CN101799474B - 一种检测重组人白细胞介素-12蛋白活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测重组人白细胞介素-12蛋白活性的方法。该方法包括如下步骤：1)用不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素，检测每种浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生的γ干扰素的量，得到标准曲线；2)用于1)相同的方法用待测重组人白细胞介素-12蛋白进行试验，得到所述γ干扰素的量为其最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素-12蛋白的浓度值；3)计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白的活性。本发明方法操作简便、快速、稳定且成本低廉、具有很高的稳定性、重复性、灵敏度及特异性。因此，本发明方法在rhIL-12蛋白活性检测领域将有广阔的应用前景，为rhIL-12蛋白的临床应用、药性检测等提供了良好的基础。

Description

一种检测重组人白细胞介素-12蛋白活性的方法

技术领域

本发明涉及一种检测重组人白细胞介素-12蛋白活性的方法。

背景技术

人白细胞介素-12(Human Interleukin 12，hIL-12)是一种异二聚体细胞因子，由p35和p40两个亚单位通过多对二硫键连接组成。hIL-12又称为NK细胞刺激因子(NKSF)，hIL-12具有强烈的抗肿瘤和抗病毒效益，这种效应是由机体的自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK细胞)介导的，hIL-12还在细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、B细胞的发育分化和成熟活化中起重要作用，被誉为免疫系统行使抗病毒、抗肿瘤的核心调控因子，机体天然免疫系统的关键蛋白质。这一系列的生物学功能使人们认识到hIL-12有可能在临床应用中发挥重要作用。目前，重组人白细胞介素-12(Recombinant Human Interleukin 12，rhIL-12)作为一种药物已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病和过敏性哮喘的临床试验阶段。rhIL-12的活性直接关系到临床上治疗效果评价及用药剂量等关键问题。目前，用于活性测定的NK细胞、T细胞主要来源于正常人外周血或新生儿脐血，由于个体差异，实验稳定性、重复性、灵敏度均难以保证。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测重组人白细胞介素-12蛋白的活性的方法。

本发明所提供的检测重组人白细胞介素-12蛋白的活性的方法，包括如下步骤：

1)用不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素，检测每种浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生的γ干扰素的量，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素-12蛋白标准品的浓度为横坐标，作曲线图，得到S型标准曲线图，从所述S型标准曲线图中得到所述γ干扰素的量为其最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素-12蛋白标准品的浓度值，将该浓度值记作ED_50s；

2)用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素，检测每种浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生的γ干扰素的量，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测重组人白细胞介素-12蛋白的浓度为横坐标，作曲线图，得到S型曲线图，从所述S型曲线图中得到所述γ干扰素的量为其最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素-12蛋白的浓度值，将该浓度值记作ED_50r；

3)根据公式I，计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白的活性，

$\mathrm{Pr}=\mathrm{Ps}\×\frac{{\mathrm{ED}}_{50s}}{{\mathrm{ED}}_{50r}}$ (公式I)

其中，Ps为重组人白细胞介素-12蛋白标准品的活性值，Pr为待测重组人白细胞介素-12蛋白的活性值；

所述步骤1)中所用的人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901与所述步骤2)中所用的人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901的状态相同，所述步骤1)的刺激NKG细胞产生γ干扰素的方法与所述步骤2)中的刺激NKG细胞产生γ干扰素的方法相同，所述步骤1)的检测每种浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激NKG细胞产生的γ干扰素的量的方法与所述步骤2)中的检测每种浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激NKG细胞产生的γ干扰素的量的方法相同；

所述步骤1)和所述步骤2)没有先后顺序。

上述过程中，所述步骤1)中，所述用不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素的方法包括如下步骤：将所述不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品与所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901共培养，得到所述γ干扰素；

所述步骤2)中，所述用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素的方法包括如下步骤：将所述不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白与所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901共培养，得到所述γ干扰素。

上述过程中，所述步骤1)的共培养中，所述共培养的体系由所述重组人白细胞介素-12蛋白标准品、所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901和培养基组成；

所述步骤2)的共培养中，所述共培养的体系由所述待测重组人白细胞介素-12蛋白、所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901和培养基组成；

上述过程中，在所述步骤1)和所述步骤2)前，包括如下细胞活化步骤：将人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901接种于细胞培养基I中，在温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5％的条件下培养至对数生长期，取对数生长期的细胞；

所述细胞培养基I由α-MEM培养基、胎牛血清、马血清和重组人白细胞介素-2组成，α-MEM培养基、胎牛血清、马血清和重组人白介素-2的配比为：8ml α-MEM培养基：1ml胎牛血清：1ml马血清：1000IU重组人白介素-2。

上述过程中，所述共培养中培养基由1640培养基和胎牛血清组成，1640培养基与胎牛血清的体积比为9∶1；

所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901在所述共培养体系中的浓度为2.5×10⁵个/ml；

所述共培养的温度为37℃，所述共培养的二氧化碳体积浓度为5％，所述共培养的时间为12-48小时，具体为18-24小时。

上述过程中，所述步骤1)中重组人白细胞介素-12蛋白标准品在所述共培养体系中的浓度分别为6.4ng/ml、3.2ng/ml、1.6ng/ml、0.8ng/ml、0.4ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml；

所述步骤2)中待测重组人白细胞介素-12蛋白在所述共培养体系中的浓度分别为6.4ng/ml、3.2ng/ml、1.6ng/ml、0.8ng/ml、0.4ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml。

上述过程中，所述检测γ干扰素的量的方法为酶联免疫法，其中所用的一抗为γ干扰素单克隆抗体。

上述过程中，所述重组人白细胞介素-12蛋白的活性为重组人白细胞介素-12蛋白刺激淋巴细胞细胞产生γ干扰素的活性；所述淋巴细胞细胞为自然杀伤细胞、T细胞或B细胞。

人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901在检测重组人白细胞介素-12蛋白刺激自然杀伤细胞产生γ干扰素的活性中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明采用人自然杀伤细胞(NKG细胞)CGMCC No.2901作为测活细胞株，该细胞株具有性能稳定均一、易培养、传代次数不受限制的特点，并且在IL-12蛋白的刺激下可产生γ干扰素，存在时间-剂量-效应关系，是测rhIL-12蛋白活性得理想载体细胞。实验证明，本发明方法结果准确可靠且重复性好(检测了3份样品，每个样品进行3次实验，均得到正确结果)，避免了现有技术中来源于正常人外周血或新生儿脐血的NK细胞、T细胞不稳定、有时检测不出结果的弊端。另外，本发明方法操作简便、快速、稳定且成本低廉、具有很高的稳定性、重复性、灵敏度及特异性。因此，本发明方法在rhIL-12蛋白活性检测领域将有广阔的应用前景，为rhIL-12蛋白的临床应用、药性检测等提供了良好的基础。

附图说明

图1.ELISA方法检测γ干扰素含量标准曲线。

图2.不同浓度rhIL-12蛋白标准品NKG细胞共孵育24小时后产生γ干扰素的量。

图3.不同浓度rhIL-12蛋白待测样品与NKG细胞共孵育24小时后产生γ干扰素的量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

NKG细胞的制备：

1.外周血标本：取患有非何杰金氏淋巴瘤的病人的外周血10ml，肝素抗凝，经患者同意。

2.外周血单个核细胞的分离：用10ml无菌PBS溶液稀释抗凝外周血标本后，用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，2200转/分，30分钟，20度；吸取中界层面的单个核细胞，使用PBS溶液洗涤3遍，1500转/分，10分钟，20度；使用250μl无菌PBS溶液重悬细胞，计数，细胞浓度为1.1×10⁷/250μl，4度放置，备用。

3.NK细胞的分离纯化：向上述细胞溶液中加入20μl非特异的鼠IgG，4度，30分钟，以封闭非特异性结合。向细胞溶液中加入100μl CD56 MicroBeads，振荡混匀，4度，30分钟，每10分钟混匀一次。使用MACS分选器分选细胞，收集CD56阳性的NK细胞。使用PBS溶液洗涤2遍，1500转/分，10分钟，20度；使用完全α-MEM液体培养基重悬细胞，调整浓度为1.0×10⁵/ml，37度，5％CO2培养；上述细胞经流式细胞仪检测，CD56阳性细胞占95％以上。

4.克隆化生长细胞扩大培养：将上述纯化的NK细胞经有限稀释至每毫升含5个细胞，加至96孔板中，100μl/孔，相当于每孔含0.5个细胞，培养液为完全α-MEM液体培养基，37度，5％CO2培养；及时补加IL-2溶液，使其浓度维持在100U/ml左右。观察克隆形成情况，培养10天后部分孔出现细胞克隆，选择单个克隆孔，待细胞长至足够数量时，挑取呈克隆化生长的细胞，转入24孔板中进行扩大培养，细胞增殖后转入培养瓶中培养，获得性状稳定的细胞群体，其中1株细胞连续传代培养184天，冻存细胞复苏后传代培养69天，细胞生长情况、细胞状态等均良好，将此株细胞命名为NKG细胞。

该NKG细胞(人自然杀伤细胞)已于2009年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2901。

重组人白细胞介素-12(rhIL-12)国际标准品购自NIBSC(The National Institutefor Biological Standards and Control)。重组人白细胞介素-2购自长春生物制品研究所。胎牛血清购自上海依科赛生物制品有限公司，马血清购自上海依科赛生物制品有限公司。1640培养基、α-MEM(液体)培养基购自Invitrogen公司。人γ干扰素ELISA检测试剂盒购自Bender公司，试剂盒中包括人γ干扰素标准品、鼠抗人γ干扰素单克隆抗体、鼠抗人γ干扰素单克隆抗体包被的板及其他检测中需要的试剂。

1640完全培养基由1640培养基和胎牛血清组成，1640培养基与胎牛血清的体积比为9∶1。1640培养基的配制：取1640干粉培养基1袋(10.4克)，加入到装有950ml三蒸水的烧杯内，磁力搅拌器搅拌使其完全溶解，加入2.0克NaHCO₃，继续搅拌至溶解，用1M的HCl调节PH值7.2，使用三蒸水定容至1000mL，0.22um无菌滤膜过滤除菌，得到1640培养基，4℃保存。使用前加入10％体积的胎牛血清，即为1640完全培养基。

微量移液器购自法国Gilson公司，78-1型磁力加热搅拌器购自江苏安普电子工程有限公司。超净工作台购自上海智城分析仪器制造有限公司，CO₂培养箱购自Thermoforme公司，酶标仪购自BIO-RAD公司。

实施例1、检测重组人白细胞介素-12蛋白的活性

一、细胞活化及准备

将NKG细胞(人自然杀伤细胞)CGMCC No.2901接种于细胞培养基I中，在37℃、5％CO₂的条件下培养至对数生长期；期间可视细胞生长情况进行传代。

所述细胞培养基I由α-MEM培养基、胎牛血清、马血清和重组人白细胞介素-2组成，α-MEM培养基、胎牛血清、马血清和重组人白介素-2的配比为：8ml α-MEM培养基：1ml胎牛血清：1ml马血清：1000IU重组人白细胞介素-2。

取处于对数生长期的NKG细胞于50ml无菌离心管中，800rpm，10min，离心，弃上清，PBS溶液洗涤两遍后，悬于1640完全培养基(含10％胎牛血清的1640培养基)中，调整细胞浓度为5×10⁵个/ml，按100μl/孔加入96孔板各孔中，共36孔。

二、标准品和待检样品的准备

本实施例所用的待测样品为重组人白细胞介素12冻干剂(中国科学技术大学免疫学研究所生产，活性为6.1×10⁶(IU/mg))。

1、标准品的准备

将rhIL-12国际标准品溶于1.0ml注射用水中，然后使用1640完全培养基稀释成以下8个稀释度(ng/ml)：12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1，备用；

2、待检样品的准备

将待检样品溶于1.0ml注射用水中，然后使用1640完全培养基稀释成以下8个稀释度(ng/ml)：12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1，备用。

三、共培养(γ干扰素的诱生)

标准品实验组和待检品实验组均在同一96孔板上进行试验。

1、标准品实验组：向步骤一中加有细胞的96孔板对应孔中分别加入100μl不同稀释度的IL-12标准品，每个稀释度做双复孔，同时设立培养基对照2孔。37℃，5％CO₂培养24小时；

共培养体系由IL-12标准品、NKG细胞和1640完全培养基组成，IL-12标准品在共培养体系中的浓度分别为6.4ng/ml、3.2ng/ml、1.6ng/ml、0.8ng/ml、0.4ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml，人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901在共培养体系中的浓度为2.5×10⁵个/ml。

2、待检品实验组：向步骤一中加有细胞的96孔板对应孔中分别加入100μl不同稀释度的IL-12待检品，每个稀释度做双复孔，同时设立培养基对照2孔。37℃，5％CO₂培养24小时；

共培养体系由IL-12待检品、NKG细胞和1640完全培养基组成，IL-12待检品在共培养体系中的浓度分别为6.4ng/ml、3.2ng/ml、1.6ng/ml、0.8ng/ml、0.4ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml，人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901在共培养体系中的浓度为2.5×10⁵个/ml。

实验证明，标准品与细胞混合后，培养时间从18小时-24小时，结果均一致，待测品也如此。

四、γ干扰素含量检测

取培养后的NKG细胞上清50μl，酶联免疫法(ELISA方法)测定γ干扰素含量。

1、稀释人γ干扰素标准品：用样品稀释液将γ干扰素标准品先1∶10，再1∶100稀释为200pg/ml，倍比稀释为(pg/ml)200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0，共8个梯度。

2、用洗涤液洗涤鼠抗人γ干扰素单克隆抗体包被的板条2次，拍干。

3、分别取待检样品组细胞上清50μl、标准品组细胞上清50μl加入酶标板中(待检样品和标准品均做复孔)，再加入50μl样品稀释液和50μl生物素标记的鼠抗人γ干扰素单克隆抗体工作液，混匀，室温(22℃±4℃)放置2小时。用洗涤液洗板3次，拍干；每孔加入亲和素标记的辣根过氧化物酶工作液100μl，室温(22℃±4℃)放置1小时。用洗涤液洗板3次，拍干后，每孔加TMB底物工作液100μl，室温(22℃±4℃)静置10-20分钟，每孔再加终止液100μl。450nm波长下测定A值。

五、作S型曲线图

1、标准品作图：

采用Origin软件，用标准品的浓度和对应的A值作图，结果如图1所示。

以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以人白细胞介素-12蛋白标准品的浓度为横坐标，作图，结果如图2所示。

2、待检品作图

根据图1，输入待检样品A值直接求出待检样品γ干扰素含量。以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以人白细胞介素-12蛋白待检品的浓度为横坐标，作图，结果如图3所示。

六、待测样品活性计算

以γ干扰素含量对样品稀释度作图，计算各个实验样品的ED50(即γ干扰素含量为最大浓度的一半时的样品浓度)，并按下式计算结果：

Ps：标准品效价，IU/mg；

ED₅₀s：标准品ED50；

ED₅₀r：待测样品ED50。

待测样品效价＝1.0×10⁷(IU/mg)×0.58645(ng/ml)/0.94505(ng/ml)

＝6.2×10⁶(IU/mg)

结果检测得到的效价正确。试验设3次重复，第一次实验的结果为6.2×10⁶(IU/mg)，第二次实验的结果为5.95×10⁶(IU/mg)，第三次实验的结果为6.3×10⁶(IU/mg)。表明，本发明方法结果可靠。

Claims (3)

1.一种检测重组人白细胞介素-12蛋白的活性的方法，包括如下步骤：

1)用不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素，检测每种浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生的γ干扰素的量，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素-12蛋白标准品的浓度为横坐标，作曲线图，得到S型标准曲线图，从所述S型标准曲线图中得到所述γ干扰素的量为其最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素-12蛋白标准品的浓度值，将该浓度值记作ED_50s；

2)用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素，检测每种浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生的γ干扰素的量，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测重组人白细胞介素-12蛋白的浓度为横坐标，作曲线图，得到S型曲线图，从所述S型曲线图中得到所述γ干扰素的量为其最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素-12蛋白的浓度值，将该浓度值记作ED_50r；

3)根据公式I，计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白的活性，

(公式I)

其中，Ps为重组人白细胞介素-12蛋白标准品的活性值，Pr为待测重组人白细胞介素-12蛋白的活性值；

所述步骤1)中所用的人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901与所述步骤2)中所用的人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901的状态相同，所述步骤1)的刺激NKG细胞产生γ干扰素的方法与所述步骤2)中的刺激NKG细胞产生γ干扰素的方法相同，所述步骤1)的检测每种浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激NKG细胞产生的γ干扰素的量的方法与所述步骤2)中的检测每种浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激NKG细胞产生的γ干扰素的量的方法相同；

所述步骤1)和所述步骤2)没有先后顺序；

所述步骤1)中，所述用不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素的方法包括如下步骤：将所述不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品分别与所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901共培养，得到所述γ干扰素；

所述步骤2)中，所述用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自然 杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901产生γ干扰素的方法包括如下步骤：将所述不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白分别与所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901共培养，得到所述γ干扰素；

所述步骤1)的共培养中，所述共培养的体系由所述重组人白细胞介素-12蛋白标准品、所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901和培养基组成；

所述步骤2)的共培养中，所述共培养的体系由所述待测重组人白细胞介素-12蛋白、所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901和培养基组成；

所述方法中，在所述步骤1)和所述步骤2)前，包括如下细胞活化步骤：将人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901接种于细胞培养基I中，在温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5％的条件下培养至对数生长期，取对数生长期的细胞；

所述细胞培养基I由α-MEM培养基、胎牛血清、马血清和重组人白细胞介素-2组成，α-MEM培养基、胎牛血清、马血清和重组人白细胞介素-2的配比为：8ml α-MEM培养基∶1ml胎牛血清∶1ml马血清∶1000IU重组人白细胞介素-2；

所述共培养中培养基由1640培养基和胎牛血清组成，1640培养基与胎牛血清的体积比为9∶1；

所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No.2901在所述共培养体系中的浓度为2.5×10⁵个/ml；

所述共培养的温度为37℃，所述共培养的二氧化碳体积浓度为5％，所述共培养的时间为18-24小时；

所述步骤1)中重组人白细胞介素-12蛋白标准品在所述共培养体系中的浓度分别为6.4ng/ml、3.2ng/ml、1.6ng/ml、0.8ng/ml、0.4ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml；

所述步骤2)中待测重组人白细胞介素-12蛋白在所述共培养体系中的浓度分别为6.4ng/ml、3.2ng/ml、1.6ng/ml、0.8ng/ml、0.4ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测γ干扰素的量的方法为酶联免疫法，其中所用的一抗为γ干扰素单克隆抗体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组人白细胞介素-12蛋白的活性为重组人白细胞介素-12蛋白刺激淋巴细胞产生γ干扰素的活性；所述淋巴细胞为自然杀伤细胞、T细胞或B细胞。 

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