KR20180080205A - 클로스트리디움 신경독소를 정제하는 방법 - Google Patents

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실파 파란
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Abstract

양이온 교환 수지를 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 접촉 단계는 적어도 pH 7.3에서 수행되고, 여기서 양이온 교환 수지를 상기 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계가 단일 쇄 형태로부터 이중쇄 형태로의 클로스트리디움 신경독소의 전환 전에 일어나는 것인, 클로스트리디움 신경독소를 정제하는 방법이 제공된다. 또한, 클로스트리디움 신경독소가 단일 쇄 형태인 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 갖는 완충제의 용도, 정제 중간체 및 본 발명에 의해 수득가능한 클로스트리디움 신경독소가 제공된다.

Description

클로스트리디움 신경독소를 정제하는 방법
본 발명은 클로스트리디움 신경독소를 정제하는 방법, 완충제의 용도, 정제 중간체 및 본원의 방법 및 용도에 의해 수득된 클로스트리디움 신경독소에 관한 것이다.
클로스트리디아(Clostridia) 속의 박테리아는 그들이 전달되는 뉴런 및 다른 세포를 독살할 수 있는 매우 강력하고 특이적인 단백질 독소를 생산한다. 이러한 클로스트리디움 독소의 예로는 씨. 테타니(C. tetani) (TeNT)에 의해 및 씨. 보툴리눔(C. botulinum) (BoNT) 혈청형 A 내지 G에 의해 생산되는 신경독소, 뿐만 아니라 씨. 바라티이(C. baratii) 및 씨. 부티리쿰(C. butyricum)에 의해 생산되는 것들을 들 수 있다.
클로스트리디움 신경독소 중에서 가장 강력한 독소의 일부가 공지되어 있다. 예로서, 보툴리눔 신경독소는 혈청형에 따라 0.5 내지 5 ng/kg의 범위의 마우스에 대한 중위 치사 용량 (LD50) 값을 갖는다. 테타누스 및 보툴리눔 독소 둘 다는 영향을 받은 뉴런의 기능, 구체적으로 신경전달물질의 방출을 억제함으로써 작용한다. 보툴리눔 독소는 신경근 연접부에서 작용하며, 말초 신경계에서 콜린성 전달을 억제하는 반면, 테타누스 독소는 중추 신경계에서 작용한다.
사실상, 클로스트리디움 신경독소는 단일-쇄 폴리펩티드로서 합성되며, 이는 단백질분해적 절단 사건에 의해 번역후 변형되어 디술피드 결합에 의해 함께 결합된 2개의 폴리펩티드 쇄를 형성한다. 절단은 종종 쇄간 디술피드 결합을 제공하는 시스테인 잔기 사이에 위치하는 활성화 부위로 지칭되는 특이적 절단 부위에서 일어난다. 독소의 활성 형태는 이러한 이중쇄 형태이다. 2개의 쇄는 대략 100 kDa의 분자 질량을 갖는 중쇄 (H-쇄), 및 대략 50 kDa의 분자 질량을 갖는 경쇄 (L-쇄)로 용어화된다. H-쇄는 N-말단 전위 성분 (HN 도메인) 및 C-말단 표적화 성분 (HC 도메인)을 포함한다. 절단 부위는 L-쇄 및 전위 도메인 성분 사이에 위치한다. HC 도메인의 그의 표적 뉴런에의 결합 및 엔도솜을 통한 세포 내로의 결합된 독소의 내재화 후, HN 도메인은 엔도솜 막을 거쳐 및 시토졸 내로 L-쇄를 전위시키고, L-쇄는 프로테아제 기능 (비-세포독성 프로테아제로도 공지됨)을 제공한다.
비-세포독성 프로테아제는 SNARE 단백질 (예를 들어 SNAP-25, VAMP, 또는 신탁신(Syntaxin))로 공지된 세포내 수송 단백질을 단백질분해적으로 절단함으로써 작용한다 - 문헌 [Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc.] 참조. 두문자어 SNARE는 용어 가용성 NSF 부착 수용체 (Soluble NSF Attachment Receptor)로부터 유래되며, 여기서 NSF는 N-에틸말레이미드-민감성 인자 (N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)를 의미한다. SNARE 단백질은 세포내 소포 융합에, 따라서 세포로부터의 소포 수송을 통한 분자의 분비에 필수적이다. 프로테아제 기능은 아연-의존적 엔도펩티다제 활성이며, SNARE 단백질에 대한 높은 기질 특이성을 나타낸다. 따라서, 일단 목적하는 표적 세포로 전달되면, 비-세포독성 프로테아제는 표적 세포로부터의 세포 분비를 억제할 수 있다. 클로스트리디움 신경독소의 L-쇄 프로테아제는 SNARE 단백질을 절단하는 비-세포독성 프로테아제이다.
SNARE 단백질의 편재적 성질의 관점에서, 클로스트리디움 신경독소, 예컨대 보툴리눔 독소는 광범위한 요법에 성공적으로 채용되었다.
예로서, 본 발명자들은 문헌 [William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004)]을 언급하며, 여기에는 다수의 치료적 및 화장료적 또는 미용적 적용에서의 뉴런 전달을 억제하기 위한 클로스트리디움 신경독소, 예컨대 보툴리눔 신경독소 (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 테타누스 신경독소 (TeNT)가 기재되어 있으며 - 예를 들어, 시장화된 보툴리눔 독소 제품은 현재 국소 강직, 상지 강직, 하지 강직, 목 이긴장증, 안검연축, 반얼굴 연축, 겨드랑이의 다한증, 만성 편두통, 신경성 배뇨근 과다활동, 미간 선, 및 중증 측면 안각 선을 비롯한 증상에 대한 치료제로서 승인되어 있다. 또한, 신경근 장애를 치료하기 위한 (US 6,872,397 참조); 자궁 장애를 치료하기 위한 (US 2004/0175399 참조); 궤양 및 위식도 역류 질환을 치료하기 위한 (US 2004/0086531 참조); 이긴장증을 치료하기 위한 (US 6,319,505 참조); 눈 장애를 치료하기 위한 (US 2004/0234532 참조); 안검연축을 치료하기 위한 (US 2004/0151740 참조); 사시를 치료하기 위한 (US 2004/0126396 참조); 통증을 치료하기 위한 (US 6,869,610, US 6,641,820, US 6,464,986, 및 US 6,113,915 참조); 섬유근통을 치료하기 위한 (US 6,623,742, US 2004/0062776 참조); 하부 요통을 치료하기 위한 (US 2004/0037852 참조); 근육 손상을 치료하기 위한 (US 6,423,319 참조); 부비동 두통을 치료하기 위한 (US 6,838,434 참조); 긴장 두통을 치료하기 위한 (US 6,776,992 참조); 두통을 치료하기 위한 (US 6,458,365 참조); 편두통 통증의 감소를 위한 (US 5,714,469 참조); 심혈관 질환을 치료하기 위한 (US 6,767,544 참조); 신경학적 장애, 예컨대 파킨슨병을 치료하기 위한 (US 6,620,415, US 6,306,403 참조); 신경정신병적 장애를 치료하기 위한 (US 2004/0180061, US 2003/0211121 참조); 내분비 장애를 치료하기 위한 (US 6,827,931 참조); 갑상선 장애를 치료하기 위한 (US 6,740,321 참조); 콜린성 영향받은 한선 장애를 치료하기 위한 (US 6,683,049 참조); 당뇨병을 치료하기 위한 (US 6,337,075, US 6,416,765 참조); 췌장 장애를 치료하기 위한 (US 6,261,572, US 6,143,306 참조); 암, 예컨대 골 종양을 치료하기 위한 (US 6,565,870, US 6,368,605, US 6,139,845, US 2005/0031648 참조); 귀 장애를 치료하기 위한 (US 6,358,926, US 6,265,379 참조); 자율신경 장애, 예컨대 위장 근육 장애 및 다른 평활근 기능이상을 치료하기 위한 (US 5,437,291 참조); 피부 세포-증식성 장애와 연관된 피부 병변의 치료를 위한 (US 5,670,484 참조); 신경성 염증성 장애의 관리를 위한 (US 6,063,768 참조); 탈모를 감소시키고, 모발 성장을 자극하기 위한 (US 6,299,893 참조); 하강된 입을 치료하기 위한 (US 6,358,917 참조); 식욕을 감소시키기 위한 (US 2004/40253274 참조); 치과 요법 및 절차를 위한 (US 2004/0115139 참조); 신경근 장애 및 상태를 치료하기 위한 (US 2002/0010138 참조); 다양한 장애 및 상태 및 연관된 통증을 치료하기 위한 (US 2004/0013692 참조); 점액 과다분비로부터 초래되는 상태, 예컨대 천식 및 COPD를 치료하기 위한 (WO 00/10598 참조); 및 비-뉴런 상태, 예컨대 염증, 내분비 상태, 외분비 상태, 면역학적 상태, 심혈관 상태, 골 상태를 치료하기 위한 (WO 01/21213 참조) 클로스트리디움 신경독소 요법이 기재되어 있다. 상기 공보 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인간 및 다른 포유동물의 치료적 및 화장료적 치료에 있어서의 비-세포독성 프로테아제, 예컨대 클로스트리디움 신경독소 (예를 들어 BoNT 및 TeNT)의 용도는 이들 독소의 특성으로부터 유익을 받을 수 있는 계속 넓어지는 범위의 질환 및 질병으로 확대될 것으로 예상된다.
전신적 신경학적 효과를 회피하기 위해, 많은 클로스트리디움 신경독소 요법은 주어진 표적 부위 (예컨대 표적 조직)에의 클로스트리디움 신경독소 치료제의 직접적 투여를 이용한다. 클로스트리디움 신경독소-기반 치료제를 이 방식으로 투여하는 경우의 문제점은 투여 부위로부터의 및 주위의 조직 또는 전신적 순환 내로의 독소의 확산이다. 표적 조직으로부터의 독소의 확산은 극심한 경우 삶을 위협할 수 있는 바람직하지 않은 부작용의 원인이 되는 것으로 믿어진다. 이는 클로스트리디움 신경독소 치료제 (예컨대 BoNT 치료제)를 높은 용량, 농도 및 주사 부피로 사용하는 경우 특히 문제가 될 수 있다. 시판되는 BoNT/A 치료제에 대해 보고된 이 문제와 연관된 유해 효과로는 무력증, 일반적 근육 약화, 복시, 안검하수증, 연하곤란, 발성장애, 조음장애, 요실금, 및 호흡 곤란을 들 수 있다. 연하 및 호흡 곤란은 삶을 위협할 수 있으며, 독소 효과의 확산과 관련된 사망이 보고되었다. 이들 문제는 조작된 클로스트리디움 신경독소의 등전점 (pI)을 증가시키는 적어도 1개의 아미노산 변형을 포함하는 조작된 클로스트리디움 신경독소를 제공한 WO2015/004461 A1 (본원에 참조로 포함됨)에서 다루어지고, 해결되었다.
클로스트리디움 신경독소를 정제하는 방법은 관련 기술분야에 제공되어 있다. WO2006/096163 A1 (본원에 참조로 포함됨)은 안정화 비-독성 단백질과 복합체화된 보툴리눔 신경독소 유형 A를 정제하기 위한 크로마토그래피 공정 및 시스템을 교시한다. WO2006/096163 A1은 마무리 칼럼으로서 양이온 교환 칼럼 (즉, 보툴리눔 신경독소 유형 A 복합체가 이미 하나 이상의 이전의 칼럼으로 처리되고, 실질적으로 순수한 상태인 경우 사용되는 칼럼)의 사용을 포함하는, 복수의 크로마토그래피 공정을 교시한다. WO2006/096163 A1에는 보툴리눔 신경독소 유형 A 복합체로 양이온 교환 크로마토그래피를 결합하고 수행하는 경우 매우 낮은 pH 값 (예를 들어 pH 4.0)을 사용하는 것이 교시되어 있다.
그러나, 바람직하게는 클로스트리디움 신경독소의 정제를 보다 적은 (및/또는 임의로 보다 유효한) 단계로 용이하게 하는, 개선된 공정 및/또는 개선된 수율을 제공하는 클로스트리디움 신경독소 (특히 비-복합체화된 클로스트리디움 신경독소)를 정제하기 위한 최적화되고 향상된 기술에 대한 필요가 여전히 존재한다.
제1 측면에 따르면, 본 발명은 양이온 교환 수지를 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 접촉 단계는 적어도 pH 7.3에서 수행되고, 여기서 양이온 교환 수지를 상기 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 상기 단계는 단일 쇄 형태로부터 이중쇄 형태로의 상기 클로스트리디움 신경독소의 전환 전에 일어나는 것인, 클로스트리디움 신경독소를 정제하는 방법을 제공한다.
제2 측면에서, 양이온 교환 수지와 회합된 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 정제 중간체이며, 여기서 정제 중간체는 적어도 pH 7.3의 pH 값을 갖고, 여기서 상기 클로스트리디움 신경독소는 단일 쇄 형태인 정제 중간체가 제공된다.
제3 측면에서, 양이온 교환 수지로부터 분리되어 있는 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 정제 중간체이며, 여기서 정제 중간체는 적어도 pH 7.3의 pH 값을 갖고, 여기서 상기 클로스트리디움 신경독소는 단일 쇄 형태인 정제 중간체가 제공된다.
제4 측면에서, 본 발명은 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물을, 동일한 조건 하에서 상기 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위 초과로 낮은 pH 값을 사용하는 것과 비교 시, 클로스트리디움 신경독소의 증가된 결합 및/또는 수율을 위해 양이온 교환 수지와 접촉시키기 위한, 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 갖는 완충제의 용도이며, 여기서 상기 클로스트리디움 신경독소는 단일 쇄 형태인 용도를 제공한다.
제5 측면에서, 선행하는 청구항 중 어느 하나의 방법 또는 용도에 의해 수득가능한 및/또는 본 발명의 정제 중간체로부터 단리된 클로스트리디움 신경독소가 제공된다.
이하, 본 발명의 실시양태를 단지 예로서, 첨부된 도면을 참조하여 설명할 것이다:
도 1은 상이한 pH에서의 양이온 교환 수지 상의 rBoNT/A1 포획을 나타낸다. 내음성 rBoNT/A1의 이. 콜라이(E. coli) 용해물을 pH 6.0 (패널 A 및 B), pH 7.5 (패널 C 및 D), 또는 pH 8.0 (패널 E 및 F)으로 완충제 교환하였다. 용해물을 하이-트랩(Hi-Trap) SP-HP 상으로 로딩하고, 세척하고, pH (패널 A) 또는 NaCl (패널 B 내지 F) 구배 중 어느 하나로 용리하였다. 분획 F5-F16을 SDS-PAGE에 의해 분석하였으며, BoNT/A는 각각의 패널 상에 별표 (*)로 지시된다.
도 2는 상이한 pH에서의 양이온 교환 수지 상의 양이온성 rBoNT/A1 포획을 나타낸다. 내음성 양이온성 rBoNT/A1의 이. 콜라이 용해물을 pH 6.0 (패널 A 및 B), pH 7.5 (패널 C 및 D), 또는 pH 8.0 (패널 E 및 F)으로 완충제 교환하였다. 용해물을 하이-트랩 SP-HP 상으로 로딩하고, 세척하고, pH (패널 A) 또는 NaCl (패널 B 내지 F) 구배 중 어느 하나로 용리하였다. 관련된 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였으며, BoNT/A는 각각의 패널 상에 별표 (*)로 지시된다.
도 3은 양이온성 BoNT/A1 (예를 들어 천연 BoNT/A1과 비교 시 증가된 등전점을 갖는 BoNT/A1) 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 1)을 나타낸다.
도 4는 양이온성 rBoNT/A1 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 2)을 나타낸다.
도 5는 rBoNT/A1 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 3)을 나타낸다.
도 6은 rBoNT/A1 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 4)을 나타낸다.
도 7은 양이온성 BoNT/A, "CatHN_v1", 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 5)을 나타낸다.
도 8은 양이온성 BoNT/A, "CatHN_v1", 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 6)을 나타낸다.
도 9는 양이온성 BoNT/A, "CatHN_v2", 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 7)을 나타낸다.
도 10은 양이온성 BoNT/A, "CatHN_v2", 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 8)을 나타낸다.
도 11은 양이온성 BoNT/A, "CatHN_v3", 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 9)을 나타낸다.
도 12는 양이온성 BoNT/A, "CatHN_v3", 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 10)을 나타낸다.
도 13은 양이온성 BoNT/E 경쇄, "CatLC", 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 11)을 나타낸다.
도 14는 양이온성 BoNT/E 경쇄, "CatLC", 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 12)을 나타낸다.
도 15는 BoNT/A1 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 13)을 나타낸다.
도 16은 BoNT/A1 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 14)을 나타낸다.
도 17은 양이온성 BoNT/A1, "Cat-A", 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 15)을 나타낸다.
도 18은 양이온성 BoNT/A1, "Cat-A", 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 16)을 나타낸다.
도 19는 양이온성 BoNT/A1, "Cat-B", 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 17)을 나타낸다.
도 20은 양이온성 BoNT/A1, "Cat-B", 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 18)을 나타낸다.
도 21은 양이온성 BoNT/A1, "Cat-C", 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 19)을 나타낸다.
도 22는 양이온성 BoNT/A1, "Cat-C", 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 20)을 나타낸다.
도 23은 양이온성 BoNT/A1, "Cat-D", 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 21)을 나타낸다.
도 24는 양이온성 BoNT/A1, "Cat-D", 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 22)을 나타낸다.
본 발명의 중대한 발견은 클로스트리디움 신경독소가 양이온 교환 잔기와 적어도 pH 7.3에서 회합한다는 것이다. 이는 고도로 예상외의 것이며, 정제되는 단백질의 pI 훨씬 미만인 양이온 교환 크로마토그래피 동안의 pH 값을 사용하는 것을 교시하는 선행 기술의 우세한 지식과 대조적이다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도, 상기 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점 (pI)보다 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 갖는 완충제의 용도가 상이한 pH 조건 하에서 유사한 용도와 비교 시 결합 및/또는 수율을 증가시킴을 발견하였다.
따라서, 한 실시양태에서, 양이온 교환 수지를 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 접촉 단계는 적어도 pH 7.3에서 수행되고, 여기서 양이온 교환 수지를 상기 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 상기 단계는 단일 쇄 형태로부터 이중쇄 형태로의 상기 클로스트리디움 신경독소의 전환 전에 일어나는 것인, 클로스트리디움 신경독소를 정제하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 접촉 단계는 적어도 약 pH 7.3에서 수행될 수 있다. 적합하게는, 접촉 단계는 적어도 약 pH 7.4 또는 적어도 pH 7.5에서 수행될 수 있다.
적합하게는, 접촉 단계는 적어도 약 pH 7.6 또는 적어도 약 pH 7.7에서 수행될 수 있다.
적합하게는, 접촉 단계는 적어도 약 pH 7.8 또는 적어도 약 pH 7.9에서 수행될 수 있다.
적합하게는, 접촉 단계는 적어도 약 pH 8.0에서 수행될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 접촉 단계는 적어도 약 pH 7.3 내지 약 pH 9.5에서 수행될 수 있다. 적합하게는, 접촉 단계는 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.0, 또는 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5의 pH 값에서 수행될 수 있다.
적합하게는, 접촉 단계는 약 pH 7.5의 pH 값에서 수행될 수 있다.
적합하게는, 접촉 단계는 약 pH 8.0의 pH 값에서 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "정제하는"은 바람직하게는 비-클로스트리디움 신경독소 오염물이 없는 클로스트리디움 신경독소를 얻을 목적으로, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물에 존재할 수 있는 1종 이상의 비-클로스트리디움 신경독소 오염물을 제거하는 것을 의미한다. 다시 말해서, 용어 "정제하는"은 달리 언급되지 않는다면, 절대적 정제라기 보다는 정제의 정도를 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "정제하는"은 비-클로스트리디움 신경독소 오염물의 적어도 5% (적합하게는 적어도 10% 또는 20%)를 제거하는 것을 지칭할 수 있다. 적합하게는, "정제하는"은 오염물의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%를 제거하는 것을 지칭할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물을, 동일한 조건 하에서 상기 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위 초과로 낮은 pH 값을 사용하는 것과 비교 시, 클로스트리디움 신경독소의 증가된 결합 및/또는 수율을 위해 양이온 교환 수지와 접촉시키기 위한, 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 갖는 완충제의 용도이며, 여기서 상기 클로스트리디움 신경독소는 단일 쇄 형태인 용도가 제공된다.
본원에 사용된 용어 "클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위 초과인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은"은 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위인 값보다 더 높은 pH를 의미한다. 예를 들어, 이 용어는 -0.5, +0.5, +1 pH 단위 등을 포함할 것이다. 예로서, 클로스트리디움 신경독소가 8.0의 pI를 갖는 경우, -1 pH 단위 초과인 값 또는 그 값보다 더 높은 pH 값은 pH 7.0 초과의 pH 값, 예를 들어 pH 8.0, pH 9.0 등을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "상기 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위 초과로 낮은"은 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위인 값보다 더 낮은 pH를 의미한다. 예를 들어, 이 용어는 -2 pH 단위 등을 포함할 것이다. 예로서, 클로스트리디움 신경독소가 8.0의 pI를 갖는 경우, -1 pH 단위 초과로 낮은 pH 값은 pH 7.0 미만의 pH, 예를 들어 pH 6.0, pH 5.0 등을 의미한다.
본 발명에 사용하기 위한 양이온 교환 수지는 클로스트리디움 신경독소와 회합할 수 있는 임의의 종류의 양이온 교환 수지일 수 있다. 한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 강 양이온 교환 수지, 약 양이온 교환 수지 또는 이들의 조합일 수 있다.
적합하게는, 양이온 교환 수지는 강 양이온 교환 수지일 수 있다.
강 양이온 교환제의 비-제한적 예로는 SP 세파로스(Sepharose) HP, SP 세파로스 FF (둘 다 영국의 지이 헬스케어(GE Healthcare)로부터 이용가능함), 무스탕(Mustang) S, S 세라믹(Ceramic), 하이퍼D(HyperD)® F, 무스탕 S를 갖는 아크로디스크(Acrodisc), 무스탕 S를 갖는 아크로프렙(AcroPrep) 및/또는 S 세라믹 하이퍼D® F를 갖는 아크로셉(AcroSep) (이들 모두는 (달리 지시되지 않는다면) 미국 11050 뉴욕주 포트 워싱턴 하버 파크 드라이브 25 소재의 폴 코포레이션(Pall Corporation)으로부터 시판됨)을 들 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 술폰산을 포함하는 강 양이온 교환 수지일 수 있다.
한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 SP 세파로스 HP 수지 및/또는 SP 세파로스 FF 수지 (모두 영국의 지이 헬스케어로부터 시판됨)일 수 있다.
약 양이온 교환제의 비-제한적 예로는 CM 세라믹 하이퍼D® F, CM 세라믹 및/또는 하이퍼D® F를 갖는 아크로셉 (이들 모두는 미국 11050 뉴욕주 포트 워싱턴 하버 파크 드라이브 25 소재의 폴 코포레이션으로부터 시판됨)을 들 수 있다.
한 실시양태에서, 약 양이온 교환 수지는 카르복시메틸을 포함하는 수지일 수 있다.
한 실시양태에서, 혼합 방식 수지가 사용될 수 있다. 혼합 방식 수지는 이온성 상호작용을 통해 표적 단백질과 상호작용하는 하전된 리간드를 사용할 수 있으며, 1종 이상의 관능기(들) (예를 들어, 수소 결합에 의한 상호작용, 소수성, 및 반 데르 발스 상호작용을 초래함)로 향상될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 혼합 방식 수지는 이온 교환 수지 및 소수성 상호작용 수지로서 기능할 수 있다. 적합하게는, 혼합 방식 수지는 양이온 교환 수지 (적합하게는 약 양이온 교환 수지) 및 소수성 상호작용 수지로서 기능할 수 있다.
혼합 방식 수지의 비-제한적 예로는 캅토(Capto) 멀티모드 범위의 크로마토그래피 칼럼 (영국의 지이 헬스케어로부터 시판됨)을 들 수 있다.
사실상, 클로스트리디움 신경독소는 단일-쇄 폴리펩티드로서 합성되며, 이는 단백질분해적 절단 사건에 의해 번역후 변형되어 디술피드 결합에 의해 함께 결합된 2개의 폴리펩티드 쇄를 형성한다. 절단은 종종 쇄간 디술피드 결합을 제공하는 시스테인 잔기 사이에 위치하는 활성화 부위로 지칭되는 특이적 절단 부위에서 일어난다. 독소의 활성 형태는 이러한 이중쇄 형태이다. 2개의 쇄는 대략 100 kDa의 분자 질량을 갖는 중쇄 (H-쇄), 및 대략 50 kDa의 분자 질량을 갖는 경쇄 (L-쇄)로 용어화된다. H-쇄는 N-말단 전위 성분 (HN 도메인) 및 C-말단 표적화 성분 (HC 도메인)을 포함한다. 절단 부위는 L-쇄 및 전위 도메인 성분 사이에 위치한다. HC 도메인의 그의 표적 뉴런에의 결합 및 엔도솜을 통한 세포 내로의 결합된 독소의 내재화 후, HN 도메인은 엔도솜 막을 거쳐 및 시토졸 내로 L-쇄를 전위시키고, L-쇄는 프로테아제 기능 (비-세포독성 프로테아제로도 공지됨)을 제공한다.
많은 상이한 유형의 클로스트리디움 신경독소는 본 발명에 사용하기에 적합하다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 용어 "클로스트리디움 신경독소"는 씨. 보툴리눔(보툴리눔 신경독소 혈청형 A, B, C1, D, E, F 및 G), 씨. 테타니(테타누스 신경독소), 씨. 부티리쿰(보툴리눔 신경독소 혈청형 E), 및 씨. 바라티이(보툴리눔 신경독소 혈청형 F)에 의해 생산된 독소, 뿐만 아니라 변형된 클로스트리디움 신경독소 또는 상기 중 임의의 것으로부터 유래된 유도체를 포괄한다. 용어 "클로스트리디움 신경독소"는 또한 천연 발생 보툴리눔 신경독소 혼성체, 모자이크 및 키메라를 포괄할 수 있다.
이 맥락에서 사용된 용어 "모자이크"는 또 다른 유형의 클로스트리디움 신경독소 (예를 들어 상이한 혈청형의 클로스트리디움 신경독소)로부터의 적어도 1개의 기능적 도메인을 포함하는 천연 발생 클로스트리디움 신경독소 (상기 클로스트리디움 신경독소는 통상적으로 적어도 1개의 기능적 도메인을 포함하지 않음)를 지칭한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 클로스트리디아 보툴리눔(Clostridia botulinum), 클로스트리디아 테타니(Clostridia tetani), 클로스트리디아 바라티이(Clostridia baratii) 및 씨. 부티리쿰으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 클로스트리디아로부터 수득가능할 수 있다.
보툴리눔 신경독소 (BoNT)는 다수의 보조 단백질에 복합체화된 BoNT 그 자체로 이루어진, 큰 단백질 복합체의 형태의 씨. 보툴리눔에 의해 생산된다. 현재 8개의 상이한 부류의 보툴리눔 신경독소, 즉: 보툴리눔 신경독소 혈청형 A, B, C1, D, E, F, G, 및 H가 있으며, 이들 모두는 유사한 구조 및 작용 방식을 공유한다. 상이한 BoNT 혈청형은 특이적 중화 항-혈청에 의한 불활성화에 기초하여 구별될 수 있으며, 이러한 혈청형에 의한 분류는 아미노산 수준에서의 백분율 서열 동일성과 상관된다. 주어진 혈청형의 BoNT 단백질은 아미노산 백분율 서열 동일성에 기초하여 상이한 하위유형으로 추가로 나누어진다.
BoNT는 위장관에서 흡수되며, 일반 순환에 들어간 후, 콜린성 신경 말단의 시냅스전 막에 결합하고, 그들의 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 방지한다. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G는 시냅토브레빈/소포-회합된 막 단백질 (VAMP)을 절단하고; BoNT/C1, BoNT/A 및 BoNT/E는 25 kDa의 시냅토솜-회합된 단백질 (SNAP-25)을 절단하고; BoNT/C1은 신탁신을 절단한다.
테타누스 독소는 씨. 테타니에 의해 단일 혈청형에서 생산된다. 씨. 부티리쿰은 BoNT/E를 생산하는 반면, 씨. 바라티이는 BoNT/F를 생산한다.
한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소는 TeNT일 수 있다. 참조 TeNT 서열은 유니프롯KB(UniProtKB) 수탁 번호 P04958을 갖는다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 보툴리눔 신경독소 (BoNT), 바람직하게는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 및 BoNT/G로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 BoNT(들)일 수 있다.
한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소는 BoNT/A일 수 있다. 참조 BoNT/A 서열은 유니프롯KB 수탁 번호 P10845를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소는 BoNT/B일 수 있다. 참조 BoNT/B 서열은 유니프롯KB 수탁 번호 P10844를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소는 BoNT/C일 수 있다. 참조 BoNT/C1 서열은 유니프롯KB 수탁 번호 P18640을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소는 BoNT/D일 수 있다. 참조 BoNT/D 서열은 유니프롯KB 수탁 번호 P19321을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소는 BoNT/E일 수 있다. 참조 BoNT/E 서열은 유니프롯KB 수탁 번호 Q00496을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소는 BoNT/F일 수 있다. 참조 BoNT/F 서열은 유니프롯KB 수탁 번호 YP_001390123을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소는 BoNT/G일 수 있다. 참조 BoNT/G 서열은 유니프롯KB 수탁 번호 Q60393을 갖는다.
용어 "클로스트리디움 신경독소"는 또한 하기 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 변형된 클로스트리디움 신경독소 및 그의 유도체를 포괄하는 것으로 의도된다. 변형된 클로스트리디움 신경독소 또는 유도체는 클로스트리디움 신경독소의 천연 (비변형된) 형태에 비해 변형된 1개 이상의 아미노산을 함유할 수 있거나, 클로스트리디움 신경독소의 천연 (비변형된) 형태에 존재하지 않는 1개 이상의 삽입된 아미노산을 함유할 수 있거나, 클로스트리디움 신경독소의 천연 (비변형된) 형태와 비교 시 결실된 1개 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 예로서, 변형된 클로스트리디움 신경독소는 천연 (비변형된) 클로스트리디움 신경독소 서열에 비해 1개 이상의 도메인에 변형된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 변형은 신경독소의 기능적 측면, 예를 들어 생물학적 활성 또는 지속성을 변형시킬 수 있다.
변형된 클로스트리디움 신경독소는 WO2015/004461 A1에 교시된 변형된 클로스트리디움 신경독소 (예를 들어 양이온성 BoNT)일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 양이온성 BoNT/A일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 양이온성 BoNT/B일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 양이온성 BoNT/C일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 양이온성 BoNT/D일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 양이온성 BoNT/E일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 양이온성 BoNT/F일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 양이온성 BoNT/G일 수 있다.
양이온성 BoNT는 그의 천연 BoNT 대응물보다 더 높은 등전점을 갖는 BoNT이다.
변형된 클로스트리디움 신경독소는 중쇄의 아미노산 서열에 1개 이상의 변형 (예컨대 변형된 HC 도메인)을 가질 수 있으며, 여기서 상기 변형된 중쇄는 천연 (비변형된) 클로스트리디움 신경독소보다 더 높거나 더 낮은 친화도를 갖는 표적 신경 세포에 결합한다. HC 도메인에서의 이러한 변형은 표적 신경 세포의 강글리오시드 수용체 및/또는 단백질 수용체에의 결합을 변경시키는 HC 도메인의 강글리오시드 결합 부위에서 또는 단백질 (SV2 또는 시냅토타그민) 결합 부위에서 잔기를 변형시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 변형된 클로스트리디움 신경독소의 예는 WO 2006/027207 및 WO 2006/114308에 기재되어 있으며, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
변형된 클로스트리디움 신경독소는 경쇄의 아미노산 서열에 1개 이상의 변형, 예를 들어 변형된 LC의 SNARE 단백질 특이성을 변경시키거나 변형시킬 수 있는 기질 결합 또는 촉매 도메인에 변형을 가질 수 있다. 이러한 변형된 클로스트리디움 신경독소의 예는 WO 2010/120766 및 US 2011/0318385에 기재되어 있으며, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
변형된 클로스트리디움 신경독소는 변형된 클로스트리디움 신경독소의 생물학적 활성 및/또는 생물학적 지속성을 증가시키거나 감소시키는 1개 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 클로스트리디움 신경독소는 류신- 또는 티로신-기반 모티프를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 모티프는 변형된 클로스트리디움 신경독소의 생물학적 활성 및/또는 생물학적 지속성을 증가시키거나 감소시킨다. 적합한 류신-기반 모티프로는 xDxxxLL, xExxxLL, xExxxIL, 및 xExxxLM (여기서 x는 임의의 아미노산임)을 들 수 있다. 적합한 티로신-기반 모티프로는 Y-x-x-Hy (여기서 Hy는 소수성 아미노산임)를 들 수 있다. 류신- 및 티로신-기반 모티프를 포함하는 변형된 클로스트리디움 신경독소의 예는 WO 2002/08268에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
용어 "클로스트리디움 신경독소"는 혼성체 및 키메라 클로스트리디움 신경독소를 포괄하는 것으로 의도된다. 혼성체 또는 키메라 클로스트리디움 신경독소는 하나의 클로스트리디움 신경독소 또는 그의 하위유형으로부터의 경쇄의 적어도 일부, 및 또 다른 클로스트리디움 신경독소 또는 클로스트리디움 신경독소 하위유형으로부터의 중쇄의 적어도 일부를 포함한다.
한 실시양태에서, 혼성체 또는 키메라 클로스트리디움 신경독소는 하나의 클로스트리디움 신경독소 하위유형으로부터의 전체 경쇄 및 또 다른 클로스트리디움 신경독소 하위유형으로부터의 중쇄를 함유할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 키메라 클로스트리디움 신경독소는 하나의 클로스트리디움 신경독소 하위유형의 중쇄의 일부 (예를 들어 결합 도메인)을 함유할 수 있으며, 중쇄의 또 다른 일부는 또 다른 클로스트리디움 신경독소 하위유형이다. 유사하게 또는 대안적으로, 치료 요소는 상이한 클로스트리디움 신경독소로부터의 경쇄 부분을 포함할 수 있다. 이러한 혼성체 또는 키메라 클로스트리디움 신경독소는 예를 들어, 주어진 클로스트리디움 신경독소 하위유형에 면역학적으로 내성인 환자에게, 주어진 클로스트리디움 신경독소 중쇄 결합 도메인에 대한 수용체의 평균 농도보다 더 낮은 농도를 가질 수 있는 환자에게, 또는 막 또는 소포 독소 기질 (예를 들어, SNAP-25, VAMP 및 신탁신)의 프로테아제-내성 변이체를 가질 수 있는 환자에게 이러한 클로스트리디움 신경독소의 치료 유익을 전달하는 수단으로서 유용하다. 혼성체 및 키메라 클로스트리디움 신경독소는 US 8,071,110 및 GB1607901.4 (아직 공개되지 않음)에 기재되어 있으며, 이들 공보는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 방법 또는 용도에 따른 정제를 위한 클로스트리디움 신경독소는 조작된 클로스트리디움 신경독소일 수 있으며, 적합하게는, 이는 조작된 혼성체 클로스트리디움 신경독소, 또는 조작된 키메라 클로스트리디움 신경독소일 수 있다.
용어 "클로스트리디움 신경독소"는 재-표적화된 클로스트리디움 신경독소를 포괄하는 것으로 의도된다. 재-표적화된 클로스트리디움 신경독소에서, 클로스트리디움 신경독소는 표적화 모이어티 (TM: Targeting Moiety)로 공지된 외인성 리간드를 포함하도록 변형된다. TM은 목적하는 표적 세포에 대한 결합 특이성을 제공하도록 선택되며, 재-표적화 프로세스의 일부로서 클로스트리디움 신경독소의 천연 결합 부분 (예를 들어 HC 도메인, 또는 HCC 도메인)은 제거될 수 있다. 재-표적화 기술은 예를 들어, EP-B-0689459; WO 1994/021300; EP-B-0939818; US 6,461,617; US 7,192,596; WO 1998/007864; EP-B-0826051; US 5,989,545; US 6,395,513; US 6,962,703; WO 1996/033273; EP-B-0996468; US 7,052,702; WO 1999/017806; EP-B-1107794; US 6,632,440; WO 2000/010598; WO 2001/21213; WO 2006/059093; WO 2000/62814; WO 2000/04926; WO 1993/15766; WO 2000/61192; 및 WO 1999/58571에 기재되어 있으며; 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 조작된 클로스트리디움 신경독소는 조작된 재-표적화된 클로스트리디움 신경독소일 수 있다.
본 발명은 또한 비-천연 프로테아제 절단 부위를 갖는 클로스트리디움 신경독소 (또는 그의 용도)를 포괄한다. 이러한 클로스트리디움 신경독소에서, 천연 프로테아제 절단 부위 (상기 기재된 바와 같이 활성화 부위로도 공지됨)는 그 클로스트리디움 신경독소에 대해 천연이 아닌 프로테아제 절단 부위 (즉, 외인성 절단 부위)로 변형되거나 대체된다. 이러한 부위는 절단을 위해 외인성 프로테아제를 요구할 것이며, 이는 절단 사건의 시기 및 위치에 관한 개선된 제어를 허용한다. 클로스트리디움 신경독소에서 채용될 수 있는 비-천연 프로테아제 절단 부위는 하기를 포함한다:
엔테로키나제 (DDDDK↓)
인자 Xa (IEGR↓/ IDGR↓)
TEV (담배 식각 바이러스) (ENLYFQ↓G)
트롬빈 (LVPR↓GS)
프리시젼 (PreScission) (LEVLFQ↓GP).
추가의 프로테아제 절단 부위로는 비-세포독성 프로테아제에 의해, 예를 들어 클로스트리디움 신경독소의 경쇄에 의해 절단되는 인식 서열을 들 수 있다. 이들은 비-세포독성 프로테아제, 예컨대 클로스트리디움 신경독소의 경쇄에 의해 절단되는 SNARE (예를 들어 SNAP-25, 신탁신, VAMP) 단백질 인식 서열을 포함한다. 비-천연 프로테아제 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움 신경독소는 US 7,132,259, EP 1206554-B2 및 US 2007/0166332에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, 자기-절단 서열인 인테인이 용어 프로테아제 절단 부위에 의해 포괄된다. 자기-스플라이싱 반응은 예를 들어 존재하는 환원제의 농도를 다양화함으로써 제어가능하다.
본 발명은 또한 "파괴적 절단 부위"를 포함하는 클로스트리디움 신경독소의 용도를 포괄한다. 상기 클로스트리디움 신경독소에서, 비-천연 프로테아제 절단 부위는 상기 부위에서의 절단이 클로스트리디움 신경독소의 활성을 감소시키거나, 이를 불활성화시킬 것이도록 선택된 위치에서 클로스트리디움 신경독소 내로 혼입된다. 파괴적 프로테아제 절단 부위는, 클로스트리디움 신경독소가 투여 후 비-표적 위치로 이동하는 사건에서, 국소 프로테아제에 의한 절단에 대해 감수성일 수 있다. 적합한 비-천연 프로테아제 절단 부위로는 상기 기재된 것들을 들 수 있다. 파괴적 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움 신경독소는 WO 2010/094905 및 WO 2002/044199에 기재되어 있으며, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 PEG화될 수 있으며 - 이는 안정성, 예를 들어 경쇄 성분의 작용 기간을 증가시키는 것을 도울 수 있다. PEG화는 경쇄가 BoNT/A, B 또는 C1 프로테아제를 포함하는 경우 특히 바람직하다. PEG화는 바람직하게는 경쇄 성분의 N-말단에의 PEG의 첨가를 포함한다. 예로서, 경쇄의 N-말단은 동일하거나 상이할 수 있는 1개 이상의 아미노산 (예를 들어 시스테인) 잔기로 확장될 수 있다. 상기 아미노산 잔기 중 1개 이상은 그에 부착된 (예를 들어 공유적으로 부착된) 그 자신의 PEG 분자를 가질 수 있다. 이 기술의 예는 WO2007/104567에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 천연 발생 클로스트리디움 신경독소 복합체에 존재하는 복합체화 단백질이 없을 수 있다.
본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21을 포함하는 핵산 또는 그와 적어도 65% 또는 70% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21을 포함하는 핵산 또는 그와 적어도 75% 또는 80% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21을 포함하는 핵산 또는 그와 적어도 85% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21을 포함하는 핵산 또는 그와 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 22로서 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그와 적어도 65% 또는 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 22로서 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그와 적어도 75% 또는 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 22로서 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그와 적어도 85% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 22로서 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그와 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 13을 포함하는 핵산 또는 그와 적어도 65% 또는 70% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 13을 포함하는 핵산 또는 그와 적어도 75% 또는 80% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 13을 포함하는 핵산 또는 그와 적어도 85% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 13을 포함하는 핵산 또는 그와 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 14로서 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그와 적어도 65% 또는 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 14로서 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그와 적어도 75% 또는 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 14로서 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그와 적어도 85% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 14로서 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그와 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21을 포함하는 핵산, 또는 그와 적어도 65% 또는 70% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능한 양이온성 클로스트리디움 신경독소일 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21을 포함하는 핵산, 또는 그와 적어도 75% 또는 80% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능한 양이온성 클로스트리디움 신경독소일 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21을 포함하는 핵산, 또는 그와 적어도 85% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능한 양이온성 클로스트리디움 신경독소일 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21을 포함하는 핵산, 또는 그와 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산을 발현시킴으로써 수득가능한 양이온성 클로스트리디움 신경독소일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 22로서 나타내어진 폴리펩티드 서열, 또는 그와 적어도 65% 또는 70% 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 양이온성 클로스트리디움 신경독소일 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 22로서 나타내어진 폴리펩티드 서열, 또는 그와 적어도 75% 또는 80% 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 양이온성 클로스트리디움 신경독소일 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 22로서 나타내어진 폴리펩티드 서열, 또는 그와 적어도 85% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 양이온성 클로스트리디움 신경독소일 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 22로서 나타내어진 폴리펩티드 서열, 또는 그와 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 양이온성 클로스트리디움 신경독소일 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 "퍼센트 서열 동일성"은 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다. 따라서, % 동일성은 동일한 뉴클레오티드의 수 / 뉴클레오티드의 총 수로 나눈 아미노산 / 아미노산, 곱하기 100으로서 계산될 수 있다. % 서열 동일성의 계산은 또한 갭의 수, 및 2개 이상의 서열의 정렬을 최적화하기 위해 도입될 필요가 있는 각각의 갭의 길이를 고려할 수 있다. 서열 비교 및 2개 이상의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 특정 수학적 알고리듬, 예컨대 BLAST를 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 통상의 기술자에게 익숙할 것이다.
용어 "클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물"은 제조물의 임의의 상태의 임의의 이러한 조성물을 지칭한다.
한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 적어도 약 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있다. 적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 적어도 약 pH 7.4 또는 pH 7.5인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 적어도 약 pH 7.6 또는 적어도 약 pH 7.7인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 적어도 약 pH 7.8 또는 적어도 약 pH 7.9인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 적어도 약 pH 8.0인 pH 값을 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 약 pH 7.3 내지 약 pH 9.5의 pH를 가질 수 있다. 적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.0, 또는 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5의 pH를 가질 수 있다.
적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 약 pH 7.5의 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 약 pH 8.0의 pH 값을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 그에 포함된 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 그에 포함된 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 -0.5 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 적어도 그에 포함된 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 그에 포함된 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 적어도 약 0.2 pH 단위 또는 적어도 약 0.5 pH 단위 높은 값인 pH 값을 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 그에 포함된 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 약 -1 pH 단위 낮은 값 내지 계산된 등전점보다 약 2 pH 단위 높은 값인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 그에 포함된 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 약 -0.5 pH 단위 낮은 값 내지 계산된 등전점보다 약 1.5 pH 단위 높은 값인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 약 그에 포함된 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점 내지 계산된 등전점보다 약 2 pH 단위 높은 값인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 그에 포함된 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 약 0.2 pH 단위 높은 값 내지 계산된 등전점보다 약 1.5 pH 단위 높은 값인 pH 값을 가질 수 있다.
바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 그에 포함된 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 약 0.5 pH 단위 높은 값 내지 계산된 등전점보다 약 1.5 pH 단위 높은 값인 pH 값을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, "클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물"은 무세포 추출물 및/또는 세포 용해물일 수 있다. 용어 "무세포 추출물"은 추출물이 추출물의 총 부피 당 약 5% 미만의 세포, 보다 바람직하게는 약 1% 또는 0.1% 미만의 세포를 포함함을 의미한다.
무세포 추출물 및/또는 세포 용해물은 클로스트리디움 신경독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 본원의 뉴클레오티드 서열 중 1종 이상을 발현하는 숙주 세포로부터 수득가능할 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 숙주 세포일 수 있다.
세포 용해물은 세포 페이스트의 용해 후에 수득될 수 있다. 세포 페이스트는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 용해될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해는 적합하게는 적어도 1종의 뉴클레아제 (예를 들어 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 시판되는 벤조나제(Benzonase)®)의 존재 하에서 초음파처리를 사용하여 달성될 수 있다.
세포 용해물의 제조 후, 상기 세포 용해물은 완충제 교환될 수 있다. 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 방법론을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 이는 탈염 칼럼, 또는 적절한 투석 막 및 완충제로의 투석을 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 탈염 칼럼의 예로는 에코노-팩(Econo-Pac) 10DG 탈염 칼럼 (바이오-라드(Bio-Rad)로부터 시판됨)을 들 수 있다.
다른 실시양태에서, "클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물"은 하나 이상의 사전 정제 단계(들) (즉, 조성물을 수득하기 전에 수행되는 정제 단계)로부터 수득가능한 (예를 들어 수득된) 조성물일 수 있다. 사전 정제 단계는 관련 기술분야에 공지된 임의의 정제 단계, 바람직하게는 클로스트리디움 신경독소를 정제하는데 적합한 것으로 공지된 정제 단계일 수 있다. 사전 정제 단계는 크로마토그래피 정제 단계, 침전-기반 정제 단계 (예를 들어 황산암모늄 침전) 및 결정화 정제 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법 및/또는 용도는 양이온 교환 수지를 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 제1 정제 단계 (예를 들어 제1 크로마토그래피 단계)를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 방법 및/또는 용도는 하나 이상의 정제 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 정제 단계는 양이온 교환 잔기를 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키기 전에 또는 후에 수행될 수 있다. 적합하게는, 하나 이상의 정제 단계는 양이온 교환 잔기를 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시킨 후에 수행될 수 있다.
하나 이상의 정제 단계(들)는 크로마토그래피 정제 단계 및 침전-기반 정제 단계 (예를 들어 황산암모늄 침전)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "크로마토그래피 정제 단계"는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 또는 음이온 교환 크로마토그래피), 혼합 방식 크로마토그래피, 소수성 전하-유도 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 지칭할 수 있다.
한 실시양태에서, 크로마토그래피 정제 단계는 혼합 방식 크로마토그래피의 사용, 적합하게는 수산화인회석 수지의 사용을 포함할 수 있다. 적합하게는, 수산화인회석 수지는 수산화인회석 I 및/또는 수산화인회석 II 수지일 수 있다. 이러한 수지는 시판된다 (예를 들어 영국의 지이 헬스케어로부터).
또 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 정제 단계는 양이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피는 강 양이온 교환 수지 및/또는 약 양이온 교환 수지의 사용을 포함할 수 있다.
적합하게는, 강 양이온 교환 수지는 술폰산을 포함하는 수지일 수 있다.
적합하게는, 약 양이온 교환 수지는 카르복시메틸을 포함하는 수지일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 정제 단계는 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 강 음이온 교환 수지 및/또는 약 음이온 교환 수지의 사용을 포함할 수 있다.
강 음이온 교환 수지의 예로는 4급 암모늄을 포함하는 것들, 예컨대 무스탕® Q, Q 세라믹 하이퍼D® F, 무스탕 Q를 갖는 아크로디스크®, 무스탕 Q를 갖는 아크로프렙™, Q 세라믹 하이퍼D® F를 갖는 아크로셉™, Q 및 S 하이퍼셀(HyperCel) 및/또는 하이퍼셀 STAR AX (이들 모두는 미국 11050 뉴욕주 포트 워싱턴 하버 파크 드라이브 25 소재의 폴 코포레이션으로부터 시판됨)를 들 수 있다.
약 음이온 교환 수지의 예로는 카르복시메틸을 포함하는 것들, 예컨대 CM 세라믹 하이퍼D® F, CM 세라믹 및/또는 하이퍼D® F를 갖는 아크로셉 (이들 모두는 미국 11050 뉴욕주 포트 워싱턴 하버 파크 드라이브 25 소재의 폴 코포레이션으로부터 시판됨)을 들 수 있다.
크로마토그래피 정제 단계가 겔 여과 단계인 실시양태에서, 적합하게는 수지는 슈퍼덱스(Superdex) 200 수지 (영국의 지이 헬스케어로부터 시판됨)일 수 있다.
크로마토그래피 정제 단계가 소수성 상호작용 단계인 실시양태에서, 적합하게는 수지는 페닐(Phenyl) FF 수지, 옥틸(Octyl) FF 수지 및/또는 부틸(Butyl) FF 수지 (영국의 지이 헬스케어로부터 시판됨)일 수 있다.
크로마토그래피 정제 단계가 친화성 크로마토그래피 단계인 실시양태에서, 적합하게는 수지는 글루타티온 수지, 스트렙타비딘 수지, 비오틴 수지, 킬레이트화 금속 수지, 덱스트린 세파로스 수지 및 IgG 수지 (영국의 지이 헬스케어로부터 시판됨)로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피 정제 단계는 항체 친화성 크로마토그래피 단계일 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법 또는 용도는 보툴리눔 신경독소를 단일 쇄 형태로부터 이중쇄 형태 (활성화 단계)로 전환시키는 단계를 포함할 수 있다. 클로스트리디움 신경독소를 활성화시키는 것은 적합하게는 클로스트리디움 신경독소를 양이온 교환 수지와 접촉시킨 후에 수행된다. 보다 바람직하게는, 활성화 단계는 클로스트리디움 신경독소가 양이온 교환 수지로부터 분리된 후에 수행될 수 있다.
클로스트리디움 신경독소는 클로스트리디움 신경독소를, 적합한 프로테아제가 클로스트리디움 신경독소의 폴리펩티드 서열을 절단할 수 있는 조건에서 적합한 프로테아제와 접촉시킴 (및 임의로 인큐베이션함)으로써 활성화될 수 있다.
한 실시양태에서, 적합한 프로테아제는 클로스트리디움 신경독소 폴리펩티드 서열을, 그것이 활성화되도록 절단할 수 있는 엔도프로테아제일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 엔도프로테아제는 Lys-C 프로테아제일 수 있다. 적합한 Lys-C 프로테아제는 둘 다 본원에 참조로 포함되는 및/또는 WO2014/079495 또는 WO2014/080206에 교시된 것일 수 있다.
Lys-C 프로테아제는 임의의 적합한 공급원으로부터 수득가능할 수 있으며, 영국의 라이프 테크놀로지스 리미티드(Life Technologies Ltd)로부터 시판된다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및/또는 용도는 대안적으로 및/또는 추가적으로 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함할 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, Lys-C 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용한 클로스트리디움 신경독소의 활성화를 추가로 포함하는 (또는 그로 더 이루어지는) 본 발명의 방법 및/또는 용도가 제공된다.
바람직하게는, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 부틸 세파로스 수지, 페닐 세파로스 수지 및 옥틸 세파로스 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명은 양이온 교환 수지를 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다.
양이온 교환 수지를 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계에 대해 언급할 경우 용어 "접촉시키는"은 양이온 교환 수지와 클로스트리디움 신경독소의 회합을 용이하게 하기 위한 임의의 공지된 방법을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 접촉 단계는 양이온 교환 수지를 적합한 조건 하에서 적합한 시간 동안 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 함께 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 적합한 인큐베이션 조건은 단백질 안정성의 향상 및/또는 활성의 유지를 위해 선택되는 교반 또는 적절한 온도의 존재를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 접촉 단계는 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물을 양이온 교환 수지를 포함하는 칼럼에 적용함으로써 수행될 수 있다. 적합하게는, 접촉은 자동화 또는 반-자동화 공정을 사용함으로써, 예를 들어 자동화 액체 크로마토그래피 (예를 들어 고속 단백질 액체 크로마토그래피)를 위해 설계된 시스템을 사용함으로써 수행될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물은 양이온 교환 수지와 혼합될 수 있다. 적합하게는, 상기 혼합물은 결합을 용이하게 하는 적절한 온도 및/또는 시간에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 교반될 수 있다. 다른 실시양태에서, 정제 칼럼을 혼합물로부터 제조하고, 통상적인 액체 크로마토그래피 기술 (예를 들어 세척 및/또는 용리를 포함함)로 처리할 수 있다.
한 실시양태에서, "회합"은 적합하게는 전하-기반 상호작용 또는 회합일 수 있다. 적합하게는, "회합"은 클로스트리디움 신경독소와 회합된 양이온 교환 수지를 1종 이상의 세척 완충제에 노출시키는 것을 견뎌낼 수 있는 상호작용일 수 있다. 용어 "세척 완충제"는 양이온 교환 수지에의 원하지 않는 오염물 단백질 (적합하게는 클로스트리디움 신경독소가 아닌 단백질)의 결합을 방해하는데 사용하기 위한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 제조된 1종 이상의 완충제를 지칭한다. 전형적으로, 세척 완충제는, 그것이 양이온 교환 수지에의 클로스트리디움 신경독소의 결합을 상당히 방해하지 않고, 양이온 교환 수지에의 원하지 않는 오염물 단백질 (적합하게는 클로스트리디움 신경독소가 아닌 단백질)의 결합을 방해하는데 충분히 엄격하도록 제조될 수 있다.
적어도 약 pH 7.3의 pH를 갖는 완충제는 본 발명에 사용될 수 있다. 적합하게는, 적어도 약 pH 7.5의 pH를 갖는 완충제는 본 발명에 사용될 수 있다.
올바른 pH의 용액은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 임의의 적합한 완충제로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 완충제는 비스-트리스(Bis-Tris) (프로판), 비스-트리스 (메탄), 트리스(Tris), HEPES 또는 시트레이트 포스페이트를 포함할 수 있다. 적합하게는, 완충제는 비스-트리스 (프로판)을 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 완충제의 임의의 적합한 몰농도를 선택할 수 있다. 적합하게는, 몰농도는 약 50 mM일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 완충제는 적어도 약 pH 7.3 (적합하게는 적어도 약 pH 7.4 또는 pH 7.5)인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 적어도 약 pH 7.6 또는 적어도 약 pH 7.7인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 적어도 약 pH 7.8 또는 적어도 약 pH 7.9인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 적어도 약 pH 8.0인 pH 값을 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 약 pH 7.3 내지 약 pH 9.5의 pH를 가질 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.0, 또는 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5의 pH를 가질 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 약 pH 7.5의 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 약 pH 8.0의 pH 값을 가질 수 있다.
본 발명의 용도는 클로스트리디움 신경독소 (예를 들어 상기 용도의 대상체인 클로스트리디움 신경독소)의 계산된 등전점보다 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 갖는 완충제의 용도를 포함한다.
지칭되는 pH 값은 양이온 교환 수지가 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉되는 경우 측정되는 pH 값, 예를 들어 양이온 교환제 및 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물의 혼합물을 포함하는 용액의 pH 값일 수 있다.
본 발명은 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 갖는 완충제의 용도를 포함할 수 있다.
올바른 pH의 용액은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 임의의 적합한 완충제로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 완충제는 비스-트리스 (프로판), 비스-트리스 (메탄), 트리스, HEPES 또는 시트레이트 포스페이트를 포함할 수 있다. 적합하게는, 완충제는 비스-트리스 (프로판)을 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 완충제의 임의의 적합한 몰농도를 선택할 수 있다. 적합하게는, 몰농도는 약 50 mM일 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 사용하기 위한 pH 값은 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 -0.5 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 pH 값은 적어도 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점일 수 있다.
적합하게는, pH 값은 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 적어도 약 0.2 pH 단위 또는 적어도 약 0.5 pH 단위 높은 값일 수 있다.
한 실시양태에서, pH 값은 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 약 -1 pH 단위 낮은 값 내지 계산된 등전점보다 약 2 pH 단위 높은 값일 수 있다.
적합하게는, pH 값은 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 약 -0.5 pH 단위 낮은 값 내지 계산된 등전점보다 약 1.5 pH 단위 높은 값일 수 있다.
적합하게는, pH 값은 약 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점 내지 계산된 등전점보다 약 2 pH 단위 높은 값일 수 있다.
적합하게는, pH 값은 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 약 0.2 pH 단위 높은 값 내지 계산된 등전점보다 약 1.5 pH 단위 높은 값일 수 있다.
바람직하게는, pH 값은 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 약 0.5 pH 단위 높은 값 내지 계산된 등전점보다 약 1.5 pH 단위 높은 값일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 적어도 약 pH 5.0, 적합하게는 적어도 약 pH 6.0의 pH 값을 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 적어도 약 pH 6.5, 적어도 약 pH 7.0 또는 적어도 약 pH 7.5의 pH 값을 가질 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 적어도 약 pH 8.0의 pH 값을 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 약 pH 5.0 내지 약 pH 9.5, 적합하게는 약 pH 6.0 내지 약 pH 9.5의 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 약 pH 5.0 내지 약 pH 9.0, 적합하게는 약 pH 6.0 내지 약 pH 9.0의 pH 값을 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 적합하게는 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0의 pH 값을 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 약 pH 6.0, 적합하게는 약 pH 6.5 또는 약 pH 7.0의 pH 값을 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 약 pH 7.5의 pH 값을 가질 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 완충제는 약 pH 8.0의 pH 값을 가질 수 있다.
등전점 (pI)은 주어진 단백질의 특이적 특성이다. 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 단백질은 아미노산의 특이적 서열 (단백질에서의 경우 아미노산 잔기로도 지칭됨)로부터 만들어진다. 20개의 표준 세트의 각각의 아미노산은 상이한 측쇄 (또는 R 기)를 가지며, 이는 단백질에서의 각각의 아미노산 잔기가 상이한 화학적 특성, 예컨대 전하 및 소수성을 나타냄을 의미한다. 이들 특성은 주위의 화학적 환경, 예컨대 온도 및 pH에 의해 영향을 받을 수 있다. 단백질의 전체 화학적 특징은 이들 다양한 인자의 합계에 의존할 것이다.
특정 아미노산 잔기 (하기에 상세화됨)는 주위의 pH에 따라 전기적 전하를 나타낼 수 있는 이온화가능한 측쇄를 소유한다. 이러한 측쇄가 주어진 pH에서 하전되는지 아닌지 여부는 관련 이온화가능한 모이어티의 pKa에 의존하며, 여기서 pKa는 접합체 염기로부터의 특정화된 양성자에 대한 산 해리 상수 (Ka)의 음의 로그이다.
예를 들어, 산성 잔기, 예컨대 아스파르트산 및 글루탐산은 대략 4.1의 pKa 값 (정확한 pKa 값은 온도, 이온 강도 및 이온화가능한 기의 미세환경에 의존할 수 있음)을 갖는 측쇄 카르복실산 기를 갖는다. 따라서, 이들 측쇄는 7.4의 pH (종종 "생리학적 pH"로 지칭됨)에서 음전하를 나타낸다. 낮은 pH 값에서, 이들 측쇄는 양성자화되고, 그들의 전하를 잃을 것이다.
반대로, 염기성 잔기, 예컨대 리신 및 아르기닌은 대략 10 내지 12의 pKa 값을 갖는 질소-함유 측쇄 기를 갖는다. 따라서, 이들 측쇄는 7.4의 pH에서 양전하를 나타낸다. 이들 측쇄는 높은 pH 값에서 탈-양성자화되고, 그들의 전하를 잃을 것이다.
따라서, 단백질 분자의 전체 (순) 전하는 단백질에 존재하는 산성 및 염기성 잔기의 수 (및 그들의 표면 노출의 정도) 및 주위의 pH에 의존한다. 주위의 pH를 변화시키는 것은 단백질 상의 전체 전하를 변화시킨다. 따라서, 모든 단백질에 대해, 양 및 음 전하의 수가 동등하고, 단백질이 전체 순 전하를 나타내지 않는 주어진 pH가 있다. 이 점은 등전점 (pI)으로 공지되어 있다. 등전점은 통상의 기술자가 익숙할 것인 단백질 생화학에서의 표준 개념이다.
따라서, 등전점 (pI)은 단백질이 0의 순 전하를 나타내는 pH 값으로서 정의된다. pI의 증가는 단백질이 0의 순 전하를 나타내는데 보다 높은 pH 값이 요구됨을 의미한다. 따라서, pI의 증가는 주어진 pH에서 단백질의 순 양전하의 증가를 나타낸다. 반대로, pI의 감소는 단백질이 0의 순 전하를 나타내는데 보다 낮은 pH 값이 요구됨을 의미한다. 따라서, pI의 감소는 주어진 pH에서 단백질의 순 양전하의 감소를 나타낸다.
단백질의 pI를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 통상의 기술자에게 익숙할 것이다. 예로서, 단백질의 pI는 단백질에 존재하는 각각의 아미노산의 평균 pKa 값으로부터 계산될 수 있다 ("계산된 pI"). 이러한 계산은 관련 기술분야에 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행될 수 있으며; pI 값을 계산하기 위한 컴퓨터 프로그램의 바람직한 예로는 스크립스 리서치 인스티튜트(Scripps Research Institute)로부터의 프로테인 캘큘레이터(Protein Calculator) 및 ExPASy로부터의 컴퓨트 pI/MW 툴(Compute pI/MW Tool)을 들 수 있다. 상이한 분자 사이의 pI 값의 비교는 동일한 계산 기술/프로그램을 사용하여 수행되어야 한다.
특히 바람직한 실시양태에서, "계산된 pI"는 www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc (그의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에서 이용가능한 온라인 툴인 스크립스 프로테인 캘큘레이터 v3.4를 사용하여 계산된 pI를 지칭할 수 있다.
적절할 경우, 단백질의 계산된 pI는 등전위 초점화의 기술을 사용하여 실험적으로 확인될 수 있다 ("관찰된 pI"). 이 기술은 단백질을 그들의 pI에 따라 분리하는 전기영동을 사용한다. 등전위 초점화는 전형적으로 고정화된 pH 구배를 갖는 겔을 사용하여 수행된다. 전기장이 인가되는 경우, 단백질은 그것이 0의 순 전하를 갖는 pH에 도달할 때까지 pH 구배를 통해 이동하며, 이 점이 단백질의 pI이다. 등전위 초점화에 의해 제공된 결과는 전형적으로 성질상 상대적으로 저-해상도이며, 따라서, 본 발명자들은 계산된 pI에 의해 제공된 결과 (상기 기재된 바와 같음)가 사용하기에 보다 적절하다고 믿고 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, "pI"는 달리 언급되지 않는다면 "계산된 pI"를 의미한다.
단백질의 pI는 그의 표면 상에 나타나는 염기성 및/또는 산성 기의 수를 변경시킴으로써 증가되거나 감소될 수 있다. 이는 단백질의 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, pI의 증가는 산성 잔기의 수를 감소시킴으로써, 또는 염기성 잔기의 수를 증가시킴으로써 제공될 수 있다. 이러한 아미노산 변형은 하기에 보다 상세하게 논의된다.
예로서, BoNT/A (서열식별번호: 14)의 계산된 pI는 6.4이다. 계산된 pI는 또한 양이온성 BoNT: Cat-A, Cat-B 및 Cat-C (WO2015/004461에 교시되어 있음)에 대해; 뿐만 아니라 Cat HN_v1, Cat HN_v2 및 Cat HN_v3에 대해 제공된다.
본 발명에 사용하기 위한 pH의 결정은 정제되는 클로스트리디움 독소의 pI를 참조하여 달성된다. 예를 들어, 정제의 대상이 7.4의 계산된 pI를 갖는 양이온성 rBoNT/A (서열식별번호: 2)인 경우, 본 발명에 사용하기 위한 pH 값은 pH 6.4 이상이다. 유사하게, 7.3의 pI를 갖는 "Cat-A" (서열식별번호: 16)의 경우, 본 발명에 사용하기 위한 pH 값은 약 pH 6.3 이상이다.
표 1. 다수의 클로스트리디움 신경독소에 대한 계산된 pI 값.
Figure pct00001
단백질에서 발견되는 20종의 표준 아미노산은 표 2에 나타낸 바와 같다.
표 2. 아미노산.
Figure pct00002
하기 아미노산은 하전된 아미노산으로 간주된다: 아스파르트산 (음성), 글루탐산 (음성), 아르기닌 (양성), 및 리신 (양성).
7.4의 pH에서, 아스파르트산 (pKa 3.1) 및 글루탐산 (pKa 4.1)의 측쇄는 음전하를 갖는 반면, 아르기닌 (pKa 12.5) 및 리신 (pKa 10.8)의 측쇄는 양전하를 갖는다. 아스파르트산 및 글루탐산은 산성 아미노산 잔기로 지칭된다. 아르기닌 및 리신은 염기성 아미노산 잔기로 지칭된다.
하기 아미노산은 비하전된, 극성 (이들이 수소 결합에 참여할 수 있음을 의미함) 아미노산으로 간주된다: 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 및 트립토판.
하기 아미노산은 비하전된, 소수성 아미노산으로 간주된다: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 및 글리신.
본 발명에 따른 방법 및/또는 용도는 적합하게는 클로스트리디움 신경독소의 증가된 결합 및/또는 수율을 초래한다. 적합하게는, "증가된 결합 및/또는 수율"은 본 발명의 방법 및/또는 용도를 사용하여 얻어진 결합 및/또는 수율을 본 발명의 그것과 상이한 pH 값 (그러나 그 외에는 동일한)을 이용한 유사한 방법 및/또는 용도와 비교함으로써 결정될 수 있다.
본원에서 이 맥락에서 사용된 용어 "결합"은 클로스트리디움 신경독소와 양이온 교환 수지의 회합을 지칭한다. 결합된 클로스트리디움 신경독소의 농도는 양이온 교환 수지와 접촉시키기 전의 출발 조성물 중의 클로스트리디움 신경독소의 농도 및 양이온 교환 수지와 접촉된 용액에 잔류하는 클로스트리디움 신경독소의 농도 (존재할 경우)를 비교함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 출발 조성물 중의 클로스트리디움 신경독소의 농도를 양이온 교환 수지와 회합하지 않은 조성물 중의 단백질을 나타내는 통과물 분획 중의 클로스트리디움 신경독소의 농도와 비교할 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 용도는 조성물에 포함된 총 클로스트리디움 신경독소의 적어도 약 50%의 결합을 달성할 수 있다. 적합하게는, 방법 및/또는 용도는 조성물에 포함된 총 클로스트리디움 신경독소의 적어도 약 60% 또는 70%의 결합을 달성할 수 있다.
적합하게는, 방법 및/또는 용도는 조성물에 포함된 총 클로스트리디움 신경독소의 적어도 약 80% 또는 90%의 결합을 달성할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 약 95%, 97% 또는 99%의 결합.
본원에 사용된 용어 "수율"은 본 발명의 방법 및/또는 용도를 수행한 후 수득된 클로스트리디움 신경독소의 양 (예를 들어 농도)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "수율"은 출발 조성물 중의 클로스트리디움 신경독소의 양 (예를 들어 농도)을 양이온 교환 수지로부터 용리된 분획에 존재하는 클로스트리디움 신경독소의 양 (예를 들어 농도)과 비교함으로써 계산될 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 용도는 클로스트리디움 신경독소를 양이온 교환 잔기로부터 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이는 본원에서 "용리"로 지칭될 수 있다. 분리는 적절한 용리 완충제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 전형적으로, 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피)를 위해, 결합된 단백질을 이온 교환 수지 (예를 들어 양이온 교환 수지)로부터 교체하는 적절한 농도의 적절한 염을 포함하는 완충제가 설계된다.
일부 실시양태에서, 양이온 교환 수지와 회합된 클로스트리디움 신경독소는 용리 완충제에 노출될 수 있다. 적합하게는, 임의의 용액은 그 후 양이온 교환 수지로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 칼럼을 사용하는 경우, 하나 이상의 분획이 수집될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 용리 완충제에 포함된 클로스트리디움 신경독소가 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 용리 완충제에 포함된 정제 중간체가 제공된다.
더 추가의 실시양태에서, 용리 완충제에 포함된 본 발명의 방법 및/또는 용도에 의해 수득가능한 클로스트리디움 신경독소가 제공된다.
한 실시양태에서, 용리 완충제의 구배 농도는 클로스트리디움 신경독소와 회합된 양이온 교환 수지에 적용될 수 있다. 구배는 목적하는 염 농도 (예를 들어 클로스트리디움 신경독소가 양이온 교환 수지로부터 용리되는 농도보다 더 높은 염 농도)를 갖는 용리 완충제를 상이한 (예를 들어 보다 낮은) 염 농도를 갖는 1종 이상의 추가의 완충제(들)와 혼합함으로써 만들어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 양이온 교환 수지로부터 분리된 클로스트리디움 신경독소는 실질적으로 순수한 상태일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "순수한 상태"는 클로스트리디움 신경독소가 비-클로스트리디움 신경독소 오염물 (예를 들어 단백질 오염물)이 없는 상태를 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은 주어진 조성물에서 클로스트리디움 신경독소가 비-클로스트리디움 신경독소 오염물 (예를 들어 단백질 오염물)이 대부분 없고, 총 단백질 농도의 적어도 약 85%, 90% 또는 95%를 차지하는 것을 의미한다. 적합하게는, 클로스트리디움 신경독소는 총 단백질 농도의 적어도 약 97%, 99% 또는 99.9%를 차지할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 방법 또는 용도에 의해 수득가능한 (예를 들어 수득된) 클로스트리디움 신경독소를 제공한다. 적합하게는, 클로스트리디움 신경독소는 실질적으로 순수한 클로스트리디움 신경독소일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 양이온 교환 수지와 회합된 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 정제 중간체이며, 여기서 정제 중간체는 적어도 pH 7.3의 pH 값을 갖는 것인 정제 중간체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 양이온 교환 수지로부터 분리되어 있는 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 정제 중간체이며, 여기서 정제 중간체는 적어도 pH 7.3의 pH 값을 갖는 것인 정제 중간체를 제공한다.
한 실시양태에서, 정제 중간체는 적어도 약 pH 7.3 (적합하게는 적어도 pH 7.4 또는 pH 7.5)인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 정제 중간체는 적어도 약 pH 7.6 또는 적어도 약 pH 7.7인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 정제 중간체는 적어도 약 pH 7.8 또는 적어도 약 pH 7.9인 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 정제 중간체는 적어도 약 pH 8.0인 pH 값을 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 정제 중간체는 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.5의 pH를 가질 수 있다. 적합하게는, 정제 중간체는 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.0, 또는 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5의 pH를 가질 수 있다.
적합하게는, 정제 중간체는 약 pH 7.5의 pH 값을 가질 수 있다.
적합하게는, 정제 중간체는 약 pH 8.0의 pH 값을 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "정제 중간체"는 적어도 하나의 정제 단계로 처리되었거나, 처리되는 공정에 있지만, 통상의 기술자에 의해 의도되는 모든 정제 단계로 처리되지는 않은 클로스트리디움 신경독소를 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 정제 중간체는 실질적으로 순수한 상태일 수 있다.
한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소는 본 발명의 정제 중간체로부터 수득가능할 (예를 들어 수득될) 수 있다. 적합하게는, 클로스트리디움 신경독소는 실질적으로 순수한 상태일 수 있다.
본 발명에 따른 정제 중간체 및/또는 클로스트리디움 신경독소는 상기 정제 중간체 및/또는 클로스트리디움 신경독소가 포함되는 완충제의 적어도 pH 값에 의해, 대안적 방법에 의해 수득가능한 정제 중간체 및/또는 클로스트리디움 신경독소로부터 구별될 수 있다.
다시 말해서, 본 발명에 따른 정제 중간체 및/또는 클로스트리디움 신경독소의 완충제는 적어도 약 pH 7.3의 pH 값을 가질 수 있다. 적합하게는, 완충제는 적어도 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있으며, 추가로 양이온 교환 용리 완충제와 일치하는 염 농도를 포함한다.
용리 완충제는 NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 및 (NH4)2SO4 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 완충제는 적어도 약 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 50 mM NaCl 또는 적어도 약 100 mM NaCl을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 완충제는 적어도 약 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 200 mM NaCl 또는 적어도 약 300 mM NaCl (적합하게는 적어도 약 400 mM NaCl 또는 적어도 약 500 mM NaCl)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 완충제는 적어도 약 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 50 mM KCl 또는 적어도 약 100 mM KCl을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 완충제는 적어도 약 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 200 mM KCl 또는 적어도 약 300 mM KCl (적합하게는 적어도 약 400 mM KCl 또는 적어도 약 500 mM KCl)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 완충제는 적어도 약 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 50 mM CaCl2 또는 적어도 약 100 mM CaCl2를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 완충제는 적어도 약 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 200 mM CaCl2 또는 적어도 약 300 mM CaCl2 (적합하게는 적어도 약 400 mM CaCl2 또는 적어도 약 500 mM CaCl2)를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 완충제는 적어도 약 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 50 mM MgCl2 또는 적어도 약 100 mM MgCl2를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 완충제는 적어도 약 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 200 mM MgCl2 또는 적어도 약 300 mM MgCl2 (적합하게는 적어도 약 400 mM MgCl2 또는 적어도 약 500 mM MgCl2)를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 완충제는 적어도 약 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 50 mM (NH4)2SO4 또는 적어도 약 100 mM (NH4)2SO4를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 완충제는 적어도 약 pH 7.3인 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 200 mM (NH4)2SO4 또는 적어도 약 300 mM (NH4)2SO4 (적합하게는 적어도 약 400 mM (NH4)2SO4 또는 적어도 약 500 mM (NH4)2SO4)를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 완충제는 바람직하게는 50 mM 비스-트리스 프로판 pH 8.0을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 양이온 교환 잔기로부터 용리하는 경우, 50 mM 비스-트리스 프로판 pH 8.0을 포함하는 완충제는 염의 약 0 내지 약 500 mM의 용리 구배와 조합으로 사용될 수 있다. 적합하게는, 염은 NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 및 (NH4)2SO4 (바람직하게는 NaCl)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 용도에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 갖는 완충제는 용리 완충제일 수 있다. 용리 완충제는 NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 및 (NH4)2SO4 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 완충제는 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 적어도 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 50 mM NaCl 또는 적어도 약 100 mM NaCl을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 완충제는 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 적어도 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 200 mM NaCl 또는 적어도 약 300 mM NaCl (적합하게는 적어도 약 400 mM NaCl 또는 적어도 약 500 mM NaCl)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 완충제는 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 적어도 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 50 mM KCl 또는 적어도 약 100 mM KCl을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 완충제는 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 적어도 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 200 mM KCl 또는 적어도 약 300 mM KCl (적합하게는 적어도 약 400 mM KCl 또는 적어도 약 500 mM KCl)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 완충제는 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 적어도 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 50 mM CaCl2 또는 적어도 약 100 mM CaCl2를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 완충제는 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 적어도 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 200 mM CaCl2 또는 적어도 약 300 mM CaCl2 (적합하게는 적어도 약 400 mM CaCl2 또는 적어도 약 500 mM CaCl2)를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 완충제는 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 적어도 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 50 mM MgCl2 또는 적어도 약 100 mM MgCl2를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 완충제는 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 적어도 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 200 mM MgCl2 또는 적어도 약 300 mM MgCl2 (적합하게는 적어도 약 400 mM MgCl2 또는 적어도 약 500 mM MgCl2)를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 완충제는 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 적어도 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 50 mM (NH4)2SO4 또는 적어도 약 100 mM (NH4)2SO4를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 완충제는 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 적어도 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 가질 수 있으며, 적어도 약 200 mM (NH4)2SO4 또는 적어도 약 300 mM (NH4)2SO4 (적합하게는 적어도 약 400 mM (NH4)2SO4 또는 적어도 약 500 mM (NH4)2SO4)를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 완충제는 바람직하게는 50 mM 비스-트리스 프로판 pH 8.0을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 양이온 교환 잔기로부터 용리하는 경우, 50 mM 비스-트리스 프로판 pH 8.0을 포함하는 완충제는 염의 약 0 내지 약 500 mM의 용리 구배와 조합으로 사용될 수 있다. 적합하게는, 염은 NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 및 (NH4)2SO4 (바람직하게는 NaCl)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
서열 상동성
제한 없이, 전역적 방법 및 국소적 방법 및 혼성 방법, 예컨대, 예를 들어, 분절 접근 방법을 비롯한 임의의 다양한 서열 정렬 방법은 퍼센트 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다. 퍼센트 동일성을 결정하는 프로토콜은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내의 통상적인 절차이다. 전역적 방법은 서열을 분자의 처음부터 마지막까지 정렬하며, 개별적 잔기 쌍의 점수를 합산함으로써, 및 갭 페널티를 도입함으로써 최량 정렬을 결정한다. 비-제한적 방법으로는 예를 들어, CLUSTAL W (예를 들어, 문헌 [Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)] 참조); 및 반복적 보정 (예를 들어, 문헌 [Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)] 참조)을 들 수 있다. 국소적 방법은 모든 입력 서열에 의해 공유된 하나 이상의 보존된 모티프를 확인함으로써 서열을 정렬한다. 비-제한적 방법으로는 예를 들어, 매치-박스(Match-box) (예를 들어, 문헌 [Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)] 참조); 깁스(Gibbs) 샘플링 (예를 들어, 문헌 [C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)] 참조); 얼라인(Align)-M (예를 들어, 문헌 [Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)] 참조)을 들 수 있다.
따라서, 퍼센트 서열 동일성은 통상적인 방법에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌 [Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986] 및 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992]을 참조한다. 간략하게, 2개의 아미노산 서열은, 10의 갭 개방 페널티, 1의 갭 연장 페널티, 및 하기 나타낸 바와 같은 헤니코프 및 헤니코프(Henikoff and Henikoff) (같은 문헌)의 "블로섬(blosum) 62" 점수화 행렬을 사용하여 정렬 점수를 최적화하도록 정렬된다 (아미노산은 표준 1-문자 부호에 의해 지시됨).
서열 동일성을 결정하기 위한 정렬 점수
Figure pct00003
그 후, 퍼센트 동일성은 하기와 같이 계산된다:
Figure pct00004
실질적으로 상동 폴리펩티드는 1개 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 것으로서 특징화된다. 이들 변화는 바람직하게는 사소한 성질의 것이며, 이는 보존적 아미노산 치환 (하기 참조), 및 폴리펩티드의 폴딩 또는 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는 다른 치환; 전형적으로 1 내지 약 30 아미노산의 소형 결실; 및 소형 아미노- 또는 카르복실-말단 연장, 예컨대 아미노-말단 메티오닌 잔기, 약 20 내지 25 잔기 이하의 소형 링커 펩티드, 또는 친화성 태그이다.
보존적 아미노산 치환
염기성: 아르기닌
리신
히스티딘
산성: 글루탐산
아스파르트산
극성: 글루타민
아스파라긴
소수성: 류신
이소류신
발린
방향족: 페닐알라닌
트립토판
티로신
소형: 글리신
알라닌
세린
트레오닌
메티오닌
20종의 표준 아미노산 외에도, 비-표준 아미노산 (예컨대 4-히드록시프롤린, 6-N-메틸 리신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린 및 α-메틸 세린)은 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 제한된 수의 비-보존적 아미노산, 유전 암호에 의해 코딩되지 않는 아미노산, 및 비천연 아미노산은 클로스트리디움 폴리펩티드 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
비-천연 발생 아미노산으로는 제한 없이, 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메타노-프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시-프롤린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸-트레오닌, 히드록시-에틸시스테인, 히드록시에틸호모-시스테인, 니트로-글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, tert-류신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐-알라닌, 4-아자페닐-알라닌, 및 4-플루오로페닐알라닌을 들 수 있다. 비-천연 발생 아미노산 잔기를 단백질 내로 혼입시키기 위한 몇몇 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 넌센스 돌연변이가 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를 사용하여 억제되는 시험관내 시스템이 채용될 수 있다. 아미노산을 합성하고, tRNA를 아미노아실화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 넌센스 돌연변이를 함유하는 플라스미드의 전사 및 번역은 이. 콜라이 S30 추출물 및 시판되는 효소 및 다른 시약을 포함하는 무세포 시스템에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예를 들어, 문헌 [Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991]; [Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991]; [Chung et al., Science 259:806-9, 1993]; 및 [Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993]을 참조한다. 두번째 방법에서, 번역은 제노푸스(Xenopus) 난모세포에서, 돌연변이된 mRNA 및 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA의 미세주사에 의해 수행된다 (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). 세번째 방법 내에서, 이. 콜라이 세포는 대체되어야 하는 천연 아미노산 (예를 들어, 페닐알라닌)의 부재 하에서 및 목적하는 비-천연 발생 아미노산(들) (예를 들어, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재 하에서 배양된다. 비-천연 발생 아미노산은 그의 천연 대응물 대신 폴리펩티드 내로 혼입된다. 문헌 [Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994]을 참조한다. 천연 발생 아미노산 잔기는 시험관내 화학적 변형에 의해 비-천연 발생 종으로 전환될 수 있다. 화학적 변형은 치환의 범위를 더 확장하기 위해 부위-지정 돌연변이유발과 조합될 수 있다 (Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).
제한된 수의 비-보존적 아미노산, 유전 암호에 의해 코딩되지 않는 아미노산, 비-천연 발생 아미노산, 및 비천연 아미노산은 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 치환할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에서 필수 아미노산은 관련 기술분야에 공지된 절차, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발에 따라 확인될 수 있다 (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). 생물학적 상호작용의 부위는 또한 추정 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께, 핵 자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화와 같은 기술에 의해 결정된 바와 같이, 구조의 물리적 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [de Vos et al., Science 255:306-12, 1992]; [Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992]; [Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992]을 참조한다. 필수 아미노산의 동일성은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 관련된 성분 (예를 들어 전위 또는 프로테아제 성분)과의 상동성의 분석으로부터 추론될 수 있다.
다중 아미노산 치환은 돌연변이유발 및 스크리닝의 공지된 방법, 에컨대 문헌 [Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)] 또는 [Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)]에 의해 개시된 것들을 사용하여 수행되고, 시험될 수 있다. 간략하게, 이들 저자들은 폴리펩티드에서 2개 이상의 위치를 동시에 무작위화하고, 기능적 폴리펩티드에 대해 선택한 후, 돌연변이유발된 폴리펩티드를 시퀀싱하여 각각의 위치에서 허용가능한 치환의 스펙트럼을 결정하는 방법을 개시하고 있다. 사용될 수 있는 다른 방법으로는 파지 제시 (예를 들어, 문헌 [Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991]; 미국 특허 번호 5,223,409 (Ladner et al.); WIPO 공개 WO 92/06204 (Huse)) 및 영역-지정 돌연변이유발 (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988)을 들 수 있다.
다중 아미노산 치환은 돌연변이유발 및 스크리닝의 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)] 또는 [Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)]에 의해 개시된 것들을 사용하여 수행되고, 시험될 수 있다. 간략하게, 이들 저자들은 폴리펩티드에서 2개 이상의 위치를 동시에 무작위화하고, 기능적 폴리펩티드에 대해 선택한 후, 돌연변이유발된 폴리펩티드를 시퀀싱하여 각각의 위치에서 허용가능한 치환의 스펙트럼을 결정하는 방법을 개시하고 있다. 사용될 수 있는 다른 방법으로는 파지 제시 (예를 들어, 문헌 [Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991]; 미국 특허 번호 5,223,409 (Ladner et al.); WIPO 공개 WO 92/06204 (Huse)) 및 영역-지정 돌연변이유발 (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988)을 들 수 있다.
이점
상기 실시양태에 따르면, 본 발명자들에 의한 중대한 발견은 클로스트리디움 신경독소가 적어도 pH 7.3의 pH 값에서 양이온 교환 수지와 상호작용할 수 있다는 것이다. 이는, (이론에 구애되기를 원하지는 않지만) 이러한 클로스트리디움 신경독소는 그의 계산된 pI보다 더 높은 pH 값에서이고, 전체 음전하를 갖는 것으로 믿어지기 때문에, 예상치 않은 것이다. 따라서, 이것이 양으로-하전된 단백질과 회합하는 것으로 공지된 양이온 교환 수지와 (특히 이렇게 높은 결합 효율로) 상호작용할 수 있을 것임은 매우 놀라운 것이다.
본 발명의 추가의 이점은 정제 공정 전반에 걸쳐 동일한 pH가 유지될 수 있다는 점이다. 다시 말해서, 시간-소모 완충제 변화 (pH 7.3 미만의 pH 값이 사용되는 유사한 방법에서)에 대한 필요가 감소되거고/거나, 제거되고, 따라서 효율 및/또는 처리량을 개선시킨다. 추가적으로 또는 대안적으로, 정제 공정 전반에 걸쳐 동일한 pH를 유지하는 것은 유리하게는 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물 및/또는 정제 중간체 및/또는 클로스트리디움 신경독소의 물리적 조작이 감소됨을 의미한다.
양이온 교환 수지를 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 접촉이 상기 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH에서 일어나는 용도는 다수의 개선된 특성을 초래한다. 예를 들어, 이러한 용도는 접촉이 상기 클로스트리디움 신경독소의 계산된 등전점보다 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값에서 일어나지 않는 유사한 용도와 비교 시, 클로스트리디움 신경독소의 증가된 결합 및/또는 수율을 달성한다.
이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 클로스트리디움 신경독소 및 양이온 교환 칼럼을 지시된 pH 조건 하에서 접촉시킴으로써, 양이온 교환 칼럼에의 클로스트리디움 신경독소의 증가된 결합은 조성물에 존재하는 오염물 (예를 들어 단백질 오염물)이 클로스트리디움 독소와 결합하고, 따라서 그와 공-용리하는 것을 방지하는 것으로 믿어진다.
양이온 교환 수지에의 클로스트리디움 신경독소의 향상된 결합은 또한 정제의 효율을 개선시켜, 증가된 수율 및/또는 각각의 정제와 연관된 감소된 비용을 초래한다. 다시 말해서, 덜 낭비적이고/거나 보다 경제적인 정제 공정이 제공된다.
본 발명의 방법 및/또는 용도는 유리하게는 요법 및/또는 의료에 사용하기에 적합한 등급의 클로스트리디움 신경독소를 얻기 위해 보다 적은 정제 단계가 채용될 필요가 있음을 의미한다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)], 및 [Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)]은 통상의 기술자에게 이 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반적 사전을 제공한다.
이 개시내용은 본원에 개시된 예시적인 방법 및 물질에 의해 제한되지 않으며, 본원에 개시된 것들과 유사하거나 등가의 임의의 방법 및 물질은 이 개시내용의 실시양태의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 수치 범위는 범위를 한정하는 수를 포함한다. 달리 지시되지 않는다면, 각각, 임의의 핵산 서열은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 배향으로 기재되며; 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 배향으로 기재된다.
본원에 제공된 표제는 이 개시내용의 다양한 측면 또는 실시양태의 제한이 아니며, 이는 전체로서의 명세서를 참조하여 가져질 수 있다. 따라서, 바로 아래 정의된 용어는 전체로서의 명세서를 참고로 보다 완전히 정의된다.
아미노산은 본원에서 아미노산의 명칭, 즉, 3문자 약어 또는 단일 문자 약어를 사용하여 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "단백질"은 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "아미노산 서열"은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질"과 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "펩티드"와 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "효소"와 동의어이다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 호환적으로 사용된다. 본 개시내용 및 청구범위에서, 아미노산 잔기에 대해 통상적인 1-문자 및 3-문자 부호가 사용될 수 있다. 아미노산에 대한 3-문자 부호는 IUPACIUB 생화학 명명법에 관한 공동 위원회 (Joint Commission on Biochemical Nomenclature) (JCBN)에 따라 정의된다. 또한, 폴리펩티드는 유전 암호의 축퇴성으로 인해 1개 초과의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있음이 이해된다.
용어의 다른 정의는 명세서 전반에 걸쳐 나타날 수 있다. 예시적인 실시양태를 보다 상세하게 설명하기 전에, 이 개시내용은 설명된 특정 실시양태에 제한되지 않으며, 따라서 물론 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본 개시내용의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 목적이며, 제한인 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한 및 하한 사이의, 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 하한의 단위의 1/10까지의 각각의 개재하는 값은 또한 구체적으로 개시된 것으로 이해된다. 언급된 범위에서 임의의 언급된 값 또는 개재하는 값 및 그 언급된 범위에서 임의의 다른 언급된 또는 개재하는 값 사이의 각각의 보다 작은 범위는 이 개시내용 내에 포함된다. 이들 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 이 범위에 포함되거나 제외될 수 있으며, 어느 하나의, 어느 것도 아닌, 또는 둘 다의 한계가 보다 작은 범위에 포함되는 경우 각각의 범위는 또한 이 개시내용 내에 포함되며, 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 한계의 영향을 받는다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 그러한 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 다를 제외한 범위는 또한 이 개시내용에 포함된다.
본원에 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "클로스트리디움 신경독소"에 대한 언급은 복수의 이러한 후보 작용제를 포함하며, "클로스트리디움 신경독소"에 대한 언급은 1종 이상의 클로스트리디움 신경독소 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물에 대한 언급을 포함하는 등이다.
본원에 논의된 간행물은 단지 본 출원의 출원일 전의 그들의 개시내용에 대해 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 이러한 간행물이 본원에 첨부된 청구범위에 대한 선행 기술을 구성함의 허용으로 해석되지 않아야 한다.
이하, 본 발명을 단지 예로서 하기 도면 및 실시예를 참조하여 설명할 것이다.
실시예
실시예 1 - 숙주의 배양 및 가용성 rBoNT/A 단백질의 발현
rBoNT/A DNA 서열 (서열식별번호: 1 또는 3)을 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 BL21 (DE3) 세포의 단일 콜로니를 사용하여 30 μg/mL 카나마이신으로 보충된 변형된 테리픽 브로쓰(Terrific Broth) (mTB) 100 mL를 접종하였다. 이 방법은 플라스크를 접종하기 위한 마이크로뱅크(Microbank)™ 비드 또는 글리세롤 스톡 (10 내지 100 μL)을 사용하는 경우 동등하게 적용가능할 것이다. 배양물을 37 ℃에서 16시간 동안 250 RPM 진탕하면서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 100 mL 배양물 중 총 10 mL를 사용하여 0.2% 글루코스아민 및 30 μg/mL 카나마이신으로 보충된 mTB 1 L를 접종하였다. 배양물을 37 ℃에서 250 RPM으로 0.5의 OD600이 도달될 때까지 인큐베이션하였다. 이 시점에서, 인큐베이션 온도는 16 ℃로 강하하였다. 1시간 후, 표적 단백질의 발현을 1 mM IPTG로 유도한 후, 16 ℃에서 20시간 동안 225 RPM 진탕하면서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 4000x g에서 20분 동안 4 ℃에서의 원심분리에 의해 수확한 후, -20 ℃에서 저장하였다.
실시예 2 - 숙주 세포로부터의 rBoNT/A 단백질의 추출
세포 페이스트를 실온에서 해동시키고, 세포의 그램 당 3 mL의 50 mM 비스-트리스 pH 6.0, 50 mM NaCl 완충제에 재현탁시킨 후, 10 μL 벤조나제® 뉴클레아제를 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포를 0 내지 4 ℃에서, 100 W에서의 초음파처리 (30초 온 및 45초 오프의 10 사이클)에 의해 용해시켰다. 용해물을 4000x g에서 1시간 동안 4 ℃에서 원심분리하여 투명화된 상청액 중 가용성 rBoNT/A (서열식별번호: 2 또는 4)를 얻었다.
실시예 3 - 표적 rBoNT/A 단백질의 포획
rBoNT/A 단백질의 특성을 1차 단백질 서열로부터 스크립스 리서치 인스티튜트로부터의 스크립스 프로테인 캘큘레이터 v3.4를 사용하여 결정하였다 (표 3).
표 3: rBoNT/A의 예측된 특성
Figure pct00005
계산된 pI 값에 기초하여, rBoNT/A (서열식별번호: 4) 및 양이온성 rBoNT/A (서열식별번호: 2)는 각각 완충제 pH <6.5 및 <7.4에서 양이온 교환 (CEX) 수지에 결합할 것으로 예측되었다.
실시예 4 - 시험 완충제 내로의 투명화된 용해물의 탈염
가용성 rBoNT/A (서열식별번호: 2 및 4)를 함유하는 투명화된 용해물을 동등한 부분으로 나누고, 에코노-팩 10DG 탈염 칼럼을 사용하여 표 4에 열거된 로딩 완충제로 완충제 교환하였다.
표 4: CEX 완충제 스카우팅에 사용된 로딩 완충제.
Figure pct00006
완충제 교환된, 투명화된 용해물을 하이트랩(HiTrap) SP HP 칼럼 상으로 로딩하기 전에 4 ℃에서 저장하였다.
실시예 5 - 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)를 사용한 rBoNT/A (서열식별번호: 4)의 CEX 크로마토그래피 포획 단계를 위한 완충제 스크리닝
가용성 rBoNT/A (서열식별번호: 4)를 함유하는 완충제 교환된 용해물을 하이트랩 SP HP 칼럼 상으로 로딩하였다. 용리된 표적 단백질의 %결합 및 %순도를 SDS-PAGE 및 농도측정에 의해 결정하였다. 결합된 단백질의 용리는 pH 또는 NaCl 선형 구배 중 어느 하나를 채용함으로써 달성하였다 (표 5).
표 5: CEX 완충제 스카우팅에 사용된 로딩 완충제 및 용리 구배.
Figure pct00007
도 1 (패널 A 내지 F)은 표 5에서의 조건을 사용하여 SP HP 세파로스 수지에의 결합, 및 그로부터의 용리 후의 rBoNT/A (서열식별번호: 4) 용리 프로파일의 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. SDS-PAGE 겔의 분석은 용리된 표적 단백질의 %순도의 추정을 허용하였다 (표 6).
표 6: SP HP 세파로스 수지에의 rBoNT/A (서열식별번호: 4) 결합의 분석
Figure pct00008
† SDS-PAGE 겔의 농도측정 분석.
SDS-PAGE 겔의 육안 평가 (도 1)는 조건 3 내지 6으로의 용리 후 표적 단백질의 보다 큰 회수를 나타내며, 이는 수지에의 표적 단백질의 보다 큰 초기 결합을 시사한다.
실시예 6 - 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)를 사용한 양이온성 rBoNT/A (서열식별번호: 2)의 CEX 크로마토그래피 포획 단계를 위한 완충제 스크리닝
가용성 양이온성 rBoNT/A (서열식별번호: 2)를 함유하는 완충제 교환된 용해물을 하이트랩 SP HP 칼럼 상으로 로딩하였다. 용리된 표적 단백질의 %결합 및 %순도를 SDS-PAGE 분석에 의해 결정하였다. 결합된 단백질의 용리는 pH 또는 NaCl 선형 구배 중 어느 하나를 채용함으로써 달성하였다 (표 5).
도 2 (패널 A 내지 F)는 표 5에서의 조건을 사용하여 SP HP 세파로스 수지에의 결합, 및 그로부터의 용리 후의 양이온성 rBoNT/A (서열식별번호: 2) 용리 프로파일의 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. SDS-PAGE 겔의 분석은 SP HP 세파로스 수지에 대한 표적 단백질의 %순도 및 %결합의 추정을 허용하였다 (표 7).
표 7: SP HP 세파로스 수지에의 양이온성 rBoNT/A (서열식별번호: 2) 결합의 분석
Figure pct00009
* 육안 평가 및 %결합의 추정.
† SDS-PAGE 겔의 농도측정 분석.
SDS-PAGE 겔 (도 2)의 평가는 pH 6.0에 비해 pH 7.5 내지 8.0에서 표적 단백질의 보다 큰 %결합 및 유사한 %순도를 나타낸다. 이는 표적 단백질 회수의 전반적인 증가와 동등하다.
상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명을 구체적인 바람직한 실시양태와 관련하여 기재하였지만, 청구되는 바와 같은 본 발명은 이러한 구체적인 실시양태에 부당하게 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 사실, 생화학 및 생명공학 또는 관련된 분야의 통상의 기술자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> IPSEN BIOPHARM LIMITED <120> METHOD <130> SYNT-P45203WO <150> GB/1517450.1 <151> 2015-10-02 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3888 <212> DNA <213> artificial <220> <223> cationic BoNT/A1 <400> 1 atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60 tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120 aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180 ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240 gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300 acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360 agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420 gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480 atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540 ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600 gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 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Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile 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Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu 645 650 655 Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala 660 665 670 Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys 675 680 685 Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu 690 695 700 Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys 705 710 715 720 Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu 725 730 735 Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn 740 745 750 Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp 755 760 765 Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile 770 775 780 Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met 785 790 795 800 Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys 805 810 815 Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly 820 825 830 Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp 835 840 845 Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser 850 855 860 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn 865 870 875 880 Leu Arg Tyr Glu Ser Lys His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser 885 890 895 Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn 900 905 910 Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu 915 920 925 Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser 930 935 940 Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys Ile Ser Leu Asn Asn 945 950 955 960 Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val 965 970 975 Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Lys Glu 980 985 990 Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser 995 1000 1005 Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg 1010 1015 1020 Leu Asn Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln 1025 1030 1035 Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile 1040 1045 1050 Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp 1055 1060 1065 Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu 1070 1075 1080 Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys 1085 1090 1095 Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met 1100 1105 1110 Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val 1115 1120 1125 Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val 1130 1135 1140 Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr 1145 1150 1155 Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile 1160 1165 1170 Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn 1175 1180 1185 Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu 1190 1195 1200 Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser 1205 1210 1215 Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn 1220 1225 1230 Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly 1235 1240 1245 Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala 1250 1255 1260 Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu 1265 1270 1275 Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu 1280 1285 1290 Arg Pro Leu 1295 <210> 3 <211> 3888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rBoNT/A1 <400> 3 atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60 tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120 aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180 ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240 gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300 acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360 agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420 gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480 atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540 ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600 gaggttgata 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Ile Asn Ile 770 775 780 Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met 785 790 795 800 Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys 805 810 815 Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly 820 825 830 Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp 835 840 845 Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser 850 855 860 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn 865 870 875 880 Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser 885 890 895 Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn 900 905 910 Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu 915 920 925 Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser 930 935 940 Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn 945 950 955 960 Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val 965 970 975 Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu 980 985 990 Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser 995 1000 1005 Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg 1010 1015 1020 Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln 1025 1030 1035 Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile 1040 1045 1050 Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp 1055 1060 1065 Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu 1070 1075 1080 Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys 1085 1090 1095 Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met 1100 1105 1110 Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val 1115 1120 1125 Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val 1130 1135 1140 Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr 1145 1150 1155 Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile 1160 1165 1170 Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Arg 1175 1180 1185 Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu 1190 1195 1200 Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Arg Val Arg Arg Leu Ser 1205 1210 1215 Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn 1220 1225 1230 Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Arg Arg Gly Asn Asp Ile Gly 1235 1240 1245 Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala 1250 1255 1260 Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Arg Ser Arg Arg Leu 1265 1270 1275 Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu 1280 1285 1290 Arg Pro Leu 1295

Claims (23)

  1. 양이온 교환 수지를 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 접촉 단계는 적어도 pH 7.3에서 수행되고, 여기서 양이온 교환 수지를 상기 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 상기 단계는 단일 쇄 형태로부터 이중쇄 형태로의 상기 클로스트리디움 신경독소의 전환 전에 일어나는 것인, 클로스트리디움 신경독소를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 클로스트리디움 신경독소를 양이온 교환 수지로부터 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 분리된 클로스트리디움 신경독소가 실질적으로 순수한 상태인 방법.
  4. 양이온 교환 수지와 회합된 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 정제 중간체이며, 여기서 정제 중간체는 적어도 pH 7.3의 pH 값을 갖고, 여기서 상기 클로스트리디움 신경독소는 단일 쇄 형태인 정제 중간체.
  5. 양이온 교환 수지로부터 분리되어 있는 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 정제 중간체이며, 여기서 정제 중간체는 적어도 pH 7.3의 pH 값을 갖고, 여기서 상기 클로스트리디움 신경독소는 단일 쇄 형태인 정제 중간체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, pH 값이 적어도 약 pH 7.5 (바람직하게는 약 pH 7.6, 바람직하게는 적어도 약 pH 7.7, 보다 바람직하게는 적어도 약 pH 7.8)인 방법 또는 정제 중간체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, pH 값이 약 pH 7.3 내지 약 pH 9.5인 방법 또는 정제 중간체.
  8. 제1항 내지 제5항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, pH 값이 약 pH 7.3 내지 약 pH 8.0인 방법 또는 정제 중간체.
  9. 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물을, 동일한 조건 하에서 상기 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위 초과로 낮은 pH 값을 사용하는 것과 비교 시, 클로스트리디움 신경독소의 증가된 결합 및/또는 수율을 위해 양이온 교환 수지와 접촉시키기 위한, 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 -1 pH 단위인 값이거나 또는 그 값보다 더 높은 pH 값을 갖는 완충제의 용도이며, 여기서 상기 클로스트리디움 신경독소는 단일 쇄 형태인 용도.
  10. 제9항에 있어서, pH 값이 적어도 상기 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI인 (바람직하게는 그보다 적어도 약 0.2 pH 단위 높은 값, 보다 바람직하게는 그보다 적어도 0.5 pH 단위 높은 값인) 용도.
  11. 제9항에 있어서, pH 값이 상기 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 약 0.2 내지 약 1.5 pH 단위 높은 값인 용도.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, pH 값이 상기 클로스트리디움 신경독소의 계산된 pI보다 약 0.2 내지 약 1.0 pH 단위 높은 값인 용도.
  13. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 수지를 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것이 제1 정제 단계 (예를 들어 제1 크로마토그래피 정제 단계)인 방법 또는 용도.
  14. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 정제가 1개 이상의 추가의 단계(들)를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  15. 제14항에 있어서, 1개 이상의 추가의 단계(들)가 클로스트리디움 신경독소를 포함하는 조성물을 1종 이상의 추가의 수지와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 1개 이상의 추가의 단계(들)가 보툴리눔 신경독소를 단일 쇄 형태로부터 이중쇄 형태로 전환시키는 것을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  17. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물에 포함되는 총 클로스트리디움 신경독소의 적어도 35% (바람직하게는 적어도 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%)가 양이온 교환 수지와 회합하는 것인 방법 또는 용도.
  18. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법 또는 용도에 의해 수득가능한 및/또는 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 정제 중간체로부터 단리된 클로스트리디움 신경독소.
  19. 제18항에 있어서, 상기 클로스트리디움 신경독소가 실질적으로 순수한 상태인 클로스트리디움 신경독소.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 클로스트리디움 신경독소가 클로스트리디아 보툴리눔(Clostridia botulinum), 클로스트리디아 테타니(Clostridia tetani), 클로스트리디아 바라티이(Clostridia baratii) 및 씨. 부티리쿰(C. butyricum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 방법, 용도 클로스트리디움 신경독소 또는 정제 중간체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 클로스트리디움 신경독소가 보툴리눔 신경독소 (BoNT), 바람직하게는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 및 BoNT/G로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 BoNT(들)인 방법, 용도, 클로스트리디움 신경독소 또는 정제 중간체.
  22. 제21항에 있어서, BoNT가 양이온성 BoNT인 방법, 용도, 클로스트리디움 신경독소 또는 정제 중간체.
  23. 실시예 및 도면을 참조하여 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법, 용도, 클로스트리디움 신경독소 또는 정제 중간체.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024080682A1 (ko) * 2022-10-12 2024-04-18 주식회사 알케미어 보툴리눔 독소의 경쇄 변이체

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2773396C (en) * 2009-10-21 2020-12-15 Revance Therapeutics, Inc. Methods and systems for purifying non-complexed botulinum neurotoxin
EP3752128A1 (de) * 2018-02-16 2020-12-23 Bontana Therapies Gmbh Nukleinsäure-basiertes botulinum neurotoxin zur therapeutischen anwendung
GB201914034D0 (en) * 2019-09-30 2019-11-13 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of neurological disorders
GB202003813D0 (en) 2020-03-16 2020-04-29 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of upper facial lines
KR20220154738A (ko) 2020-03-16 2022-11-22 입센 바이오팜 리미티드 사지 경직을 치료하기 위한 변형된 보툴리눔 신경독소
CN113832069B (zh) * 2020-11-30 2024-01-30 河南农业大学 丁酸梭菌及其应用
AU2022247196A1 (en) * 2021-03-30 2023-10-05 Ipsen Biopharm Limited Treatment of pain & inflammatory disorders
WO2023041934A1 (en) 2021-09-16 2023-03-23 Ipsen Biopharm Limited Modified bont/a for use in the treatment of cervical dystonia
GB202113602D0 (en) 2021-09-23 2021-11-10 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of a disorder affecting an eyelid muscle of a subject
WO2023047127A1 (en) 2021-09-23 2023-03-30 Ipsen Biopharm Limited Modified bont/a for use in the treatment of a disorder affecting an eyelid muscle of a subject

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
AU3658093A (en) 1992-02-10 1993-09-03 Seragen, Inc. Desensitization to specific allergens
GB9305735D0 (en) 1993-03-19 1993-05-05 North John R Novel agent for controlling cell activity
JPH08511536A (ja) 1993-06-10 1996-12-03 アラーガン、インコーポレイテッド 複数の血清型のボツリヌス毒素により、神経筋疾患および症状を処置する方法
US5437291A (en) 1993-08-26 1995-08-01 Univ Johns Hopkins Method for treating gastrointestinal muscle disorders and other smooth muscle dysfunction
US6974578B1 (en) 1993-12-28 2005-12-13 Allergan, Inc. Method for treating secretions and glands using botulinum toxin
US20040126396A1 (en) 1993-12-28 2004-07-01 Allergan, Inc. Botulinum toxin treatment for strabismus
US5670484A (en) 1994-05-09 1997-09-23 Binder; William J. Method for treatment of skin lesions associated with cutaneous cell-proliferative disorders
US5714469A (en) 1994-09-01 1998-02-03 Smithkline Beecham Corporation Method of treating sepsis
GB9508204D0 (en) 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
GB9617671D0 (en) 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
US7192596B2 (en) 1996-08-23 2007-03-20 The Health Protection Agency Ipsen Limited Recombinant toxin fragments
US6063768A (en) 1997-09-04 2000-05-16 First; Eric R. Application of botulinum toxin to the management of neurogenic inflammatory disorders
GB9721189D0 (en) 1997-10-08 1997-12-03 Speywood Lab The Limited Analgesic conjugates
WO1999058571A2 (de) 1998-05-13 1999-11-18 BioteCon Gesellschaft für Biotechnologische Entwicklung und Consulting mbH Hybridprotein zur hemmung der mastzelldegranulation und dessen verwendung
DK1098664T3 (da) 1998-07-22 2003-11-17 Osprey Pharmaceuticals Ltd Sammensætninger og deres anvendelser til at behandle sekundær vævsskade og andre inflammatoriske tilstande og forstyrrelser
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
US6776990B2 (en) 1999-04-08 2004-08-17 Allergan, Inc. Methods and compositions for the treatment of pancreatitis
US6358697B2 (en) 1999-04-21 2002-03-19 Children's Hospital Medical Center Intracellular pharmaceutical targeting
US6767544B2 (en) 2002-04-01 2004-07-27 Allergan, Inc. Methods for treating cardiovascular diseases with botulinum toxin
US6358917B1 (en) 1999-08-24 2002-03-19 Jean D. A. Carruthers Cosmetic use of botulinum toxin for treatment of downturned mouth
CA2380457A1 (en) 1999-08-25 2001-03-01 Allergan Sales, Inc. Activatable recombinant neurotoxins
GB9922554D0 (en) 1999-09-23 1999-11-24 Microbiological Res Authority Inhibition of secretion from non-neuronal cells
US6113915A (en) 1999-10-12 2000-09-05 Allergan Sales, Inc. Methods for treating pain
US6265379B1 (en) 1999-10-13 2001-07-24 Allergan Sales, Inc. Method for treating otic disorders
US6139845A (en) 1999-12-07 2000-10-31 Allergan Sales, Inc. Method for treating cancer with a neurotoxin
US7838008B2 (en) 1999-12-07 2010-11-23 Allergan, Inc. Methods for treating diverse cancers
US6143306A (en) 2000-01-11 2000-11-07 Allergan Sales, Inc. Methods for treating pancreatic disorders
US6261572B1 (en) 2000-01-11 2001-07-17 Allergan Sales, Inc. Method for treating a pancreatic disorder with a neurotoxin
US6337075B1 (en) 2000-01-11 2002-01-08 Allergan Sales, Inc. Methods for treating diabetes
US6641820B1 (en) 2000-01-19 2003-11-04 Allergan, Inc. Clostridial toxin derivatives and methods to treat pain
US6524580B1 (en) 2000-02-15 2003-02-25 Allergan Sales, Inc. Method for treating thyroid disorders
US6464986B1 (en) 2000-04-14 2002-10-15 Allegan Sales, Inc. Method for treating pain by peripheral administration of a neurotoxin
US6299893B1 (en) 2000-04-17 2001-10-09 Marvin Schwartz Method to reduce hair loss and stimulate hair regrowth
US6565870B1 (en) 2000-04-28 2003-05-20 Allergan, Inc. Methods for treating bone tumors
US6306403B1 (en) 2000-06-14 2001-10-23 Allergan Sales, Inc. Method for treating parkinson's disease with a botulinum toxin
US6903187B1 (en) 2000-07-21 2005-06-07 Allergan, Inc. Leucine-based motif and clostridial neurotoxins
US6423319B1 (en) 2000-10-04 2002-07-23 Allergan Sales, Inc. Methods for treating muscle injuries
US6827931B1 (en) 2000-10-20 2004-12-07 Allergan, Inc. Method for treating endocrine disorders
US7273722B2 (en) 2000-11-29 2007-09-25 Allergan, Inc. Neurotoxins with enhanced target specificity
ITBO20010426A1 (it) * 2001-07-06 2003-01-06 Alfa Wassermann Spa Processo per la purificazione di proteine farmacologicamente attive mediante cromatografia in scambio cationico
US7255866B2 (en) 2001-09-17 2007-08-14 Allergan, Inc. Botulinum toxin therapy for fibromyalgia
US6623742B2 (en) 2001-09-17 2003-09-23 Allergan, Inc. Methods for treating fibromyalgia
US6921538B2 (en) 2002-05-10 2005-07-26 Allergan, Inc. Therapeutic treatments for neuropsychiatric disorders
MXPA05003936A (es) 2002-10-15 2005-06-17 Allergan Inc Terapias y procedimientos odontologicos con toxina botulinica.
US7238357B2 (en) 2002-11-05 2007-07-03 Allergan, Inc. Methods for treating ulcers and gastroesophageal reflux disease
US8071550B2 (en) 2003-03-03 2011-12-06 Allergan, Inc. Methods for treating uterine disorders
US6838434B2 (en) 2003-05-02 2005-01-04 Allergan, Inc. Methods for treating sinus headache
US7220422B2 (en) 2003-05-20 2007-05-22 Allergan, Inc. Methods and compositions for treating eye disorders
US20040253274A1 (en) 2003-06-11 2004-12-16 Allergan, Inc. Use of a clostridial toxin to reduce appetite
DE102004043009A1 (de) 2004-09-06 2006-03-23 Toxogen Gmbh Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen
CN1616489A (zh) * 2004-09-30 2005-05-18 中国科学技术大学 纯化重组人白细胞介素12的方法
CA2595115C (en) 2004-12-01 2014-01-21 Health Protection Agency Fusion proteins for treating, preventing or ameliorating pain
JP5006803B2 (ja) 2005-03-03 2012-08-22 アラーガン、インコーポレイテッド クロストリジウム・バクテリアの培地およびクロストリジウム毒素を得るための方法
DE102005019302A1 (de) 2005-04-26 2006-11-16 Toxogen Gmbh Carrier zum Targeting von Nervenzellen
DK2154151T3 (da) 2005-09-19 2011-09-05 Allergan Inc Clostridiumtoksinaktiverbare clostridiumtoksiner
EP1834962A1 (de) 2006-03-15 2007-09-19 Biotecon Therapeutics GmbH PEGyliertes mutiertes Clostridium botulinum Toxin
KR101806567B1 (ko) * 2009-02-19 2018-01-10 메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아 매우 순수한 신경독을 제조하기 위한 수단 및 방법
GB0903006D0 (en) 2009-02-23 2009-04-08 Syntaxin Ltd Modified non-cytotoxic proteases
CN101497909B (zh) * 2009-03-05 2012-07-04 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 制备抗a型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法
WO2010120766A1 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Mcw Research Foundation, Inc. Engineered botulinum neurotoxin
US8440204B2 (en) 2009-04-30 2013-05-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Subtype of Closteridium botulinum neurotoxin type A and uses thereof
CA2773396C (en) * 2009-10-21 2020-12-15 Revance Therapeutics, Inc. Methods and systems for purifying non-complexed botulinum neurotoxin
US8853360B2 (en) 2010-06-23 2014-10-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Engineered botulinum neurotoxin C1 with selective substrate specificity
WO2013091895A1 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Novel method for the manufacturing of di-chain proteins for use in humans
KR102083371B1 (ko) 2012-11-21 2020-03-04 입센 바이오이노베이션 리미티드 단백질 가수분해 처리된 폴리펩티드의 제조방법
GB201312317D0 (en) * 2013-07-09 2013-08-21 Syntaxin Ltd Cationic neurotoxins
US9216210B2 (en) 2013-12-23 2015-12-22 Dublin City University Multiprotease therapeutics for chronic pain
GB201407525D0 (en) * 2014-04-29 2014-06-11 Syntaxin Ltd Manufacture of recombinant clostridium botulinum neurotoxins
EP3242884B1 (en) * 2015-01-09 2021-02-24 Ipsen Bioinnovation Limited Cationic neurotoxins

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024080682A1 (ko) * 2022-10-12 2024-04-18 주식회사 알케미어 보툴리눔 독소의 경쇄 변이체

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