CN1616489A - 纯化重组人白细胞介素12的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了纯化重组人白细胞介素12的方法，涉及蛋白质纯化方法。本发明纯化重组人白细胞介素12的方法，是将重组人白细胞介素12的细胞培养上清液进行阳离子交换层析和阴离子交换层析；所述重组人白细胞介素12的细胞培养上清液进行所述阳离子交换层析时pH高于重组人白细胞介素12的等电点，进行所述阴离子交换层析时先用pH3.5－5.0的缓冲液洗脱除去杂蛋白，接着洗脱收集目的物。为了进一步提高rhIL－12纯度，在离子交换步骤之后可增加分子尺寸排阻柱层析步骤。本发明成本低，操作简单，周期短，回收率和纯度高，能广泛用于rhIL－12的工业生产、制备。

Description

纯化重组人白细胞介素12的方法

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化方法，特别是涉及纯化重组人白细胞介素12的方法。

背景技术

白细胞介素12(Interleukin-12，IL-12)，又称细胞霉性淋巴细胞成熟因子(cytotoxiclymphocyte maturation factor，CLMF)或称自然杀伤细胞刺激因子(natural killer cellstimulation factor，NKSF)，是一种主要由巨噬细胞和B细胞等产生的异二聚体细胞因子，能够提高NK细胞和T细胞的杀伤活性，促进特异性CTL细胞的应答能力，促进激活的NK细胞和T细胞的增殖，诱导IFN-γ等细胞因子的产生，促进Th1细胞的发育，上调多种细胞表面分子的表达，抑制IgE的合成。上述基础研究使人们意识到，IL-12将在肿瘤、病毒性疾病和寄生虫病的免疫治疗中起重要作用，重组人白细胞介素IL-12(rhIL-12)作为一种药物已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病和治疗过敏性哮喘的临床试验阶段，可望有巨大的应用前景。

IL-12由分子量为40kDa(p40)和35kDa(p35)的两个亚单位经多对二硫键连接组成，且含有较多的糖基化位点，在原核细胞中难以表达出活性形式。IL-12的真核表达，就成为体外获得IL-12从而对其进行深入理论和临床研究的唯一途径，目前国内外有许多生物技术公司和研究单位在真核细胞中成功表达了rhIL-12，仅国内就有多个专利涉及rhIL-12的表达方法(中国专利：01126923.5，00113786.7，01133631.5，03131567.4，02100866.3，01133658.7)。从细胞培养物中通过各种分离手段得到纯品的下游加工过程，是基因工程产品生产过程中非常重要的一环，但目前还未见适合工业化生产的重组人白细胞介素12的下游纯化工艺的研究报道。

1989年，美国学者Kobayashi ML(J.Exp.Med.170：827)首次从经佛波醇酯(PDBu)刺激的EB病毒转化的人B淋巴母细胞株(RPMI8866)培养上清中纯化出人IL-12，该纯化方法包括6个柱层析步骤和1次超滤工艺，其纯化流程复杂，目的蛋白回收率低于0.1％。随后不少学者在此方法的基础上进行了改进，Stern AS(proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990；87：6808-6812)报道用4个柱层析步骤和1次超滤工艺纯化人IL-12，目的蛋白回收率为0.33％。Christina Yoon(the EMBO Journal 2000；19：3530-3541)报道使用6个柱层析步骤从重组CHO细胞培养上清中纯化rhIL-12。Giuseppe Carra(the Journalof immunology 2000；164：4752-4761)则采用无法在工业生产中使用的免疫共沉淀和SDS-PAGE为主的方法纯化rhIL-12。中国专利01133658.7采用亲和层析从银纹夜蛾幼虫的血淋巴中纯化rhIL-12。亲和纯化使用鼠源性抗体，有鼠源病毒污染的风险，而且从工业化观点来看，在最终产品中可能存在来源于鼠免疫球蛋白的免疫原性片段和难以验证的层析基质。这些rhIL-12纯化技术存在有高成本、实施步骤复杂、回收率低等缺陷，且使用的试剂有些还是制药学上禁止使用的。因此，建立简便、快速、廉价而有效的有工业化可行性的rhIL-12纯化工艺是当前急待解决的难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛋白回收率高、步骤简便的纯化重组人白细胞介素12的方法。

本发明所提供的纯化重组人白细胞介素12的方法，是将重组人白细胞介素12的细胞培养上清液进行阳离子交换层析和阴离子交换层析；所述重组人白细胞介素12的细胞培养上清液进行所述阳离子交换层析时pH高于重组人白细胞介素12的等电点；进行所述阴离子交换层析时先用pH3.5-5.0的缓冲液洗脱除去杂蛋白，接着洗脱收集目的物。

本发明的方法中，重组人白细胞介素12的细胞培养上清液既可以先进行阳离子交换层析，再进行阴离子交换层析；也可以先进行阴离子交换层析，再进行阳离子交换层析。当先进行阳离子交换层析时，是将重组人白细胞介素12的细胞培养上清液先在pH 6.1-7.8条件下进行阳离子交换层析，洗脱、收集含有重组人白细胞介素12的洗脱峰；然后将所得洗脱峰上样阴离子交换层析介质，先用pH3.5-5.0的缓冲液洗脱除去杂蛋白，接着洗脱、收集，得到重组人白细胞介素12；当先进行阴离子交换层析时，是将重组人白细胞介素12的细胞培养上清液先上阴离子交换层析介质，然后用pH3.5-5.0的缓冲液洗脱除去杂蛋白，接着洗脱收集含有重组人白细胞介素12的洗脱峰；最后将所得洗脱峰再在pH6.1-7.8进行阳离子交换层析，洗脱、收集，得到重组人白细胞介素12。

为了能更好的除去杂蛋白，在进行阴离子交换层析时，用pH3.5-5.0的缓冲液洗脱除去杂蛋白之后，洗脱收集前，还用含浓度为0.07-0.14M的盐的缓冲液洗脱杂蛋白。

在进行阴离子交换层析的过程中，先用pH3.5-5.0的缓冲液洗脱除去杂蛋白后，接着洗脱、收集得到目的物的洗脱液可以是酸性，也可以是碱性，但作为人体用时，以接近中性为优选，其pH范围以7.0-7.8为宜。

为了提高离子交换层析的效率，缩短纯化工艺流程的时间，细胞培养上清液在上样前还可以经过超滤浓缩。采用超滤工艺可以去除培养上清液中的小分子物质，能在短时间内将其浓缩到需要的体积，并将其pH和离子强度调节到进行离子交换层析所需要的水平。超滤浓缩采用的超滤膜的截留分子量为不超过5万道尔顿；超滤浓缩的倍数为10-100倍；优选为30-60倍。

本发明中所选用的阳离子交换介质可选择的范围是广泛的，由亲水性基质形成的介质均可以使用，例如SP Sepharose FF、CM Sepharose FF、SP Sepharose XL、SPSepharose HP、Source S、CM Sephadex C25、SP Sephadex C25或S Sepharose 4FF等，进行阳离子交换层析洗脱、收集的方法是先用20-40mmol/L、pH为7-7.8的磷酸盐缓冲液洗脱到基线，然后用含有0.2-0.25mol/LNaCl的10-40mmol/L、pH为7-7.8的磷酸盐缓冲液洗脱，此时可以收集含有rhIL-12的洗脱液。

本发明中所选用的阴离子交换介质可选择的范围也是广泛的，由亲水性基质形成的介质均可以使用，例如Q Sepharose FF、DEAE Sepharose FF、Q Sepharose XL、DEAE Sephadex A25、ANX Sepharose FF、Q Sepharose Big Beads或Source Q等，进行阴离子交换层析洗脱、收集的方法是先用20-50mmol/L、pH为3.5-5的柠檬酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液或醋酸盐缓冲液洗脱到基线，然后用含有0.2-0.25mol/LNaCl的10-50mmol/L、pH7-7.8的Tris-HCl缓冲液或三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液洗脱，此时可以收集含有rhIL-12的洗脱液。

通过阳、阴离子交换或阴、阳离子交换这两步离子交换，即可以使rhIL-12的纯度达到90％以上。但由于rhIL-12容易形成多聚体，在离子交换步骤之后增加分子尺寸排阻柱层析步骤，可以去除分子大小差异明显的rhIL-12聚体等杂质，能进一步提高rhIL-12纯度。

常用分子尺寸排阻柱层析介质有Sephacry S200 HR、Sephedex G100、Superdex 75prep grade或Superose 12 prep grade等，其洗脱剂为10mmol/L、pH为7.0-7.6的PBS缓冲液。

rhIL-12分子表面电荷分布极不均匀，这一特征使其明显区别于培养上清中的其它相关杂蛋白。本发明利用rhIL-12分子表面电荷分布的独特特征，巧妙地反常规连续采用阳离子交换层析和阴离子交换层析技术来进行纯化rhIL-12：在高于rhIL-12等电点(pI约为5.0)的pH的条件下进行阳离子交换层析，在低于rhIL-12等电点的pH条件下进行阴离子交换层析，通过两步离子交换层析即可将rhIL-12与其他杂蛋白分离，并且具有较高的回收率；进一步采用分子筛层析，可以得到纯度在98％以上的rhIL-12蛋白，其比活大于5×10⁶IU/mg，整个纯化工艺回收率在65％以上。所得蛋白产品SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹条带与标准品一致；其N端氨基酸序列和肽图(质谱法)也完全符合理论值；外源性DNA残留量＜100pg/10μg(固相斑点杂交法)；细胞蛋白残留为0.014ng/10μg蛋白(ELISA法)；牛血清白蛋白残留量＜0.01％(RIHA法)，细菌内毒素含量小于0.5EU/10μg蛋白(TAL法)，其它指标也符合动物试验和临床试验的要求。本发明所用试剂简单，纯化成本低；操作步骤简单，纯化周期短，有利于进行工业化生产；蛋白回收率和产品质量高，用途广泛，利用细胞培养(例如CHO，BHK，Vero，NSO，SP2/0，COS，293，鼠3T3和L细胞以及昆虫细胞等真核细胞)获得的rhIL-12均能够用本发明的方法得到高水平的纯化，可广泛用于rhIL-12的工业生产、制备。

附图说明

图1为阴离子交换层析洗脱图；

图2为阳离子交换层析洗脱图；

图3为分子尺寸排阻层析洗脱图；

图4为经纯化的rhIL-12的HPLC-SEC图。

具体实施方式

实施例1、纯化rhIL-12

1、超滤浓缩含rhIL-12的重组CHO细胞培养上清液

将重组CHO细胞(中国专利申请号：03131567.4)进行无血清培养，然后用Beckman离心机10000rpm离心25分钟收集得到重组CHO细胞培养上清液50L。

选用截留分子量为30kD的超滤膜，用Millipore切向流超滤系统将上清液超滤浓缩至约1L，然后向其中加入1.5L 20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.5)继续超滤浓缩至约1L，再用相同量的缓冲液置换超滤一次，取出超滤浓缩液，用上述缓冲液定容至lL备用。

2、阴离子交换柱层析对rhIL-12的纯化

选用DEAE-Sepherose Fast Flow阴离子交换柱(柱体积为1.5L)，用4个柱体积平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5)平衡，将步骤1所得1L超滤浓缩液上样，上样后用平衡缓冲液平衡洗脱色谱柱，洗脱量为6L(4个柱体积)；用洗脱液I(40mM组氨酸缓冲液，pH4.6)洗脱8个柱体积；继续用平衡缓冲液洗脱2个柱体积，再用洗脱液II(0.12M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.5)洗脱3个柱体积；最后用洗脱液III(0.25M NaCl，15mM PB，pH7.0)洗脱3个柱体积，收集含rhIL-12的组分；最后用1M NaCl、注射用水分别洗2个柱体积，使柱再生，并将层析介质保存于20％乙醇中。整个层析过程的洗脱图如图1所示，图中A峰是流穿峰；B峰是洗脱液I的洗脱峰；C峰是洗脱液II的洗脱峰；D峰是洗脱液III的洗脱峰；E峰是1M NaCl洗脱峰。rhIL-12在D峰，其它峰是杂蛋白。

3、阳离子交换柱层析对rhIL-12的分离纯化

选用CM-Sepherose Fast Flow阳离子交换柱(柱体积为150ml)，用4个柱体积平衡缓冲液(20mM MES，pH6.4)平衡。取步骤2所得含rhIL-12的收集液用平衡缓冲液按体积比1∶6稀释后上样，然后用洗脱液I(20mMPB，pH7.4)洗脱10个柱体积；再用洗脱液II(0.25M NaCl，20mM PB，pH7.4)洗脱3个柱体积，收集含rhIL-12的组分；最后用1M NaCl、注射用水分别洗2个柱体积，使柱再生，并将层析介质保存于20％乙醇中。整个层析过程的洗脱图如图2所示，图中A峰是流穿峰；B、C峰是洗脱液I的洗脱峰；D峰是洗脱液II的洗脱峰。rhIL-12在D峰，其它峰是杂蛋白。

4、分子筛(尺寸排阻层析)对rhIL-12的进一步纯化

将步骤3所得含rhIL-12的收集液用HiPrep Sephacryl S200 HR柱进行进一步纯化。用平衡液(10mM PB，0.14MNaCl，2.6mMKCl，pH7.4)平衡2倍柱体积后上样，上样体积为3％柱体积，上样后用平衡液洗脱1.5个柱体积，流速为30cm/h，收集含rhIL-12的组分，rhIL-12总的回收率为71％。其洗脱图如图3所示，图中A峰是rhIL-12聚体和大分子杂蛋白峰；B峰是rhIL-12峰。。

实施例2、纯化rhIL-12

1、超滤浓缩含IL-12的重组昆虫细胞培养上清液

离心、收集重组昆虫细胞培养上清液(魏海明等，中华微生物和免疫学杂志2000；20：584-587)，然后按实施例1步骤1进行超滤浓缩，其不同之处在于将上清液超滤浓缩到约0.5L时加入20mmol/L、pH6.4的磷酸盐缓冲液进行超滤浓缩液缓冲液置换，最后将浓缩液定容至0.5L。

2、阳离子交换柱层析纯化rhIL-12

选用SP Sepharose FF阳离子交换柱(柱体积为1.5L)，用4个柱体积平衡缓冲液(20mM PB，pH6.4)平衡。将步骤1所得0.5L浓缩培养液上样，上样完毕后用洗脱液I(20mM PB，pH7.4)洗脱10个柱体积；再用洗脱液II(0.25M NaCl，10mM PB，pH7.4)洗脱3个柱体积，收集含rhIL-12的组分；用1MNaCl、注射用水分别洗2个柱体积，使柱再生，并用20％乙醇保护介质。

3、阴离子交换柱层析纯化rhIL-12

选用Q-Sepherose Fast Flow阴离子交换柱(柱体积为150ml)，用4个柱体积平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5)平衡。取步骤3所得rhIL-12的组分用Q柱平衡缓冲液按体积比1∶4稀释后直接上样，上样后用平衡缓冲液平衡4个柱体积后，用洗脱液I(20mM柠檬酸盐缓冲液，pH4.0)洗脱6个柱体积；继续用平衡缓冲液平衡2个柱体积后再用洗脱液II(0.12MNaCl，15mM PB，pH7.5)洗脱3个柱体积；最后用洗脱液III(0.25M NaCl，15mM PB，pH7.5)洗脱3个柱体积，收集含rhIL-12的组分；用1M NaCl、注射用水分别洗2个柱体积，使柱再生，并用20％乙醇保护介质。

4、分子筛(尺寸排阻层析)对rhIL-12的进一步纯化

用Sephedex G100柱层析来进行纯化步骤3所得含rhIL-12的收集液，纯化方法与实施例1的步骤4相同。rhIL-12总的回收率为68％。

实施例3、HPLC-SEC检测纯化的rhIL-12纯度

仪器选用高压液相色谱系统(Waters)，高压液相色谱柱为亲水硅胶体积排阻色谱柱(粒度10μm，内径7.8μm，柱长30cm)。流动相：8.1mM/L磷酸氢二钠；1.5mM/L磷酸二氢钾；500mM氯化钠，pH7.3。色谱条件：流速0.6ml/min，上样量100μl，柱温20-25℃，紫外检测波长280nm，样品池温度4℃，环境温度2-25℃。测定：用流动相以0.8ml/min流速平衡高压液相色谱系统至基线平衡。取待测样品100μl上柱，用流动相以0.6ml/min流速洗脱，同时在紫外检测器280nm波长下记录色谱图及有关数据，记录数据时间为40分钟，用面积归一法计算纯度。实施例1所纯化的rhIL-12的纯度为98.4％(其色谱图如图4所示)，实施例2所纯化的rhIL-12的rhIL-12纯度为98.7％。

实施例4、rhIL-12生物活性检测(PBMC IFN-γ诱生法)

1、NIBSC标准品(WHO国际标准品)和待检样品的稀释：标准品用RMPI 1640基础培养液稀释成以下8个稀释度(ng/ml)：3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025；待检样品稀释成以下8个稀释度(ng/ml)：3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025，待用。

2、PBMC细胞的分离：取人的新鲜外周血，肝素抗凝，用等体积生理盐水稀释。将Ficoll(即淋巴细胞分离液，上海华精生物高科技有限公司)加至10ml离心管中，4ml/管，再将4ml稀释后的血液小心地加在Ficoll液面上，1000g离心20分钟，收集两层液体分界面上的细胞，此为富含淋巴细胞的单个核细胞(PBMC)。生理盐水洗两遍后，悬于含10％小牛血清的RMPI 1640基础培养基中，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，按100μl/孔将细胞加入96孔板。

3、IFN-γ的诱生：在细胞培养板中加入100μl不同稀释度的标准品和待测样品(每个稀释度做双复孔)，在37℃5％CO₂条件下培养18小时后，每孔取50μl培养上清ELISA测定(操作按R&D公司试剂盒说明书进行)IFN-γ含量。

4、结果计算：以IFN-γ含量对样品浓度作图，计算各个实验样品的ED50(即IFN-γ含量为最大浓度的一半时的样品浓度)，并按下式计算结果：待测样品效价＝标准品效价×(标准品的ED50/实验样品的ED50)。实施例1所纯化的rhIL-12的比活为8.4×10⁶IU/mg、实施例2所纯化的rhIL-12的比活为7.6×10⁶IU/mg。

Claims (10)

1、一种纯化重组人白细胞介素12的方法，是将重组人白细胞介素12的细胞培养上清液进行阳离子交换层析和阴离子交换层析；所述重组人白细胞介素12的细胞培养上清液进行所述阳离子交换层析时pH高于重组人白细胞介素12的等电点，进行所述阴离子交换层析时先用pH3.5-5.0的缓冲液洗脱除去杂蛋白，接着洗脱收集目的物。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞培养上清液先在pH6.1-7.8条件下进行阳离子交换层析，洗脱、收集含有重组人白细胞介素12的洗脱峰；然后将所得洗脱峰再进行阴离子交换层析，先用pH3.5-5.0的缓冲液洗脱除去杂蛋白，接着洗脱、收集，得到重组人白细胞介素12。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞培养上清液先上阴离子交换层析介质，再用pH3.5-5.0的缓冲液洗脱除去杂蛋白，接着洗脱收集含有重组人白细胞介素12的洗脱峰；然后将所得洗脱峰再在pH6.1-7.8条件下进行阳离子交换层析，洗脱、收集，得到重组人白细胞介素12。

4、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：进行阴离子交换层析中，所述洗脱收集前还用含0.07-0.14M的盐的缓冲液洗脱杂蛋白。

5、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述细胞培养上清液在上样前还经过超滤浓缩。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述超滤浓缩采用的超滤膜的截留分子量为不超过5万道尔顿；所述超滤浓缩的倍数为10-100倍；优选为30-60倍。

7、根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述阳离子交换层析介质为SP Sepharose FF、CM Sepharose FF、SP Sepharose XL、SP Sepharose HP、SourceS、CM Sephadex C25、SP Sephadex C25或S Sepharose 4FF；所述阳离子交换层析是先用20-40mmol/L、pH为7-7.8的磷酸盐缓冲液洗脱到基线，然后用含有0.2-0.25mol/LNaCl的10-40mmol/L、pH为7-7.8的磷酸盐缓冲液洗脱。

8、根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述阴离子交换层析介质为Q Sepharose FF、DEAE Sepharose FF、Q Sepharose XL、DEAE Sephadex A25、ANX Sepharose FF、Q Sepharose Big Beads或Source Q；所述阴离子交换层析是先用20-50mmol/L、pH为3.5-5的柠檬酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液或醋酸盐缓冲液洗脱到基线，然后用含有0.2-0.25mol/LNaCl的10-50mmol/L、pH7-8的Tris-HCl缓冲液或三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液洗脱。

9、根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述得到的重组人白细胞介素12还经过分子尺寸排阻柱层析。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述分子尺寸排阻柱层析所用介质为Sephacry S200 HR、Sephedex G100、Superdex 75 prep grade或Superose 12 prepgrade；所述分子尺寸排阻柱层析所用洗脱剂为10mmol/L、pH为7.0-7.4的PBS缓冲液。

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