CN103837687A - 使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法及应用，包括以下步骤：（1）从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素-12受体的细胞，复苏活化培养至对数生长期；（2）使用不同浓度的重组人白细胞介素-12标准品诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，得到重组人白细胞介素-12标准品浓度值ED50s；（3）使用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白质诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，得到待测重组人白细胞介素-12蛋白质浓度值ED50r；（4）根据公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，得到待测重组人白细胞介素-12蛋白质体外活性Pr。

Description

使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法及应用
技术领域
本发明涉及重组人白细胞介素-12活性的检测技术，具体涉及一种使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法。
背景技术
具有白细胞介素-12受体的细胞，能够受到白细胞介素-12的诱导，诱发细胞内的信号传导。NK-92是一株白细胞介素-2依赖型自然杀伤细胞株。实验证明，NK92细胞在白细胞介素-12的诱导下，调节细胞表面受体的表达量，增强与肿瘤细胞表面配体的结合，抑制和杀死肿瘤细胞。或者是NK92细胞通过分泌免疫因子（例如：干扰素）和其他细胞因子直接抑制肿瘤细胞生长。白细胞介素-12（IL-12）是一种异源二聚体分子，是由单核/巨噬细胞及B淋巴细胞产生的一种细胞因子。
重组人白细胞介素-12（rhIL-12）是通过基因工程技术，采用真核细胞表达的编码人的白细胞介素-12。实验证明，重组人白细胞介素-12能够通过刺激NK细胞和T细胞增殖活化从而介导主动和被动免疫保护反应，是连接天然免疫和获得性免疫的功能性桥梁，具有多种重要生物学功能和药理作用，可应用于抗肿瘤、抗感染、抗哮喘、抗结核等多个领域。近年的研究发现，小剂量的rhIL-12可以刺激骨髓造血、保护造血微环境从而全面恢复受损血像，起到辐射和肿瘤放化疗防护的作用，作为抗辐射药试剂，重组人IL-12具有巨大的药物开发价值和临床应用价值。目前的研究中，rhIL-12的体外活性检测通常采用人的外周血，测定计数血细胞集落的方法，或者测定人外周血在rhIL-12刺激下产生γ干扰素的方法。用人外周血测定rhIL-12的活性，一方面细胞来源不能得到保证，同时由于人的个体差异，不能保证每次采集的血细胞性能相同，导致实验的准确性、精确性和重复性差。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是：针对现有技术中由于人的个体差异，导致rhIL-12的体外活性检测结果的准确性、精确性和重复性差的问题，提供一种检测准确性和精确性高、重复性好的使用具有白细胞介素-12受体的稳定细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法。
本发明所要解决的第二个技术问题是：提供使用具有白细胞介素-12受体的细胞在检测重组人白细胞介素-12体外活性中的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，包括以下步骤：
（1）从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素-12受体的细胞，将细胞快速融化复苏，在培养基中静置培养传代至对数生长期。
（2）使用不同浓度的重组人白细胞介素-12标准品与步骤（1）得到的具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素-12标准品的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素-12标准品的浓度值，该浓度值记作为ED50s。
（3）使用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白质与步骤（1）得到的具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测重组人白细胞介素-12蛋白质的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素-12蛋白质的浓度值，该浓度值记作为ED50r。
（4）根据公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白质的体外活性Pr,其中Ps为重组人白细胞介素-12标准品的活性值。
所述步骤（2）和步骤（3）同时操作，并使用同源的具有白细胞介素-12受体的细胞，使用相同的培养条件和相同的操作步骤。
优选的，步骤（1）中，从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素-12受体的细胞，将细胞快速融化复苏，置换掉冻存液，按照具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中的密度为2～3×105进行重悬后，静置活化培养，将对数生长期的具有白细胞介素-12受体的细胞使用培养基重悬细胞，将活化后的具有白细胞介素-12受体的细胞转移到检测孔板中。
所述具有白细胞介素-12受体的细胞，具有表达人白细胞介素-12的受体β1和β2（IL-12Rβ1和β2）的能力，能够与人白细胞介素-12结合，并且诱导产生γ干扰素（INF-γ）。
所述具有白细胞介素-12受体的细胞，可以是细胞天然就有表达人白细胞介素-12受体β1和β2的能力，也可以是通过人工重组的细胞，具有表达人白细胞介素-12受体β1和β2的能力。
优选的，所述具有白细胞介素-12受体的细胞是NK92细胞，所述NK92细胞具有天然表达人白细胞介素-12受体β1和β2的能力。
作为进一步的优选，所述NK92细胞购买自美国典型培养物收集库（ATCC），编号为CRL-2407。
优选的，步骤（1）、（2）、（3）中，所述培养和共培养均是在温度37℃、二氧化碳体积浓度是5%的环境中培养至对数生长期。
优选的，步骤（1）、（2）、（3）中，培养至对数生长期时所述具有白细胞介素-12受体的细胞在步骤（1）中的培养基中以及在步骤（2）、（3）中的共培养体系中的密度均为1～5×105个/ml。
作为进一步的优选，所述步骤（1）中的培养是在温度37℃、二氧化碳体积浓度是5%的环境中培养12～72小时。
作为一种改进，所述步骤（2）和步骤（3）中重组人白细胞介素-12蛋白标准品和待测重组人白细胞介素-12蛋白质在共培养体系中的浓度为0.032ng/ml～51.2ng/ml，所述诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素的时间为2～120小时。
作为进一步的改进，所述步骤（2）和步骤（3）中重组人白细胞介素-12蛋白标准品和待测重组人白细胞介素-12蛋白质在共培养体系中的浓度分别为：0.032ng/ml、0.06ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.8ng/ml、1.6ng/ml、3.2ng/ml、6.4ng/ml、12.8ng/ml、25.6ng/ml和51.2ng/ml。
作为另一种改进，步骤（1）、（2）、（3）中，所述培养基是在MEM培养基中添加β巯基乙醇、叶酸、rhIL-2、马血清和胎牛血清组成的。
优选的，所述步骤（2）和步骤（3）中的培养基为MEM培养基中含有0.1mM的β巯基乙醇、0.02mM的叶酸、100U/ml的rhIL-2、12.5wt%的马血清和12.5wt%的胎牛血清。
优选的，所述步骤（2）和步骤（3）中，产生的γ干扰素的检测方法为酶联免疫法，所述酶联免疫法使用的一抗为γ干扰素抗体。
为解决上述第二个技术问题，本发明的技术方案是：
使用具有白细胞介素-12受体的细胞在检测重组人白细胞介素-12体外活性中的应用。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明采用具有白细胞介素-12受体的细胞作为重组人白细胞介素-12体外活性的检测细胞株，具有传代次数不受限制、容易培养和性能稳定的特点。具有白细胞介素-12受体的细胞膜表面具有白细胞介素-12的受体蛋白质，因此，具有白细胞介素-12受体的细胞能够受到白细胞介素-12蛋白质的诱导，分泌γ干扰素，实验证明rhIL-12用量与产生γ干扰素的效果具有很好的量效关系，是测定重组人白细胞介素-12体外活性合适的细胞株。
本发明操作简单、快捷、结果重复性好、灵敏度高、特异性强。因此，本发明方法在重组人白细胞介素-12蛋白质的体外活性检测方面具有广阔的使用前景。
本发明使用的具有白细胞介素-12受体的细胞为冻存的NK92细胞，冻存的NK92细胞购买自美国典型培养物收集库（ATCC），编号为CRL-2407，避免了现有技术中使用人的外周血，由于人的个体差异，实验的准确性、精确性和重复性差的问题，因此，本发明的检测结果准确性和重复性相比现有技术大大提高。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是IL-12Rβ1和IL-12Rβ2在具有白细胞介素-12受体的细胞中的表达原理图；
图2是IL-12诱导具有白细胞介素-12受体的细胞分泌INF-γ的信号通路图；
图3是ELSIA方法测定INF-γ含量标准曲线图：图中纵坐标为INF-γ浓度值（pg/ml），横坐标为450nm处的光吸收值；
图4是IL-12标准品诱导NK92细胞产生INF-γ的曲线图：图中纵坐标为INF-γ浓度值（pg/ml），横坐标为重组人白细胞介素-12标准品的浓度（ng/ml）；
图5是IL-12待测重组人白细胞介素-12诱导NK92细胞产生INF-γ的曲线图。（3种线型分别代表3次重复试验）。图中纵坐标为INF-γ浓度值（pg/ml），横坐标为待测重组人白细胞介素-12蛋白质的浓度（ng/ml）。
具体实施方式
如图1和图2所示，泳道1：IL-12Rβ1阳性对照；泳道2，泳道3：IL-12Rβ1具有白细胞介素-12受体的细胞cDNA；泳道4：IL-12Rβ2阳性对照；泳道5，泳道6：IL-12Rβ2具有白细胞介素-12受体的细胞cDNA；泳道7，泳道8：内参β-actin具有白细胞介素-12受体的细胞cDNA。
如图1和图2所示，IL-12能够通过细胞膜表面IL-12受体结合具有白细胞介素-12受体的细胞，诱导具有白细胞介素-12受体的细胞启动SATA4的信号通路，分泌高水平的INF-γ，因此，充分证明具有白细胞介素-12受体的细胞是可以用于检测IL-12生物学体外活性的模式细胞株。
具有白细胞介素-12受体的细胞膜表面具有白细胞介素-12的受体蛋白质，该受体有2个亚基，分别是IL-12受体beta1（IL-12Rβ1）和IL-12受体beta2（IL-12Rβ2），以具有白细胞介素-12受体的细胞cDNA为样本，RT-PCR实验证明，IL-12Rβ1和IL-12Rβ2都能在具有白细胞介素-12受体的细胞中表达。
具有白细胞介素-12受体的细胞膜上的IL-12受体与IL-12结合后，诱导细胞内生成活性的转导和转录活性因子4（signal transducer and activatortranscription4,STAT4）,STAT4进入细胞核内与INF-γ的DNA结合，促进INF-γmRNA的转录和表达。
使用IL-12标准品处理具有白细胞介素-12受体的细胞后，测定NK-92细胞中STAT4的磷酸化水平的改变的结果。在WHO IL-12标准品处理后，与对照的没有被IL-12标准品处理的具有白细胞介素-12受体的细胞比，IL-12标准品处理的NK-92细胞中STAT4的磷酸化水平提高，但STAT4的总表达量没有变化。
如表1所示，因为重组人白细胞介素-12是异源二聚体，由P35和P40两个亚基组成，另外在天然状态下，P40亚基容易形成同源二聚体P80。将NK92细胞培养至对数生长期，分别加入P35、P40、P80、P70（rhIL-12WHO标准品）蛋白质与NK92细胞共培养，浓度为0～51.2ng/ml，诱导NK92细胞分泌γ干扰素，结果显示：只有P70（rhIL-12WHO标准品）能够刺激NK92产生γ干扰素，而P35、P40、P80亚基都不能诱导NK92产生γ干扰素，说明NK92细胞能够特异性的检测rhIL-12的体外活性。
表1P35，P40，P80和P70（rhIL-12WHO标准品）分别诱导NK92细胞产生IFN-γ的对比实验。
Figure BDA0000474920850000061
如图3至图5所示，rhIL-12与γ干扰素具有很好的量效关系，是测定白细胞介素-12体外活性合适的细胞株，并且操作简单、快捷、检测结果重复性好、灵敏度高、特异性强。
实施例1
（1）从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素-12受体的细胞，将细胞快速融化复苏，在培养基中静置培养传代至对数生长期，将活化后的具有白细胞介素-12受体的细胞转移到24孔板中。
（2）使用不同浓度的重组人白细胞介素-12标准品与上述活化后的具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，重组人白细胞介素-12标准品在共培养体系中的浓度为：0.032～51.2ng/ml，诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素-12标准品的不同浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素-12标准品的浓度值，该浓度值为ED50s=0.8723(ng/ml)。
（3）与步骤（2）同时操作，使用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白质与上述活化后的具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，待测重组人白细胞介素-12蛋白质在共培养体系中的浓度为：0.032ng/ml～51.2ng/ml，且与步骤（2）的浓度相同，诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测重组人白细胞介素-12蛋白质的不同浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素-12蛋白质的浓度值，该浓度值为ED50r=0.5059(ng/ml)。
（4）根据公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白质的体外活性Pr,其中Ps为重组人白细胞介素-12标准品的活性值，10000IU/μg；待测样品效价=1×104（IU/μg）×0.8723(ng/ml)/0.5059(ng/ml)=1.72×104（IU/μg）。
实施例2
（1）从液氮罐取出一支冻存的NK92细胞，将细胞快速融化，置换掉冻存液，接种于培养基中，在37℃，5%CO2，静置培养至对数生长期，进行传代培养，按照NK92细胞在培养基中的密度为2×105进行重悬后，静置活化培养，将对数生长期的NK92细胞使用培养基重悬细胞，将活化后的NK92细胞转移到24孔板中，然后加入0.5mlIL-12样品与培养基的混合液或培养基（对照），NK92细胞终密度为1×105cells/ml/孔。所述冻存的NK92细胞购买自美国典型培养物收集库（ATCC），编号为CRL-2407。
本实施例所用的重组人白细胞介素-12标准品是购自NIBSC（The NationalInstitute for Biological Standards and Control），其活性为10000IU/μg。
稀释重组人白细胞介素-12的标准品，用PBS（Gibico,Cat#10010）分别稀释到10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml；
稀释待测重组人白细胞介素-12蛋白质，用PBS（Gibico,Cat#10010）分别稀释到10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml；
（2）使用不同浓度的重组人白细胞介素-12标准品诱导NK92细胞，将以下浓度的重组人白细胞介素-12标准品（ng/ml）：51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05，分别加入上述24孔板的NK92细胞培养基中，组成共培养体系，在温度37℃、二氧化碳体积浓度是5%的环境中共培养24小时，收取细胞培养液，离心取上清，检测IFN-γ；所述共培养体系由NK92细胞、培养基和重组人白细胞介素-12标准品组成，所述NK92细胞在共培养体系中的密度为1×105个/ml。
（3）与步骤（2）同时操作，使用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白质诱导NK92细胞，将以下浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白质（ng/ml）：51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05，分别加入上述24孔板的NK92细胞培养基中，组成共培养体系，在温度37℃、二氧化碳体积浓度是5%的环境中共培养18小时，收取细胞培养液，离心取上清，检测IFN-γ；所述共培养体系由NK92细胞、培养基和待测人白细胞介素-12蛋白质组成，所述NK92细胞在共培养体系中的密度为1×105个/ml。
（4）按照梯度稀释方法，稀释INF-γ标准品，浓度为（pg/ml）：1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、0。用洗涤液洗涤包被的板条2次，拍干。从24孔板的孔中，分别取培养基上清放置于第一个1.5mleppendorf管离心（1500g，10分钟，4℃），离心后取上清，把上清放置于第二个1.5mleppendorf管中。对大于等于6.4ng/ml样品刺激的上清，用试剂盒中的标准稀释液稀释50倍后（取30μl上清，加标准稀释液），置于第三个1.5mleppendorf管中。对小于6.4ng/ml样品刺激的上清，用试剂盒中的标准稀释液稀释30倍后（取50μl上清，加
Figure BDA0000474920850000092
标准稀释液），置于第三个1.5mleppendorf管中。
用ELISA法检测培养基上清中IFN-γ的含量（稀释后的上清）。
采用GraphPad Prims5软件，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素-12标准品的不同浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素-12标准品的浓度值，该浓度值为ED50s=0.8723(ng/ml)。
以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测人白细胞介素-12蛋白质的不同浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的待测人白细胞介素-12蛋白质的浓度值，该浓度值为ED50r=0.5462(ng/ml)。
根据公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白质的体外活性Pr,其中Ps为重组人白细胞介素-12标准品的活性值，10000IU/μg；待测样品效价=1×104（IU/μg）×0.8723(ng/ml)/0.5462(ng/ml)=1.60×104（IU/μg）。
实施例3
（1）从液氮罐取出一支冻存的NK92细胞，将细胞快速融化，置换掉冻存液，接种于培养基中，在37℃，5%CO2，静置培养至对数生长期，进行传代培养，按照NK92细胞在培养基中的密度为3×105进行重悬后，静置活化培养，将对数生长期的NK92细胞，使用培养基重悬细胞，将活化后的NK92细胞转移到24孔板中，然后加入0.5mlIL-12样品与培养基的混合液或培养基（对照），NK92细胞终密度为1.5×105cells/ml/孔。所述冻存的NK92细胞购买自美国典型培养物收集库（ATCC），编号为CRL-2407。所述培养基为MEM培养基5中加入0.1mM的β巯基乙醇0.02mM的叶酸、100U/ml的rhIL-2、12.5wt%的马血清和12.5wt%的胎牛血清。
本实施例所用的重组人白细胞介素-12标准品是购自NIBSC（The NationalInstitute for Biological Standards and Control），其活性为10000IU/μg。
本实施例所用的待测重组人白细胞介素-12蛋白质为青岛康立泰药业制备的冻干粉针剂。重组人白细胞介素-2购自江苏金丝利药业有限公司，国药准字：S10970058。胎牛血清购自Gibco公司，马血清购自Invitrogen公司。MEM培养基购自Invitrogen公司。PBS缓冲液购自Gibco公司。β-巯基乙醇购自经科宏达公司。人γ干扰素ELISA检测试剂盒购自Invitrogen公司，试剂盒中包括人γ干扰素标准品、鼠抗人抗γ干扰素抗体、鼠抗人抗γ干扰素抗体包被的板，及其他检测中需要的试剂等。
稀释重组人白细胞介素-12的标准品，用PBS（Gibico,Cat#10010）分别稀释到10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml；
稀释待测重组人白细胞介素-12蛋白质，用PBS（Gibico,Cat#10010）分别稀释到10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml；
（2）使用不同浓度的重组人白细胞介素-12标准品诱导NK92细胞，将以下浓度的重组人白细胞介素-12标准品（ng/ml）：51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05，分别加入上述24孔板的NK92细胞培养基中，组成共培养体系，在温度37℃、二氧化碳体积浓度是5%的环境中共培养24小时，收取细胞培养液，离心取上清，检测IFN-γ；所述共培养体系由NK92细胞、培养基和重组人白细胞介素-12标准品组成，所述NK92细胞在共培养体系中的密度为1.5×105个/ml。
（3）与步骤（2）同时操作，使用不同浓度的待测人白细胞介素-12蛋白质诱导NK92细胞，将待测人白细胞介素-12蛋白质诱导NK92细胞，将以下浓度的待测人白细胞介素-12蛋白质（ng/ml）：51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05，分别加入上述24孔板的具有白细胞介素-12受体的细胞培养基中，组成共培养体系，在温度37℃、二氧化碳体积浓度是5%的环境中共培养24小时，收取细胞培养液，离心取上清，检测IFN-γ；所述共培养体系由NK92细胞、培养基和待测人白细胞介素-12蛋白质组成，所述NK92细胞在共培养体系中的浓度为1×105个/ml。
（4）按照梯度稀释方法，稀释INF-γ标准品，浓度为（pg/ml）：1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、0。用洗涤液洗涤包被的板条2次，拍干。从24孔板的孔中，分别取培养基上清放置于第一个1.5mleppendorf管离心（1500g，10分钟，4℃），离心后取上清，把上清放置于第二个1.5mleppendorf管中。对大于等于6.4ng/ml样品刺激的上清，用试剂盒中的标准稀释液稀释50倍后（取30μl上清，加
Figure BDA0000474920850000111
标准稀释液），置于第三个1.5mleppendorf管中。对小于6.4ng/ml样品刺激的上清，用试剂盒中的标准稀释液稀释30倍后（取50μl上清，加
Figure BDA0000474920850000112
标准稀释液），置于第三个1.5mleppendorf管中。
用ELISA法检测培养基上清中IFN-γ的含量（稀释后的上清），使用的一抗为抗γ干扰素抗体。
采用GraphPad Prims5软件，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素-12标准品的不同浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素-12标准品的浓度值，该浓度值为ED50s=0.8723(ng/ml)。
以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测人白细胞介素-12蛋白质的不同浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的待测人白细胞介素-12蛋白质的浓度值，该浓度值为ED50r=0.5236(ng/ml)。
根据公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白质的体外活性Pr,其中Ps为重组人白细胞介素-12标准品的活性值，10000IU/μg；待测样品效价=1×104（IU/μg）×0.8723(ng/ml)/0.5236(ng/ml)=1.66×104（IU/μg）。

Claims (10)

1.使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素-12受体的细胞，将细胞快速融化复苏，在培养基中静置培养传代至对数生长期；
（2）使用不同浓度的重组人白细胞介素-12标准品与步骤（1）得到的具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素-12标准品的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素-12标准品的浓度值，该浓度值记作为ED50s；
（3）使用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白质与步骤（1）得到的具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测重组人白细胞介素-12蛋白质的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素-12蛋白质的浓度值，该浓度值记作为ED50r；
（4）根据公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白质的体外活性Pr,其中Ps为重组人白细胞介素-12标准品的活性值；
所述步骤（2）和步骤（3）同时操作，并使用同源的具有白细胞介素-12受体的细胞，使用相同的培养条件和相同的操作步骤。
2.如权利要求1所述的使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，其特征在于：所述具有白细胞介素-12受体的细胞，具有表达人白细胞介素-12的受体β1和β2的能力，能够与人白细胞介素-12结合，并且被诱导产生γ干扰素。
3.如权利要求2所述的使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，其特征在于：所述具有白细胞介素-12受体的细胞，可以是细胞天然就有表达人白细胞介素-12受体β1和β2的能力，也可以是通过人工重组的细胞，具有表达人白细胞介素-12受体β1和β2的能力。
4.如权利要求3所述的使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，其特征在于：所述具有白细胞介素-12受体的细胞是NK92细胞，所述NK92细胞具有天然表达人白细胞介素-12受体β1和β2的能力。
5.如权利要求1所述的使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，其特征在于：步骤（1）、（2）、（3）中，所述培养和共培养均是在温度37℃、二氧化碳体积浓度是5%的环境中培养至对数生长期。
6.如权利要求5所述的使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，其特征在于：步骤（1）、（2）、（3）中，培养至对数生长期时所述具有白细胞介素-12受体的细胞在步骤（1）中的培养基中以及在步骤（2）、（3）中的共培养体系中的密度均为1～5×105个/ml。
7.如权利要求1所述的使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）中重组人白细胞介素-12蛋白标准品和待测重组人白细胞介素-12蛋白质在共培养体系中的浓度为0.032ng/ml～51.2ng/ml，所述诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素的时间为2～120小时。
8.如权利要求1所述的使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，其特征在于：步骤（1）、（2）、（3）中，所述培养基是在MEM培养基中添加β巯基乙醇、叶酸、rhIL-2、马血清和胎牛血清组成的。
9.如权利要求1至8任一权利要求所述的使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）中，产生γ干扰素的检测方法为酶联免疫法，所述酶联免疫法使用的一抗为γ干扰素抗体。
10.使用具有白细胞介素-12受体的细胞在检测重组人白细胞介素-12体外活性中的应用。
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