CN1172001C - 一种高效纯化基因工程菌重组表达产物的工艺及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效纯化基因工程重组表达产物的方法及其试剂。使用表面活性剂等助溶剂克服重组表达产物的聚合问题，提高纯化效率。使用层析系统和适当的分离纯化条件提高了基因工程重组表达产物的分离效率。
Description
发明领域
本发明属于遗传工程领域，涉及一种高效纯化基因工程重组表达产物的工艺，主要是通过添加表面活性物质等助溶剂克服重组表达产物的聚合问题。
背景技术
基因工程重组表达产物的聚合问题是困绕生物技术产业界的难题之一。如何克服该问题，提高重组表达产物的纯化效率是产业界迄待解决的瓶颈。
干扰素是一种细胞因子，它是细胞对病毒感染应答中产生的一种具有抗病毒活性的蛋白质。按其来源不同，干扰素可以分为：α干扰素(主要由B淋巴细胞产生)、β干扰素(由成纤维细胞产生)、γ干扰素(主要由T淋巴细胞产生)。人α干扰素还有各种亚型，至今已发现了20多种，α2干扰素是其中最主要的一种亚型。
人α干扰素具有抗病毒，抗肿瘤和免疫调节等多种生物学功能，是临床上疗效确切，应用面广和市场需求量大的基因工程产品。人们最早采用细胞工程的方法生产人α干扰素，采用仙台病毒诱导一种淋巴细胞产生干扰素。用这种方法生产干扰素产量低、成本高，很难大量供应。基因工程技术的出现为大量制备廉价的人α干扰素创造了条件，最先建成的人α干扰素基因工程表达系统是大肠杆菌系统(Nagata，S.et al.Nature284，361-320，1980；Goeddel，D.V.et al.，Nature 287：411-416，1980)，用大肠杆菌表达的人α2a干扰素和人α2b干扰素都已在1986年上市。但是，大肠杆菌表达的人α干扰素均为细胞内表达，表达产物在大肠杆菌细胞内以包含体形式存在，为了取得活性好的干扰素，需要经过复杂的变性和复性过程。另外，由于大肠杆菌会产生对人体有害的内毒素，在用大肠杆菌生产人α干扰素时，必须作很大的努力去清除内毒素。这些都给大规模尘产带来困难。一些用大肠杆菌生产的干扰素常常会发生副作用，在大剂量使用时问题更为严重。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因工程表达系统与大肠杆菌系统相比虽然晚了近十年，但是，由于酵母菌是单细胞的真核生物，它在操作上与大肠杆菌一样简单，但它具有真核生物的基本特性。另外，几个世纪来，酵母一直被用来进行食品发酵，证明其不产生任何对人体有害的物质。1982年英国Tuite等首先用PGK1启动子在酿酒酵母中表达了人α2a干扰素(Tuite，M.F.et al.，EMBO Journal，1：603-608，1982.)。他们采用的是胞内表达方式，分离纯化步骤极其复杂。1983年美国Hitzeman等用干扰素基因的信号序列来指导其在酵母菌中的分泌表达，他们发现信号肽加工不均一，所以表达的干扰素N端不均一(Hitzeman，Ronald A et al.，Science，219：420-425，1983)。1984年美国Singh等改用酵母α因子基因的信号序列指导了人α干扰素的分泌表达，但是表达量仅达108IU/L(Singh，A.et al.，Nucleic Acids Research 12(23)：8927-8938，1984)。1986年美国Zsebo等用酵母系统分泌表达了IFN-Con基因，结果表明仅有不足5％表达的干扰素在培养液中，95％以上的干扰素仍留在菌体内(Zsebo，K.M.et al.，J.Biological Chemistry，281：5858-5895，1986.)。发明人等曾在1990年成功地构建了一个稳定性高的酵母载体pHC11，并利用PGK1启动子-α因子前导顺序和ADH1终止子建成了高效分泌表达人α2a干扰素的工程菌DC04/pHC11-IFN2a，表达量可达到1.02×1010IU/L(霍克克等，中国科学B辑，1992年，922-929，1992)。但是，将表达人α2a干扰素的酵母工程菌DC04/pHC11-IFN2a在丰富培养基YEPD中发酵，将发酵液通过截留分子量为10万的超滤膜过滤、浓缩、透析。然后将发酵液、滤出液和透析后的浓缩液进行凝胶电泳分析。分析结果表明：滤出液只有很少量的干扰素，而在透析后的浓缩液中且含有大量的干扰素(图1)，说明极大部分的干扰素以分子量大于10万的聚合体存在。这种聚合体可能是由干扰素自身聚合而成，也可能是由干扰素与杂蛋白聚合而成。
将上述发酵液进行各种柱层析技术分离，再对洗脱液各个组分进行凝胶电泳分析，可以发现在洗脱的各个峰中均有人α2a干扰素存在，人α2a干扰素的纯化得率非常低。因此，要提高得率首先要解决干扰素的解聚问题。
发明内容
本发明的目的是通过解决基因工程重组表达产物的解聚问题，尤其是分明表达产物的解聚问题，特别是在酵母中表达的外源基因产物的聚合问题，提供一利高效纯化基因工程菌重组表达产物的方法。
本发明提出的纯化基因工程菌重组表达产物的方法，是在培养发酵阶段通过添加表面活性物质助溶剂，以解决重组表达产物的聚合问题。并相应建立了一条操作简单、收得率高的纯化重组表达产物的工艺路线。通过该方法，重组表达产物的纯化得率可达44％左右。
本发明中所述的基因工程菌包括基因工程菌包括基因工程修饰过的细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等。
本发明中所述的基因工程菌重组表达产物包括任何用途的蛋白质和多肽，包括但不限于蛋白质药物、疫苗、工业和农业用蛋白质等。
本发明中，所述的助溶剂包括但不限于Tween(吐温)系列的表面活性剂。
本发明中，所述的聚合包括重组表达产物自身聚合以及与其他物质的聚合。
本发明中，所述的基因工程菌是酵母，表达产物是人α干扰素。
上述酵母通常用酿酒酵母，其表达产物是分泌表达的人α干扰素。
上述助溶剂通常用Tween-20，浓度范围为培养基的万分之五到千分之六。
本发明对由酶母分泌表达的人α2a干扰素进行高效分离纯化。其方法步骤如下：
1、工程菌的发酵培养：将表达人α2a干扰素的酿酒酵母工程菌DC04/pHC11-IFN2a接种在20ml补加腺嘌呤的基本培养液中，30℃左右下培养16-18小时后，作为种子液转接到的YEPD培养液(每升培养液含有蛋白胨20g，酵母抽提物10g、葡萄糖20g、腺嘌呤20mg和吐温-20 1ml)中，30℃下培养48小时。此时发酵液的细胞密度约为OD600 20-24。在培养液中添加吐温后，吐温在培养液中的浓度一般为千分之六到万分之五，几乎所有分泌表达的人α2a干扰素都可以通过截留分子量为10万的超滤膜。
2、人α2a干扰素的分离纯化：
a、离心除菌，收集上清液；
b、CM-SepharoseFF阳离子交换柱层析I：将离心收集所得的上清液用HAc调pH至3.4-5.4，然后上样至已用50mM pH4.4醋酸缓冲液平衡好的阳离子交换柱上(CM-SepharoseFF 2.6/10cm)，用同样缓冲液将未结合到介质上的蛋白质洗去，直至280nm吸收降到最低，用200mM醋酸缓冲液洗脱结合在介质上的部分杂蛋白，当吸收峰再次下降到最低时，再用400mM醋酸缓冲液进一步洗脱，收集到的各个分部用15％浓度的SDS-PAGE分析确定含目标蛋白质人α2a干扰素的组分，然后将它们合并；
c、CM-SepharoseFF阳离子交换柱层析II：将前面所得的含有人α2a干扰素的收集液上样到用100mM醋酸缓冲液平衡好的CM-SepharoseFF(1.6/4cm)柱上，用同样缓冲液洗去没有结合的蛋白质，直至280nm吸收降至最低时，再用300mM醋酸缓冲液进行洗脱，收集的各个分部通过15％浓度的SDS-PAGE分析确定含目标蛋白质人α2a干扰素的组分，然后将它们合并；
d、Sephadex75凝胶过滤层析：首先将Sephadex75凝胶柱(2.0/60cm)用含有150mMNaCl的磷酸缓冲液平衡，然后将前面所得的含有人α2a干扰素的收集液分批上样，用同样的缓冲液洗脱，收集的各个分部通过15％浓度的SDS-PAGE分析确定含目标蛋白质人α2a干扰素的组分，然后将它们合并。
附图说明
图1 滤出液只有很少量的干扰素，而在透析后的浓缩液中且含有大量的干扰素。
图2 在培养液中添加0.1％吐温后，几乎所有分泌表达的人α2a干扰素都可以通过截留分子量为10万的超滤膜。
图3 阳离子交换柱CM-SepharoseFF层析(I)图谱。图中箭头I：上样；箭头II：洗涤；箭头III：洗脱1；箭头IV：洗脱2数字为管号。
图4 阳离子交换柱CM-SepharoseFF层析(I)干扰素各组分的电泳分析。图中1：28号管；2：30号管；3：33号管；4：35号管；5：37号管；6：39号管；7：41号管；8：43号管；9：45号管；10：47号管。
图5 阳离子交换柱CM-SepharoseFF层析(II)图谱。图中箭头I：上样；箭头II：洗涤；箭头III：洗脱；数字为管号。
图6 阳离子交换柱CM-SepharoseFF层析(II)干扰素各组分的电泳分析。图中m：分子量标准；1：1号管；2：2号管；3：3号管；4：4号管；5：5号管；6：6号管；7：7号管；8：8号管；9：10号管。
图7 凝胶过滤柱Sephadex75层析图谱。图中箭头：上样；数字为管号。
图8 凝胶过滤柱Sephadex75层析干扰素各组分的电泳分析。图中1：12号管；2：13号管；3：14号管；4：15号管；5：16号管；6：17号管；7：18号管；8：20号管；9：22号管；10：24号管。
图9 纯化人α2a干扰素HPLC纯度分析。
图10 纯化人α2a干扰素的分子量测定。图中A：电泳图谱B：标准曲线。
图11 纯化人α2a干扰素的等电聚焦分析。图中，1：等电点标准；2-5：样品。
图12 纯化人α2a干扰素的紫外吸收光谱分析。
图13 纯化人α2a干扰素的免疫印迹分析。图中，1：凝胶(柯马斯亮兰染色)；2：转移至PVDF膜；3：IFN抗体反应；4：正常小鼠血清。
具体实施方式
下面通过实施例(但不限于该实施例)具体描述本发明。
实施例：酵母分泌表达的人α2a干扰素高效纯化方法。
1、工程菌的发酵培养：将表达人α2a干扰素的酿酒酵母工程菌DC04/pHC11-IFN2a接种在20ml补加腺嘌呤的基本培养液(每升培养液含有无氨基酸的酵母氮源6.7g、腺嘌呤20mg和葡萄糖20g)中，30℃下培养16-18小时后，作为种子液转接到400ml的YEPD培养液(每升培养液含有蛋白胨20g，酵母抽提物10g、葡萄糖20g、腺嘌呤20mg和吐温-20 1ml)中，30℃下培养48小时。此时发酵液的细胞密度约为OD600 20-24。在培养液中添加0.1％吐温后，几乎所有分泌表达的人α2a干扰素都可以通过截留分子量为10万的超滤膜。(图2)
2、人α2a干扰素的分离纯化：
①离心除菌：将发酵液以5,000rpm的速度，离心15分钟，弃菌体，收集上清液。
②CM-SepharoseFF阳离子交换柱层析I：将离心收集所得的上清液用37％HAc调pH至4.4。然后上样至已用50mM pH4.4醋酸缓冲液平衡好的阳离子交换柱上(CM-SepharoseFF 2.6/10cm)，用同样缓冲液将未结合到介质上的蛋白质洗去，直至280nm吸收降到最低，用200mM醋酸缓冲液洗脱结合在介质上的部分杂蛋白。当吸收峰再次下降到最低时，再用400mM醋酸缓冲液进一步洗脱。收集到的各个分部用15％浓度的SDS-PAGE分析确定含目标蛋白质人α2a干扰素的组分，然后将它们合并。CM-SepharoseFF阳离子交换柱层析I的层析图谱见图3，样品的SDS-PAGE图谱见图4。
③CM-SepharoseFF阳离子交换柱层析II：将前面所得的含有人α2a干扰素的收集液上样到用100mM醋酸缓冲液平衡好的CM-SepharoseFF(1.6/4cm)柱上，用同样缓冲液洗去没有结合的蛋白质，直至280nm吸收降至最低时，再用300mM醋酸缓冲液进行洗脱。收集的各个分部通过15％浓度的SDS-PAGE分析确定含目标蛋白质人α2a干扰素的组分，然后将它们合并。CM-SepharoseFF阳离子交换柱层析II的层析图谱见图5，样品的SDS-PAGE图谱见图6。
④Sephadex75凝胶过滤层析：首先将Sephadex75凝胶柱(2.0/60cm)用含有150mM NaCl的磷酸缓冲液平衡，然后将前面所得的含有人α2a干扰素的收集液分批上样，用同样的缓冲液洗脱。收集的各个分部通过15％浓度的SDS-PAGE分析确定含目标蛋白质人α2a干扰素的组分，然后将它们合并。Sephadex75凝胶过滤层析的层析图谱见图7，样品的SDS-PAGE图谱见图8。
采用上述纯化工艺得到的人α2a干扰素的纯度可达到99.6％左右，纯化得率可达44％左右，干扰素的活性可达2.2×108IU/mg左右。表1是其中一次试验的结果。
表1：人α2a干扰素分离纯化各步结果汇总
| 样品 | 体积(ml) | 活性(IU/ml) | 蛋白质浓度(mg/ml) | 比活性(IU/mg蛋白) | 总活性(IU) | 累积得率(％) |
| 发酵液 | 400 | 1.2×107 | 11.8 | 1.02×106 | 4.80×109 | 100 |
| CM-I | 72 | 4.1×107 | 0.64 | 6.40×107 | 2.95×109 | 61.5 |
| CM-II | 17 | 1.7×108 | 1.79 | 9.46×107 | 2.89×109 | 60.2 |
| Superde×75 | 24 | 8.4×107 | 0.430 | 2.30×108 | 2.02×109 | 42.1 |
1.纯化人α2a干扰素的鉴定
①人α2a干扰素的抗病毒活性的测定：采用细胞病变抑制法测定，以Wish细胞/VSV为基本检测系统，以中国药品生物制品检定所提供的参考品校准为国际单位(IU)。
②纯度分析(采用HPLC法)：采用C18反相柱进行分析。层析柱先用0.1％的三氟乙酸平衡，上样后以1ml/min的流速，在40分钟内完成从0-100％乙晴的剃度洗脱，得到一个单峰(图9)。
③分子量测定(采用SDS-PAGE法)：用15％的SDS-PAGE将纯化得到的人α2a干扰素样品与标准蛋白质分子量标准同时电泳，显色后测定各条蛋白质带的Rf值，经统计处理计算出人α2a干扰素的分子量为19.14kDa(图10)。与理论值一致。
④等电点测定：等电点的测定采用BioRad公司的微型等电聚焦仪(BioRadModel III Mini IEF Cell)进行，所用pH5-7的两性介质系由中国科学院上海生物化学研究所试剂厂生产。测得的等电点为6.2(图11)。
⑤紫外吸收光谱分析：用UV260紫外吸收光谱仪在200-300nm范围内扫描。样品的紫外吸收峰在279.2nm(图12)。
⑥□免疫印迹分析：人α2a干扰素样品先进行15％的SDS-PAGE电泳，然后采用BioRad公司的半干电泳转移仪(BioRad Trans-Blot SD Semi-DryElectrophoretic Transfer Cell)将蛋白质带从电泳胶转移到PVDF膜上。免疫显色所用的第一抗体为鼠抗人α2a干扰素单抗，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，显色剂为二氨基联苯胺(DAB)。通过免疫印迹证明样品可以与人α2a干扰素单抗反应(图13)。
⑦□N端氨基酸序列分析：采用BECKMAN公司LF3200蛋白/多肽氨基酸序列仪分析。分析表明人α2a干扰素的N端20个氨基酸的序列为：CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQ。与天然的人α2a干扰素的N端序列一致。
Claims (8)
1.一种使基因工程菌重组表达产物高效纯化的方法，其特征是在培养发酵阶段通过添加助溶剂Tween系列，使重组表达产物解聚合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的基因工程菌包括基因工程修饰过的细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的基因工程菌重组表达产物为任何用途的蛋白质和多肽。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的聚合为重组表达产物自身聚合以及与其他物质的聚合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的基因工程菌是酵母，其表达产物是人α干扰素。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是所说的酵母是酿酒酵母，表达产物是分泌表达的人α干扰素。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的助溶剂为Tween-20，浓度范围为培养基的万分之五到千分之六。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征是分离纯化人α2a干扰素的工艺步骤如下：
(1)工程菌的发酵培养：将表达人α2a干扰素的酿酒酵母工程菌DCO4/pHC11-IFN2a接种在20ml补加腺嘌呤的基本培养液中，30℃下培养16-18小时后，作为种子液转接到YEPD培养液中，30℃下培养48小时；在该培养液中添加有吐温，其浓度为千分之六到万分之五。
(2)人α2a干扰素的分离纯化：
a、离心除菌，收集上清液；
b、CM-SepharoseFF阳离子交换柱层析I：将离心收集所得的上清液用HAc调pH至3.4-5.4，然后上样至已用50mM pH4.4醋酸缓冲液平衡好的阳离子交换柱上，用同样缓冲液将未结合到介质上的蛋白质洗去，直至280nm吸收降到最低，用200mM醋酸缓冲液洗脱结合在介质上的部分杂蛋白，当吸收峰再次下降到最低时，再用400mM醋酸缓冲液进一步洗脱，收集到的各个分部用15％浓度的SDS-PAGE分析确定含目标蛋白质人α2a干扰素的组分，然后将它们合并；
c、CM-SepharoseFF阳离子交换柱层析II：将前面所得的含有人α2a干扰素的收集液上样到用100mM醋酸缓冲液平衡好的CM-SepharoseFF柱上，用同样缓冲液洗去没有结合的蛋白质，直至280nm吸收降至最低时，再用300mM醋酸缓冲液进行洗脱，收集的各个分部通过15％浓度的SDS-PAGE分析确定含目标蛋白质人α2a干扰素的组分，然后将它们合并；
d、Sephadex75凝胶过滤层析：首先将Sephadex75凝胶柱用含有150mM NaCl的磷酸缓冲液平衡，然后将前面所得的含有人α2a干扰素的收集液分批上样，用同样的缓冲液洗脱，收集的各个分部通过15％浓度的SDS-PAGE分析确定含目标蛋白质人α2a干扰素的组分，然后将它们合并。
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