顶流出,经过阀7、阀6进入紫外检测仪,检测紫外吸收信号,再作为废液排走。
根据以上流程,选用了相应设备:STREAMLINE200层析柱,WASTON-MARLOW蠕动泵两台,紫外检测仪及数据记录仪,手动阀门以及管道。将所有组件,根据工艺流程安装起来,形成了扩张床吸附的手动纯化系统。
实施例4:扩张床吸附纯化干扰素新工艺的生产规模放大
将实验规模的XK16/10小柱中摸索的条件直接放大至STREAMLINE200扩张柱,柱床体积由20ml放大到4.5L,为225倍一步放大。
实验材料:
1.设备:层析柱:STREAMLINE200,凝胶:STREAMLINE DEAE4.5L,
层析系统:扩张床吸附手动纯化系统
2.缓冲液:平衡液:pH7.450mM Tris-HCl,
洗脱液:0.4MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl,
再生液:0.5MNaOH-1MNaCl,WFI,30%异丙醇、25%醋酸、20%乙醇
实验程序:
1.装柱:在平衡缓冲液体系中装柱,直接将凝胶装入层析柱内,装柱体积4.5L
2.平衡:采用300CM/H的流速,10个柱床体积的平衡液平衡柱床
3.上样:菌体匀浆液100L在300CM/H流速下上样,收集流穿
4.清洗:采用平衡液在300CM/H的流速下清洗柱床,洗至紫外吸收接近基线
5.洗脱:采用0.4MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl以100CM/H进行一步洗脱,收集洗脱峰
6.再生:采用多种CIP清洗液再生凝胶
7.保存:采用20%乙醇保存凝胶
实验结果:扩张床吸附层析曲线如图3。检定数据如下表,新工艺比旧工艺平均提高得率82%。
其中,Yn/Yo:新工艺得率/旧工艺得率 At:总活性
实验 | |
匀浆液 |
离子交换 |
亲和层析 |
凝胶过滤 |
总得率 |
Yn/Yo |
At×1010IU |
At×1010IU |
At×109IU |
At×109IU |
% |
P1 |
新工艺 |
3.18 |
3.05 |
4.85 |
5.15 |
16.2 |
1.42 |
旧工艺 |
3.18 |
0.74 |
2.08 |
3.64 |
11.4 |
P2 |
新工艺 |
3.66 |
2.44 |
6.50 |
8.50 |
23.2 |
2.46 |
旧工艺 |
3.66 |
1.21 |
2.00 |
3.46 |
9.5 |
P3 |
新工艺 |
2.43 |
1.73 |
4.50 |
7.54 |
31.0 |
1.57 |
旧工艺 |
2.43 |
0.62 |
4.30 |
4.80 |
19.8 |
实施例5:STREAMLINE DEAE凝胶负载测试
实验材料:
层析柱XK16/6.9,采用装填床的形式装填13.8ml STREAMLINE DEAE凝胶。
平衡液:pH7.450mM Tris缓冲液
上样:采用干扰素菌体匀浆液离心去除颗粒,作为上样液
实验程序:
1.用缓冲液平衡10个柱床
2.以270CM/H的速度上样1000ML
3.对流穿定点取样,流穿收集点为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000ML
4.检测各流穿收集点的干扰素浓度C,除以上样中干扰素浓度Co,得到C/Co值,C/Co最大为1。
5.以C/Co值对响应的收集体积作图,如图4。
实验结果:
从图4可以看出,上样达到400ml时,干扰素流穿C/Co=0.28,尚可接受。上样500ml时,C/Co=0.44,已经完全不可接受。因此,以400ml点作为凝胶最大吸附量。计算STREAMLINEDEAE凝胶吸附量如下。
1.凝胶最大菌体负载=400ml×50gcell/1000ml/13.8mlgel
=1.45gcell/ml gel
2.凝胶最大菌体干扰素负载=400ml×0.0252mg IFN/ml/13.8ml gel
=0.725mg IFN/ml gel
根据以上凝胶负载,STEAMLINE200柱所装4.5L凝胶,其最大菌体上样量为6.5Kg菌体,按最大负载80%上样,上样量为5.2Kg干扰素菌体。
实施例6:STREAMLLINE200柱床稳定性检测
1.目检:对玻璃制的扩张床柱,目检是检测柱床稳定性的重要步骤。在柱床平衡扩张后,进行目检。稳定的柱床中,悬浮的凝胶颗粒只在原地做小的旋转运动。如果出现紊流或沟流,会导致吸附效果不理想。柱床上部大的回旋运动,可能是柱子没有处于垂直的位置。柱床下部的沟流提示柱底的分布器中存在气泡或者分布系统部分堵塞。
2.柱床扩张倍数检测
扩张倍数是扩张后柱床的高度H与沉降后柱床的高度Ho的比值,H/Ho。理想状态下,扩张倍数与流速,缓冲体系,温度有关,这三个指标确定的情况下,扩张倍数得以确定。异常情况下,扩张倍数的下降可能意味着分布板中存在气泡或堵塞,凝胶被污染,柱子不垂直等问题。
在STREAMLINE200柱中,使用STREAMLINE DEAE凝胶,50mM pH7.4的Tris缓冲液,20℃的工作温度,和300CM/H的平衡速度,扩张倍数=H/Ho=43.6/14.5=3.0,为合理值。
3.理论塔板数检测
保留时间分布实验可以用来确定理论塔板数,以评估扩张床中凝胶轴向分布的情况。将稀释的丙酮溶液上样到扩张好的柱内,同时检测流出物中丙酮的紫外吸收信号,根据层析图谱计算理论塔板数。具体程序如下:
(1).采用平衡缓冲液在300GM/H流速下充分扩张,记录扩张床高度。
(2).降低柱塞到离扩张床胶面0.5-1CM
(3).启动记录仪和紫外检测仪。当基线稳定时,上样缓冲液-丙酮的混合物(0.25%V/V)并等待丙酮紫外吸收信号出现。
(4).当紫外信号稳定在最大吸收值(100%)时,换成缓冲液。在记录纸上作下标记。
(5).等待紫外信号下降并稳定在基线水平。
(6).根据图5所示,计算理论塔板数N。
N=t2/σ2
t=平均保留时间,
是从步骤4中的标记处到50%最大紫外信号的距离
σ=标准偏差
是从最大紫外信号的15.85%到84.15%之间距离的一半
在STREAMLINE200柱采用14.5CM的STREAMLINE DEAE凝胶,扩张到43.6CM,最后检测到:
t=120.6,σ=25.9,
N=t2/σ2=120.62/25.92=22为合理的理论塔板数
实施例7:扩张床吸附洗脱液上亲和层析操作程序
实验材料:
1.设备:层析柱90×70,蠕动泵,紫外检测仪和记录仪
2.材料:单抗胶MCAb-Sepharose F.F.,
缓冲液PBS,0.1M Gly-HCl,0.1MTris-HCl,0.1MNaAc,0.5MNaOH
实验程序:
1.平衡:使用PBS平衡柱床
2.上样:根据扩张床吸附洗脱液的检测结果确定上样量,将洗脱液上样至柱内
3.清洗:使用PBS清洗柱内未吸附的杂质
4.洗脱:使用洗脱缓冲液将柱上吸附的干扰素清洗下来,收集洗脱峰,即图6中第2个峰
5.再生:使用Tris-HCl和NaAc缓冲液清洗残留的柱内杂质
亲和层析图谱见图6,图中横坐标为时间,每一格是30分钟,图中纵坐标为280nm紫外线吸收相对值(百分数)。
实施例8:凝胶过滤处理亲和层析洗脱液
实验材料
1.设备:层析柱130×70,蠕动泵,紫外检测仪和记录仪
2.材料:Sephacryl S-100,
缓冲液PBS,0.5MNaOH
实验程序
1.平衡:使用PBS缓冲液平衡三个柱床体积
2.上样:将亲和层析洗脱液按柱床体积4%的上样量上到柱内
3.洗脱:使用PBS缓冲液洗脱样品,收集干扰素主峰
4.再生:使用0.5MNaOH再生柱床
凝胶过滤图谱见图7,图中横坐标为时间,每一格是60分钟,图中纵坐标为280nm紫外线吸收相对值(百分数)。
与现有技术相比较,采用本发明重组人干扰素α1b的纯化工艺,生产效率可以大大提高,生产成本则大大降低。具体体现在:工艺周期缩短40%,纯化得率提高70%,生产成本降低40-50%等多方面。
(1).工艺周期比较
上表为干扰素新旧纯化工艺流程图和工期比较。从中可以看出,在旧工艺中,从菌体到原液的整个纯化工艺周期为5天时间,而新工艺仅为3天时间,工期缩短2天。纯化周期缩短40%,相应的纯化产能可以提高40%。而且由于通常纯化是整个生产的瓶颈所在,纯化产能提高40%,就意味着干扰素原料和制剂的生产能力提高40%。
(2).纯化得率比较
从菌体开始,经过全部纯化路线,获得干扰素纯品。在不同规模情况下比较了新旧工艺的得率。
在实验室规模,用与旧工艺相同批的菌体匀浆液沿新工艺路线生产至干扰素纯品。其中,由于没有实验室规模扩张柱,实验室规模的扩张床吸附采用装填床的形式进行层析。而旧工艺的数据取自实际生产。从下表结果来看,新旧工艺活性得率之比为2.08,即新工艺得率提高1倍。
批号 |
T1 |
T2 |
T3 |
T4 |
平均 |
新工艺活性得率Yn(%) |
25.8 |
30.2 |
16.9 |
30.4 | |
旧工艺活性得率Yo(%) |
11.9 |
13.9 |
9.6 |
14.1 | |
Yn/Yo |
2.17 |
2.17 |
1.76 |
2.16 |
2.08 |
工艺放大后,在生产规模,采用STREAMLINE200柱进行扩张床吸附,与旧工艺采用相同的菌体匀浆液纯化至纯品。结果如下表,可以看出,同在生产规模,采用EBA的新工艺得率提高82%。
批号 |
P1 |
P2 |
P3 |
平均 |
新工艺活性得率Yn(%) |
16.2 |
23.2 |
31.0 | |
旧工艺活性得率Yo(%) |
11.4 |
9.4 |
19.8 | |
Yn /Yo |
1.42 |
2.46 |
1.57 |
1.82 |
生产规模得率提高的幅度低于实验规模,主要原因有两点:1.由于EBA得率远高于旧工艺中相应的初纯和离子交换步骤,因此EBA收集物上单抗时经常出现过量上样问题,导致干扰素流穿过多。而旧工艺不存在这个问题,在单抗步骤损失很少。2.EBA收集物由于只经过一步纯化,在样品保存过程中可能存在酶解问题。
(3).产品质量比较
新旧工艺在质量指标上无明显差异,都完全满足生物制品规程的要求。所有指标包括:比活、HPLC及电泳纯度、内毒素、外源DNA、宿主蛋白、IgG含量都全部合格,成品的动物实验等要求全部合格。
(4).生产成本比较
A.新工艺固定资产投资降低。由于去除了离心分离、多步沉淀、柱层析脱盐和离子交换等步骤,因而减少了大型连续流离心机、多个反应罐和层析系统的投资。在年产1000万支干扰素的生产规模,纯化设备的投资可以减少260万人民币,减少幅度为41%。
B.物料成本降低。酸化沉淀、硫氨盐析、脱盐等步骤的减少,使得物料成本降低。在年产1000万支干扰素的生产规模,物料成本降低18万,降低幅度为58%。同时还伴随着水电等成本的下降。
C.人员成本下降。由于工艺的简化,劳动量的降低。使得完成相同任务所需人数大大降低。在年产1000万支干扰素的生产规模,纯化人数从14人减为8人,人员成本减少43%。
综合以上因素,可以看出,由于采用新工艺,整个纯化工艺的生产成本下降了40-50%。
以上各实施例意在具体说明本发明之设计思路:在重组人干扰素α1b的纯化工艺中采用扩张床吸附技术取代传统的柱层析技术,以及如何实现该项技术。本发明之实施,并不限于以上各实施例所公开的方式,凡基于本发明之设计思路,进行简单推演与替换,得到的具体的重组人干扰素α1b的纯化工艺,都属于本发明的实施。