ES2769775T3 - Método para purificar la neurotoxina clostridial - Google Patents

Abstract

Un método para purificar una neurotoxina clostridial que comprende: (a) poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial, en donde la etapa de contacto se realiza en un tampón con un pH superior a -1 unidad de pH por debajo del pI calculado de la neurotoxina clostridial, en donde dicha etapa de poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende dicha neurotoxina clostridial se produce antes de la conversión de dicha neurotoxina clostridial de una forma de cadena única a una forma de cadena doble; (b) separar la neurotoxina clostridial de la resina de intercambio catiónico; y (c) recuperar la neurotoxina clostridial de cadena sencilla.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para purificar la neurotoxina clostridial

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para purificar neurotoxinas clostridiales, usos de un tampón, intermedios de purificación y neurotoxinas clostridiales obtenidas por los métodos y usos de la presente memoria.

Antecedentes

Las bacterias en el género Clostridia producen toxinas proteicas muy potentes y específicas, que puede contaminar las neuronas y otras células a las que se suministran. Los ejemplos de dichas toxinas clostridiales incluyen las neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT) y por C. botulinum (BoNT) de serotipos A-G, así como las producidas por C. baratii y C. butyricum.

Entre las neurotoxinas clostridiales se encuentran algunas de las toxinas más potentes conocidas. A modo de ejemplo, las neurotoxinas botulínicas tienen medianas de valores de dosis letales (DL⁵⁰) para ratones que varían entre 0,5 y 5 ng/kg, dependiendo del serotipo. Las toxinas tanto tetánica como botulínica actúan inhibiendo la función de las neuronas afectadas, específicamente la liberación de neurotransmisores. Mientras que la toxina botulínica actúa en la unión neuromuscular e inhibe la transmisión colinérgica en el sistema nervioso periférico, la toxina tetánica actúa en el sistema nervioso central.

En la naturaleza, las neurotoxinas clostridiales se sintetizan como un polipéptido de cadena sencilla que se modifica después de la traducción mediante un acontecimiento de escisión proteolítica para formar dos cadenas polipeptídicas unidas por un enlace disulfuro. Se produce escisión en un sitio de escisión específico, denominado con frecuencia como el sitio de activación que está localizado entre los restos de cisteína que proporcionan el enlace disulfuro intercatenario. Esta forma de cadena doble es la forma activa de la toxina. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y cadena ligera (cadena L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. La cadena H comprende un componente de translocación N-terminal (dominio Hⁿ) y un componente de direccionamiento C-terminal (dominio H^c). El sitio de escisión se localiza entre la cadena L y los componentes del dominio de translocación. Después de la unión del dominio H^c con su neurona diana e internalización de la toxina unida en la célula a través de un endosoma, el dominio Hⁿ transloca la cadena L a través de la membrana endosómica y en el citosol, y la cadena L proporciona una función de proteasa (también conocida como proteasa no citotóxica).

Las proteasas no citotóxicas actúan mediante la escisión proteolítica de proteínas de transporte intracelular conocidas como proteínas SNARE (p. ej., SNAP-25, VAMP o sintaxina) - véase Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4a edición) John Wiley & Sons, Inc. El acrónimo SNARE proviene de la expresión Receptor de Unión a NSF Soluble (Soluble NSF Attachment Receptor), donde NSF significa Factor Sensible a N-etilmaleimida (N-ethylmaleimide-Sensitive Factor). Las proteínas SNARE son integrales para la fusión de vesículas intracelulares y, por tanto, para la secreción de moléculas a través del transporte de vesículas desde una célula. La función de proteasa es una actividad endopeptidasa dependiente del cinc y presenta una alta especificidad de sustrato por proteínas SNARE. Por consiguiente, una vez suministrada a una célula diana deseada, la proteasa no citotóxica es capaz de inhibir la secreción celular de la célula diana. Las proteasas de la cadena L de neurotoxinas clostridiales son proteasas no citotóxicas que escinden las proteínas SNARE.

En vista de la naturaleza ubicua de las proteínas SNARE, las neurotoxinas clostridiales tales como la toxina botulínica se han empleado con éxito en una amplia gama de terapias.

A modo de ejemplo, los inventores hacen referencia a William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004), que describe el uso de neurotoxinas clostridiales, tales como neurotoxinas botulínicas (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Ci, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, y neurotoxina tetánica (TeNT), para inhibir la transmisión neuronal en varias aplicaciones terapéuticas y cosméticas o estéticas, por ejemplo, están aprobados en la actualidad productos de toxina botulínica comercializados como productos terapéuticos para indicaciones que incluyen espasticidad focal, espasticidad de extremidades superiores, espasticidad de extremidades inferiores, distonía cervical, blefaroespasmo, espasmo hemifacial, hiperhidrosis de las axilas, migraña crónica, hiperactividad neurogénica del detrusor, líneas glabelares y líneas de canto lateral graves. Además, se describen terapias de neurotoxina clostridial para tratar trastornos neuromusculares (véase el documento US 6.872.397); para tratar trastornos uterinos (véase el documento US 2004/0175399); para tratar úlceras y enfermedad por reflujo gastroesofágico (véase el documento US 2004/0086531); para tratar la distonía (véase el documento US 6.319.505); para tratar trastornos oculares (véase el documento US 2004/0234532); para tratar el blefaroespasmo (véase el documento US 2004/0151740); para tratar el estrabismo (véase el documento US 2004/0126396); para tratar el dolor (véanse los documentos US 6.869.610, US 6.641.820, US 6.464.986 y US 6.113.915); para tratar la fibromialgia (véanse los documentos US 6.623.742, US 2004/0062776); para tratar el dolor lumbar (véase el documento US 2004/0037852); para tratar lesiones musculares (véase el documento US 6.423.319); para tratar la cefalea sinusal (véase el documento US 6.838.434); para tratar la cefalea de tensión (véase el documento US 6.776.992); para tratar la cefalea (véase el documento US 6.458.365); para la reducción del dolor de cefalea por migraña (véase el documento US 5.714.469); para tratar enfermedades cardiovasculares (véase el documento US 6.767.544); para tratar trastornos neurológicos tales como la enfermedad de Parkinson (véanse los documentos US 6.620.415, US 6.306.403); para tratar trastornos neuropsiquiátricos (véanse los documentos US 2004/0180061, US 2003/0211121); para tratar trastornos endocrinos (véase el documento US 6.827.931); para tratar trastornos tiroideos (véase el documento US 6.740.321); para tratar trastornos de las glándulas sudoríparas con influencia colinérgica (véase el documento US 6.683.049); para tratar la diabetes (véanse los documentos US 6.337.075, US 6.416.765); para tratar un trastorno pancreático (véanse los documentos US 6.261.572, US 6.143.306); para tratar cánceres tales como tumores óseos (véanse los documentos US 6.565.870, US 6.368.605, US 6.139.845, US 2005/0031648); para tratar trastornos óticos (véanse los documentos US 6.358.926, US 6.265.379); para tratar trastornos autonómicos tales como trastornos de músculos gastrointestinales y otras disfunciones del músculo liso (véase el documento US 5.437.291); para el tratamiento de lesiones cutáneas asociadas con trastornos cutáneos proliferativos celulares (véase el documento US 5.670.484); para el tratamiento de trastornos inflamatorios neurogénicos (véase el documento US 6.063.768); para reducir la caída del cabello y estimular el crecimiento del cabello (véase el documento US 6.299.893); para tratar la boca curvada hacia abajo (véase el documento US 6.358.917); para reducir el apetito (véase el documento US 2004/40253274); para terapias y procedimientos dentales (véase el documento US 2004/0115139); para tratar trastornos y afecciones neuromusculares (véase el documento US 2002/0010138); para tratar diversos trastornos y afecciones y dolor asociado (véase el documento US 2004/0013692); para tratar afecciones resultantes de hipersecreción de moco, tal como asma y EPOC (véase el documento WO 00/10598); y para tratar afecciones no neuronales tales como inflamación, afecciones endocrinas, afecciones exocrinas, afecciones inmunológicas, afecciones cardiovasculares, afecciones óseas (véase el documento WO 01/21213).

Se prevé que el uso de proteasas no citotóxicas tales como neurotoxinas clostridiales (p. ej., BoNT y TeNT) en tratamientos terapéuticos y cosméticos de seres humanos y otros mamíferos se expanda a una gama cada vez más amplia de enfermedades y dolencias que pueden beneficiarse de las propiedades de estas toxinas.

Para evitar los efectos neurológicos sistémicos, muchas terapias de neurotoxina clostridial utilizan la administración directa del producto terapéutico de neurotoxina clostridial a un sitio diana dado (tal como un tejido diana). Un problema al administrar terapias basadas en neurotoxinas clostridiales de esta manera es la propagación de toxinas fuera del sitio de administración y hacia el tejido circundante o la circulación sistémica. Se cree que la difusión de la toxina fuera del tejido diana es responsable de los efectos secundarios indeseables que en casos extremos pueden ser potencialmente mortales. Esto puede ser una preocupación particular cuando se usan productos terapéuticos de neurotoxinas clostridiales (tales como productos terapéuticos de BoNT) en dosis, concentraciones y volúmenes de inyección altos. Los efectos adversos asociados con este problema que se han descrito para productos terapéuticos de BoNT/A comerciales incluyen astenia, debilidad muscular generalizada, diplopia, ptosis, disfagia, disfonía, disartria, incontinencia urinaria y dificultades respiratorias. Las dificultades para tragar y respirar pueden ser potencialmente mortales y se han descrito muertes relacionadas con la propagación de los efectos de las toxinas. Estos problemas se han abordado y resuelto en el documento WO2015/004461 A1 que proporcionó neurotoxinas clostridiales modificadas que comprendían al menos una modificación de aminoácidos que aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la neurotoxina clostridial modificada.

Se proporcionan en la técnica métodos para purificar neurotoxinas clostridiales. El documento WO2006/096163 A1 enseña procesos y sistemas cromatográficos para purificar neurotoxina botulínica de tipo A en complejo con proteínas estabilizantes no tóxicas. El documento WO2006/096163 A1 enseña una pluralidad de procesos cromatográficos, incluyendo el uso de una columna de intercambio catiónico como columna de acabado (es decir, una columna usada cuando el complejo de neurotoxina botulínica de tipo A ya se ha sometido a una o más columnas anteriores y está en un estado sustancialmente puro). En el documento WO2006/096163 A1 se enseña a usar valores de pH muy bajos (p. ej., pH 4,0) al unir y realizar una cromatografía de intercambio catiónico con un complejo de neurotoxina botulínica de tipo A.

Sin embargo, todavía existe la necesidad de técnicas optimizadas y mejoradas para purificar neurotoxinas clostridiales (especialmente neurotoxinas clostridiales no complejas), que proporcionan un proceso mejorado y/o rendimientos mejorados, preferiblemente facilitando la purificación de neurotoxinas clostridiales en menos (y/u opcionalmente más eficientes) etapas.

Compendio de la invención

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para purificar una neurotoxina clostridial que comprende poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial, en donde la etapa de contacto se realiza al menos a pH 7,3, en donde dicha etapa de poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende dicha neurotoxina clostridial se produce antes de la conversión de dicha neurotoxina clostridial de una forma de cadena única a una forma de cadena doble.

En un segundo aspecto, se proporciona un producto intermedio de purificación que comprende una neurotoxina clostridial asociada con una resina de intercambio catiónico, en donde el intermedio de purificación tiene un valor de pH de al menos pH 7,3 y en donde dicha neurotoxina clostridial está en forma de cadena única

También se describe en la presente memoria una neurotoxina clostridial que se ha separado de una resina de intercambio catiónico, en donde el intermedio de purificación tiene un valor de pH de al menos pH 7,3 y en donde dicha neurotoxina clostridial está en forma de cadena única.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona el uso de un tampón que tiene un valor de pH que es -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de una neurotoxina clostridial para poner en contacto una composición que comprende la neurotoxina clostridial con una resina de intercambio catiónico para una mayor unión y/o rendimiento de la neurotoxina clostridial, en comparación con el uso de un pH de más de -1 unidades de pH inferiores al pI calculado de dicha neurotoxina clostridial en condiciones idénticas y en donde dicha neurotoxina clostridial está en forma de cadena única. Asimismo, se describe en la presente memoria una neurotoxina clostridial obtenible por el método o uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y/o aislada de un producto intermedio de purificación de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Ahora se describirán realizaciones de la invención, únicamente a modo de ejemplo, en referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 muestra la captura de rBoNT/A1 en resinas de intercambio catiónico a diferentes pH. Se intercambió el tampón de lisados de E. coli de rBoNT/A1 endonegativo a pH 6,0 (paneles A y B), pH 7,5 (paneles C y D) o pH 8,0 (paneles E y F). Los lisados se cargaron en Hi-Trap SP-HP, se lavaron y se eluyeron con un gradiente de pH (panel A) o NaCl (paneles B-F). Las fracciones F5-F16 se analizaron mediante SDS-PAGE y BoNT/A se indica con un asterisco (*) en cada panel.

La figura 2 muestra la captura catiónica de rBoNT/A1 en resinas de intercambio catiónico a diferentes pH. Se intercambió el tampón de lisados de E. coli de rBoNT/A1 catiónico endonegativo a pH 6,0 (paneles A y B), pH 7,5 (paneles C y D) o pH 8,0 (paneles E y F). Los lisados se cargaron en Hi-Trap SP-HP, se lavaron y se eluyeron con un gradiente de pH (panel A) o NaCl (paneles B-F). Las fracciones relevantes se analizaron mediante s DS-PAGE y BoNT/A se indica con un asterisco (*) en cada panel.

La figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos catiónica de BoNT/A1 (p. ej., una BoNT/A1 que tiene un punto isoeléctrico aumentado en comparación con la BoNT/A1 nativa) (SEQ ID No. 1).

La figura 4 muestra la secuencia polipeptídica catiónica de rBoNT/A1 (SEQ ID No. 2).

La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos de rBoNT/A1 (SEQ ID No. 3).

La figura 6 muestra la secuencia polipeptídica de rBoNT/A1 (SEQ ID No. 4).

La figura 7 muestra una secuencia de nucleótidos catiónica de BoNT/A, "CatHN_v1" (SEQ ID No. 5).

La figura 8 muestra una secuencia polipeptídica catiónica de BoNT/A, "CatHN_v1" (SEQ ID No. 6).

La figura 9 muestra una secuencia de nucleótidos catiónica de BoNT/A, "CatHN_v2" (SEQ ID No. 7).

La figura 10 muestra una secuencia polipeptídica catiónica de BoNT/A, "CatHN_v2" (SEQ ID No. 8).

La figura 11 muestra una secuencia de nucleótidos catiónica de BoNT/A, "CatHN_v3" (SEQ ID No. 9).

La figura 12 muestra una secuencia polipeptídica catiónica de BoNT/A, "CatHN_v3" (SEQ ID No. 10).

La figura 13 muestra una secuencia de nucleótidos de cadena ligera catiónica de BoNT/E, "CatLC" (SEQ ID No.

11).

La figura 14 muestra una secuencia polipeptídica de cadena ligera catiónica de BoNT/E, "CatLC" (SEQ ID No. 12). La figura 15 muestra una secuencia de nucleótidos de BoNT/A1 (SEQ ID No. 13).

La figura 16 muestra una secuencia polipeptídica de BoNT/A1 (SEQ ID No. 14).

La figura 17 muestra una secuencia de nucleótidos catiónica de BoNT/A1, "Cat-A" (SEQ ID No. 15).

La figura 18 muestra una secuencia polipeptídica catiónica de BoNT/A1, "Cat-A" (SEQ ID No. 16).

La figura 19 muestra una secuencia de nucleótidos catiónica de BoNT/A1, "Cat-B" (SEQ ID No. 17).

La figura 20 muestra una secuencia polipeptídica catiónica de BoNT/A1, "Cat-B" (SEQ ID No. 18).

La figura 21 muestra una secuencia de nucleótidos catiónica de BoNT/A1, "Cat-C" (SEQ ID No. 19).

La figura 22 muestra una secuencia polipeptídica catiónica de BoNT/A1, "Cat-C" (SEQ ID No. 20).

La figura 23 muestra una secuencia de nucleótidos catiónica de BoNT/A1, "Cat-D" (SEQ ID No. 21).

La figura 24 muestra una secuencia polipeptídica catiónica de BoNT/A1, "Cat-D" (SEQ ID No. 22).

Descripción detallada

Un hallazgo fundamental de la presente invención es que las neurotoxinas clostridiales se asocian con restos de intercambio catiónico al menos a pH 7,3. Esto es muy inesperado y contrario al conocimiento predominante en la técnica, que enseña el uso de valores de pH durante la cromatografía de intercambio catiónico que están muy por debajo del pI de la proteína que se purifica.

Los inventores también han descubierto sorprendentemente que el uso de un tampón que tiene un valor de pH que es -1 unidad de pH o mayor que el punto isoeléctrico (pI) calculado de dicha neurotoxina clostridial aumenta la unión y/o el rendimiento en comparación con un uso similar en condiciones de pH diferentes.

Por lo tanto, en una realización, se proporciona un método para purificar una neurotoxina clostridial que comprende poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial, en donde la etapa de contacto se realiza al menos a pH 7,3, en donde dicha etapa de poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende dicha neurotoxina clostridial se produce antes de la conversión de dicha neurotoxina clostridial de una forma de cadena única a una forma de cadena doble.

En una realización, la etapa de contacto puede realizarse al menos aproximadamente a pH 7,3. De manera adecuada, la etapa de contacto puede realizarse al menos aproximadamente a pH 7,4 o al menos a pH 7,5.

De manera adecuada, la etapa de contacto puede realizarse al menos aproximadamente a pH 7,6 o al menos aproximadamente a pH 7,7.

De manera adecuada, la etapa de contacto puede realizarse al menos aproximadamente a pH 7,8 o al menos aproximadamente a pH 7,9.

De manera adecuada, la etapa de contacto puede realizarse al menos aproximadamente a pH 8,0.

En otra realización, la etapa de contacto puede realizarse al menos aproximadamente a pH 7,3 aproximadamente a pH 9,5. De manera adecuada, la etapa de contacto puede realizarse a un valor de pH entre aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente pH 9,0 o entre aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente pH 8,5.

De manera adecuada, la etapa de contacto puede realizarse a un valor de pH de aproximadamente pH 7,5.

De manera adecuada, la etapa de contacto puede realizarse a un valor de pH de aproximadamente pH 8,0.

El término "purificar", como se emplea en esta memoria, significa eliminar uno o más contaminantes de neurotoxinas no clostridiales que podrían estar presentes en una composición que comprende una neurotoxina clostridial, preferiblemente con el objetivo de obtener una neurotoxina clostridial que esté libre de dichos contaminantes de neurotoxinas no clostridiales. En otras palabras, el término "purificar" se refiere a un grado de purificación más que a una purificación absoluta, a menos que se indique otra cosa. Por lo tanto, el término "purificar" puede referirse a la eliminación de al menos 5 % (de manera adecuada, al menos 10 % o 20 %) de los contaminantes de neurotoxinas no clostridiales. De manera adecuada, "purificar" puede referirse a eliminar al menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de los contaminantes.

En otra realización, se proporciona el uso de un tampón que tiene un valor de pH que es -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de una neurotoxina clostridial para poner en contacto una composición que comprende la neurotoxina clostridial con una resina de intercambio catiónico para una mayor unión y/o rendimiento de la neurotoxina clostridial, en comparación con el uso de un pH que es más de -1 unidades de pH inferior al pI calculado de dicha neurotoxina clostridial en condiciones idénticas y en donde dicha neurotoxina clostridial está en forma de cadena única.

La expresión "más de -1 unidades de pH o mayor que el pI calculado de una neurotoxina clostridial" como se emplea en esta memoria significa un pH más de -1 unidades de pH por debajo del pI calculado de la neurotoxina clostridial. Por ejemplo, esta expresión abarcaría -0,5, 0,5, 1 unidades de pH, etc. Como ejemplo, si una neurotoxina clostridial tiene un pI de 8,0, entonces un valor de pH que es más de -1 unidades de pH o mayor significa un pH de más de pH 7,0, p. ej., pH 8,0, pH 9,0, etc.

La expresión "más de -1 unidades de pH inferiores al pI calculado de dicha neurotoxina clostridial" como se emplea en esta memoria significa un pH menos de -1 unidades de pH por debajo del pI calculado de la neurotoxina clostridial. Por ejemplo, esta expresión abarcaría -2 unidades de pH, etc. Como ejemplo, si una neurotoxina clostridial tiene un pI de 8,0, entonces un valor de pH que es más de -1 unidades de pH menor significa un pH de menos de pH 7,0, p. ej., pH 6,0, pH 5,0, etc.

La resina de intercambio catiónico para su uso en la presente invención puede ser cualquier tipo de resina de intercambio catiónico capaz de asociarse con una neurotoxina clostridial. En una realización, la resina de intercambio catiónico puede ser una resina de intercambio catiónico fuerte, una resina de intercambio catiónico débil o combinaciones de las mismas.

De manera adecuada, la resina de intercambio catiónico puede ser una resina de intercambio catiónico fuerte.

Los ejemplos no limitantes de intercambiadores catiónicos fuertes incluyen: SP Sepharose HP, SP Sepharose FF (ambos disponibles de GE Healthcare, Reino Unido), Mustang S, HyperD® F cerámico S, Acrodisc con Mustang S, AcroPrep con Mustang S y/o AcroSep con HyperD® F cerámico S (todos los cuales (a menos que se indique otra cosa) están disponibles en el mercado de Pall Corporation, 25 Harbor Park Drive, Port Washington, NY 11050, EE. UU.).

En una realización preferida, la resina de intercambio catiónico puede ser una resina de intercambio catiónico fuerte que comprende ácido sulfónico.

En una realización, la resina de intercambio catiónico puede ser una resina SP Sepharose HP y/o una resina SP Sepharose FF (todas disponibles en el mercado de GE Healthcare, Reino Unido).

Los ejemplos no limitantes de intercambiadores catiónicos débiles incluyen: HyperD® F cerámico CM, AcroSep con HyperD® F y/o cerámico CM (todos disponibles en el mercado de Pall Corporation, 25 Harbor Park Drive, Port Washington, NY 11050, EE. UU.).

En una realización, la resina de intercambio catiónico débil puede ser una resina que comprende carboximetilo.

En una realización, se puede usar una resina de modo mixto. Las resinas de modo mixto pueden usar ligandos con carga que interactúan con una proteína diana a través de interacciones iónicas y pueden estar potenciadas con uno o más grupos funcionales (p. ej., dando como resultado la interacción por enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas y de van der Waals). Por lo tanto, en una realización, una resina de modo mixto puede actuar como una resina de intercambio iónico y una resina de interacción hidrófoba. De manera adecuada, una resina de modo mixto puede actuar como una resina de intercambio catiónico (resina de intercambio catiónico adecuadamente débil) y una resina de interacción hidrófoba.

Los ejemplos no limitantes de resinas de modo mixto incluyen la serie multimodal de columnas de cromatografía Capto (disponibles en el mercado de GE Healthcare, Reino Unido).

En la naturaleza, las neurotoxinas clostridiales se sintetizan como un polipéptido de cadena sencilla que se modifica después de la traducción mediante un acontecimiento de escisión proteolítica para formar dos cadenas polipeptídicas unidas por un enlace disulfuro. Se produce escisión en un sitio de escisión específico, denominado con frecuencia como el sitio de activación que está localizado entre los restos de cisteína que proporcionan el enlace disulfuro intercatenario. Esta forma de cadena doble es la forma activa de la toxina. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y cadena ligera (cadena L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. La cadena H comprende un componente de translocación N-terminal (dominio Hⁿ) y un componente de direccionamiento C-terminal (dominio H^c). El sitio de escisión se localiza entre la cadena L y los componentes del dominio de translocación. Después de la unión del dominio H^c con su neurona diana e internalización de la toxina unida en la célula a través de un endosoma, el dominio Hⁿ transloca la cadena L a través de la membrana endosómica y en el citosol, y la cadena L proporciona una función de proteasa (también conocida como proteasa no citotóxica).

Muchos tipos diferentes de neurotoxinas clostridiales son adecuados para su uso en la presente invención. Por tanto, en el contexto de la presente invención, la expresión "neurotoxina clostridial" abarca toxinas producidas por C. botulinum (serotipos de neurotoxina botulínica A, B, C¹, D, E, F y G), C. tetani (neurotoxina tetánica), C. butyricum (neurotoxina botulínica serotipo E) y C. baratii (neurotoxina botulínica serotipo F), así como neurotoxinas clostridiales modificadas o derivados procedentes de cualquiera de los anteriores. La expresión "neurotoxina clostridial" también puede abarcar híbridos, mosaicos y quimeras de neurotoxina botulínica de origen natural.

El término "mosaico", como se usa en este contexto, se refiere a una neurotoxina clostridial de origen natural que comprende al menos un dominio funcional de otro tipo de neurotoxinas clostridiales (p. ej., una neurotoxina clostridial de un serotipo diferente), no comprendiendo dicha neurotoxina clostridial habitualmente dicho al menos un dominio funcional.

Por lo tanto, en una realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser obtenible de uno o más Clostridia seleccionados del grupo que consiste en: Clostridia botulinum, Clostridia tetani, Clostridia baratii y C. butyricum.

La neurotoxina botulínica (BoNT) es producida por C. botulinum en forma de un gran complejo proteico, que consiste en BoNT en sí misma en complejo con una serie de proteínas accesorias. Actualmente, hay ocho clases diferentes de neurotoxina botulínica, concretamente: neurotoxina botulínica serotipos A, B, C¹, D, E, F, G y H, todas las cuales comparten estructuras y modos de acción similares. Se pueden distinguir diferentes serotipos de BoNT en función de la inactivación por antisueros neutralizantes específicos, correlacionándose dicha clasificación por serotipo con el porcentaje de identidad de secuencia en los aminoácidos. Las proteínas BoNT de un serotipo dado se dividen adicionalmente en diferentes subtipos en función del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos.

Las BoNT se absorben en el tracto gastrointestinal y, después de entrar en la circulación general, se unen a la membrana presináptica de los terminales nerviosos colinérgicos y evitan la liberación de su neurotransmisor acetilcolina. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G escinden sinaptobrevina/proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP); BoNT/Ci, BoNT/A y BoNT/E escinden la proteína asociada a sinaptosoma de 25 kDa (SNAP-25); y BoNT/Ci corta la sintaxina.

La toxina tetánica es producida en un solo serotipo por C. tetani. C. butyricum produce BoNT/E, mientras que C. baratii produce BoNT/F.

En una realización, la neurotoxina clostridial puede ser una TeNT. Una secuencia de TeNT de referencia tiene el número de referencia de UniProtKB P04958.

De manera adecuada, la neurotoxina clostridial de, o para su uso en, la presente invención puede ser una neurotoxina botulínica (BoNT), preferiblemente una o más BoNT seleccionadas del grupo que consiste en: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Ci, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G.

En una realización, la neurotoxina clostridial puede ser BoNT/A. Una secuencia de BoNT/A de referencia tiene el número de referencia de UniProtKB P10845.

En otra realización, la neurotoxina clostridial puede ser BoNT/B. Una secuencia de BoNT/B de referencia tiene el número de referencia de UniProtKB P10844.

En otra realización, la neurotoxina clostridial puede ser BoNT/C. Una secuencia de BoNT/Ci de referencia tiene el número de referencia de UniProtKB P18640.

En otra realización, la neurotoxina clostridial puede ser BoNT/D. Una secuencia de BoNT/D de referencia tiene el número de referencia de UniProtKB P19321.

En otra realización, la neurotoxina clostridial puede ser BoNT/E. Una secuencia de BoNT/E de referencia tiene el número de referencia de UniProtKB Q00496.

En otra realización, la neurotoxina clostridial puede ser BoNT/F. Una secuencia de BoNT/F de referencia tiene el número de referencia de UniProtKB YP_001390123.

En otra realización, la neurotoxina clostridial puede ser BoNT/G. Una secuencia de BoNT/G de referencia tiene el número de referencia de UniProtKB Q60393.

También se entiende que la expresión "neurotoxina clostridial" abarca las neurotoxinas clostridiales modificadas y derivados de las mismas, incluyendo, pero sin limitación, los descritos a continuación. Una neurotoxina clostridial modificada o un derivado puede contener uno o más aminoácidos que han sido modificados en comparación con la forma nativa (sin modificar) de la neurotoxina clostridial, o puede contener uno o más aminoácidos insertados que no están presentes en la forma nativa (sin modificar) de la neurotoxina clostridial o puede tener uno o más aminoácidos suprimidos en comparación con la forma nativa (sin modificar) de la neurotoxina clostridial. A modo de ejemplo, una neurotoxina clostridial modificada puede tener secuencias de aminoácidos modificadas en uno o más dominios en relación con la secuencia de neurotoxina clostridial nativa (sin modificar). Dichas modificaciones pueden modificar aspectos funcionales de la neurotoxina, por ejemplo, la actividad biológica o la persistencia.

Una neurotoxina clostridial modificada puede ser una neurotoxina clostridial modificada enseñada en el documento WO2015/004461 A i (p. ej., una BoNT catiónica).

En otra realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una BoNT/A catiónica En otra realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una BoNT/B catiónica En otra realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una BoNT/C catiónica En otra realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una BoNT/D catiónica En otra realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una BoNT/E catiónica En otra realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una BoNT/F catiónica En otra realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una BoNT/G catiónica Una BoNT catiónica es una BoNT que tiene un punto isoeléctrico mayor que su BoNT nativa homóloga.

Las neurotoxinas clostridiales modificadas pueden tener una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (tal como un dominio Hc modificado), en donde dicha cadena pesada modificada se une a células nerviosas diana con una afinidad mayor o menor que la neurotoxina clostridial nativa (sin modificar). Dichas modificaciones en el dominio H^c pueden incluir modificar restos en el sitio de unión a gangliósido del dominio H^c o en el sitio de unión a la proteína (SV2 o sinaptotagmina) que alteran la unión con el receptor de gangliósido y/o el receptor de proteína de la célula nerviosa diana. Se describen ejemplos de dichas neurotoxinas clostridiales modificadas en los documentos WO 2006/027207 y WO 2006/114308.

Una neurotoxina clostridial modificada puede tener una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera, por ejemplo, modificaciones en el dominio catalítico o de unión al sustrato que pueden alterar o modificar la especificidad de la proteína SNARE de la LC modificada. Se describen ejemplos de dichas neurotoxinas clostridiales modificadas en los documentos WO 2010/120766 y US 2011/0318385.

Una neurotoxina clostridial modificada puede comprender una o más modificaciones que aumentan o disminuyen la actividad biológica y/o la persistencia biológica de la neurotoxina clostridial modificada. Por ejemplo, una neurotoxina clostridial modificada puede comprender un motivo a base de leucina o tirosina, en donde dicho motivo aumenta o disminuye la actividad biológica y/o la persistencia biológica de la neurotoxina clostridial modificada. Los motivos adecuados a base de leucina incluyen xDxxxLL, xExxxLL, xExxxIL y xExxxLM (en donde x es cualquier aminoácido). Los motivos adecuados a base de tirosina incluyen Y-x-x-Hy (en donde Hy es un aminoácido hidrófobo). En el documento WO 2002/08268 se describen ejemplos de neurotoxinas clostridiales modificadas que comprenden motivos a base de leucina y tirosina.

Se entiende que la expresión "neurotoxina clostridial" abarca neurotoxinas clostridiales híbridas y quiméricas. Una neurotoxina clostridial híbrida o quimérica comprende al menos una parte de una cadena ligera de una neurotoxina clostridial o subtipo de la misma y al menos una parte de una cadena pesada de otra neurotoxina clostridial o subtipo de neurotoxina clostridial.

En una realización, la neurotoxina clostridial híbrida o quimérica puede contener la cadena ligera completa de un subtipo de neurotoxina clostridial y la cadena pesada de otro subtipo de neurotoxina clostridial. En otra realización, una neurotoxina clostridial quimérica puede contener una parte (p. ej., el dominio de unión) de la cadena pesada de un subtipo de neurotoxina clostridial, siendo otra parte de la cadena pesada de otro subtipo de neurotoxina clostridial. De manera similar o como alternativa, el elemento terapéutico puede comprender partes de cadena ligera de diferentes neurotoxinas clostridiales. Dichas neurotoxinas clostridiales híbridas o quiméricas son útiles, por ejemplo, como un medio para administrar los beneficios terapéuticos de dichas neurotoxinas clostridiales a pacientes que son inmunológicamente resistentes a un subtipo de neurotoxinas clostridiales dado, a pacientes que pueden tener una concentración inferior a la media de receptores de un dominio de unión a cadena pesada de neurotoxina clostridial dado o a pacientes que pueden tener una variante resistente a la proteasa del sustrato de toxina de membrana o vesícula (p. ej., SNAP-25, VAMP y sintaxina). Se describen neurotoxinas clostridiales híbridas y quiméricas en el documento u S 8.071.110 y en el documento GB1607901.4 (que aún no se ha publicado).

Por tanto, en un ejemplo, la neurotoxina clostridial para purificación según un método o uso de la presente invención puede ser una neurotoxina clostridial modificada por ingeniería genética, de manera adecuada puede ser una neurotoxina clostridial híbrida modificada por ingeniería genética o una neurotoxina clostridial quimérica modificada por ingeniería genética.

Se entiende que la expresión "neurotoxina clostridial" abarca neurotoxinas clostridiales redirigidas. En una neurotoxina clostridial redirigida, la neurotoxina clostridial se modifica para incluir un ligando exógeno conocido como Resto de Dirección (RD). El RD se selecciona para proporcionar especificidad de unión para una célula diana deseada y, como parte del proceso de redirección, puede eliminarse la parte de unión nativa de la neurotoxina clostridial (p. ej., el dominio H^c o el dominio H^cc). Se describe tecnología de redirección, por ejemplo, en los documentos: EP-B-0689459; WO 1994/021300; EP-B-0939818; US 6.461.617; US 7.192.596; WO 1998/007864; EP-B-0826051; US 5.989.545; US 6.395.513; US 6.962.703; WO 1996/033273; EP-B-0996468; US 7.052.702; WO 1999/017806; EP-B-1107794; US 6.632.440; WO 2000/010598; WO 2001/21213; WO 2006/059093; WO 2000/62814; WO 2000/04926; WO 1993/15766; WO 2000/61192; y WO 1999/58571.

Por tanto, en un ejemplo, la neurotoxina clostridial modificada por ingeniería genética para su uso en la presente invención puede ser una neurotoxina clostridial redirigida modificada por ingeniería genética.

La presente invención también abarca el uso de neurotoxinas clostridiales que tienen un sitio de escisión de proteasa no nativo. En dichas neurotoxinas clostridiales, el sitio de escisión de proteasa nativo (también conocido como el sitio de activación, como se ha descrito anteriormente) se modifica o reemplaza con un sitio de escisión de proteasa que no es nativo de esa neurotoxina clostridial (es decir, un sitio de escisión exógeno). Dicho sitio requerirá una proteasa exógena para la escisión, lo que permite un mejor control sobre el momento y la ubicación de los acontecimientos de escisión. Los sitios de escisión de proteasa no nativos que pueden emplearse en neurotoxinas clostridiales incluyen:

Enterocinasa (DDDDK|)

Factor Xa (IEGR¿ / IDGRj)

TEV (virus del grabado del tabaco) (ENLYFQ^G)

Trombina (LVPR^GS)

PreScission (LEVLFQ^GP).

Los sitios de escisión de proteasa adicionales incluyen secuencias de reconocimiento que son escindidas por una proteasa no citotóxica, por ejemplo, por la cadena ligera de una neurotoxina clostridial. Estas incluyen las secuencias de reconocimiento de proteínas SNARE (p. ej., SNAP-25, sintaxina, VAMP) que son escindidas por proteasas no citotóxicas tales como la cadena ligera de una neurotoxina clostridial. Se describen neurotoxinas clostridiales que comprenden sitios de escisión de proteasas no nativas en los documentos US 7.132.259, patente europea EP 1206554-B2 y US 2007/0166332. La expresión sitio de escisión de proteasa también abarca una inteína, que es una secuencia de autoescisión. La reacción de corte y empalme propio es controlable, por ejemplo, variando la concentración del agente reductor presente.

La presente invención también abarca el uso de neurotoxinas clostridiales que comprenden un "sitio de escisión destructiva". En dichas neurotoxinas clostridiales, se incorpora un sitio de escisión de proteasa no nativo en la neurotoxina clostridial, en una ubicación elegida de manera que la escisión en dicho sitio disminuya la actividad de, o inactive, la neurotoxina clostridial. El sitio de escisión de proteasa destructiva puede ser susceptible de escisión por una proteasa local, en el caso de que la neurotoxina clostridial, después de la administración, migre a una ubicación no diana. Los sitios de escisión de proteasa no nativos adecuados incluyen los descritos anteriormente. Se describen neurotoxinas clostridiales que comprenden un sitio de escisión destructiva en los documentos WO 2010/094905 y WO 2002/044199.

Las neurotoxinas clostridiales para su uso en la presente invención pueden estar PEGiladas, esto puede ayudar a aumentar la estabilidad, por ejemplo, duración de acción del componente de cadena ligera. La PEGilación es particularmente preferida cuando la cadena ligera comprende una proteasa de BoNT/A, B o C¹. La PEGilación incluye preferiblemente la adición de PEG al extremo N del componente de cadena ligera. A modo de ejemplo, el extremo N de una cadena ligera puede extenderse con uno o más restos de aminoácidos (p. ej., cisteína), que pueden ser iguales o diferentes. Uno o más de dichos restos de aminoácidos pueden tener su propia molécula de PEG unida (p. ej., unida covalentemente) a los mismos. Se describe un ejemplo de esta tecnología en el documento WO2007/104567.

En una realización preferida, la neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede estar libre de las proteínas en complejo que están presentes en un complejo de neurotoxina clostridial de origen natural.

La neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser obtenible expresando un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 1, la SEQ ID No. 3, la SEQ ID No. 5, la SEQ ID No. 7, la SEQ ID No. 9, la SEQ ID No. 11, la s Eq ID No. 13, la SEQ ID No. 15, la SEQ ID No. 17, la SEQ ID No. 19, la SEQ ID No. 21 o un ácido nucleico que tiene al menos 65 % o 70 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, la neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser obtenible expresando un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 1, la SEQ ID No. 3, la SEQ ID No. 5, la SEQ ID No. 7, la SEQ ID No. 9, la SEQ ID No. 11, la SEQ ID No. 13, la SEQ ID No. 15, la SEQ ID No. 17, la SEQ ID No. 19, la SEQ ID No. 21 o un ácido nucleico que tiene al menos 75 % u 80 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, la neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser obtenible expresando un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 1, la SEQ ID No. 3, la SEQ ID No. 5, la SEQ ID No. 7, la SEQ ID No. 9, la SEQ ID No. 11, la SEQ ID No. 13, la SEQ ID No. 15, la SEQ ID No. 17, la SEQ ID No. 19, la SEQ ID No. 21 o un ácido nucleico que tiene al menos 85 % o 90 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, la neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser obtenible expresando un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 1, la SEQ ID No. 3, la SEQ ID No. 5, la SEQ ID No. 7, la SEQ ID No. 9, la SEQ ID No. 11, la SEQ ID No. 13, la SEQ ID No. 15, la SEQ ID No. 17, la SEQ ID No. 19, la SEQ ID No. 21 o un ácido nucleico que tiene al menos 95 % o 99 % de identidad de secuencia con el mismo.

En una realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede comprender una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 2, la SEQ ID No. 4, la SEQ ID No. 6, la SEQ ID No. 8, la SEQ ID No. 10, la SEQ ID No. 12, la SEQ ID No. 14, la SEQ ID No. 16, la SEQ ID No. 18, la SEQ ID No. 20, la SEQ ID No. 22 o una secuencia polipeptídica que tiene al menos 65 % o 70 % de identidad de secuencia con la misma.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede comprender una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 2, la SEQ ID No. 4, la SEQ ID No. 6, la SEQ ID No. 8, la SEQ ID No. 10, la SEQ ID No. 12, la SEQ ID No. 14, la SEQ ID No. 16, la SEQ ID No. 18, la SEQ ID No. 20, la SEQ ID No.

22 o una secuencia polipeptídica que tiene al menos 75 % u 80 % de identidad de secuencia con la misma.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede comprender una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 2, la SEQ ID No. 4, la SEQ ID No. 6, la SEQ ID No. 8, la SEQ ID No. 10, la SEQ ID No. 12, la SEQ ID No. 14, la SEQ ID No. 16, la SEQ ID No. 18, la SEQ ID No. 20, la SEQ ID No.

22 o una secuencia polipeptídica que tiene al menos 85 % u 90 % de identidad de secuencia con la misma.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede comprender una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 2, la SEQ ID No. 4, la SEQ ID No. 6, la SEQ ID No. 8, la SEQ ID No. 10, la SEQ ID No. 12, la SEQ ID No. 14, la SEQ ID No. 16, la SEQ ID No. 18, la SEQ ID No. 20, la SEQ ID No.

22 o una secuencia polipeptídica que tiene al menos 95 % u 99 % de identidad de secuencia con la misma.

En una realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser obtenible expresando un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 3, la SEQ ID No. 13 o un ácido nucleico que tiene al menos 65 % o 70 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser obtenible expresando un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 3, la SEQ ID No. 13 o un ácido nucleico que tiene al menos 75 % u 80 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser obtenible expresando un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 3, la SEQ ID No. 13 o un ácido nucleico que tiene al menos 85 % o 90 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser obtenible expresando un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 3, la SEQ ID No. 13 o un ácido nucleico que tiene al menos 95 % o 99 % de identidad de secuencia con el mismo.

En una realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede comprender una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 4, la SEQ ID No. 14 o una secuencia polipeptídica que tiene al menos 65 % o 70 % de identidad de secuencia con la misma.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede comprender una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 4, la SEQ ID No. 14 o una secuencia polipeptídica que tiene al menos 75 % u 80 % de identidad de secuencia con la misma.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede comprender una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 4, la SEQ ID No. 14 o una secuencia polipeptídica que tiene al menos 85 % o 90 % de identidad de secuencia con la misma.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede comprender una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 4, la SEQ ID No. 14 o una secuencia polipeptídica que tiene al menos 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

En otra realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una neurotoxina clostridial catiónica obtenible mediante la expresión de un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 1, la SEQ ID No. 5, la SEQ ID No. 7, la SEQ ID No. 9, la SEQ ID No. 11, la SEQ ID No. 15, la SEQ ID No. 17, la SEQ ID No. 19, la SEQ ID No. 21 o un ácido nucleico que tiene al menos 65 % o 70 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una neurotoxina clostridial catiónica obtenible mediante la expresión de un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 1, la SEQ ID No. 5, la SEQ ID No. 7, la SEQ ID No. 9, la SEQ ID No. 11, la SEQ ID No. 15, la SEQ ID No. 17, la SEQ ID No. 19, la SEQ ID No. 21 o un ácido nucleico que tiene al menos 75 % u 80 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una neurotoxina clostridial catiónica obtenible mediante la expresión de un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 1, la SEQ ID No. 5, la SEQ ID No. 7, la SEQ ID No. 9, la SEQ ID No. 11, la SEQ ID No. 15, la SEQ ID No. 17, la SEQ ID No. 19, la SEQ ID No. 21 o un ácido nucleico que tiene al menos 85 % o 90 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una neurotoxina clostridial catiónica obtenible mediante la expresión de un ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. 1, la SEQ ID No. 5, la SEQ ID No. 7, la SEQ ID No. 9, la SEQ ID No. 11, la SEQ ID No. 15, la SEQ ID No. 17, la SEQ ID No. 19, la SEQ ID No. 21 o un ácido nucleico que tiene al menos 95 % o 99 % de identidad de secuencia con el mismo.

En otra realización, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una neurotoxina clostridial catiónica que comprende una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 2, la SEQ ID No. 6, la SEQ ID No. 8, la SEQ ID No. 10, la SEQ ID No. 12, la SEQ ID No. 16, la SEQ ID No. 18, la SEQ ID No. 20, la SEQ ID No. 22 o un ácido nucleico que tiene al menos 65 % o 70 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una neurotoxina clostridial catiónica que comprende una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 2, la SEQ ID No. 6, la SEQ ID No. 8, la SEQ ID No. 10, la SEQ ID No. 12, la SEQ ID No. 16, la SEQ ID No. 18, la SEQ ID No. 20, la SEQ ID No. 22 o un ácido nucleico que tiene al menos 75 % u 80 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una neurotoxina clostridial catiónica que comprende una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 2, la SEQ ID No. 6, la SEQ ID No. 8, la SEQ ID No. 10, la SEQ ID No. 12, la SEQ ID No. 16, la SEQ ID No. 18, la SEQ ID No. 20, la SEQ ID No. 22 o un ácido nucleico que tiene al menos 85 % o 90 % de identidad de secuencia con el mismo.

De manera adecuada, una neurotoxina clostridial para su uso en la presente invención puede ser una neurotoxina clostridial catiónica que comprende una secuencia polipeptídica mostrada como la SEQ ID No. 2, la SEQ ID No. 6, la SEQ ID No. 8, la SEQ ID No. 10, la SEQ ID No. 12, la SEQ ID No. 16, la SEQ ID No. 18, la SEQ ID No. 20, la SEQ ID No. 22 o un ácido nucleico que tiene al menos 95 % o 99 % de identidad de secuencia con el mismo.

El "porcentaje de identidad de secuencia" entre dos o más secuencias de ácido nucleico o aminoácidos está en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias. Por tanto, el % de identidad se puede calcular como el número de nucleótidos/aminoácidos idénticos dividido por el número total de nucleótidos/aminoácidos, multiplicado por 100. Los cálculos del % de identidad de secuencia también pueden tener en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que debe introducirse para optimizar la alineación de dos o más secuencias. Las comparaciones de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos o más secuencias se pueden llevar a cabo usando algoritmos matemáticos específicos, tales como BLAST, con los que estará familiarizado un experto en la técnica.

La expresión "composición que comprende una neurotoxina clostridial" se refiere a cualquiera de dichas composiciones en cualquier estado de preparación.

En una realización, una composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3. De manera adecuada, una composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,4 o pH 7,5.

De manera adecuada, una composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,6 o al menos aproximadamente pH 7,7.

De manera adecuada, una composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,8 o al menos aproximadamente pH 7,9.

De manera adecuada, una composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 8,0.

En otra realización, una composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un pH entre aproximadamente pH 7,3 y aproximadamente pH 9,5. De manera adecuada, una composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un pH entre aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente pH 9,0 o entre aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente pH 8,5.

De manera adecuada, una composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH de aproximadamente pH 7,5.

De manera adecuada, una composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH de aproximadamente pH 8,0.

En algunas realizaciones, la composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que es -1 unidad de pH o mayor que el punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial comprendida en la misma.

De manera adecuada, la composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que es -0,5 unidades de pH o mayor alto que el punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial comprendida en la misma.

De manera adecuada, la composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que es al menos el punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial comprendida en la misma.

De manera adecuada, la composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente 0,2 unidades de pI o al menos aproximadamente 0,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial comprendida en la misma.

En una realización, la composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que está entre aproximadamente -1 unidades de pH por debajo del punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial comprendida en la misma mismo hasta aproximadamente 2 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado.

De manera adecuada, la composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que está entre aproximadamente -0,5 unidades de pH por debajo del punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial comprendida en la misma hasta aproximadamente 1,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado.

De manera adecuada, la composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que está entre aproximadamente el punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial comprendida en la misma mismo hasta aproximadamente 2 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado.

De manera adecuada, la composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que está entre aproximadamente 0,2 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial comprendida en la misma hasta aproximadamente 1,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado.

Preferiblemente, la composición que comprende una neurotoxina clostridial puede tener un valor de pH que está entre aproximadamente 0,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial comprendida en la misma hasta aproximadamente 1,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado. En algunas realizaciones, la "composición que comprende una neurotoxina clostridial" puede ser un extracto sin células y/o un lisado celular. La expresión "extracto sin células" significa que el extracto comprende menos de aproximadamente 5% de células, más preferiblemente menos de aproximadamente 1 % o 0,1 % de células por volumen total de extracto.

Un extracto sin células y/o un lisado celular puede ser obtenible de una célula hospedadora que expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina clostridial, por ejemplo, una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente memoria. En una realización, una célula hospedadora puede ser una célula hospedadora de Escherichia coli.

El lisado celular se puede obtener después de la lisis de una pasta celular. Se puede lisar una pasta celular usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede conseguir lisis celular usando sonicación, de manera adecuada en presencia de al menos una nucleasa (p. ej., Benzonase® disponible en el mercado de Sigma-Aldrich).

Después de la preparación de un lisado celular, puede intercambiarse el tampón de dicho lisado celular. Esto puede llevarse a cabo usando cualquier metodología adecuada conocida por un experto en la técnica. Por ejemplo, esto puede llevarse a cabo usando una columna de desalación o diálisis con una membrana y tampón de diálisis apropiados. Un ejemplo de una columna desaladora adecuada puede incluir una columna desaladora Econo-Pac 10DG (disponible en el mercado de Bio-Rad).

En otras realizaciones, la "composición que comprende una neurotoxina clostridial" puede ser una composición obtenible (p. ej., obtenida) de una o más etapas de purificación anteriores (es decir, una etapa de purificación llevada a cabo antes de obtener la composición). La etapa de purificación anterior puede ser cualquier etapa de purificación conocida en la técnica, preferiblemente una etapa de purificación que se sabe que es adecuada para purificar una neurotoxina clostridial. La etapa de purificación anterior puede ser una o más seleccionadas del grupo que consiste en: una etapa de purificación cromatográfica, una etapa de purificación basada en precipitación (p. ej., una precipitación con sulfato de amonio) y una etapa de purificación por cristalización.

En alguna realización, el método y/o uso según la invención puede comprender una primera etapa de purificación (p. ej., una primera etapa cromatográfica) de poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial.

En otras realizaciones, el método y/o uso puede comprender una o más etapas de purificación. La o las etapas de purificación pueden llevarse a cabo antes o después de poner en contacto un resto de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial. De manera adecuada, la o las etapas de purificación pueden llevarse a cabo después de poner en contacto un resto de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial.

La o las etapas de purificación pueden seleccionarse del grupo que consiste en: una etapa de purificación cromatográfica y una etapa de purificación basada en precipitación (p. ej., una precipitación con sulfato de amonio).

La expresión "etapa de purificación cromatográfica" como se emplea en esta memoria puede referirse a una o más seleccionadas del grupo que consiste en: cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio iónico (p. ej., cromatografía de intercambio catiónico o intercambio aniónico), cromatografía de modo mixto, cromatografía de inducción de carga hidrófoba, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad.

En una realización, una etapa de purificación cromatográfica puede comprender el uso de cromatografía de modo mixto, de manera adecuada, el uso de una resina de hidroxiapatita. De manera adecuada, una resina de hidroxiapatita puede ser una resina de hidroxiapatita I y/o hidroxiapatita II. Dichas resinas están disponibles en el mercado (p. ej., de GE Healthcare, Reino Unido).

En otra realización, una etapa de purificación cromatográfica puede ser cromatografía de intercambio catiónico. La cromatografía de intercambio catiónico puede implicar el uso de una resina de intercambio catiónico fuerte y/o una resina de intercambio catiónico débil.

De manera adecuada, una resina de intercambio catiónico fuerte puede ser una resina que comprende ácido sulfónico.

De manera adecuada, una resina de intercambio catiónico débil puede ser una resina que comprende carboximetilo.

En otra realización, una etapa de purificación cromatográfica puede ser cromatografía de intercambio aniónico. La cromatografía de intercambio aniónico puede implicar el uso de una resina de intercambio aniónico fuerte y/o una resina de intercambio aniónico débil.

Los ejemplos de resinas de intercambio aniónico fuertes incluyen las que comprenden un amonio cuaternario, tales como Mustang® Q, HyperD® F cerámico Q, Acrodisc® con Mustang Q, AcroPrep™ con Mustang Q, AcroSep™ con HyperD® F cerámico Q, Q y S HyperCel y/o HyperCel STAR AX (todos los cuales están disponibles en el mercado de Pall Corporation, 25 Harbor Park Drive, Port Washington, NY 11050, EE. UU.).

Los ejemplos de resinas de intercambio aniónico débil incluyen las que comprenden carboximetilo, tales como HyperD® F cerámico CM, AcroSep con HyperD® F y/o cerámico CM (todos disponibles en el mercado de Pall Corporation, 25 Harbor Park Drive, Port Washington, n Y 11050, EE. UU.).

En realizaciones donde la etapa de purificación cromatográfica es una etapa de filtración en gel, de manera adecuada, la resina puede ser una resina Superdex 200 (disponible en el mercado de GE Healthcare UK).

En realizaciones donde la etapa de purificación cromatográfica es una etapa de interacción hidrófoba, de manera adecuada la resina puede ser una resina de fenil FF, una resina de octil FF y/o una resina de butil FF (disponible en el mercado de GE Healthcare UK).

En realizaciones donde la etapa de purificación cromatográfica es una etapa de cromatografía de afinidad, de manera adecuada la resina se puede seleccionar de: resina de glutatión, resina de estreptavidina, resina de biotina, resina de metal quelado, resina de dextrina sepharose y resina de IgG (disponible en el mercado de GE Healthcare UK).

En algunas realizaciones, la etapa de purificación cromatográfica puede ser una etapa de cromatografía de afinidad de anticuerpos.

En algunas realizaciones, el método o uso puede comprender una etapa de convertir la neurotoxina botulínica de una forma de cadena única en una forma de cadena doble (etapa de activación). La activación de una neurotoxina clostridial se lleva a cabo de manera adecuada después de poner en contacto la neurotoxina clostridial con una resina de intercambio catiónico. Más preferiblemente, la etapa de activación puede llevarse a cabo después de que una neurotoxina clostridial se haya separado de una resina de intercambio catiónico.

Una neurotoxina clostridial puede activarse poniendo en contacto (y opcionalmente incubando) la neurotoxina clostridial con una proteasa adecuada en condiciones en las que la proteasa adecuada puede escindir una secuencia polipeptídica de una neurotoxina clostridial.

En una realización, una proteasa adecuada puede ser una endoproteasa capaz de escindir una secuencia polipeptídica de neurotoxina clostridial de modo que se active.

En una realización, una endoproteasa para su uso de acuerdo con la invención puede ser una proteasa Lys-C. Una proteasa Lys-C adecuada puede ser una enseñada en los documentos WO2014/079495 y/o WO2014/080206.

La proteasa Lys-C puede ser obtenible de cualquier fuente adecuada y está disponible en el mercado de Life Technologies Ltd, Reino Unido.

En una realización más preferida, el método y/o uso de la invención puede comprender como alternativa y/o adicionalmente cromatografía de interacción hidrófoba. Por lo tanto, en una realización preferida, se proporciona un método y/o uso de la invención que comprende además (o que consiste además en) la activación de una neurotoxina clostridial usando Lys-C y cromatografía de interacción hidrófoba.

Preferiblemente, la cromatografía de interacción hidrófoba puede comprender el uso de una o más seleccionadas del grupo que consiste en: una resina de butil sepharose, una resina de fenil sepharose y una resina de octil sepharose.

La presente invención comprende poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial.

Se entiende que el término "contacto" cuando se hace referencia a la etapa de poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial abarca cualquier método conocido para facilitar la asociación de una resina de intercambio catiónico con una neurotoxina clostridial. Por ejemplo, la etapa de contacto puede llevarse a cabo incubando una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial en condiciones adecuadas durante un tiempo adecuado. Las condiciones de incubación adecuadas pueden incluir la presencia de agitación o temperaturas apropiadas seleccionadas para potenciar la estabilidad de la proteína y/o el mantenimiento de la actividad.

En una realización, la etapa de contacto puede llevarse a cabo aplicando una composición que comprende una neurotoxina clostridial a una columna que comprende una resina de intercambio catiónico. De manera adecuada, el contacto puede llevarse a cabo usando un proceso automático o semiautomático, p. ej., usando un sistema diseñado para cromatografía líquida automática (p. ej., cromatografía líquida rápida de proteínas).

En otra realización, una composición que comprende una neurotoxina clostridial puede mezclarse con una resina de intercambio catiónico. De manera adecuada, dicha mezcla se puede incubar a una temperatura y/o tiempo apropiados para facilitar la unión. En algunas realizaciones, la mezcla puede agitarse. En otras realizaciones, se puede preparar una columna de purificación a partir de la mezcla y someterla a técnicas convencionales de cromatografía líquida (p. ej., que comprenden lavado y/o elución).

En una realización, la "asociación" puede ser de manera adecuada una interacción o asociación basada en la carga. De manera adecuada, la "asociación" puede ser una interacción capaz de resistir la exposición de la resina de intercambio catiónico asociada con una neurotoxina clostridial a uno o más tampones de lavado. La expresión "tampón de lavado" se refiere a uno o más tampones preparados por el experto en la técnica para su uso en la alteración de la unión de proteínas contaminantes no deseadas (de manera adecuada, proteínas que no son neurotoxinas clostridiales) a la resina de intercambio catiónico. Normalmente, se puede preparar un tampón de lavado de modo que sea lo suficientemente riguroso para alterar la unión de proteínas contaminantes no deseadas (de manera adecuada, proteínas que no son neurotoxinas clostridiales) a la resina de intercambio catiónico sin alterar de manera significativa la unión de la neurotoxina clostridial a la resina de intercambio catiónico.

En la presente invención, se puede usar un tampón que tenga un pH de al menos aproximadamente pH 7,3. De manera adecuada, en la presente invención se puede usar un tampón que tenga un pH de al menos aproximadamente pH 7,5.

Las soluciones del pH correcto son conocidas por el experto en la técnica y pueden prepararse con cualquier tampón adecuado. En una realización, el tampón puede comprender: Bis-Tris (propano), Bis-Tris (metano), Tris, HEPES o fosfato de citrato. De manera adecuada, el tampón puede comprender Bis-Tris (propano). El experto en la técnica puede seleccionar cualquier molaridad adecuada de tampón. De manera adecuada, la molaridad puede ser de aproximadamente 50 mM.

En una realización, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 (de manera adecuada al menos aproximadamente pH 7,4 o pH 7,5).

De manera adecuada, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,6 o al menos aproximadamente pH 7,7.

De manera adecuada, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,8 o al menos aproximadamente pH 7,9.

De manera adecuada, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 8,0.

En otra realización, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un pH entre aproximadamente pH 7,3 y aproximadamente pH 9,5. De manera adecuada, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un pH entre aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente pH 9,0 o entre aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente pH 8,5.

De manera adecuada, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH de aproximadamente pH 7,5.

De manera adecuada, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH de aproximadamente pH 8,0.

El uso de la invención comprende el uso de un tampón que tiene un valor de pH que es -1 unidad de pH o mayor que el punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial (p. ej., la neurotoxina clostridial que es objeto de dicho uso).

El valor de pH mencionado puede ser el valor de pH medido cuando una resina de intercambio catiónico se pone en contacto con una composición que comprende una neurotoxina clostridial, por ejemplo, el valor de pH de la solución que comprende una mezcla de un intercambiador catiónico y una composición que comprende una neurotoxina clostridial.

La presente invención puede implicar el uso de un tampón que tiene un valor de pH de -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de una neurotoxina clostridial.

Las soluciones del pH correcto son conocidas por el experto en la técnica y pueden prepararse con cualquier tampón adecuado. En una realización, el tampón puede comprender: Bis-Tris (propano), Bis-Tris (metano), Tris, HEPES o fosfato de citrato. De manera adecuada, el tampón puede comprender Bis-Tris (propano). El experto en la técnica puede seleccionar cualquier molaridad adecuada de tampón. De manera adecuada, la molaridad puede ser de aproximadamente 50 mM.

De manera adecuada, el valor de pH para su uso en la presente invención puede ser un valor de pH que es -0,5 unidades de pH o mayor que el punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial.

En una realización, el valor de pH para su uso en la presente invención puede ser al menos el punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial.

De manera adecuada, el valor de pH puede ser al menos aproximadamente 0,2 unidades de pI o al menos aproximadamente 0,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial.

En una realización, el valor de pH puede estar entre aproximadamente -1 unidades de pH por debajo del punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial y aproximadamente 2 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado.

De manera adecuada, el valor de pH puede estar entre aproximadamente -0,5 unidades de pH por debajo del punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial y aproximadamente 1,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado.

De manera adecuada, el valor de pH puede estar entre aproximadamente el punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial y aproximadamente 2 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado.

De manera adecuada, el valor de pH puede estar entre aproximadamente 0,2 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial y aproximadamente 1,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado.

Preferiblemente, el valor de pH puede estar entre aproximadamente 0,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado de la neurotoxina clostridial y aproximadamente 1,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico calculado.

En una realización, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH de al menos aproximadamente pH 5,0, de manera adecuada al menos aproximadamente pH 6,0.

En otra realización, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH de aproximadamente pH 6,5, al menos aproximadamente pH 7,0 o al menos aproximadamente pH 7.5.

Preferiblemente, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH de al menos aproximadamente pH 8,0.

En una realización, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH de entre aproximadamente pH 5,0 y aproximadamente pH 9,5, de manera adecuada entre aproximadamente pH 6,0 y aproximadamente pH 9,5.

De manera adecuada, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH de entre aproximadamente pH 5,0 y aproximadamente pH 9,0, de manera adecuada entre aproximadamente pH 6,0 y aproximadamente pH 9,0.

En otra realización, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH de entre aproximadamente pH 6,5 y aproximadamente pH 8,5, de manera adecuada entre aproximadamente pH 7,0 y aproximadamente pH 8,0.

En una realización, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH de aproximadamente pH 6,0, de manera adecuada aproximadamente pH 6,5 o aproximadamente pH 7,0.

En otra realización, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH de aproximadamente pH 7,5.

Preferiblemente, un tampón para su uso en la presente invención puede tener un valor de pH de aproximadamente pH 8,0.

El punto isoeléctrico (pI) es una propiedad específica de una proteína dada. Como es bien conocido en la técnica, las proteínas están hechas de una secuencia específica de aminoácidos (también denominados cuando están en una proteína restos de aminoácidos). Cada aminoácido del conjunto convencional de veinte tiene una cadena lateral (o grupo R) diferente, lo que significa que cada resto de aminoácido en una proteína presenta diferentes propiedades químicas, tales como carga e hidrofobicidad. Estas propiedades pueden estar influidas por el ambiente químico circundante, tal como la temperatura y el pH. Las características químicas generales de una proteína dependerán de la suma de estos diversos factores.

Determinados restos de aminoácidos (detallados a continuación) poseen cadenas laterales ionizables que pueden presentar una carga eléctrica dependiendo del pH circundante. Si dicha cadena lateral está cargada o no a un pH dado depende del pKa del resto ionizable relevante, en donde pKa es el logaritmo negativo de la constante de disociación ácida (Ka) para un protón especificado de una base conjugada.

Por ejemplo, los restos ácidos tales como ácido aspártico y ácido glutámico tienen grupos de ácido carboxílico de cadena lateral con valores de pKa de aproximadamente 4,1 (los valores precisos de pKa pueden depender de la temperatura, la fuerza iónica y el microambiente del grupo ionizable). Por tanto, estas cadenas laterales presentan una carga negativa a un pH de 7,4 (denominado con frecuencia "pH fisiológico"). A valores bajos de pH, estas cadenas laterales se protonarán y perderán su carga.

Por el contrario, los restos básicos tales como lisina y arginina tienen grupos de cadena lateral que contienen nitrógeno con valores de pKa de aproximadamente 10-12. Por lo tanto, estas cadenas laterales presentan una carga positiva a un pH de 7,4. Estas cadenas laterales se desprotonarán y perderán su carga a altos valores de pH.

Por lo tanto, la carga global (neta) de una molécula de proteína depende del número de restos ácidos y básicos presentes en la proteína (y su grado de exposición superficial) y del pH circundante. Cambiar el pH circundante cambia la carga global de la proteína. Por consiguiente, para cada proteína hay un pH dado en el que el número de cargas positivas y negativas es igual y la proteína no presenta ninguna carga neta general. Este punto se conoce como el punto isoeléctrico (pI). El punto isoeléctrico es un concepto convencional en bioquímica de proteínas con el que el experto en la técnica estaría familiarizado.

Por lo tanto, el punto isoeléctrico (pI) se define como el valor de pH al que una proteína presenta una carga neta de cero. Un aumento de pI significa que es necesario un valor de pH mayor para que la proteína presente una carga neta de cero. Por tanto, un aumento de pI representa un aumento de la carga neta positiva de una proteína a un pH dado. Por el contrario, una disminución de pI significa que es necesario un valor de pH menor para que la proteína presente una carga neta de cero. Por tanto, una disminución de pI representa una disminución de la carga neta positiva de una proteína a un pH dado.

Son conocidos en la técnica métodos para determinar el pI de una proteína y un experto en la técnica estaría familiarizado con ellos. A modo de ejemplo, el pI de una proteína se puede calcular a partir de los valores promedio de pKa de cada aminoácido presente en la proteína ("pI calculado"). Dichos cálculos pueden realizarse usando programas informáticos conocidos en la técnica; los programas informáticos ilustrativos preferidos para calcular los valores de pI incluyen Protein Calculator del Scripps Research Institute y la herramienta Compute pI/MW de ExPASy. Las comparaciones de los valores de pI entre diferentes moléculas se deberían realizar usando la misma técnica/programa de cálculo.

En una realización particularmente preferida, el "pI calculado" puede referirse a un pI calculado usando la Scripps Protein Calculator v3.4, que es una herramienta en línea disponible en www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.

Cuando sea adecuado, el pI calculado de una proteína se puede confirmar experimentalmente usando la técnica de isoelectroenfoque ("pI observado"). Esta técnica utiliza electroforesis para separar proteínas según su pI. El isoelectroenfoque se realiza normalmente usando un gel que tiene un gradiente de pH inmovilizado. Cuando se aplica un campo eléctrico, la proteína migra a través del gradiente de pH hasta que alcanza el pH al que tiene carga neta cero, siendo este punto el pI de la proteína. Los resultados proporcionados por isoelectroenfoque son normalmente de naturaleza de resolución relativamente baja y, por tanto, los presentes inventores creen que los resultados proporcionados por pI calculado (como se ha descrito anteriormente) son más apropiados para su uso. A lo largo de la presente memoria descriptiva, "pI" significa "pI calculado" a menos que se indique otra cosa. El pI de una proteína puede aumentarse o disminuirse alterando el número de grupos básicos y/o ácidos presentados en su superficie. Esto se puede lograr modificando uno o más aminoácidos de la proteína. Por ejemplo, se puede proporcionar un aumento de pI reduciendo el número de restos ácidos o aumentando el número de restos básicos. Dichas modificaciones de aminoácidos se analizan con más detalle a continuación.

A modo de ejemplo, el pI calculado de BoNT/A (SEQ ID No. 14) es 6,4. También se proporciona el pI calculado para BoNT catiónicas: Cat-A, Cat-B y Cat-C que se enseñan en el documento WO2015/004461; así como para Cat Hⁿ_v1, Cat Hⁿ_v2 y Cat Hⁿ_v3.

Se logra la determinación del pH para su uso en la presente invención con referencia al pI de la toxina clostridial que se purifica. Por ejemplo, si el objeto de la purificación es rBoNT/A catiónica (SEQ ID No. 2), que tiene un pI calculado de 7,4, el valor de pH para su uso en la invención es pH 6,4 o superior. Del mismo modo, si es "Cat-A" (SEQ ID No.

16) que tiene un pI de 7,3, el valor de pH para su uso en la invención es aproximadamente pH 6,3 o superior.

Tabla 1. Valores calculados de pI para varias neurotoxinas clostridiales.

(continuación)

Los 20 aminoácidos convencionales encontrados en las proteínas son como se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Aminoácidos.

Los siguientes aminoácidos se consideran aminoácidos con carga: ácido aspártico (negativo), ácido glutámico (negativo), arginina (positiva) y lisina (positiva).

A un pH de 7.4, las cadenas laterales de ácido aspártico (pKa 3,1) y ácido glutámico (pKa 4,1) tienen una carga negativa, mientras que las cadenas laterales de arginina (pKa 12,5) y lisina (pKa 10,8) tienen una carga positiva. El ácido aspártico y el ácido glutámico se denominan restos de aminoácidos ácidos. La arginina y la lisina se denominan restos de aminoácidos básicos.

Los siguientes aminoácidos se consideran aminoácidos polares sin carga (lo que significa que pueden participar en enlaces de hidrógeno): asparagina, glutamina, histidina, serina, treonina, tirosina, cisteína, metionina y triptófano.

Los siguientes aminoácidos se consideran aminoácidos hidrófobos sin carga: alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, prolina y glicina.

El método y/o uso según la presente invención da como resultado de manera adecuada un aumento de la unión y/o rendimiento de una neurotoxina clostridial. De manera adecuada, el "aumento de la unión y/o rendimiento" se puede determinar mediante comparación de la unión y/o el rendimiento obtenido usando un método y/o uso de la invención con un método y/o uso similar utilizando un valor de pH diferente al de la invención pero que por lo demás es idéntico.

El término "unión" como se usa en este contexto en la presente memoria se refiere a la asociación de una neurotoxina clostridial con una resina de intercambio catiónico. La concentración de neurotoxina clostridial unida puede determinarse comparando la concentración de neurotoxina clostridial en una composición de partida antes de entrar en contacto con una resina de intercambio catiónico y la concentración (si la hay) de neurotoxina clostridial restante en una solución que ha entrado en contacto con una resina de intercambio catiónico. En algunas realizaciones, la concentración de neurotoxina clostridial en una composición de partida puede compararse con la concentración de neurotoxina clostridial en una fracción de flujo continuo que representa proteínas en una composición que no se asocia con una resina de intercambio catiónico.

Los métodos y/o usos de la presente invención pueden lograr una unión de al menos aproximadamente 50 % de la neurotoxina clostridial total comprendida en una composición. De manera adecuada, el método y/o uso puede lograr una unión de al menos aproximadamente 60 % o 70 % de la neurotoxina clostridial total comprendida en una composición.

De manera adecuada, el método y/o uso puede lograr una unión de al menos aproximadamente 80 % o 90 % de la neurotoxina clostridial total comprendida en una composición. Preferiblemente una unión de al menos aproximadamente 95 %, 97 % o 99 %.

El término "rendimiento" como se emplea en esta memoria se refiere a la cantidad (p. ej., concentración) de neurotoxina clostridial obtenida después de llevar a cabo un método y/o uso de la invención. En algunas realizaciones, el "rendimiento" puede calcularse comparando la cantidad (p. ej., concentración) de neurotoxina clostridial en una composición de partida con la cantidad (p. ej., concentración) de neurotoxina clostridial presente en una fracción eluida de una resina de intercambio catiónico.

El método y/o uso de la presente invención puede comprender además separar una neurotoxina clostridial de un resto de intercambio catiónico. Esto puede denominarse en la presente memoria "elución". La separación se puede lograr mediante el uso de un tampón de elución apropiado. Normalmente para cromatografía de intercambio iónico (p. ej., cromatografía de intercambio catiónico), se diseña un tampón que comprende una concentración apropiada de una sal apropiada que desplaza una proteína unida de la resina de intercambio iónico (p. ej., resina de intercambio catiónico).

En algunas realizaciones, una neurotoxina clostridial asociada con una resina de intercambio catiónico puede exponerse a un tampón de elución. De manera adecuada, cualquier solución puede separarse después de la resina de intercambio catiónico. Por ejemplo, cuando se usa una columna, se pueden recoger una o más fracciones.

Por lo tanto, en una realización, se proporciona una neurotoxina clostridial comprendida en un tampón de elución.

En otra realización, se proporciona un producto intermedio de purificación comprendido en un tampón de elución.

En una realización adicional más, se proporciona una neurotoxina clostridial obtenible por un método y/o uso de la invención comprendida en un tampón de elución.

En una realización, se puede aplicar una concentración de gradiente de tampón de elución a una resina de intercambio catiónico asociada con una neurotoxina clostridial. El gradiente se puede preparar mezclando un tampón de elución que tenga una concentración de sal deseada (p. ej., una concentración de sal que sea mayor que la concentración a partir de la cual una neurotoxina clostridial eluye de una resina de intercambio catiónico) con uno o más tampones adicionales que tienen una concentración de sal diferente (p. ej., menor).

En algún ejemplo, una neurotoxina clostridial separada de una resina de intercambio catiónico puede estar en un estado sustancialmente puro.

La expresión "estado puro", como se emplea en esta memoria, significa un estado en el que una neurotoxina clostridial está libre de contaminantes de neurotoxina no clostridial (p. ej., contaminantes proteicos).

La expresión "sustancialmente puro" como se emplea en esta memoria significa que en una composición dada una neurotoxina clostridial está en su mayoría libre de contaminantes distintos de neurotoxina clostridial (p. ej., contaminantes proteicos) y representa al menos aproximadamente 85 %, 90 % o 95 % de la concentración total de proteínas. De manera adecuada, la neurotoxina clostridial puede representar al menos aproximadamente 97 %, 99 % o 99,9 % de la concentración total de proteínas.

Se describe en la presente memoria una neurotoxina clostridial obtenible (p. ej., obtenida) por un método o uso de la presente invención. De manera adecuada, la neurotoxina clostridial puede ser una neurotoxina clostridial sustancialmente pura.

En una realización, la invención proporciona un producto intermedio de purificación que comprende una neurotoxina clostridial asociada con una resina de intercambio catiónico, en donde el producto intermedio de purificación tiene un valor de pH de al menos pH 7,3.

En una realización, un producto intermedio de purificación puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 (de manera adecuada al menos pH 7,4 o pH 7,5).

De manera adecuada, un producto intermedio de purificación puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,6 o al menos aproximadamente pH 7,7.

De manera adecuada, un producto intermedio de purificación puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,8 o al menos aproximadamente pH 7,9.

De manera adecuada, un intermedio de purificación puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 8,0.

En otra realización, un producto intermedio de purificación puede tener un pH entre aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente pH 9,5. De manera adecuada, un producto intermedio de purificación puede tener un pH entre aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente pH 9,0 o entre aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente pH 8,5.

De manera adecuada, un producto intermedio de purificación puede tener un valor de pH de aproximadamente pH 7,5.

De manera adecuada, un producto intermedio de purificación puede tener un valor de pH de aproximadamente pH 8,0.

Se entiende que la expresión "intermedio de purificación", como se emplea en esta memoria, se refiere a una neurotoxina clostridial que ha sido sometida o está siendo sometida al menos a una etapa de purificación pero que no ha sido sometida a todas las etapas de purificación previstas por el trabajador cualificado. En algunas realizaciones, el producto intermedio de purificación puede estar en un estado sustancialmente puro.

En un ejemplo, una neurotoxina clostridial puede ser obtenible (p. ej., obtenida) de un intermedio de purificación de la invención. De manera adecuada, la neurotoxina clostridial puede estar en un estado sustancialmente puro.

Un producto intermedio de purificación según la presente invención puede distinguirse de un producto intermedio de purificación obtenible por un método alternativo por al menos el valor de pH del tampón en el que está comprendido dicho producto intermedio de purificación y/o neurotoxina clostridial.

En otras palabras, un tampón en el que un intermedio de purificación y/o una neurotoxina clostridial según la presente invención pueden tener un valor de pH de al menos aproximadamente pH 7,3. De manera adecuada, el tampón puede tener un valor de pH que es al menos pH 7,3 y comprender además una concentración de sal que sea coherente con un tampón de elución de intercambio catiónico.

El tampón de elución puede comprender uno o más de: NaCl, KCl, CaCh, MgCh y (N H ^S O ⁴.

En una realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 y puede comprender al menos aproximadamente NaCl 50 mM o al menos aproximadamente NaCl 100 mM.

En otra realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 y puede comprender al menos aproximadamente NaCl 200 mM o al menos aproximadamente NaCl 300 mM (de manera adecuada al menos aproximadamente NaCl 400 mM o al menos aproximadamente NaCl 500 mM).

En una realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 y puede comprender al menos aproximadamente KCl 50 mM o al menos aproximadamente KCl 100 mM.

En otra realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 y puede comprender al menos aproximadamente KCl 200 mM o al menos aproximadamente KCl 300 mM (de manera adecuada al menos aproximadamente KCl 400 mM o al menos aproximadamente KCl 500 mM).

En una realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 y puede comprender al menos aproximadamente CaCh 50 mM o al menos aproximadamente CaCh 100 mM.

En otra realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 y puede comprender al menos aproximadamente CaCh 200 mM o al menos aproximadamente CaCh 300 mM (de manera adecuada al menos aproximadamente CaCh 400 mM o al menos aproximadamente CaCh 500 mM).

En una realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 y puede comprender al menos aproximadamente MgCh 50 mM o al menos aproximadamente MgCh 100 mM.

En otra realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 y puede comprender al menos aproximadamente MgCh 200 mM o al menos aproximadamente MgCh 300 mM (de manera adecuada al menos aproximadamente MgCh 400 mM o al menos aproximadamente MgCh 500 mM).

En una realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 y puede comprender al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴50 mM o al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴100 mM.

En otra realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos aproximadamente pH 7,3 y puede comprender al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴200 mM o al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴ 300 mM (de manera adecuada al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴400 mM o al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴500 mM).

Un tampón para su uso en la presente invención puede comprender preferiblemente además Bis-Tris propano 50 mM pH 8,0.

Cuando se eluye de un resto de intercambio catiónico de acuerdo con la presente invención, se puede usar un tampón que comprende Bis-Tris Propano 50 mM pH 8,0 en combinación con un gradiente de elución de aproximadamente 0 a aproximadamente 500 mM de sal. De manera adecuada, la sal puede seleccionarse del grupo que consiste en: NaCl, KCl, CaCl², MgCh y (N H ^S O ⁴) (preferiblemente NaCl).

Un tampón que tiene un valor de pH que es -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de una neurotoxina clostridial para su uso en un uso de la invención puede ser un tampón de elución. El tampón de elución puede comprender uno o más de: NaCl, KCl, CaCh, MgCh y (Nh ⁴)²SO⁴.

En una realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de la neurotoxina clostridial y puede comprender al menos aproximadamente NaCl 50 mM o al menos aproximadamente NaCl 100 mM.

En otra realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de la neurotoxina clostridial y puede comprender al menos aproximadamente NaCl 200 mM o al menos aproximadamente NaCl 300 mM (de manera adecuada al menos aproximadamente NaCl 400 mM o al menos aproximadamente NaCl 500 mM).

En una realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de la neurotoxina clostridial y puede comprender al menos aproximadamente KCl 50 mM o al menos aproximadamente KCl 100 mM.

En otra realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de la neurotoxina clostridial y puede comprender al menos aproximadamente KCl 200 mM o al menos aproximadamente KCl 300 mM (de manera adecuada al menos aproximadamente KCl 400 mM o al menos aproximadamente KCl 500 mM).

En una realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de la neurotoxina clostridial y puede comprender al menos aproximadamente CaCh 50 mM o al menos aproximadamente CaCh 100 mM.

En otra realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de la neurotoxina clostridial y puede comprender al menos aproximadamente CaCh 200 mM o al menos aproximadamente CaCh 300 mM (de manera adecuada al menos aproximadamente CaCh 400 mM o al menos aproximadamente CaCl²500 mM).

En una realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de la neurotoxina clostridial y puede comprender al menos aproximadamente MgCh 50 mM o al menos aproximadamente MgCh 100 mM.

En otra realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de la neurotoxina clostridial y puede comprender al menos aproximadamente MgCh 200 mM o al menos aproximadamente MgCh 300 mM (de manera adecuada al menos aproximadamente MgCh 400 mM o al menos aproximadamente MgCh 500 mM).

En una realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de la neurotoxina clostridial y puede comprender al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴50 mM o al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴100 mM.

En otra realización, dicho tampón puede tener un valor de pH que es al menos -1 unidad de pH o mayor que el pI calculado de la neurotoxina clostridial y puede comprender al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴200 mM o al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴ 300 mM (de manera adecuada al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴ 400 mM o al menos aproximadamente (NH⁴)²SO⁴500 mM).

Un tampón para su uso en la presente invención puede comprender preferiblemente además Bis-Tris propano 50 mM pH 8,0.

Cuando se eluye de un resto de intercambio catiónico de acuerdo con la presente invención, se puede usar un tampón que comprende Bis-Tris Propano 50 mM pH 8,0 en combinación con un gradiente de elución de aproximadamente 0 a aproximadamente 500 mM de sal. De manera adecuada, la sal puede seleccionarse del grupo que consiste en: NaCl, KCl, CaCl², MgCh y (NH⁴)²SO⁴ (preferiblemente NaCl).

Homología de secuencia

Se puede usar cualquiera de una diversidad de métodos de alineación de secuencias para determinar el porcentaje de identidad, incluyendo, sin limitación, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como, p. ej., métodos de enfoque por segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica. Los métodos globales alinean secuencias desde el principio hasta el final de la molécula y determinan la mejor alineación sumando puntuaciones de pares de restos individuales e imponiendo penalizaciones por hueco. Los métodos no limitantes incluyen, p. ej., CLUSTAL W, véase, p. ej., Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22 (22) Nucleic Acids Research 4673­ 4680 (1994); y refinamiento por iteraciones, véase, p. ej., Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264 (4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996). Los métodos locales alinean secuencias identificando uno o más motivos conservados compartidos por todas las secuencias de entrada. Los métodos no limitantes incluyen, p. ej., Match-box, véase, p. ej., Eric Depiereux y Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8 (5) CABIOS 501 -509 (1992); muestreo de Gibbs, véase, p. ej., C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262 (5131) Science 208-214 (1993); Align-M, véase, p. ej., Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20 (9) Bioinformatics:1428-1435 (2004).

Por tanto, el porcentaje de identidad de secuencia se determina por métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992. En resumen, se alinean dos secuencias de aminoácidos para optimizar las puntuaciones de alineación usando una penalización por apertura de hueco de 10, una penalización por extensión de hueco de 1 y la matriz de puntuación "blosum 62" de Henikoff y Henikoff (misma referencia) como se muestra a continuación (los aminoácidos se indican mediante los códigos convencionales de una letra).

Puntuaciones de alineación para determinar la identidad de secuencia

A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V

A 4

R-1 5

N-2 0 6

D-2-2 1 6

C 0 -3 -3 -3 9

Q-1 1 0 0 - 35

E -1 0 0 2 -4 2 5

G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6

H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8

I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4

L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4-3 2 4

K-1 2 0 - 1 - 31 1-2-1 -3-2 5

M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2-1 5

F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -10 0 -3 0 6

P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7

S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4

T 0 -1 0-1-1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 - 2 - 11 5

W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1-4-3-211

Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7

V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -33 1 -2 1 -1 -2 -20 -3 -1 4

El porcentaje de identidad se calcula entonces como:

Los polipéptidos sustancialmente homólogos se caracterizan por tener una o más sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de naturaleza menor, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras (véase a continuación) y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegamiento o la actividad del polipéptido; pequeñas supresiones, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tales como un resto de metionina amino terminal, un péptido conector pequeño de hasta aproximadamente 20-25 restos o un marcador de afinidad.

Sustituciones de aminoácidos conservadoras

Básicos: arginina

lisina

histidina

Ácidos: ácido glutámico

ácido aspártico

Polares: glutamina

asparagina

Hidrófobos: leucina

isoleucina

valina

Aromáticos: fenilalanina

triptófano

tirosina

Pequeños: glicina

alanina

serina

treonina

metionina

Además de los 20 aminoácidos convencionales, también se pueden sustituir restos de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención por aminoácidos no convencionales (tales como 4-hidroxiprolina, 6-A/-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y a-metil serina). Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no están codificados por el código genético y aminoácidos no naturales pueden sustituir restos de aminoácidos de polipéptidos clostridiales. Los polipéptidos de la presente invención también pueden comprender restos de aminoácidos de origen no natural.

Los aminoácidos de origen no natural incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metano-prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxi-prolina, N-metilglicina, alo-treonina, metil-treonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitro-glutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafeni-alanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. Son conocidos en la técnica varios métodos para incorporar restos de aminoácidos de origen no natural en proteínas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema in vitro en donde las mutaciones sin sentido se suprimen usando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Son conocidos en la técnica métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se lleva a cabo en un sistema libre de células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas y otros reactivos disponibles en el mercado. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véase, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). En un segundo método, se lleva a cabo traducción en ovocitos de Xenopus por microinyección de ARNm mutado y ARNt supresores químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). Dentro de un tercer método, se cultivan células de E. coli en ausencia de un aminoácido natural que se va a reemplazar (p. ej., fenilalanina) y en presencia del aminoácido o de los aminoácidos deseados de origen no natural (p. ej., 2-azafenilalanina, 3 azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido de origen no natural se incorpora al polipéptido en lugar de su homólogo natural. Véase, Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994. Los restos de aminoácidos de origen natural pueden convertirse en especies de origen no natural mediante modificación química in vitro. La modificación química se puede combinar con mutagénesis dirigida para expandir adicionalmente el intervalo de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).

Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos de origen no natural y aminoácidos no naturales pueden sustituir restos de aminoácidos de polipéptidos de la presente invención.

Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Los sitios de interacción biológica también se pueden determinar mediante el análisis físico de la estructura, según lo determinado por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje de fotoafinidad, junto con mutación de aminoácidos del sitio de contacto potencial. Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., Fe Bs Lett. 309:59-64, 1992. Las identidades de aminoácidos esenciales también se pueden inferir a partir del análisis de homologías con componentes relacionados (p. ej., los componentes de translocación o proteasa) de los polipéptidos de la presente invención.

Se pueden realizar y probar múltiples sustituciones de aminoácidos usando métodos conocidos de mutagénesis y exploración, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989). En resumen, estos autores describen métodos para seleccionar aleatoriamente de manera simultánea dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar el polipéptido funcional y después secuenciar los polipéptidos mutados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden usarse incluyen la presentación en fagos (p. ej., Lowman et al., Biochem.

30:10832-7, 1991; Ladner et al., patente de los Estados Unidos n.° 5.223.409; Huse, Publicación de la OMPI WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).

Se pueden realizar y probar múltiples sustituciones de aminoácidos usando métodos conocidos de mutagénesis y exploración, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989). En resumen, estos autores describen métodos para seleccionar aleatoriamente de manera simultánea dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar el polipéptido funcional y después secuenciar los polipéptidos mutados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden usarse incluyen la presentación en fagos (p. ej., Lowman et al., Biochem.

30:10832-7, 1991; Ladner et al., patente de los Estados Unidos n.° 5.223.409; Huse, Publicación de la OMPI WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).

Ventajas

De acuerdo con las realizaciones anteriores, es un hallazgo fundamental de los presentes inventores que una neurotoxina clostridial es capaz de interactuar con una resina de intercambio catiónico a un valor de pH de al menos pH 7,3. Esto es inesperado porque (sin pretender quedar ligados a teoría alguna) dicha neurotoxina clostridial tiene un valor de pH mayor que su pl calculado y se cree que tiene una carga general negativa. Por tanto, es muy sorprendente que sea capaz de interactuar (especialmente con una eficacia de unión tan alta) con una resina de intercambio catiónico, que se sabe que se asocia con proteínas con carga positiva.

Una ventaja adicional de la presente invención es que se puede mantener el mismo pH durante todo el proceso de purificación. En otras palabras, se reduce y/o elimina la necesidad de cambios de tampón que requieren mucho tiempo

(en métodos similares donde se usa un valor de pH inferior a pH 7,3), mejorando de este modo la eficacia y/o el rendimiento. Adicionalmente o como alternativa, mantener el mismo pH durante todo el proceso de purificación significa provechosamente que se reduce la manipulación física de una composición que comprende una neurotoxina clostridial y/o un producto intermedio de purificación y/o neurotoxina clostridial.

Los usos que comprenden poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial, en donde el contacto se produce a un pH de -1 unidad de pH o mayor que el punto isoeléctrico calculado de dicha neurotoxina clostridial da como resultado una serie de propiedades mejoradas. Por ejemplo, dichos usos logran mayor unión y/o rendimiento de una neurotoxina clostridial en comparación con un uso similar donde el contacto no se produce a un valor de pH que es -1 unidad de pH o mayor que el punto isoeléctrico calculado de dicha neurotoxina clostridial.

Sin pretender quedar ligados a teoría alguna, Se cree que al poner en contacto una neurotoxina clostridial y una columna de intercambio catiónico en las condiciones de pH indicadas, ese aumento de la unión de la neurotoxina clostridial a una columna de intercambio catiónico evita que estén presentes contaminantes (p. ej., contaminantes proteicos) en la unión de la composición y, por tanto, eluyan conjuntamente con la toxina clostridial.

La unión mejorada de una neurotoxina clostridial a una resina de intercambio catiónico también mejora la eficacia de la purificación, dando como resultado mayores rendimientos y/o costes reducidos asociados con cada purificación. En otras palabras, se proporciona un proceso de purificación menos derrochador y/o más económico.

Los métodos y/o usos de la invención significan provechosamente que es necesario emplear menos etapas de purificación para obtener una neurotoxina clostridial de un grado adecuado para su uso en terapia y/o medicina.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente descripción. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994) y Hale y Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en la presente descripción.

Esta descripción no está limitada por los métodos y materiales ilustrativos descritos en la presente memoria y cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria puede usarse en la práctica o prueba de realizaciones de la presente descripción. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el rango. A menos que se indique otra cosa, cualquier secuencia de ácido nucleico se escribe de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxilo, respectivamente.

Los encabezados proporcionados en la presente memoria no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la presente descripción que se pueden tener por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. Por consiguiente, los términos definidos a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto.

Se hace referencia a los aminoácidos en la presente memoria usando el nombre del aminoácido, la abreviatura de tres letras o la abreviatura de una letra.

El término "proteína", como se emplea en esta memoria, incluye proteínas, polipéptidos y péptidos.

Como se emplea en esta memoria, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "polipéptido" y/o el término "proteína". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "péptido". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "enzima".

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en la presente memoria. En la presente descripción y las reivindicaciones, se pueden usar los códigos convencionales de una letra y tres letras para restos de aminoácidos. El código de 3 letras para aminoácidos como se define de conformidad con la Comisión Conjunta de IUPACIUB sobre Nomenclatura Bioquímica (JCBN). También se entiende que un polipéptido puede estar codificado por más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético.

Pueden aparecer otras definiciones de términos a lo largo de la memoria descriptiva. Antes de que las realizaciones ejemplares se describan con más detalle, se debe entender que la presente descripción no se limita a realizaciones particulares descritas, ya que estas pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es con el fin de describir solo realizaciones particulares y no se desea que sea limitante, dado que el alcance de la presente descripción estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente otra cosa, entre los límites superior e inferior de ese intervalo también se describe de manera específica. Cada intervalo menor entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido se incluye dentro de esta descripción. Los límites superior e inferior de estos intervalos menores se pueden incluir o excluir de manera independiente en el intervalo, y cada intervalo donde uno, ninguno o ambos límites están incluidos en los intervalos menores también se incluye en esta descripción, sujeto a cualquier límite excluido de manera específica en el intervalo establecido. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en esta descripción.

Cabe destacar que como se emplea en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/a" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente indique otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una neurotoxina clostridial" incluye una pluralidad de dichos agentes candidatos y la referencia a "la neurotoxina clostridial" incluye referencia a una o más neurotoxinas clostridiales y equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

Las publicaciones analizadas en la presente memoria se proporcionan únicamente por su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo contenido en la presente memoria debe interpretarse como una admisión de que dichas publicaciones constituyen un estado de la técnica anterior a las reivindicaciones adjuntas a la presente.

La invención se describirá ahora, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a las siguientes figuras y ejemplos.

Ejemplos

EJEMPLO 1 - Cultivo de hospedador y expresión de proteínas rBoNT/A solubles

Se usó una sola colonia de células BL21 (DE3), transformadas con un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN de rBoNT/A (SEQ ID No. 1 o 3), para inocular 100 ml de caldo de cultivo Terrific modificado (mTB) complementado con kanamicina 30 pg/ml. Este método sería igualmente aplicable cuando se utiliza una perla Microbank™ o una reserva de glicerol (10-100 pl) para inocular el matraz. El cultivo se incubó durante 16 h a 37 °C con agitación a 250 RPM.

Después de la incubación, se usó un total de 10 ml del cultivo de 100 ml para inocular 1 l de mTB complementado con glucosamina al 0,2 % y kanamicina 30 pg/ml. El cultivo se incubó a 37 °C con 250 RPM hasta que se alcanzó una DO⁶⁰⁰ de 0,5. En este punto, la temperatura de incubación se redujo a 16 °C. Después de 1 h, se indujo expresión de la proteína diana con IPTG 1 mM seguido de incubación a 16 °C durante 20 h con agitación a 225 RPM. Después de la incubación, las células se recogieron por centrifugación a 4000x g durante 20 min a 4 °C y después se almacenaron a -20 °C.

EJEMPLO 2 - Extracción de proteínas de rBoNT/A de células hospedadoras

Las pastas celulares se descongelaron a temperatura ambiente y se resuspendieron en 3 ml de Bis-Tris 50 mM pH 6,0, tampón de NaCl 50 mM por gramo de células, después se añadieron 10 pl de nucleasa Benzonase® a la suspensión celular. Las células fueron lisadas, a 0-4 °C, por sonicación a 100 W (10 ciclos de 30 s encendido y 45 s apagado). Los lisados se centrifugaron a 4000x g durante 1 h a 4 °C para proporcionar el rBoNT/A soluble (SEQ ID No. 2 o 4) en el sobrenadante clarificado.

EJEMPLO 3 - Captura de la proteína de rBoNT/A diana

Las propiedades de las proteínas de rBoNT/A se determinaron a partir de la secuencia proteica primaria usando la Scripps Protein Calculator v3.4 del Scripps Research Institute (Tabla 3).

Tabla 3: Propiedades predichas de rBoNT/A

Basándose en los valores calculados de pl, se predijo que rBoNT/A (SEQ ID No. 4) y rBoNT/A catiónico (SEQ ID No.

2) se unirían a una resina de intercambio catiónico (CEX) a un pH de tampón <6,5 y <7,4, respectivamente.

EJEMPLO 4 - Desalación del lisado clarificado en tampones de prueba

Los lisados clarificados que contenían rBoNT/A soluble (SEQ ID No. 2 y 4) se dividieron en partes iguales y se intercambió su tampón en los tampones de carga enumerados en la Tabla 4 usando una columna de desalación Econo-Pac 10DG.

Tabla 4: Tampones de carga usados para la exploración de tampón de CEX.

Los lisados clarificados, con tampón intercambiado, se almacenaron a 4 °C antes de cargarlos en una columna HiTrap SP HP.

EJEMPLO 5 - Exploración de tampón para la etapa de captura por cromatografía de CEX de rBoNT/A (SEQ ID No. 4) usando cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC)

Los lisados con tampón intercambiado que contenían rBoNT/A soluble (SEQ ID No. 4) se cargaron en una columna HiTrap SP HP. El % de unión y el % de pureza de la proteína diana eluida se determinaron mediante SDS-PAGE y densitometría. La elución de la proteína unida se logró empleando un gradiente lineal de pH o NaCl (Tabla 5).

Tabla 5: Tampones de carga y gradiente de elución usados para la exploración de tampón de CEX.

La FIGURA 1 (paneles A-F) muestra geles de SDS-PAGE teñidos con coomassie de los perfiles de elución de rBoNT/A (SEQ ID No. 4) después de la unión con y elución de la resina de sepharose SP HP usando las condiciones de la Tabla 5. El análisis de los geles de SDS-PAGE permitió estimar el % de pureza de la proteína diana eluida (Tabla 6).

Tabla 6: Análisis de la unión de rBoNT/A (SEQ ID No. 4) a la resina de sepharose SP HP

La evaluación visual de los geles de SDS-PAGE (FIGURA 1) muestra una mayor recuperación de proteína diana después de la elución con las condiciones 3-6, lo que sugiere mayor unión inicial de la proteína diana a la resina. EJEMPLO 6 - Exploración de tampón para la etapa de captura por cromatografía de CEX de rBoNT/A catiónica (SEQ ID No. 2) usando cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC)

Los lisados con tampón intercambiado que contenían rBoNT/A soluble catiónico (SEQ ID No. 2) se cargaron en una columna HiTrap SP HP. El % de unión y el % de pureza de la proteína diana eluida se determinaron mediante análisis de SDS-PAGE. La elución de la proteína unida se logró empleando un gradiente lineal de pH o NaCl (Tabla 5). La FIGURA 2 (paneles A-F) muestra geles de SDS-PAGE teñidos con coomassie de los perfiles de elución de rBoNT/A catiónico (SEQ ID No. 2) después de la unión con y elución de la resina de sepharose SP HP usando las condiciones de la Tabla 5. El análisis de los geles de SDS-PAGE permitió estimar el % de pureza y el % de unión de la proteína diana a la resina de sepharose SP HP (Tabla 7).

Tabla 7: Análisis de la unión de rBoNT/A catiónica (SEQ ID No. 2) a la resina de sepharose SP HP

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para purificar una neurotoxina clostridial que comprende:

(a) poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial, en donde la etapa de contacto se realiza en un tampón con un pH superior a -1 unidad de pH por debajo del pI calculado de la neurotoxina clostridial, en donde dicha etapa de poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende dicha neurotoxina clostridial se produce antes de la conversión de dicha neurotoxina clostridial de una forma de cadena única a una forma de cadena doble;

(b) separar la neurotoxina clostridial de la resina de intercambio catiónico; y

(c) recuperar la neurotoxina clostridial de cadena sencilla.

2. Un método según la reivindicación 1, en donde la neurotoxina clostridial separada está en un estado sustancialmente puro.

3. Un producto intermedio de purificación que comprende una neurotoxina clostridial asociada con una resina de intercambio catiónico, en donde el producto intermedio de purificación tiene un valor de pH de al menos pH 6,5, preferiblemente al menos pH 7,3, y en donde la resina de intercambio catiónico se pone en contacto con dicha neurotoxina clostridial antes de la conversión de dicha neurotoxina clostridial de una forma de cadena única a una forma de cadena doble.

4. Un método o producto intermedio de purificación según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el valor de pH es:

(a) al menos aproximadamente pH 6,5;

(b) al menos aproximadamente pH 7,5, preferiblemente aproximadamente pH 7,6, más preferiblemente al menos aproximadamente pH 7,7, aún más preferiblemente al menos aproximadamente pH 7,8;

(c) entre aproximadamente pH 7,3 y aproximadamente pH 9,5; o

(d) entre aproximadamente pH 7,3 y aproximadamente pH 8,0.

5. Uso de un tampón que tiene un valor de pH que está más de -1 unidad de pH por debajo del pI calculado de una neurotoxina clostridial de cadena sencilla para poner en contacto una composición que comprende la neurotoxina clostridial con una resina de intercambio catiónico antes de la conversión de dicha forma de cadena única en forma de cadena doble para aumentar la unión y/o el rendimiento de la neurotoxina clostridial de cadena sencilla, en comparación con el uso de un valor de pH que está más de -1 unidades de pH por debajo del pI calculado de dicha neurotoxina clostridial en condiciones idénticas.

6. Un uso según la reivindicación 5, en donde el valor de pH es:

(a) al menos aproximadamente pH 6,5;

(b) al menos el pI calculado de dicha neurotoxina clostridial, preferiblemente al menos aproximadamente 0,2 unidades de pH por encima, más preferiblemente al menos 0,5 unidades de pH por encima del pI calculado de dicha neurotoxina clostridial;

(c) entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 1,5 unidades de pH por encima del pI calculado de dicha neurotoxina clostridial; o

(d) entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 1,0 unidades de pH por encima del pI calculado de dicha neurotoxina clostridial.

7. Un método o uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4-6, en donde poner en contacto una resina de intercambio catiónico con una composición que comprende una neurotoxina clostridial es una primera etapa de purificación (p. ej., una primera etapa de purificación cromatográfica).

8. Un método o uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4-6, en donde la purificación comprende una o más etapas adicionales.

9. Un método o kit según la reivindicación 8, en donde la o las etapas adicionales comprenden poner en contacto la composición que comprende una neurotoxina clostridial con una o más resinas adicionales y opcionalmente en donde:

(a) el contacto con una o más resinas adicionales se lleva a cabo después de la etapa de poner en contacto la resina de intercambio catiónico con la composición que comprende la neurotoxina clostridial; y/o

(b) la o las etapas adicionales se seleccionan del grupo que consiste en cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de modo mixto, cromatografía de inducción de carga hidrófoba, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad;

en donde preferiblemente el método comprende la etapa adicional de cromatografía de intercambio aniónico después de la etapa de poner en contacto la resina de intercambio catiónico con la composición que comprende la neurotoxina clostridial.

10. Un método o uso según la reivindicación 8 o 9, en donde la o las etapas adicionales comprenden convertir la neurotoxina botulínica de una forma de cadena sencilla a una forma de cadena doble después de la recuperación de la neurotoxina clostridial de cadena sencilla.

11. Un método o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4-10, en donde al menos 35% (preferiblemente al menos 40%, 50% 60%, 70% u 80% ) de la neurotoxina clostridial total comprendida en la composición se asocia con la resina de intercambio catiónico.

12. Un método, uso o producto intermedio de purificación según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la neurotoxina clostridial es una o más seleccionadas del grupo que consiste en: Clostridia botulinum, Clostridia tetani, Clostridia baratii y C. butyricum.

13. Un método, uso o producto intermedio de purificación según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la neurotoxina clostridial es una neurotoxina botulínica (BoNT), preferiblemente una o más BoNT seleccionadas del grupo que consiste en: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BonT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, más preferiblemente en donde la BoNT es una BoNT catiónica.