CN108137657A - 纯化梭菌神经毒素的方法 - Google Patents

纯化梭菌神经毒素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108137657A
CN108137657A CN201680055073.8A CN201680055073A CN108137657A CN 108137657 A CN108137657 A CN 108137657A CN 201680055073 A CN201680055073 A CN 201680055073A CN 108137657 A CN108137657 A CN 108137657A
Authority
CN
China
Prior art keywords
clostridial neurotoxins
seq
bont
value
purposes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680055073.8A
Other languages
English (en)
Inventor
S·G·哈克特
S·帕兰
D·B·安德森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ipsen Biological Pharmaceutical Co Ltd
Ipsen Biopharm Ltd
Original Assignee
Ipsen Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ipsen Biological Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Ipsen Biological Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN108137657A publication Critical patent/CN108137657A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24068—Tentoxilysin (3.4.24.68), i.e. tetanus neurotoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

一种纯化梭菌神经毒素的方法，其包括使阳离子交换树脂与包含梭菌神经毒素的组合物接触，其中所述接触步骤在至少pH 7.3下进行，其中使阳离子交换树脂与包含所述梭菌神经毒素的组合物接触的步骤发生在将梭菌神经毒素从单链形式转化为双链形式之前。还提供了具有比梭菌神经毒素的计算的pI值高1‑个pH单位或更高的pH值的缓冲液的用途，通过本发明可获得的纯化中间体和梭菌神经毒素，其中梭菌神经毒素为单链形式。

Description

纯化梭菌神经毒素的方法
技术领域
本发明涉及纯化梭菌神经毒素的方法，缓冲液的用途、通过本文的方法和用途获得的纯化中间体和梭菌神经毒素。
背景
梭状芽孢杆菌(Clostridia)属细菌产生高度有效且特异性的蛋白质毒素，其可以毒害神经元和它们被递送到的其他细胞。此类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(TeNT)和肉毒梭菌(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的神经毒素。
梭菌神经毒素中已知有一些最有效的毒素。举例来说，取决于血清型，肉毒杆菌神经毒素对于小鼠的半数致死剂量(LD50)值为0.5至5ng/kg。破伤风和肉毒杆菌毒素都通过抑制受影响的神经元的功能，特别是神经递质的释放起作用。虽然肉毒杆菌毒素作用于神经肌肉接点并抑制外周神经系统中的胆碱能传递，但破伤风毒素在中枢神经系统中起作用。
在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其被蛋白水解切割事件翻译后修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，该位点通常称为位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间的激活位点。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链被称为重链(H链)，其具有约100kDa的分子量，和轻链(L链)，其具有约50kDa的分子量。H链包含N-端易位组分(HN结构域)和C-端靶向组分(HC结构域)。切割位点位于L-链和易位结构域组分之间。在HC结构域与其靶神经元结合并通过内体将结合的毒素内化入细胞后，HN结构域将L链易位穿过内体膜并进入胞质溶胶，并且L-链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。
非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白(例如SNAP-25、VAMP或Syntaxin)来起作用-参见Gerald K(2002)“Cell and MolecularBiology”(第4版)John Wiley&Sons，Inc。首字母缩写词SNARE来源于术语Soluble NSFAttachment Receptor，其中NSF是指N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白与细胞内囊泡融合所必需的，因此是通过囊泡转运从细胞中分泌分子所必需的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性并且对SNARE蛋白表现出高底物特异性。因此，一旦递送至期望的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。
鉴于SNARE蛋白质的普遍性质，梭菌神经毒素如肉毒杆菌毒素已成功用于各种疗法中。
举例来说，我们提及William J.Lipham,Cosmetic and Clinical Applicationsof Botulinum Toxin(Slack,Inc.,2004)，其描述了使用梭菌神经毒素如肉毒杆菌神经毒素(BoNT)，BoNT/A，BoNT/B，BoNT/C1，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(TeNT)，以在许多治疗和化妆或美容应用中抑制神经元传导-例如市售肉毒杆菌毒素产品目前被批准为用于适应证的治疗，所述适应证包括局灶性痉挛状态、上肢痉挛状态、下肢痉挛状态、颈部张力障碍、眼睑痉挛、半面痉挛、腋部多汗症、慢性偏头痛、神经性逼尿肌过度活动、眉间纹和严重外眦线。另外，描述了梭菌神经毒素疗法用于治疗神经肌肉病症(参见US 6,872,397)；用于治疗子宫病症(参见US 2004/0175399)；用于治疗溃疡和胃食管反流疾病(参见US 2004/0086531)；用于治疗张力障碍(参见US 6,319,505)；用于治疗眼睛病症(参见US 2004/0234532)；用于治疗眼睑痉挛(参见US 2004/0151740)；用于治疗斜视(参见US 2004/0126396)；用于治疗疼痛(参见US 6,869,610，US 6,641,820，US 6,464,986和US6,113,915)；用于治疗纤维肌痛(参见US 6,623,742，US 2004/0062776)；用于治疗腰痛(参见US 2004/0037852)；用于治疗肌肉损伤(参见US 6,423,319)；用于治疗窦性头痛(参见US6,838,434)；用于治疗紧张性头痛(参见US 6,776,992)；用于治疗头痛(参见US 6,458,365)；用于减轻偏头痛性头痛(参见US 5,714,469)；用于治疗心血管疾病(参见US 6,767,544)；用于治疗神经障碍例如帕金森病(参见US 6,620,415，US 6,306,403)；用于治疗神经精神障碍(参见US 2004/0180061，US 2003/0211121)；用于治疗内分泌失调(参见US 6,827,931)；用于治疗甲状腺病症(参见US 6,740,321)；用于治疗受胆碱能影响的汗腺病症(参见US 6,683,049)；用于治疗糖尿病(参见US 6,337,075，US 6,416,765)；用于治疗胰腺病症(参见US 6,261,572，US 6,143,306)；用于治疗癌症例如骨肿瘤(参见US 6,565,870，US 6,368,605，US 6,139,845，US 2005/0031648)；用于治疗耳部病症(参见US 6,358,926，US 6,265,379)；用于治疗自主神经障碍如胃肠肌肉障碍和其他平滑肌功能障碍(参见US5,437,291)；用于治疗与皮肤细胞增殖性病症相关的皮肤损伤(参见US 5,670,484)；用于治疗神经源性炎性病症(参见US 6,063,768)；用于减少脱发和刺激毛发生长(参见US 6,299,893)；用于治疗下行口(参见US 6,358,917)；用于减少食欲(参见US 2004/40253274)；用于牙科治疗和程序(参见US 2004/0115139)；用于治疗神经肌肉障碍和病症(参见US2002/0010138)；用于治疗各种病症和状况以及相关的疼痛(参见US 2004/0013692)；用于治疗由粘液高分泌导致的病症，如哮喘和COPD(参见WO 00/10598)；和用于治疗非神经元病症如炎症，内分泌疾病，外分泌疾病，免疫病症，心血管疾病，骨骼病症(参见WO 01/21213)。所有上述出版物均通过引用整体并入本文。
预计非细胞毒性蛋白酶如梭菌神经毒素(例如BoNT和TeNT)在人类和其他哺乳动物的治疗和美容治疗中的应用将扩大到可受益于这些毒素的性质的不断扩大的疾病和病痛范围。
为了避免全身神经毒性效应，许多梭菌神经毒素疗法利用梭菌神经毒素治疗剂的直接施用于给定的靶位点(例如靶组织)。以这种方式施用基于梭菌神经毒素的治疗剂时的问题是毒素扩散远离施用部位并进入周围组织或体循环。认为毒素从靶组织中扩散导致不希望的副作用，在极端情况下可能危及生命。当以高剂量、浓度和注射量使用梭状芽孢杆菌神经毒素治疗剂(如BoNT治疗剂)时，这可能是特别关注的问题。已报道的用于商业BoNT/A治疗的与这个问题相关的不利影响包括虚弱、全身肌肉无力、复视、上睑下垂、吞咽困难、发音困难、构音障碍、尿失禁和呼吸困难。吞咽和呼吸困难可能会危及生命，并且已报道了与毒素效应扩散有关的死亡。这些问题已在WO2015/004461A1(通过引用并入本文)中得到处理和解决，其提供了工程化的梭菌神经毒素，该梭菌神经毒素包含至少一个提高工程化的梭菌神经毒素的等电点(pI)的氨基酸修饰。
本领域提供了纯化梭菌神经毒素的方法。WO2006/096163A1(通过引用并入本文)教导了纯化与稳定化无毒蛋白质复合的A型肉毒杆菌神经毒素的层析方法和系统。WO2006/096163A1教导了多种层析方法，包括使用阳离子交换柱作为精加工柱(即当A型肉毒杆菌神经毒素复合物已经经历一个或多个先前的柱并且基本为纯化状态时使用的柱)。在WO2006/096163A1中教导了当与肉毒杆菌神经毒素A型复合物结合并进行阳离子交换层析时使用非常低的pH值(例如pH4.0)。
然而，仍然需要用于纯化梭菌神经毒素(特别是非复合梭菌神经毒素)的优化的和增强的技术，其提供改进的方法和/或提高的产量，优选促进梭菌神经毒素在更少(和/或任选地更高效)的步骤中纯化。
发明概述
根据第一方面，本发明提供了用于纯化梭菌神经毒素的方法，其包括使阳离子交换树脂与包含梭菌神经毒素的组合物接触，其中所述接触步骤在至少pH 7.3下进行，其中所述使阳离子交换树脂与包含所述梭菌神经毒素的组合物接触的步骤发生在所述梭菌神经毒素从单链形式转化为双链形式之前。
在第二方面，提供了包含与阳离子交换树脂缔合的梭菌神经毒素的纯化中间体，其中所述纯化中间体具有至少pH 7.3的pH值，并且其中所述梭菌神经毒素为单链形式。
在第三方面，提供了已经从阳离子交换树脂分离的梭菌神经毒素，其中所述纯化中间体具有至少pH 7.3的pH值，并且其中所述梭菌神经毒素为单链形式。
在第四方面，本发明提供了当与在相同条件下使用比所述梭菌神经毒素的计算的pI低大于-1个pH单位的pH且其中所述梭菌神经毒素为单链形式相比时，具有比梭菌神经毒素的计算的pI高-1个pH单位或更高的缓冲液用于使包含该梭菌神经毒素与阳离子交换树脂的组合物接触以增加梭菌神经毒素的结合和/产量的用途。
在第五方面，提供了通过前述权利要求中任一项的方法或用途可获得的和/或从本发明的纯化中间体分离的梭菌神经毒素。
附图简述
现在将参照附图仅以举例的方式描述本发明的实施例，其中：
图1示出了阳离子交换树脂在不同pH下的rBoNT/A1捕获。将内负性(endonegative)rBoNT/A1的大肠杆菌裂解物缓冲液交换至pH 6.0(图A和B)，pH7.5(图C和D)或pH8.0(图E和F)。将裂解物加载到Hi-Trap SP-HP上，洗涤，并用pH(图A)或NaCl(图B-F)梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析级分F5-F16，并且在每个图上用星号(*)表示BoNT/A。
图2示出了阳离子交换树脂在不同pH下的阳离子rBoNT/A1捕获。将内负性阳离子rBoNT/A1的大肠杆菌裂解物缓冲液交换至pH 6.0(图A和B)，pH7.5(图C和D)或pH8.0(图E和F)。将裂解物加载到Hi-Trap SP-HP上，洗涤，并用pH(图A)或NaCl(图B-F)梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析相关级分，并且在每个小图上用星号(*)表示BoNT/A。
图3示出了阳离子BoNT/A1(例如与天然BoNT/A1相比具有增加的等电点的BoNT/A1)核苷酸序列(SEQ ID No.1)。
图4示出了阳离子rBoNT/A1多肽序列(SEQ ID No.2)。
图5示出了rBoNT/A1核苷酸序列(SEQ ID No.3)。
图6示出了rBoNT/A1多肽序列(SEQ ID No.4)。
图7示出了阳离子BoNT/A，“CatHN_v1”，核苷酸序列(SEQ ID No.5)。
图8示出了阳离子BoNT/A，“CatHN_v1”多肽序列(SEQ ID No.6)。
图9示出了阳离子BoNT/A，“CatHN_v2”，核苷酸序列(SEQ ID No.7)。
图10示出了阳离子BoNT/A，“CatHN_v2”多肽序列(SEQ ID No.8)。
图11示出了阳离子BoNT/A，“CatHN_v3”核苷酸序列(SEQ ID No.9)。
图12示出了阳离子BoNT/A，“CatHN_v3”多肽序列(SEQ ID No.10)。
图13示出了阳离子BoNT/E轻链“CatLC”核苷酸序列(SEQ ID No.11)。
图14示出了阳离子BoNT/E轻链“CatLC”多肽序列(SEQ ID No.12)。
图15示出了BoNT/A1核苷酸序列(SEQ ID No.13)。
图16示出了BoNT/A1多肽序列(SEQ ID No.14)。
图17示出了阳离子BoNT/A1，“Cat-A”核苷酸序列(SEQ ID No.15)。
图18示出了阳离子BoNT/A1，“Cat-A”多肽序列(SEQ ID No.16)。
图19示出了阳离子BoNT/A1，“Cat-B”核苷酸序列(SEQ ID No.17)。
图20示出了阳离子BoNT/A1，“Cat-B”多肽序列(SEQ ID No.18)。
图21示出了阳离子BoNT/A1，“Cat-C”核苷酸序列(SEQ ID No.19)。
图22示出了阳离子BoNT/A1“Cat-C”多肽序列(SEQ ID No.20)。
图23示出了阳离子BoNT/A1，“Cat-D”核苷酸序列(SEQ ID No.21)。
图24示出了阳离子BoNT/A1，“Cat-D”多肽序列(SEQ ID No.22)。
详细说明
本发明的开创性发现是梭菌神经毒素在至少pH 7.3下与阳离子交换残基缔合。这是非常出乎意料的，并且与本领域普遍的智慧相反，所述智慧教导了在阳离子交换层析过程中使用远低于被纯化的蛋白质的pI的pH值。
本发明人还令人惊讶地发现，与在不同pH下的类似用途相比，使用具有比梭菌神经毒素的计算的等电点(pI)高-1个pH单位或更高的pH值的缓冲液增加结合和/或产量。
因此，在一个实施方案中，提供了用于纯化梭菌神经毒素的方法，包括使阳离子交换树脂与包含梭菌神经毒素的组合物接触，其中所述接触步骤在至少pH 7.3下进行，其中所述使阳离子交换树脂与包含所述梭菌神经毒素的组合物接触的步骤发生在所述梭菌神经毒素从单链形式转化为双链形式之前。
在一个实施方案中，接触步骤可以在至少约pH 7.3下进行。适宜地，接触步骤可以在至少约pH 7.4或至少pH 7.5下进行。
适宜地，接触步骤可以在至少约pH 7.6或至少约pH 7.7下进行。
适宜地，接触步骤可以在至少约pH7.8或至少约pH7.9下进行。
适宜地，接触步骤可以在至少约pH 8.0下进行。
在另一个实施方案中，接触步骤可以在至少约pH 7.3至约pH 9.5下进行。适宜地，接触步骤可以在约pH 7.5至约pH 9.0，或约pH 7.5至约pH 8.5之间的pH值下进行。
适宜地，接触步骤可以在约pH 7.5的pH值下进行。
适宜地，接触步骤可以在约pH8.0的pH值下进行。
如本文所用的术语“纯化”意指去除可能存在于包含梭菌神经毒素的组合物中的一种或多种非梭菌神经毒素污染物，优选目的是获得不含所述非梭菌神经毒素污染物的梭菌神经毒素。换句话说，除非另有说明，否则术语“纯化”是指纯化程度而不是绝对纯化。因此术语“纯化”可指去除至少5％(适宜地至少10％或20％)的非梭菌神经毒素污染物。适宜地“纯化”可指去除污染物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在另一个实施方案中，提供了与在相同条件下使用比所述梭菌神经毒素的计算的pI低大于-1个pH单位的pH值且其中所述梭菌神经毒素为单链形式相比时，具有比梭菌神经毒素的计算的pI值高-1个pH单位或更高的pH值的缓冲液用于使包含该梭菌神经毒素的组合物与阳离子交换树脂接触以提高梭菌神经毒素的结合和/或产量的用途。
如本文所用，术语“比梭菌神经毒素的计算的pI高大于-1个pH单位或更高”意指高于低于梭菌神经毒素的计算的pI-1个pH单位的pH。例如，该术语将包括-0.5、+0.5、+1个pH单位等。例如，如果梭菌神经毒素具有8.0的pI，则大于-1个pH单位或更高的pH值意味着大于pH 7.0的pH，例如，pH 8.0，pH 9.0等。
如本文所用，术语“比所述梭菌神经毒素的计算的pI低大于-1个pH单位”意指低于梭菌神经毒素的计算的pI的-1个pH单位以下的pH。例如，该术语将包括-2个pH单位等。例如，如果梭菌神经毒素具有8.0的pI，则低大于-1个pH单位的pH值意指小于pH 7.0的pH，例如pH 6.0，pH 5.0等。
用于本发明的阳离子交换树脂可以是能够与梭菌神经毒素缔合的任何种类的阳离子交换树脂。在一个实施方案中，阳离子交换树脂可以是强阳离子交换树脂、弱阳离子交换树脂或其组合。
适当的阳离子交换树脂可以是强阳离子交换树脂。
强阳离子交换剂的非限制性实例包括：SP Sepharose HP，SP Sepharose FF(均可得自GE Healthcare，UK)，Mustang S，S Ceramic，F，Acrodisc with MustangS，AcroPrep with Mustang S和/或AcroSep with S CeramicF(所有这些(除非另有说明)均可从Pall Corporation，25 Harbor Park Drive，Port Washington，NY11050，USA)购得。
在一个优选的实施方案中，阳离子交换树脂可以是包含磺酸的强阳离子交换树脂。
在一个实施方案中，阳离子交换树脂可以是SP Sepharose HP树脂和/或SPSepharose FF树脂(均可从英国GE Healthcare购得)。
弱阳离子交换剂的非限制性实例包括：CM CeramicF，AcroSep withCM Ceramic和/或F(所有这些都可以从Pall Corporation,25 Harbor ParkDrive,Port Washington,NY 11050,USA购得)。
在一个实施方案中，弱阳离子交换树脂可以是包含羧甲基的树脂。
在一个实施方案中，可以使用混合模式树脂。混合模式树脂可以使用经由离子相互作用与靶蛋白相互作用的带电配体，并且可以用一个或多个官能团(例如，通过氢键、疏水和范德华相互作用产生相互作用)增强。因此在一个实施方案中，混合模式树脂可以用作离子交换树脂和疏水性相互作用树脂。适宜地，混合模式树脂可以用作阳离子交换树脂(适宜地弱阳离子交换树脂)和疏水性相互作用树脂。
混合模式树脂的非限制性实例包括Capto多峰范围的层析柱(可从GEHealthcare，UK商购获得)。
在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其被蛋白水解切割事件翻译后修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，通常称为位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间的激活位点。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链被称为重链(H链)，其具有约100kDa的分子量，和轻链(L链)，其具有约50kDa的分子量。H链包含N-端易位组分(HN结构域)和C-端靶向组分(HC结构域)。切割位点位于L-链和易位结构域组分之间。在HC结构域与其目标神经元结合并通过内体将结合的毒素内化入细胞后，HN结构域将L链易位穿过内体膜并进入胞质溶胶，并且L-链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。
许多不同类型的梭菌神经毒素适用于本发明。因此，在本发明的上下文中，术语“梭菌神经毒素”包括由肉毒梭菌(C.botulinum)(肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G)、破伤风梭菌(C.tetani)(破伤风神经毒素)、丁酸梭菌(C.butyricum)(肉毒杆菌神经毒素血清型E)和巴氏梭菌(C.baratii)(肉毒杆菌神经毒素血清型F)产生的毒素，以及修饰的梭菌神经毒素或衍生自前述任一种的衍生物。术语“梭菌神经毒素”也可以包含天然存在的肉毒神经毒素杂合体、镶嵌体和嵌合体。
本文中使用的术语“镶嵌体”是指天然存在的梭菌神经毒素，其包含来自另一种梭菌神经毒素(例如不同血清型的梭菌神经毒素)的至少一个功能结构域，所述梭菌神经毒素通常不包含所述至少一个功能域。
因此，在一个实施方案中，可以从一种或多种选自肉毒梭菌、破伤风梭菌、巴氏梭菌和丁酸梭菌获得本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素。
肉毒杆菌神经毒素(BoNT)由肉毒梭菌以大蛋白复合物的形式产生，其由与许多辅助蛋白复合的BoNT本身组成。目前有八种不同类型的肉毒神经毒素，即：A、B、C1、D、E、F、G和H型肉毒杆菌神经毒素血清型，它们都具有相似的结构和作用模式。不同的BoNT血清型可基于通过特异性中和抗血清失活而区分，通过血清型的这种分类与氨基酸水平上的百分比序列同一性相关。根据氨基酸百分比序列同一性将给定血清型的BoNT蛋白进一步分成不同的亚型。
BoNT在胃肠道中被吸收，并且在进入全身循环后，与胆碱能神经末梢的突触前膜结合并阻止其神经递质乙酰胆碱的释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G裂解突触泡蛋白/囊泡相关膜蛋白(VAMP)；BoNT/C1、BoNT/A和BoNT/E切割25kDa的突触体相关蛋白(SNAP-25)；BoNT/C1切割突触融合蛋白。
破伤风毒素由破伤风梭菌以单一血清型产生。丁酸梭菌产生BoNT/E，而巴氏梭菌产生BoNT/F。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是TeNT。参考TeNT序列具有UniProtKB登录号P04958。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是肉毒杆菌神经毒素(BoNT)，优选选自BoNT/A，BoNT/B，BoNT/C1，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F和BoNT/G中的一种或多种。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/A。参考BoNT/A序列具有UniProtKB登录号P10845。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/B。参考BoNT/B序列具有UniProtKB登录号P10844。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/C。参考BoNT/C1序列具有UniProtKB登录号P18640。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/D。参考BoNT/D序列具有UniProtKB登录号P19321。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/E。参考BoNT/E序列具有UniProtKB登录号Q00496。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/F。参考BoNT/F序列具有UniProtKB登录号YP_001390123。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/G。参考BoNT/G序列具有UniProtKB登录号Q60393。
术语“梭菌神经毒素”也旨在包含修饰的梭菌神经毒素及其衍生物，包括但不限于下文所述的那些。修饰的梭菌神经毒素或衍生物可含有与梭状神经毒素的天然(未修饰)形式相比已经修饰的一个或多个氨基酸，或可含有一个或多个不存在于天然(未修饰的)形式的梭菌神经毒素的插入的氨基酸，或者与梭菌神经毒素的天然(未修饰)形式相比可以具有一个或多个氨基酸缺失。举例来说，相对于天然(未修饰的)梭菌神经毒素序列，修饰的梭菌神经毒素可以在一个或多个结构域中具有修饰的氨基酸序列。这种修饰可以修饰神经毒素的功能方面，例如生物活性或持久性。
修饰的梭菌神经毒素可以是WO2015/004461A1中教导的修饰的梭菌神经毒素(例如阳离子BoNT)。
在另一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子BoNT/A。
在另一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子BoNT/B。
在另一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子BoNT/C。
在另一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子BoNT/D。
在另一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子BoNT/E。
在另一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子BoNT/F。
在另一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子BoNT/G。
阳离子BoNT是具有比其天然BoNT对应物更高的等电点的BoNT。
修饰的梭菌神经毒素可以在重链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰(例如修饰的HC结构域)，其中所述修饰的重链以比天然(未修饰的)梭菌神经毒素更高或更低的亲和力结合靶标神经细胞。HC结构域中的这种修饰可以包括修饰HC结构域的神经节苷脂结合位点中的残基或修饰改变与神经节苷脂受体和/或靶神经细胞的蛋白质受体的结合的蛋白质(SV2或突触结合蛋白)结合位点中的残基。WO2006/027207和WO2006/114308中描述了这种修饰的梭菌神经毒素的实例，两者全部通过引用并入本文。
修饰的梭菌神经毒素可以在轻链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰，例如可以改变或修饰经修饰的LC的SNARE蛋白特异性的底物结合或催化结构域中的修饰。WO2010/120766和US2011/0318385中描述了这种修饰的梭菌神经毒素的实例，两者全部通过引用整体并入本文。
修饰的梭菌神经毒素可包含增加或降低经修饰的梭菌神经毒素的生物活性和/或生物持久性的一种或多种修饰。例如，修饰的梭菌神经毒素可包含基于亮氨酸或酪氨酸的基序，其中所述基序增加或降低经修饰的梭菌神经毒素的生物学活性和/或生物学持久性。适当的基于亮氨酸的基序包括xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL和xExxxLM(其中x是任何氨基酸)。适当的基于酪氨酸的基序包括Y-x-x-Hy(其中Hy是疏水氨基酸)。WO2002/08268中描述了包含基于亮氨酸和酪氨酸基序的修饰的梭菌神经毒素的实例，其通过引用整体并入本文。
术语“梭菌神经毒素”旨在包含杂交和嵌合的梭菌神经毒素。杂种或嵌合的梭菌神经毒素包含来自一种梭菌神经毒素或其亚型的轻链的至少一部分和来自另一种梭菌神经毒素或梭菌神经毒素亚型的重链的至少一部分。
在一个实施方案中，杂合或嵌合的梭菌神经毒素可含有来自一种梭菌神经毒素亚型的完整轻链和来自另一种梭菌神经毒素亚型的重链。在另一个实施方案中，嵌合的梭菌神经毒素可含有一种梭菌神经毒素亚型重链的一部分(例如结合结构域)，而另一部分重链来自另一种梭菌神经毒素亚型。类似地或备选地，治疗元件可以包含来自不同梭菌神经毒素的轻链部分。这样的杂合或嵌合的梭菌神经毒素例如可用作将此类梭菌神经毒素的治疗益处递送给对给定梭菌神经毒素亚型具有免疫抗性的患者，可能具有对给定的梭菌神经毒素重链结合结构域的低于平均浓度的受体的患者，或可能具有膜或囊泡毒素底物的蛋白酶抗性变体(例如SNAP-25，VAMP和突触融合蛋白)的患者。杂交和嵌合的梭菌神经毒素描述于US 8,071,110和GB1607901.4(尚未公开)中，其公开内容通过引用整体并入本文。因此，在一个实施方案中，根据本发明的方法或用途进行纯化的梭菌神经毒素可以是工程化的梭菌神经毒素，适宜地它可以是工程化的杂合梭菌神经毒素或工程化的嵌合梭菌神经毒素。
术语“梭菌神经毒素”旨在包含重新靶向的梭菌神经毒素。在重新靶向的梭菌神经毒素中，梭菌神经毒素被修饰以包括称为靶向部分(TM)的外源配体。选择TM以提供对期望的靶细胞的结合特异性，并且作为重新靶向过程的一部分，可以去除梭菌神经毒素的天然结合部分(例如HC结构域或HCC结构域)。例如，在下列文献中描述了重新靶向技术：EP-B-0689459；WO 1994/021300；EP-B-0939818；US 6,461,617；US 7,192,596；WO 1998/007864；EP-B-0826051；US 5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；WO 1996/033273；EP-B-0996468；US 7,052,702；WO 1999/017806；EP-B-1107794；US 6,632,440；WO 2000/010598；WO 2001/21213；WO 2006/059093；WO 2000/62814；WO 2000/04926；WO 1993/15766；WO2000/61192；和WO 1999/58571；其全部通过引用整体并入本文。因此，在一个实施方案中，用于本发明的工程化梭菌神经毒素可以是工程化的重新靶向的梭菌神经毒素。
本发明还包括具有非天然蛋白酶切割位点的梭菌神经毒素(或其用途)。在这些梭菌神经毒素中，天然蛋白酶切割位点(也称为活化位点，如上所述)被修饰或用对梭菌神经毒素不是天然的蛋白酶切割位点(即外源切割位点)替代。这样的位点将需要外源蛋白酶进行切割，这允许改善对切割事件的时间选择和位置的控制。可用于梭菌神经毒素的非天然蛋白酶切割位点包括：
肠激酶 (DDDDK↓)
因子Xa (IEGR↓/IDGR↓)
TEV(烟草蚀纹病毒) (ENLYFQ↓G)
凝血酶 (LVPR↓GS)
PreScission (LEVLFQ↓GP)。
额外的蛋白酶切割位点包括被非细胞毒性蛋白酶切割的识别序列，例如通过梭菌神经毒素的轻链切割。这些包括被非细胞毒性蛋白酶(例如梭菌神经毒素的轻链)切割的SNARE(例如SNAP-25，突触融合蛋白，VAMP)蛋白质识别序列。包含非天然蛋白酶裂解位点的梭菌神经毒素描述于US 7,132,259，EP 1206554-B2和US 2007/0166332中，所有这些文献全部通过引用并入本文。术语蛋白酶切割位点也包括内含肽，其是自切割序列。自剪接反应是可控制的，例如通过改变存在的还原剂的浓度。
本发明还包括使用包含“破坏性切割位点”的梭菌神经毒素。在所述梭菌神经毒素中，将非天然蛋白酶切割位点并入梭菌神经毒素中被选择的位置使得在所述位点的切割将降低梭菌神经毒素的活性或使其失活。在梭菌神经毒素施用后迁移至非靶位置的情况下，破坏性蛋白酶切割位点可能易受局部蛋白酶切割的影响。适当的非天然蛋白酶切割位点包括上述那些。包含破坏性切割位点的梭菌神经毒素描述于WO2010/094905和WO2002/044199中，两者均通过引用整体并入本文。
用于本发明的梭菌神经毒素可以被聚乙二醇化-这可以有助于增加稳定性，例如轻链组分的作用持续时间。当轻链包含BoNT/A，B或C1蛋白酶时，PEG化是特别优选的。PEG化优选包括向轻链组分的N-端添加PEG。举例来说，轻链的N-端可以用一个或多个可以相同或不同的氨基酸(例如半胱氨酸)残基延伸。所述氨基酸残基中的一个或多个可以将其自己的PEG分子连接(例如共价连接)于其上。在WO2007/104567中描述了该技术的一个实例，该专利通过引用整体并入本文。
在一个优选的实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以不含存在于天然存在的梭菌神经毒素复合物中的复合蛋白。
本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素是通过表达包含SEQ ID No.1，SEQ IDNo.3，SEQ ID No.5，SEQ ID No.7，SEQ ID No.9，SEQ ID No.11，SEQ ID No.13，SEQ IDNo.15，SEQ ID No.17，SEQ ID No.19，SEQ ID No.21的核酸或与其具有至少65％或70％序列同一性的核酸可获得的。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素是通过表达包含SEQ ID No.1，SEQ ID No.3，SEQ ID No.5，SEQ ID No.7，SEQ ID No.9，SEQ ID No.11，SEQ ID No.13，SEQID No.15，SEQ ID No.17，SEQ ID No.19，SEQ ID No.21的核酸或与其具有至少75％或80％序列同一性的核酸可获得的。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素是通过表达包含SEQ ID No.1，SEQ ID No.3，SEQ ID No.5，SEQ ID No.7，SEQ ID No.9，SEQ ID No.11，SEQ ID No.13，SEQID No.15，SEQ ID No.17，SEQ ID No.19，SEQ ID No.21的核酸或与其具有至少85％或90％序列同一性的核酸可获得的。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素是通过表达包含SEQ ID No.1，SEQ ID No.3，SEQ ID No.5，SEQ ID No.7，SEQ ID No.9，SEQ ID No.11，SEQ ID No.13，SEQID No.15，SEQ ID No.17，SEQ ID No.19，SEQ ID No.21的核酸或与其具有至少95％或99％序列同一性的核酸可获得的。
在一个实施方案中，本发明或用于本发明的梭菌神经毒素可包含如SEQ ID No.2，SEQ ID No.4，SEQ ID No.6，SEQ ID No.8，SEQ ID No.10，SEQ ID No.12，SEQ ID No.14，SEQ ID No.16，SEQ ID No.18，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22所示的多肽序列或与其具有至少65％或70％序列同一性的多肽序列。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可包含如SEQ ID No.2，SEQ IDNo.4，SEQ ID No.6，SEQ ID No.8，SEQ ID No.10，SEQ ID No.12，SEQ ID No.14，SEQ IDNo.16，SEQ ID No.18，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22所示的多肽序列或与其具有至少75％或80％序列同一性的多肽序列。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可包含如SEQ ID No.2，SEQ IDNo.4，SEQ ID No.6，SEQ ID No.8，SEQ ID No.10，SEQ ID No.12，SEQ ID No.14，SEQ IDNo.16，SEQ ID No.18，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22所示的多肽序列或与其具有至少85％或90％序列同一性的多肽序列。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可包含如SEQ ID No.2，SEQ IDNo.4，SEQ ID No.6，SEQ ID No.8，SEQ ID No.10，SEQ ID No.12，SEQ ID No.14，SEQ IDNo.16，SEQ ID No.18，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22所示的多肽序列或与其具有至少95％或99％序列同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素是通过表达包含SEQID No.3，SEQ ID No.13的核酸或与其具有至少65％或70％序列同一性的核酸可获得的。
适宜地，用于本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素是通过表达包含SEQ IDNo.3，SEQ ID No.13的核酸或与其具有至少75％或80％序列同一性的核酸可获得的。
适宜地，用于本发明的梭状神经毒素或用于本发明的梭状神经毒素是通过表达包含SEQ ID No.3，SEQ ID No.13的核酸或与其具有至少85％或90％序列同一性的核酸可获得的。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素是通过表达包含SEQ ID No.3，SEQ ID No.13的核酸或与其具有至少95％或99％序列同一性的核酸可获得的。
在一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可包含SEQ ID No.4，SEQ ID No.14所示的多肽序列或与其具有至少65％或70％序列同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可包含SEQ ID No.4，SEQ ID No.14所示的多肽序列或与其具有至少75％或80％序列同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可包含SEQ ID No.4，SEQ ID No.14所示的多肽序列或与其具有至少85％或90％序列同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可包含SEQ ID No.4，SEQ ID No.14所示的多肽序列或与其具有至少95％或99％序列同一性的多肽序列。
在另一个实施方案中，本发明或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子梭菌神经毒素，其是通过表达包含SEQ ID No.1，SEQ ID No.5，SEQ ID No.7，SEQ ID No.9，SEQ IDNo.11，SEQ ID No.15，SEQ ID No.17，SEQ ID No.19，SEQ ID No.21的核酸或与其具有至少65％或70％序列同一性的核酸可获得的。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子梭菌神经毒素，其是通过表达包含SEQ ID No.1，SEQ ID No.5，SEQ ID No.7，SEQ ID No.9，SEQ ID No.11，SEQ ID No.15，SEQ ID No.17，SEQ ID No.19，SEQ ID No.21的核酸或与其具有至少75％或80％序列同一性的核酸可获得的。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子梭菌神经毒素，其是通过表达包含SEQ ID No.1，SEQ ID No.5，SEQ ID No.7，SEQ ID No.9，SEQ ID No.11，SEQ ID No.15，SEQ ID No.17，SEQ ID No.19，SEQ ID No.21的核酸或与其具有至少85％或90％序列同一性的核酸可获得的。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子梭菌神经毒素，其是通过表达包含SEQ ID No.1，SEQ ID No.5，SEQ ID No.7，SEQ ID No.9，SEQ ID No.11，SEQ ID No.15，SEQ ID No.17，SEQ ID No.19，SEQ ID No.21的核酸或与其具有至少95％或99％序列同一性的核酸可获得的。
在另一个实施方案中，本发明或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子梭菌神经毒素，其包含如SEQ ID No.2，SEQ ID No.6，SEQ ID No.8，SEQ ID No.10，SEQ ID No.12，SEQ ID No.16，SEQ ID No.18，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22所示的多肽序列或与其具有至少65％或70％序列同一性的核酸。
适宜地，本发明或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子梭菌神经毒素，其包含如SEQ ID No.2，SEQ ID No.6，SEQ ID No.8，SEQ ID No.10，SEQ ID No.12，SEQ IDNo.16，SEQ ID No.18，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22所示的多肽序列或与其具有至少75％或80％序列同一性的核酸。
适宜地，本发明或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子梭菌神经毒素，其包含如SEQ ID No.2，SEQ ID No.6，SEQ ID No.8，SEQ ID No.10，SEQ ID No.12，SEQ IDNo.16，SEQ ID No.18，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22所示的多肽序列或与其具有至少85％或90％序列同一性的核酸。
适宜地，本发明或用于本发明的梭菌神经毒素可以是阳离子梭菌神经毒素，其包含如SEQ ID No.2，SEQ ID No.6，SEQ ID No.8，SEQ ID No.10，SEQ ID No.12，SEQ IDNo.16，SEQ ID No.18，SEQ ID No.20，SEQ ID No.22所示的多肽序列或与其具有至少95％或99％序列同一性的核酸。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“百分比序列同一性”是序列共享的相同位置的数目的函数。因此，同一性％可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数，乘以100。序列同一性％的计算还可以考虑空位数目和为优化两个或更多序列的比对而需要引入的每个空位的长度。序列比较和两个或更多个序列之间的百分比同一性的确定可以使用专业技术人员熟悉的特定数学算法，例如BLAST来进行。
术语“包含梭菌神经毒素的组合物”是指处于任何制备状态的任何此类组合物。
在一个实施方案中，包含梭菌神经毒素的组合物可具有至少约pH 7.3的pH值。适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可以具有至少约pH 7.4或pH 7.5的pH值。
适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可具有至少约pH 7.6或至少约pH 7.7的pH值。
适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可具有至少约pH 7.8或至少约pH 7.9的pH值。
适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可以具有至少约pH8.0的pH值。
在另一个实施方案中，包含梭菌神经毒素的组合物可具有约pH 7.3至约pH 9.5的pH。适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可具有约pH 7.5至约pH 9.0，或约pH 7.5至约pH8.5之间的pH。
适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可具有约pH 7.5的pH值。
适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可具有约pH8.0的pH值。
在一些实施方案中，包含梭菌神经毒素的组合物可以具有比其中包含的梭菌神经毒素的计算的等电点高-1个pH单位或更高的pH值。
适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可以具有比其中包含的梭菌神经毒素的计算的等电点高-0.5pH单位或更高的pH值。
适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可具有至少为其中包含的梭菌神经毒素的计算的等电点的pH值。
适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可以具有比其中包含的梭菌神经毒素的等电点高至少约0.2个pI单位或至少约0.5个pH单位的pH值。
在一个实施方案中，包含梭菌神经毒素的组合物可以具有在低于其中包含的梭菌神经毒素的计算的等电点约-1个pH单位至高于计算的等电点约2个pH单位之间的pH值。
适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可以具有在低于其中包含的梭菌神经毒素的计算的等电点约-0.5个pH单位至高于计算的等电点约1.5个pH单位之间的pH值。
适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可以具有在大约是其中包含的梭菌神经毒素的计算的等电点至高于计算的等电点约2个pH单位之间的pH值。
适宜地，包含梭菌神经毒素的组合物可以具有在高于其中包含的梭菌神经毒素的计算的等电点约0.2个pH单位与高于计算的等电点约1.5个pH单位之间的pH值之间。
优选地，包含梭菌神经毒素的组合物可以具有在高于其中包含的梭菌神经毒素的计算的等电点约0.5个pH单位至高于计算的等电点约1.5个pH单位之间的pH值。
在一些实施方案中，“包含梭菌神经毒素的组合物”可以是无细胞提取物和/或细胞裂解物。术语“无细胞提取物”意指提取物包含小于约5％细胞，更优选小于约1％或0.1％细胞/提取物的总体积。
无细胞提取物和/或细胞裂解物是可从表达编码梭菌神经毒素的核苷酸序列(例如本文的一个或多个核苷酸序列)的宿主细胞获得的。在一个实施方案中，宿主细胞可以是大肠杆菌宿主细胞。
细胞裂解物可以在细胞糊的裂解后获得。可以使用本领域已知的任何方法裂解细胞糊。例如，细胞裂解可以使用超声处理来实现，适宜地在至少一种核酸酶(例如可从Sigma-Aldrich商购的)存在下。
在制备细胞裂解物后，所述细胞裂解物可以进行缓冲液交换。这可以使用本领域技术人员已知的任何适当的方法来进行。例如，这可以使用脱盐柱或用适当的透析膜和缓冲液进行透析来进行。适当的脱盐柱的实例可以包括Econo-Pac 10DG脱盐柱(可从Bio-Rad商购获得)。
在其他实施方案中，“包含梭菌神经毒素的组合物”可以是可从一个或多个在先纯化步骤(即在获得组合物之前进行的纯化步骤)获得(例如获得)的组合物。先前的纯化步骤可以是本领域已知的任何纯化步骤，优选已知适用于纯化梭菌神经毒素的纯化步骤。先前的纯化步骤可以是选自层析纯化步骤、基于沉淀的纯化步骤(例如硫酸铵沉淀)和结晶纯化步骤中的一种或多种。
在一些实施方案中，根据本发明的方法和/或用途可以包括使阳离子交换树脂与包含梭菌神经毒素的组合物接触的第一纯化步骤(例如第一层析步骤)。
在其他实施方案中，该方法和/或用途可以包括一个或多个纯化步骤。一个或多个纯化步骤可以在阳离子交换残基与包含梭菌神经毒素的组合物接触之前或之后进行。适宜地，所述一个或多个纯化步骤可以在阳离子交换残基与包含梭菌神经毒素的组合物接触后进行。
一个或多个纯化步骤可以选自：层析纯化步骤和基于沉淀的纯化步骤(例如硫酸铵沉淀)。
如本文所用的术语“层析纯化步骤”可以指选自：疏水相互作用层析法、离子交换层析法(例如阳离子交换或阴离子交换层析法)、混合模式层析法、疏水电荷诱导层析法、凝胶过滤层析和亲和层析中的一种或多种。
在一个实施方案中，层析纯化步骤可以包括使用混合模式层析法，适宜地使用羟基磷灰石树脂。适宜地，羟基磷灰石树脂可以是羟基磷灰石I和/或羟基磷灰石II树脂。这样的树脂是可商购的(例如来自GE Healthcare，UK)。
在另一个实施方案中，层析纯化步骤可以是阳离子交换层析法。阳离子交换层析可以涉及使用强阳离子交换树脂和/或弱阳离子交换树脂。
适宜地，强阳离子交换树脂可以是包含磺酸的树脂。
适宜地，弱阳离子交换树脂可以是包含羧甲基的树脂。
在另一个实施方案中，层析纯化步骤可以是阴离子交换层析法。阴离子交换层析可涉及使用强阴离子交换树脂和/或弱阴离子交换树脂。
强阴离子交换树脂的实例包括包含季铵的那些，例如Q,QCeramicF,with Mustang Q,AcroPrepTM with Mustang Q,AcroSepTMwith Q CeramicF,Q and S HyperCel和/或HyperCel STAR AX(所有这些都可从Pall Corporation,25 Harbor Park Drive,Port Washington,NY 11050,USA购得)。
弱阴离子交换树脂的实例包括包含羧甲基的那些，例如CM Ceramic F,AcroSep with CM Ceramic和/或F(所有这些都可从Pall Corporation,25Harbor Park Drive,Port Washington,NY 11050,USA购得)。
在层析纯化步骤是凝胶过滤步骤的实施方案中，适宜地，树脂可以是Superdex200树脂(可从GE Healthcare UK商购获得)。
在层析纯化步骤是疏水性相互作用步骤的实施方案中，适宜地，树脂可以是苯基FF树脂、辛基FF树脂和/或丁基FF树脂(可从GE Healthcare UK商购获得)。
在层析纯化步骤是亲和层析步骤的实施方案中，适宜地，树脂可以选自：谷胱甘肽树脂、链霉亲和素树脂、生物素树脂、螯合金属树脂、糊精琼脂糖树脂和IgG树脂(可从GEHealthcare UK商购获得)。
在一些实施方案中，层析纯化步骤可以是抗体亲和层析步骤。
在一些实施方案中，所述方法或用途可包括将肉毒杆菌神经毒素从单链形式转化为双链形式(活化步骤)的步骤。在使梭菌神经毒素与阳离子交换树脂接触之后适宜地进行梭菌神经毒素的活化。更优选地，活化步骤可以在梭菌神经毒素从阳离子交换树脂分离后进行。
可以通过在适当的蛋白酶可切割梭菌神经毒素的多肽序列的条件下使梭菌神经毒素与适当的蛋白酶接触(并任选温育)来活化梭菌神经毒素。
在一个实施方案中，适当的蛋白酶可以是能够切割梭菌神经毒素多肽序列从而使其变得活化的内切蛋白酶。
在一个实施方案中，根据本发明使用的内切蛋白酶可以是Lys-C蛋白酶。适当的Lys-C蛋白酶可以是在WO2014/079495或WO2014/080206中教导的，这两篇文献通过引用并入本文。
Lys-C蛋白酶可以从任何适当的来源获得并且可以从英国的Life TechnologiesLtd商购获得。
在更优选的实施方案中，本发明的方法和/或用途可以备选地和/或另外地包含疏水相互作用层析。
因此，在一个优选的实施方案中，提供了本发明的方法和/或用途，其进一步包含(或进一步组成为)使用Lys-C和疏水相互作用层析活化梭菌神经毒素。
优选地，疏水作用层析可包括使用选自丁基琼脂糖凝胶树脂、苯基琼脂糖凝胶树脂和辛基琼脂糖凝胶树脂中的一种或多种。
本发明包括使阳离子交换树脂与包含梭菌神经毒素的组合物接触。
当提及使阳离子交换树脂与包含梭菌神经毒素的组合物接触的步骤时，术语“接触”旨在包括促进阳离子交换树脂与梭菌神经毒素缔合的任何已知方法。例如，接触步骤可以通过将阳离子交换树脂与包含梭菌神经毒素的组合物在适当的条件下温育适当的时间来进行。适当的温育条件可包括搅动的存在或被选择用于增强蛋白质稳定性和/或维持活性的适当温度。
在一个实施方案中，接触步骤可以通过将包含梭菌神经毒素的组合物应用于包含阳离子交换树脂的柱来进行。适宜地，可以通过使用自动或半自动方法进行接触，例如通过使用设计用于自动液相层析(例如快速蛋白质液相层析)的系统。
在另一个实施方案中，包含梭菌神经毒素的组合物可以与阳离子交换树脂混合。适宜地，所述混合物可以在适当的温度和/或时间下温育以促进结合。在一些实施方案中，可以搅拌混合物。在其他实施方案中，纯化柱可以从混合物中制备并进行常规液相层析技术(例如包括洗涤和/或洗脱)。
在一个实施方案中，“缔合”可以适宜地是基于电荷的相互作用或缔合。适宜地，“缔合”可以是能够经受使与梭菌神经毒素缔合的阳离子交换树脂暴露于一种或多种洗涤缓冲液的相互作用。术语“洗涤缓冲液”是指本领域技术人员制备的一种或多种用于破坏不需要的污染物蛋白质(适宜地非梭菌神经毒素的蛋白质)与阳离子交换树脂结合的缓冲液。通常，可制备洗涤缓冲液，使其足够严格以破坏不需要的污染物蛋白质(适宜地非梭菌神经毒素的蛋白质)与阳离子交换树脂的结合，而不显著破坏梭菌神经毒素与阳离子交换树脂的结合。
具有至少约pH 7.3的pH的缓冲液可用于本发明中。适宜地，本发明中可使用具有至少约pH 7.5的pH的缓冲液。
正确pH的溶液是本领域技术人员已知的并且可以用任何适当的缓冲液制备。在一个实施方案中，缓冲液可以包含：双-Tris(丙烷)，双-Tris(甲烷)，Tris，HEPES或柠檬酸磷酸盐。适宜地，缓冲液可以包含Bis-Tris(丙烷)。技术人员可以选择任何适当的摩尔浓度的缓冲液。适宜地，摩尔浓度可以约为50mM。
在一个实施方案中，用于本发明的缓冲液可具有至少约pH 7.3(适宜地至少约pH7.4或pH 7.5)的pH值。
适宜地，用于本发明的缓冲液可具有至少约pH 7.6或至少约pH 7.7的pH值。
适宜地，用于本发明的缓冲液可具有至少约pH7.8或至少约pH7.9的pH值。
适宜地，用于本发明的缓冲液可具有至少约pH8.0的pH值。
在另一个实施方案中，用于本发明的缓冲液可具有约pH 7.3至约pH 9.5的pH。适宜地，用于本发明的缓冲液可具有约pH 7.5至约pH 9.0或约pH 7.5至约pH 8.5之间的pH。
适宜地，用于本发明的缓冲液可具有约pH 7.5的pH值。
适宜地，用于本发明的缓冲液可具有约pH8.0的pH值。
本发明的用途包括具有比梭菌神经毒素(例如所述用途的主体的梭菌神经毒素)的计算的等电点高-1个pH单位或更高的pH值的缓冲液的用途。
涉及的pH值可以是当阳离子交换树脂与包含梭菌神经毒素的组合物接触时测量的pH值，例如包含阳离子交换剂和包含梭菌神经毒素的组合物的混合物的溶液的pH值。
本发明可以涉及使用具有比梭菌神经毒素的计算的pI高-1个pH单位或更高的pH值的缓冲液。
正确pH的溶液是本领域技术人员已知的并且可以用任何适当的缓冲液制备。在一个实施方案中，缓冲液可以包含：双-Tris(丙烷)，双-Tris(甲烷)，Tris，HEPES或柠檬酸磷酸盐。适宜地，缓冲液可以包含Bis-Tris(丙烷)。技术人员可以选择任何适当的摩尔浓度的缓冲液。适宜地，摩尔浓度可以约为50mM。
适宜地，用于本发明的pH值可以是比梭菌神经毒素的计算的等电点高-0.5个pH单位或更高的pH值。
在一个实施方案中，用于本发明的pH值可以至少是梭菌神经毒素的计算的等电点。
适宜地，pH值可以比梭菌神经毒素的计算的等电点高至少约0.2pI单位或至少约0.5个pH单位。
在一个实施方案中，pH值可以是在低于梭菌神经毒素的计算的等电点约-1个pH单位至高于计算的等电点约2个pH单位之间。
适宜地，pH值可以是在低于梭状神经毒素的计算的等电点约-0.5个pH单位至高于计算的等电点约1.5个pH单位之间。
适宜地，pH值可以是在大约梭菌神经毒素的计算的等电点至高于计算的等电点约2个pH单位之间。
适宜地，pH值可以是在梭菌神经毒素的计算的等电点以上约0.2个pH单位至在计算的等电点以上约1.5个pH单位之间。
优选地，pH值可以在梭菌神经毒素的计算的等电点以上约0.5个pH单位至在计算的等电点以上约1.5个pH单位之间。
在一个实施方案中，用于本发明的缓冲液可具有至少约pH 5.0，适宜地至少约pH6.0的pH值。
在另一个实施方案中，用于本发明的缓冲液可具有至少约pH 6.5，至少约pH 7.0或至少约pH 7.5的pH值。
优选地，用于本发明的缓冲液可具有至少约pH8.0的pH值。
在一个实施方案中，用于本发明的缓冲液可具有约pH5.0至约pH9.5之间的pH值，适宜地在约pH6.0至约pH9.5之间。
适合地，用于本发明的缓冲液可具有约pH5.0至约pH9.0之间的pH值，适宜地在约pH6.0至约pH9.0之间。
在另一个实施方案中，用于本发明的缓冲液可具有约pH6.5至约pH8.5之间，适宜地约pH7.0至约pH8.0之间的pH值。
在一个实施方案中，用于本发明的缓冲液可具有约pH6.0的pH值，适宜地约pH6.5或约pH7.0。
在另一个实施方案中，用于本发明的缓冲液可具有约pH 7.5的pH值。
优选用于本发明的缓冲液可具有约pH 8.0的pH值。
等电点(pI)是给定蛋白质的特定性质。如本领域众所周知的，蛋白质由氨基酸(当在蛋白质中时也称为氨基酸残基)的特定序列制成。二十个标准组中的每个氨基酸具有不同的侧链(或R基团)，这意味着蛋白质中的每个氨基酸残基显示不同的化学性质，例如电荷和疏水性。这些特性可能会受到周围化学环境的影响，如温度和pH值。蛋白质的总体化学特征将取决于这些各种因素的总和。
某些氨基酸残基(描述如下)具有可离子化的侧链，其可根据周围的pH值显示电荷。在给定pH下这种侧链是否带电取决于相关可电离部分的pKa，其中pKa是来自共轭碱的特定质子的酸解离常数(Ka)的负对数。
例如，酸性残基如天冬氨酸和谷氨酸具有pKa值约为4.1的侧链羧酸基团(确切的pKa值可能取决于温度、离子强度和可电离基团的微环境)。因此，这些侧链在pH 7.4(通常称为“生理pH”)下呈现出负电荷。在低pH值时，这些侧链会变成质子并失去电荷。
相反，碱性残基如赖氨酸和精氨酸具有含氮侧链基团，其pKa值约为10-12。因此这些侧链在7.4的pH下呈现正电荷。这些侧链将变为去质子化并在高pH值下失去电荷。
因此，蛋白质分子的总(净)电荷取决于蛋白质中存在的酸性和碱性残基的数量(以及它们的表面暴露程度)和周围pH值。改变周围的pH值会改变蛋白质的总电荷。因此，对于每种蛋白质，都有一个给定的pH值，在这个pH值下，正电荷和负电荷的数量是相等的，并且蛋白质不显示总净电荷。这一点被称为等电点(pI)。等电点是技术人员熟悉的蛋白质生物化学中的标准概念。
等电点(pI)因此被定义为蛋白质显示净电荷为零的pH值。pI的增加意味着蛋白质需要更高的pH值以显示净电荷为零。因此，pI的增加表示给定pH下蛋白质的净正电荷的增加。相反，pI的降低意味着蛋白质需要较低的pH值以显示净电荷为零。因此，pI的降低表示给定pH下蛋白质净正电荷的降低。
确定蛋白质的pI的方法是本领域已知的并且对于本领域技术人员来说是熟悉的。举例来说，可以从蛋白质中存在的每个氨基酸的平均pKa值计算蛋白质的pI(“计算的pI”)。这种计算可以使用本领域已知的计算机程序来执行；用于计算pI值的优选的示例计算机程序包括来自Scripps Research Institute的Protein Calculator和来自ExPASy的ComputepI/MW Tool。应使用相同的计算技术/程序对不同分子之间的pI值进行比较。
在特别优选的实施方案中，“计算的pI”可以指使用Scripps Protein Calculatorv3.4计算的pI，其是可在www.scripps.edu/～cdputnam/protcalc获得的在线工具(其内容通过引用并入本文)。
在适当的情况下，可以使用等电聚焦技术(“观察的pI”)通过实验确认蛋白质的计算pI。该技术根据其pI使用电泳分离蛋白质。等电聚焦通常使用具有固定化pH梯度的凝胶进行。当施加电场时，蛋白质通过pH梯度迁移直至达到其具有零净电荷的pH，这一点是蛋白质的等电点。等电聚焦所提供的结果本质上通常是相对低分辨率的，因此本发明人认为由计算的pI提供的结果(如上所述)更适合于使用。
在整个本说明书中，除非另有说明，否则“pI”是指“计算的pI”。
通过改变其表面上显示的碱性和/或酸性基团的数量可以增加或减少蛋白质的pI。这可以通过修饰蛋白质的一个或多个氨基酸来实现。例如，可以通过减少酸性残基的数量或通过增加碱性残基的数量来提供pI的增加。下面将更详细地讨论这种氨基酸修饰。
举例来说，BoNT/A(SEQ ID No.14)的计算的pI是6.4。还为在WO2015/004461中教导的阳离子BoNT：Cat-A，Cat-B和Cat-C；以及Cat HN_v1，Cat HN_v2和Cat HN_v3提供了计算的pI。
参考被纯化的梭菌毒素的pI来实现用于本发明的pH的确定。例如，如果纯化的对象是具有计算的pI为7.4的阳离子rBoNT/A(SEQ ID No.2)，则用于本发明的pH值为pH 6.4或更高。同样，如果具有pI为7.3的“Cat-A”(SEQ ID No.16)，则用于本发明的pH值约为pH6.3或更高。
表1.一些梭菌神经毒素的计算的pI值。
在蛋白质中发现的20种标准氨基酸如表2所示。
表2.氨基酸
以下氨基酸被认为是带电荷的氨基酸：天冬氨酸(负的)、谷氨酸(负的)、精氨酸(正的)和赖氨酸(正的)。
在7.4的pH下，天冬氨酸(pKa 3.1)和谷氨酸(pKa 4.1)的侧链具有负电荷，而精氨酸(pKa 12.5)和赖氨酸(pKa 10.8)的侧链具有正电荷。天冬氨酸和谷氨酸被称为酸性氨基酸残基。精氨酸和赖氨酸被称为碱性氨基酸残基。
下列氨基酸被认为是不带电的、极性的(意味着它们可以参与氢键)氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
以下氨基酸被认为是不带电的疏水性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
根据本发明的方法和/或用途适宜地导致梭菌神经毒素的结合和/或产量提高。适宜地，可以通过比较使用本发明的方法和/或用途与类似的方法和/或用途获得的结合和/或产量来确定“增加的结合和/或产量”，所述类似的方法和/或用途利用与本发明不同的pH值，但在其他方面相同。
本文上下文所用的术语“结合”是指梭菌神经毒素与阳离子交换树脂的结合。结合梭菌神经毒素的浓度可以通过比较起始组合物中梭菌神经毒素接触阳离子交换树脂之前的浓度和保留在已与阳离子交换树脂接触的溶液中的梭菌神经毒素的浓度(如果有的话)来确定。在一些实施方案中，可以将起始组合物中梭菌神经毒素的浓度与代表组合物中不与阳离子交换树脂缔合的蛋白质的流通级分中的梭菌神经毒素的浓度进行比较。
本发明的方法和/或用途可实现组合物中包含的总梭菌神经毒素的至少约50％的结合。适宜地，所述方法和/或用途可实现组合物中包含的总梭菌神经毒素的至少约60％或70％的结合。
适宜地，所述方法和/或用途可实现组合物中包含的总梭菌神经毒素的至少约80％或90％的结合。优选至少约95％、97％或99％的结合。
如本文所用的术语“产量”是指在实施本发明的方法和/或用途后获得的梭菌神经毒素的量(例如浓度)。在一些实施方案中，可以通过比较起始组合物中梭菌神经毒素的量(例如浓度)与存在于从阳离子交换树脂洗脱的级分中的梭菌神经毒素的量(例如浓度)来计算“产量”。
本发明的方法和/或用途可进一步包括从阳离子交换残基分离梭菌神经毒素。这在本文可以被称为“洗脱”。分离可以通过使用适当的洗脱缓冲液来实现。典型地对于离子交换层析法(例如阳离子交换层析法)，设计缓冲液，其包含适当浓度的适当的盐，所述盐从离子交换树脂(例如阳离子交换树脂)中置换结合的蛋白质。
在一些实施方案中，与阳离子交换树脂缔合的梭菌神经毒素可以暴露于洗脱缓冲液。然后适宜地可以从阳离子交换树脂中分离任何溶液。例如，当使用柱时，可以收集一个或多个级分。
因此，在一个实施方案中，提供了包含在洗脱缓冲液中的梭菌神经毒素。
在另一个实施方案中，提供了包含在洗脱缓冲液中的纯化中间体。
在又一个实施方案中，提供了可通过包含在洗脱缓冲液中的本发明的方法和/或用途获得的梭菌神经毒素。
在一个实施方案中，可以将梯度浓度的洗脱缓冲液施加至与梭菌神经毒素缔合的阳离子交换树脂。该梯度可以通过将具有所需盐浓度(例如，高于梭菌神经毒素从阳离子交换树脂洗脱的浓度的盐浓度)的洗脱缓冲液与一种或多种具有不同的(如较低)盐浓度的另外的缓冲液混合来制备。
在一些实施方案中，从阳离子交换树脂分离的梭菌神经毒素可以处于基本上纯的状态。
如本文所用，术语“纯的状态”意指其中梭菌神经毒素不含非梭菌神经毒素污染物(例如蛋白质污染物)的状态。
如本文所用的术语“基本上纯的”意指在给定组合物中梭菌神经毒素大部分不含非梭菌神经毒素污染物(例如蛋白质污染物)且占总蛋白质浓度的至少约85％、90％或95％。适宜地，梭菌神经毒素可以占总蛋白质浓度的至少约97％、99％或99.9％。
因此，本发明提供了通过本发明的方法或用途可获得(例如获得)的梭菌神经毒素。适宜地，梭菌神经毒素可以是基本上纯的梭菌神经毒素。
在一个实施方案中，本发明提供了包含与阳离子交换树脂缔合的梭菌神经毒素的纯化中间体，其中纯化中间体具有至少pH 7.3的pH值。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含已从阳离子交换树脂分离的梭菌神经毒素的纯化中间体，其中纯化中间体具有至少pH 7.3的pH值。
在一个实施方案中，纯化中间体可以具有至少约pH 7.3(适宜地至少pH 7.4或pH7.5)的pH值。
适宜地，纯化中间体可具有至少约pH 7.6或至少约pH 7.7的pH值。
适宜地，纯化中间体可以具有至少约pH7.8或至少约pH7.9的pH值。
适宜地，纯化中间体可以具有至少约pH8.0的pH值。
在另一个实施方案中，纯化中间体可具有约pH 7.5至约pH 9.5的pH。适宜地，纯化中间体可具有约pH 7.5至约pH 9.0，或约pH 7.5至约pH 8.5之间的pH。
适宜地，纯化中间体可具有约pH 7.5的pH值。
适宜地，纯化中间体可具有约pH8.0的pH值。
本文使用的术语“纯化中间体”旨在指已经过或处于正在进行至少一个纯化步骤但未进行技术人员所期望的所有纯化步骤的过程中的梭菌神经毒素。在一些实施方案中，纯化中间体可以处于基本上纯的状态。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是从本发明的纯化中间体可获得的(例如获得)。适宜地，梭菌神经毒素可以处于基本上纯的状态。
根据本发明的纯化中间体和/或梭菌神经毒素可以与可通过替代方法获得的纯化中间体和/或梭菌神经毒素，至少通过缓冲液的pH值区分开，所述纯化中间体和/或梭菌神经毒素包含在所述缓冲液中。
换句话说，其中根据本发明的纯化中间体和/或梭菌神经毒素可以具有至少约pH7.3的pH值的缓冲液。适宜地，缓冲液可以具有至少pH 7.3的pH值，并且还包含与阳离子交换洗脱缓冲液一致的盐浓度。
洗脱缓冲液可包含以下一种或多种：NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2和(NH4)2SO4。
在一个实施方案中，这种缓冲液可以具有至少约pH 7.3的pH值，并且可以包含至少约50mM NaCl或至少约100mM NaCl。
在另一个实施方案中，这种缓冲液可以具有至少约pH 7.3的pH值，并且可以包含至少约200mM NaCl或至少约300mM NaCl(适宜地至少约400mM NaCl或至少约500mM NaCl)。
在一个实施方案中，这种缓冲液可以具有至少约pH 7.3的pH值，并且可以包含至少约50mM KCl或至少约100mM KCl。
在另一个实施方案中，这种缓冲液可以具有至少约pH 7.3的pH值，并且可以包含至少约200mM KCl或至少约300mM KCl(适宜地至少约400mM KCl或至少约500mM KCl)。
在一个实施方案中，这种缓冲液可具有至少约pH 7.3的pH值，并可包含至少约50mM CaCl2或至少约100mM CaCl2。
在另一个实施方案中，这种缓冲液可以具有至少约pH 7.3的pH值，并且可以包含至少约200mM CaCl2或至少约300mM CaCl2(适宜地至少约400mM CaCl2或至少约500mMCaCl2)。
在一个实施方案中，这种缓冲液可具有至少约pH 7.3的pH值，并可包含至少约50mM MgCl2或至少约100mM MgCl2。
在另一个实施方案中，这种缓冲液可以具有至少约pH 7.3的pH值，并且可以包含至少约200mM MgCl2或至少约300mM MgCl2(适宜地至少约400mM MgCl2或至少约500mMMgCl2)。
在一个实施方案中，这种缓冲液可以具有至少约pH 7.3的pH值，并且可以包含至少约50mM(NH4)2SO4或至少约100mM(NH4)2SO4。
在另一个实施方案中，这种缓冲液可以具有至少约pH 7.3的pH值并且可以包含至少约200mM(NH4)2SO4或至少约300mM(NH4)2SO4(适宜地至少约400mM(NH4)2SO4或至少约500mM(NH4)2SO4。
用于本发明的缓冲液可优选进一步包含50mM Bis-Tris丙烷pH 8.0。
当根据本发明从阳离子交换残基洗脱时，可以将包含50mM Bis-Tris丙烷pH8.0的缓冲液与约0至约500mM盐的洗脱梯度组合使用。适宜地，盐可以选自NaCl、KCl、CaCl2，MgCl2和(NH4)2SO4)(优选NaCl)。
具有比用于本发明用途的梭菌神经毒素的计算的pI高-1个pH单位或更高的pH值的缓冲液可以是洗脱缓冲液。洗脱缓冲液可包含以下一种或多种：NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2和(NH4)2SO4。
在一个实施方案中，这种缓冲液可以具有比梭菌神经毒素的计算的pI高至少-1个pH单位或更高的pH值，并且可以包含至少约50mM NaCl或至少约100mM NaCl。
在另一个实施方案中，这种缓冲液可以具有比梭菌神经毒素的计算的pI高至少-1个pH单位或更高的pH值，并且可以包含至少约200mM NaCl或至少约300mM NaCl(适宜地至少约400mM NaCl或至少约500mM NaCl)。
在一个实施方案中，这种缓冲液可以具有比梭菌神经毒素的计算的pI高至少-1个pH单位或更高的pH值，并且可以包含至少约50mM KCl或至少约100mM KCl。
在另一个实施方案中，这种缓冲液可以具有比梭菌神经毒素的计算的pI高至少-1个pH单位或更高的pH值，并且可以包含至少约200mM KCl或至少约300mM KCl(适宜地至少约400mM KCl或至少约500mM KCl)。
在一个实施方案中，这种缓冲液可以具有比梭菌神经毒素的计算的pI高至少-1个pH单位或更高的pH值，并且可以包含至少约50mM CaCl2或至少约100mM CaCl2。
在另一个实施方案中，这种缓冲液可以具有比梭菌神经毒素的计算的pI高至少-1个pH单位或更高的pH值，并且可以包含至少约200mM CaCl2或至少约300mM CaCl2(适宜地至少约400mM CaCl2或至少约500mM CaCl2)。
在一个实施方案中，这种缓冲液可以具有比梭菌神经毒素的计算的pI高至少-1个pH单位或更高的pH值，并且可以包含至少约50mM MgCl2或至少约100mM MgCl2。
在另一个实施方案中，这种缓冲液可以具有比梭菌神经毒素的计算的pI高至少-1个pH单位或更高的pH值，并且可以包含至少约200mM MgCl2或至少约300mM MgCl2(适宜地至少约400mM MgCl2或至少约500mM MgCl2)。
在一个实施方案中，这种缓冲液可以具有比梭菌神经毒素的计算的pI高至少-1个pH单位或更高的pH值，并且可以包含至少约50mM(NH4)2SO4或至少约100mM(NH4)2SO4。
在另一个实施方案中，这种缓冲液可以具有比梭菌神经毒素的计算的pI高至少-1个pH单位或更高的pH值，并且可以包含至少约200mM(NH4)2SO4或至少约300mM(NH4)2SO4(适宜地至少约400mM(NH4)2SO4或至少约500mM(NH4)2SO4)。
用于本发明的缓冲液可优选进一步包含50mM Bis-Tris丙烷pH 8.0。
当根据本发明从阳离子交换残基洗脱时，可以将包含50mM Bis-Tris丙烷pH8.0的缓冲液与约0至约500mM盐的洗脱梯度组合使用。适宜地，盐可以选自NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2和(NH4)2SO4(优选NaCl)。
序列同源性
可以使用各种序列比对方法中的任一种来确定百分比同一性，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如片段接近方法。确定百分比同一性的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开始到结束比对序列，并通过累加单个残基对的分数并施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，参见例如JulieD.Thompson等人，CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of Progressive MultipleSequence Alignment Through Sequence Weighting，Position-Specific Gap Penaltiesand Weight Matrix Choice，22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代改进，参见例如Osamu Gotoh，Significant Improvement in Accuracy of MultipleProtein。Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Referenceto Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过识别由所有输入序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括例如Match-box，参见例如Eric Depiereux and Ernest Feytmans,Match-Box:A Fundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501-509(1992)；Gibbs sampling，参见例如C.E.Lawrence等人，Detecting SubtleSequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见例如Ivo Van WaIIe等人，Align-M-A NewAlgorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。
因此，通过常规方法确定序列同一性百分比。参见，例如，Altschul等人，Bull.Math.Bio.48:603-16,1986和Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-19,1992。简言之，使用空位开放罚分为10，空位延伸罚分为1和Henikoff和Henikoff的“blosum 62”评分矩阵(同上)对两个氨基酸序列进行比对以优化比对评分，如下所示(氨基酸由标准的单字母密码表示)。
用于确定序列同一性的比对评分
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A 4
R -1 5
N -2 0 6
D -2 -2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -3 5
E -1 0 0 2 -4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
然后计算百分比同一性如下：
相同匹配的总数
_________________________________________x 100
[更长序列的长度加上为比对两个序列而引入到更长序列中的空位数]
基本上同源的多肽被表征为具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些改变优选具有次要性质，即保守性氨基酸取代(见下文)和不显著影响多肽折叠或活性的其他取代；小的缺失，通常为一至约30个氨基酸；和小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基，最多约20-25个残基的小接头肽或亲和标签。
保守性氨基酸取代
碱性： 精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性： 谷氨酸
天冬氨酸
极性： 谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水的： 亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳族： 苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小的： 甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
除了20种标准氨基酸之外，可以用非标准氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸，不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可取代梭菌多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸，2,4-亚甲基-脯氨酸，顺式-4-羟基脯氨酸，反式-4-羟基脯氨酸，N-甲基甘氨酸，别苏氨酸，甲基-苏氨酸，羟乙基半胱氨酸，羟乙基高半胱氨酸，硝基谷氨酰胺，高谷氨酰胺，哌可酸，叔亮氨酸，正缬氨酸，2-氮杂苯丙氨酸，3-氮杂苯丙氨酸，4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域已知几种将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质的方法。例如，可以使用体外系统，其中使用化学氨酰化抑制子tRNA抑制无义突变。合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译在包含大肠杆菌S30提取物和市售酶和其他试剂的无细胞系统中进行。蛋白质通过层析法纯化。例如参见Robertson等人，J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman等人，Methods Enzymol.202:301,1991；Chung等人，Science 259:806-9,1993；和Chung等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变mRNA和化学氨酰化抑制子tRNA在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等人，J.Biol.Chem.271：19991-8,1996)。在第三种方法中，在不存在待替换的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)的情况下并且在存在期望的非天然存在的氨基酸(例如2-3-氮杂苯丙氨酸，4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸掺入多肽中以取代其天然对应物。参见Koide等人，Biochem.33：7470-6,1994。天然存在的氨基酸残基可通过体外化学修饰转化为非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变组合以进一步扩展取代的范围(Wynn和Richards，Protein Sci.2：395-403,1993)。
有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本发明多肽的氨基酸残基。
本发明多肽中的必需氨基酸可根据本领域已知的方法如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，Science 244：1081-5,1989)进行鉴定。生物相互作用的位点也可以通过结构的物理分析确定，如通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记等技术结合推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等人，Science 255：306-12,1992；Smith等人，J.Mol.Biol.224：899-904,1992；Wlodaver等人，FEBS Lett.309:59-64,1992。必需氨基酸的同一性也可以通过分析与本发明多肽的相关组分(例如易位或蛋白酶组分)的同源性来推断。
可以使用已知的诱变和筛选方法，如由Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241：53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-6,1989)公开的那些来进行并测试多个氨基酸取代。简言之，这些作者公开了用于同时使多肽中的两个或更多个位置随机化，选择功能性多肽，然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置处的可允许取代的范围的方法。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人，Biochem.30：10832-7,1991；Ladner等人，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO公开WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人，Gene 46：145,1986；Ner等人，DNA 7：127,1988)。
可以使用已知的诱变和筛选方法，如由Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241：53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-6,1989)公开的那些来进行并测试多个氨基酸取代。简言之，这些作者公开了用于同时使多肽中的两个或更多个位置随机化，选择功能性多肽，然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置处的可允许取代的范围的方法。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人，Biochem.30：10832-7,1991；Ladner等人，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO公开WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人，Gene 46：145,1986；Ner等人，DNA 7：127,1988)。
优点
根据前述实施方案，本发明人的开创性的发现是梭菌神经毒素能够在至少pH 7.3的pH值下与阳离子交换树脂相互作用。这是意想不到的，因为(不希望受理论束缚)这种梭菌神经毒素所处pH值高于其计算的pI并且被认为具有总体负电荷。因此，能够与已知与带正电荷的蛋白质缔合的阳离子交换树脂相互作用(尤其是具有如此高的结合效率)是非常令人惊奇的。
本发明的另一个优点是在整个纯化过程中可以保持相同的pH值。换句话说，对耗时的缓冲剂变化(在使用pH值小于pH 7.3的类似方法中)的需要减少和/或消除，从而提高了效率和/或通过量。另外或备选地，在整个纯化过程中保持相同的pH有利地意味着包含梭菌神经毒素和/或纯化中间体和/或梭菌神经毒素的组合物的物理操作减少。
包括使阳离子交换树脂与包含梭菌神经毒素的组合物接触的用途导致许多改进的性质，其中所述接触在是高于所述梭菌神经毒素的计算的等电点-1个pH单位或更高的pH下发生。例如，与其中接触不在是高于所述梭菌神经毒素的计算的等电点-1个pH单位或更高的pH下发生的类似用途相比，此类用途实现梭菌神经毒素的增加的结合和/或产量。
不希望受理论束缚，相信通过在指示的pH条件下接触梭菌神经毒素和阳离子交换柱，梭菌神经毒素与阳离子交换柱的增加的结合防止了组合物中存在的污染物(例如蛋白质污染物)结合梭菌毒素并因此与梭菌毒素共洗脱。
梭菌神经毒素与阳离子交换树脂的增强结合也提高了纯化效率，导致与每次纯化相关的产量增加和/或成本降低。换句话说，提供了更少浪费和/或更经济的纯化方法。
本发明的方法和/或用途有利地意味着需要采用更少的纯化步骤来获得适用于治疗和/或药物等级的梭菌神经毒素。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY，第20版，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale&Marham，THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)向本领域技术人员提供了在本公开中使用的许多术语的通用词典。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本公开的实施方案的实践或测试中。数字范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5'至3'的方向从左至右书写；氨基酸序列从氨基到羧基方向从左到右书写。
本文提供的标题不是对本公开的各个方面或实施方式的限制，其可以作为对说明书整体参考。因此，下面直接定义的术语通过参考说明书整体更全面地定义。
氨基酸在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写进行引用。
如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，可以使用用于氨基酸残基的常规单字母和三字母编码。根据IUPACIUB生化命名联合委员会(JCBN)定义氨基酸3字母代码。还应理解的是，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一个核苷酸序列编码。
术语的其他定义可以在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应该理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应理解的是，这里使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限制。
在提供数值范围的情况下，应该理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限单位的十分之一)也被具体公开。在所述范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围包含在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在外，并且其中上限和下限中任一个、没有一个或两个都包括在较小范围内的每个范围也包含在本公开内容中，受制于规定的范围中任何特别排除的范围。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除这些被包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，对“一个梭菌神经毒素”的提及包括多种这样的候选剂，并且对“该梭菌神经毒素”的引用包括对本领域技术人员已知的一种或多种梭菌神经毒素及其等同物的引用等等。
本文讨论的出版物仅在本申请的提交日期之前被提供用于其公开。本文中任何内容都不应被解释为承认这些出版物构成了所附权利要求的现有技术。
现在将参照下面的附图和实施例仅以举例的方式描述本发明。
实施例
实施例1-宿主培养和可溶性rBoNT/A蛋白质的表达
使用以含有rBoNT/A DNA序列(SEQ ID No.1或3)的表达载体转化的BL21(DE3)细胞单菌落接种100mL改良的Terrific液体培养基(mTB)，其补充有30μg/mL卡那霉素。此方法在使用MicrobankTM珠或甘油原液(10-100μL)接种烧瓶时同样适用。培养物在37℃以250RPM振荡温育16h。
温育后，总共10mL的100mL培养物用于接种1L补充有0.2％葡糖胺和30μg/mL卡那霉素的mTB。将培养物在37℃以250RPM温育直至OD600达到0.5。此时，温育温度降至16℃。1h后，用1mM IPTG诱导靶蛋白的表达，随后在16℃以225RPM振荡温育20h。温育后，通过在4℃以4000xg离心20min收获细胞，然后在-20℃下储存。
实施例2-从宿主细胞中提取rBoNT/A蛋白质
将细胞糊在室温下融化并重悬于3mL 50mM Bis-Tris pH 6.0，50mM NaCl缓冲液/克细胞中，然后将10μL核酸酶添加至细胞悬液中。在0-4℃，通过在100W下超声处理(30s开和45s关，10个循环)裂解细胞。将裂解物在4℃下以4000x g离心1h以获得澄清上清液中的可溶性rBoNT/A(SEQ ID No.2或4)。
实施例3-靶rBoNT/A蛋白质的捕获
使用Scripps Research Institute的Scripps Protein Calculator v3.4从一级蛋白质序列确定rBoNT/A蛋白质的性质(表3)。
表3：rBoNT/A的预测性质
基于计算的pI值，预测rBoNT/A(SEQ ID No.4)和阳离子rBoNT/A(SEQ ID No.2)将分别在缓冲液pH<6.5和<7.4时与阳离子交换树脂(CEX)结合。
实施例4-将澄清的裂解物脱盐到测试缓冲液
将含有可溶性rBoNT/A(SEQ ID No.2和4)的澄清裂解物分成等份并使用Econo-Pac 10DG脱盐柱将缓冲液交换到表4中列出的上样缓冲液中。
表4：用于CEX缓冲液探测的上样缓冲液。
将交换的缓冲液，澄清的裂解物储存在4℃，然后加载到HiTrap SP HP柱上。
实施例5-使用快速蛋白液相层析(FPLC)缓冲液筛选rBoNT/A(SEQ ID No.4)的CEX 层析捕获步骤
将含有可溶性rBoNT/A(SEQ ID No.4)的缓冲液交换的裂解物加载到HiTrap SPHP柱上。通过SDS-PAGE和光密度测定法来确定洗脱的靶蛋白的％结合率和％纯度。通过使用pH或NaCl线性梯度来实现结合蛋白的洗脱(表5)。
表5：用于CEX缓冲液探测的上样缓冲液和洗脱梯度。
图1(小图A-F)示出使用表5中的条件，与SP HP琼脂糖凝胶树脂结合并洗脱后，rBoNT/A(SEQ ID No.4)洗脱曲线的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。SDS-PAGE凝胶分析允许估计洗脱的靶蛋白的纯度％(表6)。
表6：与SP HP琼脂糖树脂结合的rBoNT/A(SEQ ID No.4)的分析
SDS-PAGE凝胶的光密度分析。
SDS-PAGE凝胶的视觉评估(图1)显示用条件3-6洗脱后更高的靶蛋白质回收率，这表明靶蛋白质与树脂的更大的初始结合。
实施例6-用快速蛋白质液相层析(FPLC)缓冲液筛选阳离子rBoNT/A(SEQ ID No.2)的CEX层析捕获步骤
将含有可溶性阳离子rBoNT/A(SEQ ID No.2)的缓冲液交换的裂解物加载到HiTrap SP HP柱上。洗脱的靶蛋白的％结合率和％纯度通过SDS-PAGE分析确定。通过使用pH或NaCl线性梯度来实现结合蛋白的洗脱(表5)。
图2(小图A-F)显示了使用表5中的条件，与SP HP琼脂糖凝胶树脂结合并洗脱后阳离子rBoNT/A(SEQ ID No.2)洗脱曲线的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。SDS-PAGE凝胶分析允许估计靶蛋白与SP HP琼脂糖凝胶树脂的％纯度和％结合(表7)。
表7：与SP HP琼脂糖树脂结合的阳离子rBoNT/A(SEQ ID No.2)的分析
*视觉评估和结合％的估计。
SDS-PAGE凝胶的光密度分析。
与pH 6.0相比，SDS-PAGE凝胶(图2)的评估显示在pH7.5-8.0时靶蛋白的更高的结合％和相似的纯度％。这相当于靶蛋白质回收率的总体增加。
在上述说明书中提到的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变型对于本领域技术人员而言将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应该理解，所要求保护的本发明不应该不适当地限于这些具体实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的各种修改旨在落入以下权利要求的范围内。

Claims (23)

1.一种纯化梭菌神经毒素的方法，包括使阳离子交换树脂与包含梭菌神经毒素的组合物接触，其中所述接触步骤在至少pH 7.3下进行，其中所述使阳离子交换树脂与包含所述梭菌神经毒素的组合物接触的步骤在将所述梭菌神经毒素从单链形式转化为双链形式之前发生。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括从所述阳离子交换树脂分离梭菌神经毒素。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述分离的梭菌神经毒素处于基本上纯的状态。
4.一种包含与阳离子交换树脂缔合的梭菌神经毒素的纯化中间体，其中所述纯化中间体具有至少pH 7.3的pH值，并且其中所述梭菌神经毒素为单链形式。
5.一种包含已从阳离子交换树脂分离的梭菌神经毒素的纯化中间体，其中所述纯化中间体具有至少pH 7.3的pH值，并且其中所述梭菌神经毒素为单链形式。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法或纯化中间体，其中所述pH值为至少约pH7.5(优选约pH 7.6，优选至少约pH 7.7，更优选至少约pH 7.8)。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法或纯化中间体，其中所述pH值在约pH 7.3至约pH 9.5之间。
8.根据权利要求1-5或7中任一项所述的方法或纯化中间体，其中所述pH值在约pH 7.3至约pH 8.0之间。
9.相比于在相同条件下使用低于梭菌神经毒素的计算的pI大于-1个pH单位的pH值，并且其中所述梭菌神经毒素为单链形式，具有比所述梭菌神经毒素的计算的pI值高-1个pH单位或更高的pH值的缓冲液用于使包含梭菌神经毒素的组合物和阳离子交换树脂接触以增加梭菌神经毒素的结合和/或产量的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述pH值至少是所述梭菌神经毒素的计算的pI(优选比计算的pI高至少约0.2个pH单位，更优选高至少0.5个pH单位)。
11.根据权利要求9所述的用途，其中所述pH值比所述梭菌神经毒素的计算的pI高约0.2至约1.5个pH单位。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的用途，其中所述pH值比所述梭菌神经毒素的计算的pI高约0.2至约1.0个pH单位。
13.根据权利要求1-3或6-12中任一项所述的方法或用途，其中使阳离子交换树脂与包含梭菌神经毒素的组合物接触是第一纯化步骤(例如第一层析纯化步骤)。
14.根据权利要求1-3或6-13中任一项所述的方法或用途，其中所述纯化包括一个或多个另外的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法或用途，其中所述一个或多个另外的步骤包括使包含梭菌神经毒素的组合物与一种或多种另外的树脂接触。
16.根据权利要求14或15所述的方法或用途，其中所述一个或多个另外的步骤包括将所述肉毒梭菌神经毒素从单链形式转化为双链形式。
17.根据权利要求1-3或6-16中任一项的方法或用途，其中包含于所述组合物中的总梭菌神经毒素的至少35％(优选至少40％、50％、60％、70％或80％)与阳离子交换树脂缔合。
18.一种通过前述权利要求中任一项的方法或用途可获得的和/或从权利要求4-8中任一项的纯化中间体分离的梭菌神经毒素。
19.根据权利要求18所述的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素处于基本上纯的状态。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法、用途、梭菌神经毒素或纯化中间体，其中所述梭菌神经毒素是选自下组的一种或多种：肉毒梭菌、破伤风梭菌、巴氏梭菌和丁酸梭菌。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法、用途、梭菌神经毒素或纯化中间体，其中所述梭菌神经毒素是肉毒梭菌神经毒素(BoNT)，优选选自：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G中的一种或多种BoNT。
22.根据权利要求21所述的方法、用途、梭菌神经毒素或纯化中间体，其中所述BoNT是阳离子BoNT。
23.一种参照实施例和附图基本上如本文所述的方法、用途、梭菌神经毒素或纯化中间体。
CN201680055073.8A 2015-10-02 2016-09-27 纯化梭菌神经毒素的方法 Pending CN108137657A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1517450.1A GB201517450D0 (en) 2015-10-02 2015-10-02 Method
GB1517450.1 2015-10-02
PCT/EP2016/072986 WO2017055274A1 (en) 2015-10-02 2016-09-27 Method for purifying clostridial neurotoxin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108137657A true CN108137657A (zh) 2018-06-08

Family

ID=54606010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680055073.8A Pending CN108137657A (zh) 2015-10-02 2016-09-27 纯化梭菌神经毒素的方法

Country Status (20)

Country Link
US (1) US11066451B2 (zh)
EP (2) EP3650462A1 (zh)
JP (1) JP2018537412A (zh)
KR (1) KR102675034B1 (zh)
CN (1) CN108137657A (zh)
AU (1) AU2016330322A1 (zh)
BR (1) BR112018006300A2 (zh)
CA (1) CA2996695A1 (zh)
DK (1) DK3356391T3 (zh)
EA (1) EA036610B1 (zh)
ES (1) ES2769775T3 (zh)
GB (1) GB201517450D0 (zh)
HK (2) HK1255471A1 (zh)
HU (1) HUE047489T2 (zh)
MX (2) MX2018003644A (zh)
PL (1) PL3356391T3 (zh)
PT (1) PT3356391T (zh)
SG (1) SG10202001084VA (zh)
WO (1) WO2017055274A1 (zh)
ZA (1) ZA201801755B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113832069A (zh) * 2020-11-30 2021-12-24 河南农业大学 丁酸梭菌及其应用、药品、食品、保健品、兽药、饲料添加剂、微生态制剂

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX365496B (es) * 2009-10-21 2019-06-05 Revance Therapeutics Inc Metodos y sistemas para purificar la neurotoxina botulinica no acomplejada.
US11707510B2 (en) * 2018-02-16 2023-07-25 Preclinics Discovery Gmbh Nucleic acid-based botulinum neurotoxin for therapeutic use
GB201914034D0 (en) * 2019-09-30 2019-11-13 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of neurological disorders
GB202003813D0 (en) 2020-03-16 2020-04-29 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of upper facial lines
AU2021238924A1 (en) 2020-03-16 2022-08-25 Ipsen Biopharm Limited Modified botulinum neurotoxin for treating limb spasticity
JP2024513191A (ja) * 2021-03-30 2024-03-22 イプセン バイオファーム リミテッド 疼痛及び炎症性障害の処置
EP4401759A1 (en) 2021-09-16 2024-07-24 Ipsen Biopharm Limited Modified bont/a for use in the treatment of cervical dystonia
GB202113602D0 (en) 2021-09-23 2021-11-10 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of a disorder affecting an eyelid muscle of a subject
EP4404955A1 (en) 2021-09-23 2024-07-31 Ipsen Biopharm Limited Modified bont/a for use in the treatment of a disorder affecting an eyelid muscle of a subject
KR20240051355A (ko) * 2022-10-12 2024-04-22 주식회사 알케미어 보툴리눔 독소의 경쇄 변이체

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1396176A (zh) * 2001-07-06 2003-02-12 阿尔法·瓦瑟曼公司 通过阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法
CN1616489A (zh) * 2004-09-30 2005-05-18 中国科学技术大学 纯化重组人白细胞介素12的方法
CN101497909A (zh) * 2009-03-05 2009-08-05 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 制备抗a型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法
CN102325792A (zh) * 2009-02-19 2012-01-18 莫茨制药有限及两合公司 用于生产高纯度神经毒素的手段和方法
CN102666396A (zh) * 2009-10-21 2012-09-12 雷文斯治疗公司 用于纯化非复合的肉毒杆菌神经毒素的方法和系统
CN104870468A (zh) * 2012-11-21 2015-08-26 突触融合蛋白有限公司 用于制备经蛋白水解处理的多肽的方法

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
AU3658093A (en) 1992-02-10 1993-09-03 Seragen, Inc. Desensitization to specific allergens
GB9305735D0 (en) 1993-03-19 1993-05-05 North John R Novel agent for controlling cell activity
ES2168302T3 (es) 1993-06-10 2002-06-16 Allergan Inc Tratamiento de trastornos y estados neuromusculares con toxina botulinica de serotipo e.
US5437291A (en) 1993-08-26 1995-08-01 Univ Johns Hopkins Method for treating gastrointestinal muscle disorders and other smooth muscle dysfunction
US6974578B1 (en) 1993-12-28 2005-12-13 Allergan, Inc. Method for treating secretions and glands using botulinum toxin
US20040126396A1 (en) 1993-12-28 2004-07-01 Allergan, Inc. Botulinum toxin treatment for strabismus
US5670484A (en) 1994-05-09 1997-09-23 Binder; William J. Method for treatment of skin lesions associated with cutaneous cell-proliferative disorders
US5714469A (en) 1994-09-01 1998-02-03 Smithkline Beecham Corporation Method of treating sepsis
GB9508204D0 (en) 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
US7192596B2 (en) 1996-08-23 2007-03-20 The Health Protection Agency Ipsen Limited Recombinant toxin fragments
GB9617671D0 (en) 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
US6063768A (en) 1997-09-04 2000-05-16 First; Eric R. Application of botulinum toxin to the management of neurogenic inflammatory disorders
GB9721189D0 (en) 1997-10-08 1997-12-03 Speywood Lab The Limited Analgesic conjugates
CA2331274C (en) 1998-05-13 2010-04-06 Biotecon Gesellschaft Fur Biotechnologische Entwicklung Und Consulting Mbh Hybrid protein for inhibiting the degranulation of mastocytes and the use thereof
CA2335105C (en) 1998-07-22 2010-05-11 Osprey Pharmaceuticals Limited Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
US6776990B2 (en) 1999-04-08 2004-08-17 Allergan, Inc. Methods and compositions for the treatment of pancreatitis
US6358697B2 (en) 1999-04-21 2002-03-19 Children's Hospital Medical Center Intracellular pharmaceutical targeting
US6767544B2 (en) 2002-04-01 2004-07-27 Allergan, Inc. Methods for treating cardiovascular diseases with botulinum toxin
US6358917B1 (en) 1999-08-24 2002-03-19 Jean D. A. Carruthers Cosmetic use of botulinum toxin for treatment of downturned mouth
EP2267010B1 (en) 1999-08-25 2014-05-07 Allergan, Inc. Activatable recombinant neurotoxins
GB9922554D0 (en) 1999-09-23 1999-11-24 Microbiological Res Authority Inhibition of secretion from non-neuronal cells
US6113915A (en) 1999-10-12 2000-09-05 Allergan Sales, Inc. Methods for treating pain
US6265379B1 (en) 1999-10-13 2001-07-24 Allergan Sales, Inc. Method for treating otic disorders
US6139845A (en) 1999-12-07 2000-10-31 Allergan Sales, Inc. Method for treating cancer with a neurotoxin
US7838008B2 (en) 1999-12-07 2010-11-23 Allergan, Inc. Methods for treating diverse cancers
US6337075B1 (en) 2000-01-11 2002-01-08 Allergan Sales, Inc. Methods for treating diabetes
US6261572B1 (en) 2000-01-11 2001-07-17 Allergan Sales, Inc. Method for treating a pancreatic disorder with a neurotoxin
US6143306A (en) 2000-01-11 2000-11-07 Allergan Sales, Inc. Methods for treating pancreatic disorders
US6641820B1 (en) 2000-01-19 2003-11-04 Allergan, Inc. Clostridial toxin derivatives and methods to treat pain
US6524580B1 (en) 2000-02-15 2003-02-25 Allergan Sales, Inc. Method for treating thyroid disorders
US6464986B1 (en) 2000-04-14 2002-10-15 Allegan Sales, Inc. Method for treating pain by peripheral administration of a neurotoxin
US6299893B1 (en) 2000-04-17 2001-10-09 Marvin Schwartz Method to reduce hair loss and stimulate hair regrowth
US6565870B1 (en) 2000-04-28 2003-05-20 Allergan, Inc. Methods for treating bone tumors
US6306403B1 (en) 2000-06-14 2001-10-23 Allergan Sales, Inc. Method for treating parkinson's disease with a botulinum toxin
US6903187B1 (en) 2000-07-21 2005-06-07 Allergan, Inc. Leucine-based motif and clostridial neurotoxins
US6423319B1 (en) 2000-10-04 2002-07-23 Allergan Sales, Inc. Methods for treating muscle injuries
US6827931B1 (en) 2000-10-20 2004-12-07 Allergan, Inc. Method for treating endocrine disorders
US7273722B2 (en) 2000-11-29 2007-09-25 Allergan, Inc. Neurotoxins with enhanced target specificity
US7255866B2 (en) 2001-09-17 2007-08-14 Allergan, Inc. Botulinum toxin therapy for fibromyalgia
US6623742B2 (en) 2001-09-17 2003-09-23 Allergan, Inc. Methods for treating fibromyalgia
US6921538B2 (en) 2002-05-10 2005-07-26 Allergan, Inc. Therapeutic treatments for neuropsychiatric disorders
CA2501856A1 (en) 2002-10-15 2004-04-29 Allergan, Inc. Botulinum toxin dental therapies and procedures
US7238357B2 (en) 2002-11-05 2007-07-03 Allergan, Inc. Methods for treating ulcers and gastroesophageal reflux disease
US8071550B2 (en) 2003-03-03 2011-12-06 Allergan, Inc. Methods for treating uterine disorders
US6838434B2 (en) 2003-05-02 2005-01-04 Allergan, Inc. Methods for treating sinus headache
US7220422B2 (en) 2003-05-20 2007-05-22 Allergan, Inc. Methods and compositions for treating eye disorders
US20040253274A1 (en) 2003-06-11 2004-12-16 Allergan, Inc. Use of a clostridial toxin to reduce appetite
DE102004043009A1 (de) 2004-09-06 2006-03-23 Toxogen Gmbh Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen
AU2005311086B2 (en) 2004-12-01 2012-03-29 Allergan, Inc. Fusion proteins
CA2556796C (en) 2005-03-03 2018-01-23 Allergan, Inc. Animal product free system and process for purifying a botulinum toxin
DE102005019302A1 (de) 2005-04-26 2006-11-16 Toxogen Gmbh Carrier zum Targeting von Nervenzellen
DK2154151T3 (da) 2005-09-19 2011-09-05 Allergan Inc Clostridiumtoksinaktiverbare clostridiumtoksiner
EP1834962A1 (de) 2006-03-15 2007-09-19 Biotecon Therapeutics GmbH PEGyliertes mutiertes Clostridium botulinum Toxin
GB0903006D0 (en) 2009-02-23 2009-04-08 Syntaxin Ltd Modified non-cytotoxic proteases
EP2419128B1 (en) 2009-04-14 2018-06-06 Medical College of Wisconsin, Inc. Engineered botulinum neurotoxin
US8440204B2 (en) 2009-04-30 2013-05-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Subtype of Closteridium botulinum neurotoxin type A and uses thereof
US8129139B2 (en) * 2009-07-13 2012-03-06 Allergan, Inc. Process for obtaining botulinum neurotoxin
US8853360B2 (en) 2010-06-23 2014-10-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Engineered botulinum neurotoxin C1 with selective substrate specificity
WO2013091895A1 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Novel method for the manufacturing of di-chain proteins for use in humans
GB201312317D0 (en) * 2013-07-09 2013-08-21 Syntaxin Ltd Cationic neurotoxins
US9216210B2 (en) 2013-12-23 2015-12-22 Dublin City University Multiprotease therapeutics for chronic pain
GB201407525D0 (en) * 2014-04-29 2014-06-11 Syntaxin Ltd Manufacture of recombinant clostridium botulinum neurotoxins
WO2016110662A1 (en) 2015-01-09 2016-07-14 Ipsen Bioinnovation Limited Cationic neurotoxins

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1396176A (zh) * 2001-07-06 2003-02-12 阿尔法·瓦瑟曼公司 通过阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法
CN1616489A (zh) * 2004-09-30 2005-05-18 中国科学技术大学 纯化重组人白细胞介素12的方法
CN102325792A (zh) * 2009-02-19 2012-01-18 莫茨制药有限及两合公司 用于生产高纯度神经毒素的手段和方法
CN101497909A (zh) * 2009-03-05 2009-08-05 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 制备抗a型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法
CN102666396A (zh) * 2009-10-21 2012-09-12 雷文斯治疗公司 用于纯化非复合的肉毒杆菌神经毒素的方法和系统
CN104870468A (zh) * 2012-11-21 2015-08-26 突触融合蛋白有限公司 用于制备经蛋白水解处理的多肽的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
余红梅等: "重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin在毕赤酵母中的表达及其活性 ", 《中国生物制品学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113832069A (zh) * 2020-11-30 2021-12-24 河南农业大学 丁酸梭菌及其应用、药品、食品、保健品、兽药、饲料添加剂、微生态制剂
CN113832069B (zh) * 2020-11-30 2024-01-30 河南农业大学 丁酸梭菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180080205A (ko) 2018-07-11
PT3356391T (pt) 2020-02-19
CA2996695A1 (en) 2017-04-06
HUE047489T2 (hu) 2020-04-28
WO2017055274A1 (en) 2017-04-06
HK1257762A1 (zh) 2019-10-25
DK3356391T3 (da) 2020-02-03
BR112018006300A2 (pt) 2018-10-16
AU2016330322A1 (en) 2018-04-26
GB201517450D0 (en) 2015-11-18
EA201890851A1 (ru) 2018-08-31
SG10202001084VA (en) 2020-03-30
US11066451B2 (en) 2021-07-20
JP2018537412A (ja) 2018-12-20
KR102675034B1 (ko) 2024-06-14
EP3650462A1 (en) 2020-05-13
HK1255471A1 (zh) 2019-08-16
PL3356391T3 (pl) 2020-07-27
EP3356391B1 (en) 2019-11-06
EP3356391A1 (en) 2018-08-08
MX2018003644A (es) 2018-04-30
ES2769775T3 (es) 2020-06-29
ZA201801755B (en) 2019-01-30
EA036610B1 (ru) 2020-11-30
MX2020011816A (es) 2021-01-15
US20190100564A1 (en) 2019-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108137657A (zh) 纯化梭菌神经毒素的方法
AU777556B2 (en) Activatable recombinant neurotoxins
CA2758274C (en) Engineered botulinum neurotoxin
US7740868B2 (en) Activatable clostridial toxins
US20090018081A1 (en) Activatable clostridial toxins
JP2005517627A (ja) ロイシンベースモチーフおよびクロストリジウム神経毒
US10648045B2 (en) Chimeric polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1255471

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180608

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication