CN1102650A - 一种可纯化多种1FN-α的单抗亲和层析柱 - Google Patents
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Abstract
一种可纯化多种IFN-α的单抗亲和层析柱，采
用杂交瘤技术及现代免疫学技术筛选得到一株亲和
力适中的α-干扰素单克隆抗体4Cl，与
Sepharose-4B经偶联、封闭、洗涤、平衡而得。该层
析柱适用于大规模生产中对多种亚型基因工程α-干
扰素的最终纯化，可将rIFN-α，α2a、α2b纯化至电泳
纯级，活性回收率达95％以上，一步纯化可提高制品
纯度90～20,000倍。当用于nIFN-α纯化时，可结
合其中的大部分活性组分，活性回收大于100％。
Description
本发明涉及干扰素的分离提纯装置，确切地说是一种可纯化多种IFN-α的单抗亲和层析柱。
干扰素是机体受病毒感染后产生的一种糖蛋白，它不同于抗体，能进入细胞抑制病毒的复制，同时还能抑制迅速分裂的细胞，因此干扰素作为药物，一来抗病毒具有广谱性，二来为抗肿瘤展示了光明的前景。干扰素亦曾试用治疗过多种病毒性疾病和各种肿瘤，如鼻病毒感染、腺病毒感染、单纯疱疹、带状疱疹、慢性乙型肝炎、淋巴瘤、黑色素瘤、成骨肉瘤、鼻咽癌、白血病等均有一定疗效。目前，临床使用的人IFN-α多是基因工程干扰素，由于分离纯化技术要求极高，国内外通常使用单抗制备的亲和层析柱来纯化粗品干扰素。但当前所研制的并在生产上应用的单抗层析柱大多是一根柱子只能纯化一种或两种干扰素，尤其是对人白细胞干扰素的分离提纯，只能结合其中的某一亚型，因此回收率很低。《人α1型基因工程干扰素单克隆抗体及亲和层析柱的研制》公开的17Dg单抗亲和层析柱可用于分离提纯rHu-IFN-α1。（《中国生物制品学杂志》1992年第1期第5面）。《抗人α干扰素单克隆抗体SC8的应用》公开的SC8单抗亲和层析柱可用于纯化rIFN-α1和rIFN-αA，但不能纯化nIFN-α。（《上海免疫学杂志》1992年第1期第31页）。
本发明的目是为大规模生产干扰素提供一种分离提纯用的单抗亲和层析柱，该柱适用多种α-干扰素包括基因重组的rIFN-α及白细胞干扰素nIFN-α的分离纯化。
本发明采用杂交瘤技术及现代免疫学技术筛选得到一株亲和力适中的α-干扰素单克隆抗体4Cl（以下简称4Cl单抗）与琼脂糖（Sepharose-4B）偶联、封闭后装入层析柱，经洗涤、平衡得到用途广泛的单抗亲和层析柱。具体地说，用4Cl单抗在NaHco3缓冲液中同经Hcl溶膨后的CNBr-Sepharose-4B偶联，以Tris-Hcl缓冲液封闭后装柱，反复洗柱，用PH7.4、0.15MPBS平衡后得到可纯化多种IFN-α的单抗亲和层析柱。
4Cl单抗是由克隆化的4Cl阳性杂交瘤对健康的Balb/c小鼠攻瘤后取其腹水经纯化而得。4Cl阳性杂交瘤是纯化的rIFN-α1为抗原免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾淋巴细胞同小鼠骨髓瘤细胞融合、培养、筛选而得。
本发明适合大规模生产中对rIFN-α和nIFN-α粗品的最后纯化，粗品rIFN-α1、α2a、α2b可纯化至电泳纯，活性回收率分别达95%、98%和109%。一步纯化可提高制品纯度90～20000倍。当纯化nIFN-α时，可以结合nIFN-α中的大部分活性组分，活性回收率超过100%。
4Cl单抗亲和层析柱纯化rIFN-α和nIFN-α方法简便，效率高，对样品的前处理要求不严，吸附和洗脱均在较温和的条件下进行，可重复使用20次以上。洗脱液中鼠IgG含量低于卫生部药品检定所规定的每剂量100ng以下的要求。本发明可望替代进口单抗层析柱用于国内人α-干扰素的生产。
图1、4Cl杂交瘤染色体照片。
图2、4Cl染色体数分布。
实施例
（一）、抗原的制备
rIFN-α纯化试剂，经NMS和不完全佐剂处理后分装冻存备用。
（二）、Ba1b/c小鼠免疫：
取健康8～12周龄雌性Ba1b/c小鼠5只，首次用不完全佐剂皮下注射刺激免疫，3日后用处理过的抗原第一次免疫，间隔一周，共免疫四次，第四次免疫一至两周后，眼窦采血，测定血清的中和效价，对效价超过1∶20000的Ba1b/c小鼠在融合前四天每天强化免疫一次，融合前采血测效价。
免疫的5只Ba1b/c小鼠在经四次免疫后，测得血清的抗体中和稀释效价可达到1∶12，800-25，600，每毫升中和活性效价为2.56-5.12×106iu，经三次加强免疫后，融合前所测血清效价约达1∶243，000-72，0000。每毫升中和活性效价为4.86×106-1.45×7iu。
（三）、细胞融合
1、饲养细胞采集和培养：融合前一天无菌条件下将健康Ba1b/c小鼠的腹腔巨噬细胞取出，用含10%小牛血清的HAT-RPMI1640培养液稀释成2×105/ml，加入96孔细胞培养板，每孔0.1毫升，37℃，5%CO2培养。
2、免疫Ba1b/c小鼠脾细胞制备：无菌条件下取出免疫好的Balb/c小鼠的脾脏，破碎分离出脾淋巴细胞，计数。
3、将预先培养好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-AG14，按1∶5的比例和脾淋巴细胞混匀，细胞总数约108，在尖底离心管中离心（1000rpm，5分钟）。
4、在50%（W/V）PEG4000的作用下，反应1分钟后，以20毫升RPMI-1640洗去PEG。
5、融合细胞用HAT-RPMI1640培养基悬浮后，移入两块铺有饲养层的96孔细胞培养板培养，随时观察结果，计算融合率。
6、一周后换新鲜HAT培养液，12-14天左右检测培养上清中的抗体产生情况，计算阳性检出率。
前后共进行了四次融合，十六块板，近1600个（孔）样品，每孔都有杂交瘤生长，平均融合率为100%。用“中和法”检测抗体，检出对IFN-α有明显活性中和作用的阳性孔“4Cl”。
7、杂交瘤稳定分析及其克隆化：
4Cl杂交瘤细胞经体外传代培养上百次，液氮冻存8个月以上，其分泌抗体的能力不变。
对筛选到的阳性杂交瘤4Cl通过有限稀释法进行克隆化，将其稀释至理论意义上的每孔0.5细胞进行培养，从中筛选出由单个细胞分裂而来的阳性克隆，反复二至四次，最后获得阳性克隆即为单克隆杂交瘤细胞株。
8、染色体分析：
染色体平均众数在90～115之间，属典型杂交瘤核型。见图1、图2。
（四）、腹水McAb生产及效价测定
1、取生长状态良好的4Cl杂交瘤细胞对健康Ba1b/c小鼠攻瘤，每鼠一次攻瘤2-10×105cell，10-14天后采集腹水，每只小鼠可采腹水3～5ml，用中和法测得4Cl腹水对rIFN-α1的稀释效价为1∶218700，每毫升腹水中和活性单位为4.37×107iu。-60℃冻存备用。
2、McAb特异性鉴定
（1）、直接中和法测定McAb与各种IFN的交叉反应：抗体用4Cl培养上清及腹水，抗原用rIFN-α1，rIFN-α2a和-α2b，白细胞nIFN-α和IFN-v。
| 抗体 | rIFN-α1 | rIFN-α2a | rIFN-α2b | nIFN-α | rIFN-r |
| 4Cl腹水 | 1:217900 | 1:2700 | 1:2700 | 1:300 | -- |
| 4Cl上清 | 1:81 | 1:3 | 1:3 | -- | -- |
（2）、Western Biotting试验：将混有E.coli菌体蛋白的rIFN-α粗品和纯化的rIFN-α同时电泳，电泳后的凝胶和硝酸纤维素膜（NC）一起进行电转移，转移后的膜和McAb进行孵育（RT3hr），牛血清白蛋白封闭后，加酶标记羊抗鼠I8G反应，洗涤后加底物显色。电转移后的NC膜和McAb的显色反应只出现在rIFN-α分子量相对应的位置，说明McAb只和rIFN-α有特异性结合，不与任何E.coli菌体杂质蛋白发生非特异性反应。
以上结果可见，4Cl单抗只为IFN-α的特异性单抗。这一特性表明4Cl单抗适用于IFN-α的亲和层析分离纯化。
（3）、琼脂双扩散试验结果证明4Cl单抗免疫球蛋白属IgG。
3、McAb的纯化：
用辛酸-硫酸铵二步沉淀法纯化，每10ml腹水加330ul辛酸→离心去沉淀→上清用45%饱和硫酸铵沉淀→离心去上清→沉淀用0.01MPBS缓冲液悬浮并透析，测定蛋白质含量，SDS-PAGE检测纯度。纯化后纯度可达90%左右，还原SDS-PAGE结果显示为均一的重链（55KD）和轻链（22.5KD）蛋白质带。
（五）、单克隆抗体亲和层析柱的制备
取CNRr-Sepharose-4B，经1mMHC1溶涨后，在NaHCO3缓冲液（0.1M）中与单抗4Cl偶联，每毫升Sepharose-4B偶联单抗10-13毫克，蛋白质偶联率大于98%，以Tris-HCl（0.1M）缓冲液封闭活性基团，装柱，反复洗柱后，以pH7.4，0.15MPBS平衡备用。
（六）、单抗亲和层析柱纯化IFN-α：
1、粗rIFN-α的制备：
rIFN-α1-α2a、-α2b的发酵菌体通过菌体破碎-硫酸铵沉淀-酸化-离子交换等不同方法分别进行不同程度的纯化后上亲和柱。
2、nIFN-α，病毒诱生的白细胞培养上清，经酸化处理后直接上亲和柱。
3、单抗亲和层析柱用PBS平衡后，将部分纯化的IFN-α流动上柱，PBS洗涤，待流出液OD280值回到基线位置，用pH2.5G1Y-HCl洗脱，收集峰值管，柱子用含0.02%NaN3的PBS清洗再生，4℃保存。
用五根4Cl单抗亲和层析柱对多种α-干扰素进行了100多次纯化试验，证明4Cl单抗层析柱能特异性吸附IFN-α，PBS可洗去非特异吸附的杂蛋白。纯化后的IFN-α各项纯度指标及鼠源IgG含量均用公知的方法进行了测定达到卫生部对IFN-α的要求。
rIFN-α1、-α2a、-α2b纯化后活性回收率均为95%、98%和109%，比活性平均分别为1.55×107、3.0×108和2.36×108iu/mg。一步层析可提高纯度90～20，000倍。交换容量为每毫升胶可吸收α1大于2.88×107iu、-α2a和α2b大于2.0×108iu。
nIFN-α纯化后，比活性可达2.58×107iu/mg，活性回收率为113～116%。
Claims (1)
1、一种可纯化多种IFN-α的单抗亲和层析柱，是用单抗与Sepharose-4B偶联、封闭后装入玻璃管中，经洗涤、平衡而得，其特征是用4C1阳性杂交瘤经克隆后所得的4C1单抗在NaHco3缓冲液中偶联经Hcl溶膨后的CNBr-Sepharose-4B，以Tris-Hcl缓冲液封闭后装柱，反复洗柱，用PH7.4、0.15MPBS平衡而得。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 93114639 CN1102650A (zh) | 1993-11-12 | 1993-11-12 | 一种可纯化多种1FN-α的单抗亲和层析柱 |
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| CN1102650A true CN1102650A (zh) | 1995-05-17 |
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Country Status (1)
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| CN (1) | CN1102650A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100390198C (zh) * | 2004-07-28 | 2008-05-28 | 深圳科兴生物工程股份有限公司 | 重组人干扰素α1b的纯化工艺 |
-
1993
- 1993-11-12 CN CN 93114639 patent/CN1102650A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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