CN102666396A

CN102666396A - 用于纯化非复合的肉毒杆菌神经毒素的方法和系统

Info

Publication number: CN102666396A
Application number: CN2010800455670A
Authority: CN
Inventors: C·L·鲁格
Original assignee: Essentia Biosystems Inc
Current assignee: Revance Therapeuticals Inc
Priority date: 2009-10-21
Filing date: 2010-10-20
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2030-10-20
Also published as: CA2773396A1; AU2010310749A1; CN104961812A; DK2490986T3; CA2773396C; JP2013508388A; CY1120908T1; CN104961812B; PT2490986T; LT2490986T; BR112012009227A2; EP2490986A1; IL248486A0; MX365496B; IL218532A0; CO6551670A2; US20200277591A1; US11466262B2; KR20120099431A; KR101819129B1

Abstract

提供了用于色谱纯化肉毒杆菌神经毒素的方法和系统。这些方法和系统允许以高纯度和产量有效纯化非复合形式的肉毒杆菌神经毒素，所述非复合形式的肉毒杆菌神经毒素可在药物制剂中用作活性成分。

Description

用于纯化非复合的肉毒杆菌神经毒素的方法和系统

本申请要求2009年10月21日提交的美国临时申请No.61/253,810的优先权的权益。该美国临时申请的内容通过引用在此整体并入。

发明领域

本发明大体上涉及用于从细胞培养物中纯化游离的肉毒杆菌神经毒素以产生高纯度，高效价产品的色谱方法和系统。发明背景

肉毒杆菌毒素是由细菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)以及其他梭菌属物种，诸如丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和巴氏梭菌(Clostridium baraffi)产生的神经毒性蛋白。该毒素阻断神经肌肉传递，并在人和动物中引起神经性麻痹疾病，称为肉毒中毒。肉毒梭菌及其孢子通常存在于土壤和腐败的动物尸体中，并且可以在不适当灭菌或不适当密封的食物容器中生长，这是许多肉毒中毒病例的病因。肉毒中毒症状可以包括步行困难、吞咽困难和讲话困难，并可发展成呼吸肌麻痹，和最终死亡。

A型肉毒杆菌毒素是人类已知的最致命的天然物质。除了血清型A之外，还表征了六种其他常见的免疫上不同的肉毒杆菌毒素，即肉毒杆菌毒素血清型B、C₁、D、E、F和G。不同的血清型可通过用类型特异性抗体中和来区分，并且在它们引起的麻痹的严重度和它们最经常感染的动物物种方面不同。已知的肉毒杆菌毒素血清型的每一种的肉毒杆菌毒素蛋白分子的分子量是约150kD，包括连接到约50kD轻链的约100kD重链。然而，肉毒杆菌毒素由梭菌细菌以150kD毒素与一个或多个非毒素蛋白的复合物释放。例如，A型肉毒杆菌毒素以900kD、500kD和300kD复合物(近似分子量)的形式存在。尽管已知毒性效应，但A型肉毒杆菌毒素在临床上用于治疗多种适应症，包括例如以骨骼肌活动过度为特征的神经肌肉障碍。例如，

是可商购自Irvine，Calif的Allergan，Inc.的A型肉毒杆菌毒素复合物的商标。A型肉毒杆菌毒素用于例如治疗自发性睑痉挛、斜视、颈部肌张力障碍(cervical dystonia)和眉间纹(面部)皱纹。其他血清型也已在临床上使用。例如，已表明B型肉毒杆菌毒素可用于治疗颈部肌张力障碍。肉毒杆菌毒素被认为以高亲和力结合于运动神经元的突触前膜，移位到神经元，并随后阻断乙酰胆碱的突触前释放。

用于临床使用的肉毒杆菌毒素通常从细胞培养物分离，并已使用多种纯化方法。历史上，通过一系列沉淀和切向流过滤步骤，以复合形式纯化毒素。参见例如Schantz E.J.等人，Properties and use ofbotulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine(肉毒杆菌毒素和其他微生物神经毒素在医学中的性质和用途)，MicrobiolRev 1992年3月56(1)：80-99。然而，这种方法提供了相对低的收率，通常小于约10％。其他方法使用尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法和/或亲和力色谱法。参见例如SchmidtJ.J.等人，Purification of type Ebotulinum neurotoxin by high-performance ion exchangechromatography(通过高效离子交换色谱法纯化E型肉毒杆菌神经毒素)，Anal.Biochem.1986年7月；156(1)：213-219；Simpson L.L.等人，Isolation and characterization of the botulinum neurotoxins(内毒杆菌神经毒素的分离和表征)，Harsman S编辑.Methods inEnzymology(酶学方法).第165卷，Microbial Toxins：Tools inEnzymology(微生物毒素：酶学中的工具)San Diego，Calif：AcademicPress；第165卷；第76-85页(1988)；Kannan K.等人，Methodsdevelopment for the biochemical assessment of Neurobloc(botulinum toxin type B)(肉毒毒素制剂(B型肉毒杆菌毒素)的生物化学评价的方法开发)，Mov Disord 2000；15(增刊2)：20(2000)；WangY.C.，The preparation and quality of botulinum toxin type A forinjection(BTXA)and its clinical use(注射用A型肉毒杆菌毒素(BTXA)的制备和质量，及其临床用途)，Dermatol Las Faci Cosm Surg2002；58(2002)；和美国专利申请公开No.2003/0008367。

其他方法仅关注于毒素的重链或轻链之一，而不是完整的且有生物活性的肉毒杆菌毒素蛋白。例如，通过重组方法单独合成链中的一条。参见例如Zhou L.等人，Expression and purification of the lightchain of botulinum neurotoxin A：A single mutation abolishes itscleavage of SNAP-25 and neurotoxicity after reconstitution withthe heavy chain(A型肉毒杆菌毒素的轻链的表达和纯化：单突变取消其SNAP-25裂解，及与重链重构后的神经毒性)，Biochemistry 1995；34(46)：15175-81(1995)；和Johnson S.K.等人Scale-up of thefermentation and purification of the recombination heavy chainfragment C of botulinum neurotoxin serotype F，expressed in Pichiapastoris(毕赤酵母中表达的肉毒杆菌神经毒素血清型F的重组重链片段C的发酵和纯化的放大)，Protein Expr and Purif 2003；32：1-9(2003)。然而，这些方法需要额外步骤来重新形成完整的且具有生物活性的肉毒杆菌毒素蛋白。

最新的一种方法包括使用疏水相互作用色谱、混合模式和/或离子交换色谱纯化复合物形式的肉毒杆菌毒素。参见例如美国专利No.7,452,697和7,354,740，其通过引用在此并入。

因此，本领域存在对用于分离稳定的、具有生物活性但非复合形式的完整的肉毒杆菌毒素蛋白的改进的纯化方法的需要。因此，本发明的目的是提供解决这些和其他需要的组合物和方法。

提出以上讨论仅是为了提供对本领域所面对的问题的性质的更好理解，并且以上讨论不应以任何方式解释为对现有技术的承认，并且也不应将本文中的任何参考文献的引述理解为承认，这些参考文献构成本申请的“现有技术”。

发明概述

本发明涉及用于纯化非复合的肉毒杆菌毒素的系统和方法。在一个实施方案中，该方法包括纯化粗制的非复合的肉毒杆菌毒素以得到纯化的非复合的肉毒杆菌毒素。在该实施方案中，该方法包括，将粗制的非复合的肉毒杆菌毒素装载到阴离子交换柱，以将非复合的肉毒杆菌毒素俘获在阴离子交换柱上；用缓冲液洗脱非复合的肉毒杆菌毒素以得到包含非复合的肉毒杆菌毒素的洗脱液；用来自阴离子交换柱的洗脱液装载阳离子交换柱，以允许俘获非复合的肉毒杆菌毒素；和用另一缓冲液洗脱非复合的肉毒杆菌毒素以得到洗脱液，由此获得纯化的非复合的肉毒杆菌毒素。

在某些实施方案中，通过许多色谱步骤获得肉毒杆菌毒素复合物本身。在一些实施方案中，用于获得肉毒杆菌毒素复合物的方法包括，获得包含肉毒杆菌毒素复合物的样品；用该样品装载疏水相互作用柱以允许俘获毒素，其中俘获的肉毒杆菌毒素包含复合的肉毒杆菌毒素；和洗脱复合的肉毒杆菌毒素。然后，从该复合物解离非复合的肉毒杆菌毒素，并且非复合的肉毒杆菌毒素根据上述方法纯化。在一些实施方案中，样品通过以下获得：使包含肉毒杆菌毒素的发酵培养物经受酸以获得酸沉淀物，其可经受额外的色谱前纯化步骤，所述色谱前纯化步骤的非限制性实例包括切向流过滤(以浓缩沉淀物的不溶物质)、核酸酶消化、净化离心和/或过滤。

在一些实施方案中，样品在装载到疏水相互作用柱前，经历核酸酶消化。优选地，核酸酶源自不含动物产物的过程，且更加优选地，整个纯化过程不含动物产物或至少基本上不含动物产物。

在一些实施方案中，色谱分离中使用的样品优选是上清液或滤液级分。

纯化的非复合的肉毒杆菌毒素包括A、B、C₁、D、F、F和G型肉毒杆菌毒素中的至少一种，且优选具有约150kD的分子量的A型肉毒杆菌毒素。在一些优选的实施方案中，纯化的非复合的肉毒杆菌毒素具有至少98％的纯度；和/或具有至少200 LD₅₀单位/ng的活性。在一些实施方案中，该方法产生至少约2mg/L发酵培养物的产量。在其他实施方案中，该方法产生约1至约2mg/L发酵培养物的产量。

通过参考以下本发明的详细描述，本发明的这些方面和其他方面将被更好地理解。

附图简述

图1是对比用于直接纯化非复合的肉毒杆菌毒素的根据本发明的方法的一个实施方案(图1A)与用于纯化复合的肉毒杆菌毒素的方法(图1B)的概括流程图。

详细描述

本发明涉及用于纯化非复合的肉毒杆菌毒素的系统和方法。在某些实施方案中，该方法包括通过下列来纯化粗制的非复合的肉毒杆菌毒素：用粗制的非复合的肉毒杆菌毒素装载阴离子交换柱以允许阴离子交换柱俘获非复合的肉毒杆菌毒素。然后，非复合的肉毒杆菌毒素用缓冲液洗脱，以得到包含非复合的肉毒杆菌毒素的洗脱液。将来自阴离子柱的洗脱液装载到阳离子交换柱，以允许俘获非复合的肉毒杆菌毒素，然后用缓冲液洗脱纯化的非复合的肉毒杆菌毒素，从而获得纯化的非复合的肉毒杆菌毒素。

在一些实施方案中，本发明提供了以相对少的步骤纯化非复合的肉毒杆菌毒素，以产生高产量、高纯度和高效价的产物。本发明的范围内的方法和系统可用于由发酵培养物有效产生稳定但非复合的肉毒杆菌毒素。在其他实施方案中，该方法还包括，提供包含肉毒杆菌毒素复合物的样品，并用该样品装载疏水相互作用柱，从而允许通过疏水相互作用柱俘获肉毒杆菌毒素复合物。然后，用缓冲液从柱洗脱肉毒杆菌毒素复合物。从肉毒杆菌毒素复合物解离粗制的非复合的肉毒杆菌毒素，以获得包含粗制的非复合的肉毒杆菌毒素的混合物。在这一实施方案中，包含粗制的非复合的肉毒杆菌毒素的混合物根据以上描述的方法进行纯化，以得到纯的或基本纯的肉毒杆菌毒素。

本发明的一个方面是认识到，包含非复合的肉毒杆菌毒素作为活性成分的药物组合物提供了比包含复合形式的药物组合物更高的纯度。通常与肉毒杆菌毒素复合物相关的非毒素蛋白可占复合物重量的约90％。因此，提供复合物形式的肉毒杆菌毒素必然包括按重量计至少约90％的杂质。换言之，按重量计药物组合物的至少约80％至约90％将包括细胞衍生的杂质，它们不是活性分子的一部分，也不是其生物活性所必须的。然而，这些杂质代表这样的细胞衍生的物质，当其被施用于患者时，可增加对药物的不期望的免疫反应的风险；可增加不期望的副作用的风险；和/或可增加致病剂的传播的风险。相反，可通过本文描述的方法和系统获得的非复合的产物的高纯度减少了可能残留在药物组合物中的宿主细胞杂质的量，由此减少了伴随的不期望的反应和/或传播的风险。因此，本文描述的方法和系统可提供更适合于制备更安全、更纯的药物组合物的形式的肉毒杆菌毒素。

此外，不同于复合形式，根据本文描述的方法制备的游离的肉毒杆菌毒素不需要在血液源产品中被稳定以便储存。例如，A型肉毒杆菌毒素复合物通常被稳定在包含白蛋白的赋形剂中，所述白蛋白源自人类血液。例如，

包括以真空干燥形式包装的纯化的A型肉毒杆菌毒素复合物、人类血清白蛋白和氯化钠。Dysport和Xeomin也是这样。虽然筛选降低了致病剂污染的可能性，但是人类血液在药物制剂中的使用通常增加了某些致病剂(例如不能或还没有被筛选出来的致病剂)的不期望的传播的风险。相反，如本文所教导的，根据本发明制备的游离的肉毒杆菌毒素可稳定地储存在硫酸铵中。此外，如本文所讨论的，在一些优选的实施方案中，本发明的方法和系统基本上、大体上或完全不含动物产物。稳定储存基本上、大体上或完全不含动物产物的毒素产物的能力还降低与动物源产物相关的潜在风险。因此，本文描述的方法和系统提供了在安全性方面特别适合于药物应用的形式的肉毒杆菌毒素，例如，可制备和储存基本上、大体上或完全不含动物产物的药物组合物。

在某些优选的实施方案中，本文描述的方法和系统是可规模化的和/或依从cGMP的。因此，本文描述的方法和系统可以以商业化的工业规模使用，以产生用于例如药物组合物中的非复合的肉毒杆菌毒素。依从cGMP的方法或系统是指，可遵循由美国联邦管理法规要求的当前药品生产和质量管理的管理机构要求的方法或系统。在一些优选的实施方案中，非复合的肉毒杆菌毒素产物因为其易于储存和使用、高活性、高纯度、稳定性和/或提高的安全性，特别适合于大规模的生产。

本文使用的“肉毒杆菌毒素”指可由梭菌细菌生产的神经毒素蛋白分子，以及其重组产生的形式。重组肉毒杆菌毒素可具有例如由重组梭菌属和/或非梭菌属物种经重组技术合成的毒素蛋白的轻链和/或重链。“肉毒杆菌毒素”在本文中与相关表述“肉毒杆菌神经毒素”、“神经毒素”或简单的“毒素”可互换使用。“肉毒杆菌毒素”包括肉毒杆菌毒素血清型A、B、C₁、D、E、F和G中的任何一种，并且还包括复合形式和非复合形式。

“复合形式”指包含肉毒杆菌毒素蛋白(即具有约150kD的分子量的毒素分子)以及至少一个缔合的天然非毒素蛋白的肉毒杆菌毒素复合物。构成复合物的非毒素蛋白通常包括非毒素血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白。因此，复合形式可包括肉毒杆菌毒素分子(神经毒性组分)和一个或多个非毒素血凝素蛋白和/或一个或多个非毒素非血凝素蛋白。在某些实施方案中，复合物的分子量大于约150kD。例如，A型肉毒杆菌毒素的复合形式可具有约900kD、约500kD或约300kD的分子量。B型和C₁型肉毒杆菌毒素的复合形式可具有500kD的分子量。D型肉毒杆菌毒素的复合形式可具有约300kD或约500kD的分子量。最后，E型和F型肉毒杆菌毒素的复合形式可具有约300kD的分子量。

“非复合的”肉毒杆菌毒素指具有约150kD的分子量的分离的，或大体上或基本上分离的肉毒杆菌毒素蛋白。即，“非复合的”形式不包括通常与复合形式相关的非毒素蛋白，诸如非毒素血凝素和非毒素非血凝素蛋白。“非复合的”肉毒杆菌毒素在本文中与“游离的”肉毒杆菌毒素可互换使用。由天然肉毒梭菌细菌制备的所有肉毒杆菌毒素血清型由细菌合成为无活性的单链蛋白，然后其被蛋白酶切割或切断，变得具有神经活性。该蛋白包括通过二硫键连接到约50kD轻链的约100kD重链。

肉毒杆菌毒素复合物可通过多种方法解离成毒素和非毒素蛋白，包括例如升高pH至约7.0，在约7.3的pH下用红细胞处理复合物，和/或使复合物经历分离过程，诸如在约7至约8的pH下在合适的缓冲液中的柱色谱。

本发明包括能够纯化非复合的肉毒杆菌毒素(其不具有通常被认为是在纯化过程中维持稳定性所必须的缔合的非毒素蛋白)的系统和方法。在优选的实施方案中，本文描述的方法和系统有利于纯化游离的肉毒杆菌毒素，而没有稳定性损失。“稳定性”或“稳定的”指保留通过二硫键彼此连接的约100kD重链和约50kD轻链，并处于提供生物活性的构型的肉毒杆菌毒素蛋白分子。

在一些实施方案中，本发明的范围中的特定系统连同本发明的范围中的特定方法一起操作。本发明的范围中的系统可包括用于相应的多个(优选连续系列(consecutive series))色谱步骤的多个(优选连续系列)色谱柱。此外，本发明的范围中的系统可包括用于相应的多个(优选连续系列)非色谱步骤(例如色谱前步骤)的多个(优选连续系列)非色谱设备，诸如过滤和/或离心装置。

在优选的实施方案中，本发明的范围中的方法包括，从发酵培养物获得包含肉毒杆菌毒素的样品；使其经受多个色谱前纯化；然后，使其通过多个色谱柱，以得到高度纯化的高效价的非复合的肉毒杆菌毒素。这样的纯化的游离的肉毒杆菌毒素可用于制备包含游离的肉毒杆菌毒素作为活性成分的药物组合物。

本发明的一些优选实施方案的色谱前过程和色谱过程的所有步骤在图1A中示出。为了比较，图1B示出了用于获得纯化的肉毒杆菌毒素复合物的常规方法。简而言之，图1B描述了包括以下的过程：发酵培养物的深度过滤，随后切向流过滤所得的滤液(使用300kD超微过滤)；随后是净化离心步骤。然后，将离心步骤获得的团块(不溶性级分)再悬浮于氯化钠中，并装载到疏水相互作用柱或离子交换柱。重复色谱纯化步骤至少三次，以得到含有900 kD A型肉毒杆菌毒素复合物的最终洗脱液。

发酵和酸沉淀

如图1A所示，非复合的肉毒杆菌毒素通常由发酵培养物纯化。本文使用的“发酵培养物”指包含正在合成和/或已经合成至少一种肉毒杆菌毒素的细胞的培养物或培养基，和/或其组分。例如，梭菌属细菌，诸如肉毒梭菌可以在有益于细菌生长的环境(温暖的厌氧气氛)中，在琼脂平板上培养。培养步骤通常允许获得具有期望的形态和其他特征的梭菌菌落。然后，所选的培养的梭菌菌落可以在合适的培养基中发酵成发酵培养物。所培养的细胞可以包括非梭菌属物种作为宿主细胞(诸如大肠杆菌(E.coli)或酵母细胞)，通过重组技术使得它们能够生物合成肉毒杆菌毒素。合适的发酵培养条件可依赖于所用的宿主细胞，并且通常是本领域已知的。

在优选的实施方案中，可以允许发酵进展至完成，以致细胞成熟，并已生物合成了肉毒杆菌毒素。肉毒梭菌培养物的生长通常在约24小时至约36小时之后完成。在一段额外的时间段后，细菌通常溶解，并将合成的肉毒杆菌毒素复合物以复合形式释放到培养基中。例如，在约60小时至约96小时的发酵期间，大多数肉毒梭菌细胞经受溶解，并释放A型肉毒杆菌毒素复合物。

在一些实施方案中，发酵培养物可包括在常规发酵培养程序中使用的一种或多种动物产物，诸如动物蛋白。例如，肉毒杆菌毒素可使用公知的Schantz方法的改良版本，通过肉毒梭菌的厌氧发酵来生产(参见例如Schantz E.J.等人，Properties and use of botulinum toxin andother microbial neurotoxins in medicine(肉毒杆菌毒素和其他微生物神经毒素在药物中的性质和用途)，Microbiol Rev 1992年3月；56(1)：80-99；Schantz E.J.等人Preparation and characterizationof botulinum toxin type A for human treatment(用于人类治疗的A型肉毒杆菌毒素的制备和表征)，第3章Jankovic J编辑.NeurologicalDisease and Therapy.Therapy with botulinum toxin(神经学疾病和治疗.用肉毒杆菌毒素治疗)(1994)，New York，Marcel Dekker；1994，第41-49页和；Schantz E.J.等人，Use of crystalline type Abotulinum toxin in medical research(结晶A型肉毒杆菌毒素在医学研究中的用途)，Lewis G EJr编辑Biomedical Aspects of Botulism(肉毒中毒的生物医学方面)(1981)New York，Academic Press，第143-50页，每个文献通过引用并入本文)。用于获得肉毒杆菌毒素的Schantz方法和改良的Schantz方法使用动物产物，包括在培养瓶(culture vial)中的动物源Bacto-Cooked肉培养基，和在发酵培养基中的酪蛋白。此外，Schantz毒素纯化使用来自牛来源的DNA酶和RNA酶水解存在于发酵培养物中的核酸。

然而，含有使用包含动物源产物的过程纯化的活性成分的药物的施用可能使患者经受接受不同的致病剂的潜在风险。例如，朊病毒可存在于包含污染的动物源产物的药物组合物中，诸如引起克-雅二氏病的朊病毒。作为另一个实例，当动物产物用于制备药物组合物的过程中时，存在传播海绵状脑病(TSE)，诸如牛海绵状脑病(BSE)的风险。然而，经不含动物产物的过程获得的肉毒杆菌毒素的使用减少了此类风险。因此，在一些优选的实施方案中，本发明提供了不含动物产物，或大体上或基本上不含动物产物的(APF)方法/过程。“不含动物产物的”、“大体上不含动物产物的”或“基本上不含动物产物的”分别包括“不含动物蛋白的”、“大体上不含动物蛋白的”或“基本上不含动物蛋白的”，并且分别指不存在、大体上不存在或基本上不存在源自动物的产物，源自动物的产物的非限制性实例包括源自血液或汇集的血液(pooled blood)的产物。本文使用的“动物”指哺乳动物(诸如人类)、禽类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫、蜘蛛或其他动物物种，但排除微生物，诸如细菌和酵母。

不含动物产物的方法/过程(或大体上或基本上不含动物产物的方法/过程)指这样的方法/过程，其完全、基本上或大体上不含动物源产物、试剂和蛋白诸如免疫球蛋白、其他血液产品、副产物或消化物；肉产物、肉副产物、肉消化物；以及奶或乳制品、副产物或消化物。因此，不含动物产物的发酵培养程序的实例是发酵过程，诸如细菌培养，其排除血液、肉和乳制品、副产物或消化物。用于获得非复合的肉毒杆菌毒素的不含动物产物的发酵过程降低了当施用于人类时，可伴随毒素的病毒、朊病毒或其他不期望的物质的污染的可能性。

使用梭菌属培养物的不含动物产物的发酵程序描述于例如美国专利No.7,452,697和7,354,740，其通过引用在此并入。例如，用于产生肉毒杆菌毒素的生长培养基可包括基于植物的产物(而不是动物源产物)，诸如基于大豆的产物和/或Lupinus campestris的脱苦种子(debitteredseed)。用于不含动物产物的发酵培养的基于大豆的发酵培养基例如可包括基于大豆的产物、碳源诸如葡萄糖、盐诸如NaCl和KCl、含磷酸盐的成分诸如Na₂HPO₄和KH₂PO₄、二价阳离子诸如铁和镁、铁粉、氨基酸诸如L-半胱氨酸和L-酪氨酸等等。优选地，大豆是水解的大豆，且水解使用非源自动物的酶进行。水解的大豆的来源包括但不限于Hy-Soy(QuestInternational)、大豆蛋白胨(Gibco)、Bac-soytone(Difco)、AMISOY(Quest)、NZ大豆(Quest)、NZ大豆BL4、NZ大豆BL7、SE50M(DMVInternational Nutritionals，Fraser，N.Y.)和SE50MK(DMV)。

如图1A所示，在某些实施方案中，包含肉毒杆菌毒素的样品获自发酵培养物。例如，在发酵一段时间之后，在不含动物产物的或非不含动物产物的培养基中，肉毒杆菌毒素复合物被释放到培养基中，并可通过沉淀收获。例如，在一些实施方案中，如在公知的Schantz方法中，包含肉毒杆菌毒素的发酵培养基可经受酸沉淀，以促使肉毒杆菌毒素复合物与细胞碎片缔合，并形成酸沉淀物。在一些特别优选的实施方案中，约3M硫酸溶液可以被加入到发酵培养物中，以形成酸沉淀物。优选地，将pH降低至约3至约4，更优选降低至约3.2至约3.8，且更优选约3.5。在一些实施方案中，培养温度也被降低，例如降低至低于约25℃、24℃、23℃、22℃、21℃或20℃。这些条件还增强了肉毒杆菌毒素复合物与细胞碎片的缔合。形成的酸沉淀物将包括结合的肉毒杆菌毒素复合物，并可在进一步的纯化步骤(诸如净化步骤)中用作起始材料；而弃去滤液。

相反，图1B中描述的常规过程不包括酸沉淀步骤。即，虽然纯化程序也开始于包含肉毒杆菌毒素复合物的发酵培养物，但培养基经受深度过滤，且在随后的纯化步骤中使用滤液而不是细胞碎片。在图1B的过程中，弃去了细胞碎片而不是滤液，而如图1A所示，弃去了滤液，且将细胞碎片(酸沉淀物)用于进一步的纯化步骤，例如以下讨论的色谱前纯化。

色谱前纯化

在一些实施方案中，从发酵培养基获得的样品经受一种或多种色谱前纯化。色谱前纯化可包括切向流过滤、核酸酶消化和净化离心和/或过滤中的至少一种。图1A提供了本发明涵盖的包含色谱前纯化的工艺流程的一个非限制性实例。如上所示，在优选的实施方案中，对包含肉毒杆菌毒素的发酵培养物的沉淀物(或不溶性级分)而不是对发酵培养物自身或源自其的滤液(如图1B所示的过程)进行色谱前程序。即，在本发明的优选实施方案中，色谱前(净化)步骤起始于酸沉淀物(不溶性级分)。

在一些实施方案中，包含肉毒杆菌毒素的样品(酸沉淀物或不溶性级分)经受切向流过滤。切向流过滤是通常用于净化、浓缩和/或纯化蛋白的过程。与正常流动过滤(其中液体在施加的压力下直接朝向滤膜移动)相反，在切向流过滤中，液体沿着膜表面切向地或平行地移动。施加的压力用于迫使一部分液体通过滤膜，达到滤液侧，而太大而不能通过膜孔的颗粒和大分子被滞留下来。然而，不同于正常流动过滤，滞留的组分没有滞留在膜表面，而是被切向流动的液体清扫。在某些优选的实施方案中，切向流过滤用于浓缩与肉毒杆菌复合物缔合的不溶物质(细胞碎片)，同时允许滤液通过膜孔。(参见例如图1A)。切向流过滤参数，诸如孔径、进料流量、施加的压力等等可由本领域技术人员选择以浓缩细胞碎片，并产生更浓的含肉毒杆菌毒素复合物的样品。在一些特别优选的实施方案中，例如，可使用切向流过滤，其使用具有约0.1μm的孔径的滤器。

在一些实施方案中，包含肉毒杆菌毒素的样品经受核酸酶消化。核酸酶消化可促进肉毒杆菌毒素复合物易于与其结合的核酸组分的去除。在某些优选的实施方案中，核酸酶消化在切向流过滤之后，并对由切向流过滤获得的浓缩的细胞碎片进行。(参见例如图1A)。例如，浓缩的细胞碎片样品的pH可被调整以提供核酸酶活性，并可用一种或多种合适的核酸酶进行孵育，所述核酸酶诸如分别消化(水解)DNA和/或RNA的DNA酶和/或RNA酶。依赖于所用的核酸酶，合适的pH可以是约5至约7，优选地约6。在一些实施方案中，苯甲脒被用作蛋白酶抑制剂，以防止核酸酶消化步骤期间毒素的蛋白酶解。使用的核酸酶可源自任何适合的来源，包括动物源和/或非动物源。

在更加优选的实施方案中，核酸酶由非动物源获得，以提供不含动物产物的核酸酶和不含动物产物的过程。因此，本发明涵盖用于纯化肉毒杆菌毒素的不含动物产物的方法和系统(或基本上或大体上不含动物产物的方法和系统)，其包括使用核酸酶。不含动物产物的核酸酶可重组制备，例如使用重组细菌、酵母或其他合适的微生物，所述重组细菌、酵母或微生物已经被转化而表达根据本文描述的方法的核酸酶消化步骤中使用的DNA酶和/或RNA酶。核酸酶消化通常减少样品的核酸含量，因为宿主细胞的核酸被降解，并且促进了它们的去除。例如，水解的核酸和其他低分子量杂质可通过进一步的纯化步骤除去。

在某些实施方案中，包含肉毒杆菌毒素的样品可经受净化离心和/或过滤。净化离心或过滤指用于从样品中除去肉眼可见的成分(grosselement)，诸如完整的和溶解的细胞和细胞碎片，产生可测量地更澄清的样品的离心或过滤步骤。在某些实施方案中，离心以约10,000xg至约30,000xg，更优选地以约15,000xg至约20,000xg，且最优选地以约17,700xg进行。净化过滤将通常包括正常流动过滤，也称为“死端”过滤，其中液体在施加的压力下直接朝向过滤介质移动，并且太大而不能通过滤孔的颗粒积累在表面或在介质自身中，同时较小的分子作为滤液通过。在一些特别优选的实施方案中，将样品与硫酸铵混合，并且正常流动过滤使用具有约0.1至约0.3μm的孔径，且更优选地约0.2μm的孔径的滤器进行。(参见例如图1A)。在某些特别优选的实施方案中，一个或多个净化步骤跟随核酸酶消化步骤。在某些更加优选的实施方案中，一个或多个净化步骤紧在色谱纯化之前进行。

值得注意的是，在优选的实施方案中，净化的上清液或滤液(而不是被弃去的不溶性级分)提供了用于进一步的纯化步骤(诸如色谱纯化步骤)的含肉毒杆菌毒素的样品。这与图1B中描述的过程相反，其中肉毒杆菌毒素复合物包含在来自不包括酸沉淀的色谱前步骤的不溶性级分中，诸如例如从色谱前离心获得的离心团块，并且弃去上清液。

此外，并且再次与图1B中描述的过程相反，在本发明的一些实施方案中，色谱前步骤不需要从发酵培养物获得的滤液的切向流过滤步骤。即，在本发明的一些实施方案中，色谱纯化所用的样品不是通过使发酵培养物的可溶性级分经受切向流过滤来获得的。而是，在某些实施方案中，本发明使用不溶性物质(诸如酸沉淀物)，消除了其中使发酵培养物滤液经受切向流过滤以试图浓缩可溶的肉毒杆菌毒素复合物的任何步骤。因此，在优选的实施方案中，本发明的色谱前步骤消除了对任何此类步骤的需要，作为代替，使用酸来沉淀所需的毒素复合物和其他不溶性物质(细胞碎片)。

色谱纯化步骤

图1A还阐释了根据本发明的某些实施方案的色谱纯化步骤。根据本发明的一个实施方案，用于纯化非复合的肉毒杆菌毒素的色谱方法包括，使包含肉毒杆菌毒素的样品通过多个色谱柱，以获得高度纯化的、高效价的、非复合形式的神经毒素。

在某些实施方案中，使用疏水相互作用柱将复合的肉毒杆菌毒素与其他细胞组分分离(参见例如图1A)。该柱俘获复合形式的肉毒杆菌毒素，同时允许杂质流过该柱。所用的柱可以是本领域已知的、适合用于这种目的的任何疏水相互作用柱，诸如商购自GE Healthcare Life Sciences的丁基琼脂糖快流(Butyl Sepharose Fast Flow)柱或苯基琼脂糖HP(Phenyl Sepharose HP)。在一些实施方案中，该方法还包括在装载到柱上之前，处理用于疏水相互作用色谱的样品。例如，当用于苯基琼脂糖HP柱时，样品可在装载前与pH 6的0.5M硫酸铵溶液和50mM磷酸盐合并。可以使用的其他的柱、缓冲液和pH条件包括柱，诸如苯基琼脂糖快流高置换(Phenyl Sepharose Fast Flow high substitution)、苯基琼脂糖快流低置换(Phenyl Sepharose Fast Flow low substitution)、丁基琼脂糖(Butyl Sepharose)和辛基琼脂糖(Octyl Sepharose)；缓冲液，诸如乙酸盐、柠檬酸盐、MES、组氨酸、哌嗪和丙二酸盐，各自的pH范围是约4.0至约7.0，更优选地约4.5至约6.5，且更加优选地约5.5。如本领域所知的，基于本文提供的教导，可确定其他缓冲液和pH条件以使所使用的特定柱的收率最大化。不期望受到理论的束缚，认为分离包括在低于7的pH下使毒素复合物结合于树脂以避免在该步骤解离，同时允许许多细胞源杂质流过，诸如例如较小的蛋白、核酸等等。

如本领域所知的，为了将俘获的(结合的)毒素从疏水相互作用柱洗脱，可使用合适的缓冲液。在一些特别优选的实施方案中，使用下降梯度的硫酸铵。下降梯度的浓度范围可以是约0.6M至约0.0M、约0.5M至约0.0M或约0.4M至约0.0M。可使用的其他洗脱缓冲液包括例如，下降梯度的硫酸钠(Na₂SO₄)；氯化钠(NaCl)；氯化钾(KCl)；乙酸铵(NH₄OAc)等等。如本领域所知的，可鉴别包含产物峰的级分。例如，当使用硫酸铵时，通常在约0.4M至约0.0M；更优选地约0.3M至约0.0M；且最优选地约0.25M至约0.0M硫酸铵的浓度范围内发现峰级分，同时将pH保持在约6以维持复合物。即，可鉴别并在随后的纯化步骤中使用含有洗脱的肉毒杆菌毒素复合物的级分。

在优选的实施方案中，使所得的肉毒杆菌毒素复合物解离，以得到非复合形式。在某些优选实施方案中，解离步骤在疏水相互作用色谱步骤之后和/或在随后的色谱步骤之前进行(例如参见图1A)。因此，在一些优选的实施方案中，本发明涵盖了其中色谱的目标分子在不同的色谱步骤中不同的方法和系统。即，在初始的色谱步骤中，目标包括肉毒杆菌毒素复合物，而在随后的色谱步骤中，目标包括从非毒素蛋白(诸如血凝素和非血凝素蛋白)解离的游离的肉毒杆菌毒素。相反，在图1B中描述的过程包括全部设计用于纯化肉毒杆菌毒素复合物的色谱步骤。

解离肉毒杆菌毒素复合物以产生非复合的肉毒杆菌毒素蛋白可以以许多方式完成，例如，如本领域所知的和/或本文描述的。例如，可通过将pH升高至约7.0完成解离；或在其中不含动物蛋白的纯化不是必须的实施方案中，可通过在约7.3的pH下用红细胞处理复合物完成解离。

在优选的实施方案中且为了提供不含动物的毒素，基于复合物在合适的缓冲液中的pH调整，使复合物经受分离过程。合适的缓冲液包括但不限于阳离子缓冲液，优选地不与阴离子交换柱相互作用，或基本上不与阴离子交换柱相互作用的阳离子缓冲液。合适的阳离子缓冲液包括例如，Tris、bis-Tris、三乙醇胺、N-甲基二乙醇胺。约7至约8.4之间的pH；更优选地约7.4至约8.2之间的pH；且最优选地约7.8的pH通常适合于解离复合物以释放非复合的肉毒杆菌毒素。在一些特别优选的实施方案中，将疏水相互作用柱的洗脱液的pH升至约7.5、约7.8或优选地升至约8.0。例如，在一些实施方案中，洗脱液可被稀释到具有约7.8的pH的Tris缓冲液中，以使复合物解离成单独的组分，包括约150kD非复合的肉毒杆菌毒素蛋白。然后，包含解离组分的所得混合物可经受一个或多个额外的色谱纯化步骤，诸如设计用于俘获并进一步纯化非复合的毒素的离子交换色谱步骤。

在根据本发明的某些实施方案中，可使用一个或多个离子交换色谱步骤纯化非复合的肉毒杆菌毒素(例如参见图1A)。离子交换色谱实现基于静电荷的分级分离。给定的蛋白结合柱基质的程度是蛋白的静电荷的函数，蛋白的静电荷基于其氨基酸组成和柱基质的电荷。阳离子离子交换柱具有带净正电荷的基质，而阴离子离子交换柱具有带净负电荷的基质。使用含带电物质的溶剂(洗脱剂)从柱上选择性地洗脱结合的蛋白，所述带电物质诸如盐离子，其与带电的基质支持体竞争与带电的蛋白的结合。因此，结合的蛋白可基于它们的电荷强度分级分离。可选择地，可通过调节pH(其可改变蛋白的静电荷)，由此改变蛋白对带电基质的亲和力来洗脱蛋白。

在根据本发明的一些优选的实施方案中，将包含非复合的肉毒杆菌毒素的混合物装载到阴离子交换柱上(例如参见图1A)。值得注意的是，该柱俘获非复合形式的肉毒杆菌毒素，以使毒素蛋白与解离的非毒素蛋白可洗脱到不同的级分。所用的柱可以是本领域已知的适合分离带电蛋白的任何阴离子柱，其非限制性实例包括商购自GE Healthcare LifeSciences的Q琼脂糖HP(Q Sepharose HP)、Q琼脂糖快流(Q SepharoseFast Flow)或Q XL琼脂糖(Q XL Sepharose)。在一些特别优选的实施方案中，使用Q XL琼脂糖柱。在一些实施方案中，该方法还包括在装载到柱上以前，处理用于阴离子交换色谱的包含非复合的肉毒杆菌毒素的混合物。例如，如本领域所知的，基于本文提供的教导，可确定缓冲液和pH条件，以使所使用的特定柱的收率最大化。对于装载和在柱中的使用，例如，合适的缓冲液包括但不限于阳离子缓冲液，优选地不与阴离子交换柱相互作用或基本上不与阴离子交换柱相互作用的阳离子缓冲液。合适的阳离子缓冲液包括例如Tris、bis-Tris、三乙醇胺、N-甲基二乙醇胺。为装载和平衡柱，可使用约7.2至约8.6的pH；更优选地约7.4至约8.2的pH；且最优选地约7.8的pH。

如本领域所知的，为了从阴离子交换柱洗脱俘获的(结合的)毒素和其他解离组分，可使用合适的缓冲液。合适的缓冲液的实例包括例如，氯化钠(NaCl)；和氯化钾(KCl)。在一些特别优选的实施方案中，使用上升梯度的氯化钠。例如，可使用具有约0.0M至约0.4M NaCl，更优选地约0.0M至约0.5M NaCl，且更加优选地约0.0M至约0.6M NaCl的浓度范围的氯化钠缓冲液。在不同级分中分离的杂质可包括例如解离的复合物的一种或多种非毒素蛋白，诸如非毒素血凝素和/或非毒素非血凝素蛋白。如本领域所知的，可鉴别包含产物峰的级分。在约7.4至约8.4之间，优选约7.8的pH下，峰可出现在例如约8mSem至约22mSem(对应于约0.08M至约0.18M NaCl)下。相反，其他杂质可在约30至约45mSem(对应于约0.25M至约0.35M NaCl)下洗脱。

可鉴别包含洗脱的非复合的肉毒杆菌毒素的级分，以提供包含非复合的肉毒杆菌毒素的洗脱液。可通过本领域所知的方法鉴别峰，例如使用HPLC、蛋白印迹分析、ELISA、非还原型SDS-PAGE等等。例如，在非还原条件下的SDS-PAGE可鉴别出约150kDa的毒素带，而其他杂质将出现在对应于更小分子的带。然后，包含非复合形式的洗脱液可经受进一步的色谱纯化步骤。

在一个特别优选的实施方案中，通过SDS-PAGE评价毒素纯度。如本领域技术人员所了解的，SDS-PAGE分析可以在切割存在于蛋白中的二硫键的试剂的缺失或存在(即分别地，非还原条件或还原条件)下进行。例如对于A型肉毒杆菌毒素，A型肉毒杆菌毒素蛋白分子的成熟和活性形式包括分别为100kD和50kD的两条肽链，其通过非共价相互作用以及二硫键保持在一起。当使用非还原条件测定通过本发明的过程产生的A型肉毒杆菌毒素时，A型肉毒杆菌毒素蛋白分子迁移为约150kD的单一蛋白带，且测量的纯度通常大于98％。当每条凝胶泳道装载的A型肉毒杆菌毒素蛋白的量保持在光密度计的动态范围内时，存在很少(如果有的化)的可检测的杂质带，得到100％的测量纯度。当A型肉毒杆菌毒素过载，以致主要的毒素带高于光密度计的动态范围时，可检测到一些较少的杂质带(多达1-2％)。

然而，当A型肉毒杆菌毒素的SDS-PAGE分析在还原条件下进行时，肉毒杆菌毒素的二硫键被切断，且A型肉毒杆菌毒素蛋白迁移为分别具有100kD和50kD的分子量的两个组分。当装载A型肉毒杆菌毒素蛋白以致主要物质高于光密度计的动态范围，且SDS-page在还原条件下运行时，可更容易地检测到较少的杂质物质。例如，在这些条件下，由于在发酵和回收过程中不完全的蛋白酶解加工，可存在多达5％的150kD物质。在这些条件下，本发明的方法产生通常大于总蛋白的90％，且更可能大于总蛋白的95％的毒素产物(包括有活性的切割的100kD和50kD的多肽链)。因此，如本文描述的，报道的毒素的测量纯度依赖于所用的SDS-PAGE方法的细节。此外，虽然以上实例涉及A型肉毒杆菌毒素，但本领域技术人员将理解，可容易地修改本文描述的SDS-PAGE分析，以评价肉毒杆菌毒素的其他血清型的纯度。

在某些实施方案中，将来自阴离子柱的包含非复合的肉毒杆菌毒素的洗脱液装载到阳离子交换柱(参见例如图1A)。值得注意地，该柱也俘获非复合形式的肉毒杆菌毒素，以致毒素蛋白和解离的非毒素蛋白可洗脱在不同的级分中。所用的柱可以是本领域已知的适合于分离蛋白的任何阳离子柱，其非限制性实例包括SP琼脂糖(SP Sepharose)柱，包括SP琼脂糖HP(SP Sepharose HP)柱或SP琼脂糖快流(SP Sephrose FastFlow)柱；Mono S柱；或Source-S柱，诸如Source-30S柱或优选地Source-15S柱，它们都商购自GE Healthcare Life Sciences。在一些实施方案中，该方法还包括在装载到柱上之前，处理用于阳离子交换色谱的来自阴离子交换柱的包含非复合的肉毒杆菌毒素的洗脱液。在一些优选的实施方案中，调整pH，以致装载到柱上的洗脱液的pH允许游离毒素与柱有效地结合。例如，pH可以维持在约4至约8的范围内，优选地约5至约7.5，更优选地约6至约7，且最优选地约7。此外，在一些实施方案中，可在装载到阳离子交换柱上之前，处理来自阴离子柱的洗脱液以减少电导率，例如使用磷酸钠缓冲液，其非限制性实例是约20mMNaH₂PO₄的磷酸钠缓冲液。例如，来自阴离子柱的洗脱液可含有多达约0.15M的NaCl，从而在约20mM NaH₂PO₄缓冲液中的稀释减少了电导率。在一些特定的实施方案中，电导率从约12mSem减少至约3.3mSem。在缓冲液稀释、透析或本领域已知的其他方法也可用于减少电导率。

为了装载和在柱中使用，例如，合适的缓冲液包括但不限于阴离子缓冲液，优选地不与阳离子交换柱相互作用或基本上不与阳离子交换柱相互作用的阴离子缓冲液。合适的阴离子缓冲液包括例如MES、HEPES等等，且优选地磷酸钠缓冲液。为了装载和平衡柱，可使用约4至约8之间的pH；优选地约5至约7.5之间的pH；更优选地约6至约7之间的pH；且最优选地约6.8至约7的pH。

如本领域所知的，为了从阳离子交换柱洗脱俘获的(结合的)毒素(与其他解离的非毒素蛋白和其他杂质分离)，可使用合适的缓冲液。在一些特别优选的实施方案中，使用上升梯度的氯化钠。氯化钠梯度的合适的浓度范围可以从约0.0M至约1M NaCl。可使用的其他盐包括例如氯化钾，其可以约0.0M至约0.5M KCl的浓度梯度使用。如本领域所知的，可鉴别包含产物峰的级分。在约6.7的pH下，峰可以出现在例如约18至约25mSem(对应于约0.3M至约0.4M NaCl)下。即，可鉴别包含洗脱的非复合的肉毒杆菌毒素的级分以提供来自阳离子柱的包含非复合的肉毒杆菌毒素的洗脱液。在特别优选的实施方案中，来自阳离子柱的洗脱液表示高纯度的、高产量的并具有高活性的非复合的肉毒杆菌毒素。相反，图1B中描述的过程在最终的洗脱液中提供了900kD的A型肉毒杆菌毒素复合物。

纯化的非复合的肉毒杆菌毒素产物

本文描述的方法和系统可用于提供高纯度的、高产量的并具有高活性的非复合的肉毒杆菌毒素。参见以下实施例1。该产物还易于稳定，并可常规地用于制备安全的药物组合物。

在一些优选的实施方案中，纯化的非复合的肉毒杆菌毒素是至少约80％纯的，优选地至少约90％纯的，更优选地至少约95％纯的，更加优选地至少约98％纯的，且最优选地至少约99％纯的或甚至是约100％纯的。“纯化的非复合的肉毒杆菌毒素”指与其他蛋白和杂质分离或基本上分离的游离的肉毒杆菌毒素蛋白分子，所述其他蛋白和杂质在其从培养物或发酵过程获得时，可以伴随非复合的肉毒杆菌毒素。例如“80％纯的”纯化的非复合的肉毒杆菌毒素指分离的或基本上分离的非复合的肉毒杆菌毒素蛋白，其中如通过其他合适的分析方法所测定的，毒素蛋白占存在的总蛋白的80％，所述分析方法的非限制性实例包括SDS-PAGE、CE和HPLC。例如，在一些优选的实施方案中，包含非复合的肉毒杆菌毒素的阳离子柱洗脱液是至少约99％纯的，且含有小于约1％的宿主细胞蛋白，所述宿主细胞蛋白不是原本存在的约150kD的肉毒杆菌毒素。

在一些优选的实施方案中，纯化的非复合的肉毒杆菌毒素具有至少约150 LD₅₀单位/ng，优选地至少约180 LD₅₀单位/ng，更优选地至少约200 LD₅₀单位/ng，更加优选地至少约210 LD₅₀单位/ng，且最优选地至少约220 LD₅₀单位/ng的活性。肉毒杆菌毒素的一个单位被定义为，当腹膜内注射到雌性Swiss Webster小鼠(每只重量为约18-20克)时的LD₅₀。换言之，肉毒杆菌毒素的一个单位是杀死一组雌性Swiss Webster小鼠的50％的肉毒杆菌毒素的量。“活性”在本文中与相关表述“生物活性”、“效价”和“毒性”可互换使用，用于描述肉毒杆菌毒素的作用。

在优选的实施方案中，可通过本文描述的方法和系统获得的非复合的肉毒杆菌毒素显示出生物活性。即，在优选的实施方案中，当根据本发明的优选实施方案纯化时，产物的生物活性或毒性不损失，即使在纯化期间，除去了与毒素蛋白天然缔合的非毒素蛋白。在更加优选的实施方案中，使用本发明的范围内的给定的一组过程和参数获得的效价是一致的和/或可重现的。例如，进行的效价测量可具有低于约40％的变异性，优选地低于约35％的变异性，更优选地低于约30％的变异性，更加优选地低于约25％的变异性，且最优选地低于约20％的变异性。

在一些优选的实施方案中，纯化过程提供了高产量的非复合的肉毒杆菌毒素。例如从30L发酵培养物获得的产量可以是至少约30mg，优选地至少约40mg，更优选地至少约70mg，更加优选地至少约80mg，且最优选地至少约90mg，分别对应于至少约1mg/L，优选地至少约1.3mg/L，更优选地至少约2.3mg/L，更加优选地至少约2.7mg/L，且最优选地至少约3mg/L的产量。在更加优选的实施方案中，使用本发明范围内的给定的一组过程和参数获得的产量是可重现的。例如，测量的产量可具有低于约40％的变异性，优选地低于约35％的变异性，更优选地低于约30％的变异性，更加优选地低于约25％的变异性，且最优选地低于约20％的变异性。

在一些特别优选的实施方案中，在使用本文描述的方法和系统的纯化期间，纯化的非复合的肉毒杆菌毒素是稳定的。已认为，从肉毒杆菌毒素复合物，诸如A型肉毒杆菌毒素复合物除去缔合的非毒素蛋白产生显著不稳定的肉毒杆菌毒素产物。然而，如上文所讨论的，本发明提供了可稳定分离游离的肉毒杆菌毒素(其不具有通常被认为是在纯化过程期间维持稳定性所需的缔合的非毒素蛋白)的方法和系统。

在一些优选的实施方案中，本文描述的方法和系统提供了需要非常少的色谱后步骤(例如在维持储存期间的稳定性方面和在药物应用的适用性方面)的非复合的肉毒杆菌毒素。例如，如本领域所知的，可以将硫酸铵加入游离的肉毒杆菌毒素，以制备用于储存的硫酸铵悬浮液。包含游离的肉毒杆菌毒素和硫酸铵的组合物可易于储存在冰箱中，且随后可容易地回复以用于药物应用。事实上，可通过本文描述的方法获得的毒素的稳定性、高产量和纯度，和高且稳定的效价促进了纯化的产物的药物应用，如在下文更加详细地描述的。

纯化的非复合的肉毒杆菌毒素的用途

根据本发明纯化的非复合的肉毒杆菌毒素可用于制备包含毒素作为活性成分的药物组合物，所述药物组合物用于施用给将从这种药物组合物获得益处的任何受试者。在优选的实施方案中，待治疗的受试者是哺乳动物，优选人类。本文使用的“药物组合物”指其中活性成分可以是肉毒杆菌毒素的制剂。制剂将含有至少一种额外的成分，并且适合于向受试者(诸如人类患者)诊断性、治疗性和/或美容性施用。药物组合物可以是液体或固体；且可以是单组分或多组分系统，例如用稀释剂(诸如盐水)重构的冻干组合物。

本发明的另一方面提供了纯化的肉毒杆菌毒素分子至患者的施用。本文使用的“施用”指向受试者或患者提供药物组合物。药物组合物可通过本领域已知的任何方法施用，包括例如肌内(i.m.)、皮内、鼻内或皮下施用，鞘内施用，颅内、腹膜内(i.p.)施用或施用的局部(透皮)和植入(例如缓释装置的植入)途径。在某些优选的实施方案中，纯化的非复合的肉毒杆菌毒素在组合物中局部或通过注射施用，如美国专利申请No.09/910,432；10/793,138；11/072,026；11/073,307,11/824,393和12/154,982(它们通过引用整体并入本文)所描述的。

在某些实施方案中，包含非复合的肉毒杆菌毒素的硫酸铵悬浮液的组合物可容易地混合到药物组合物中。例如，包含非复合的肉毒杆菌毒素蛋白的硫酸铵悬浮液可以被离心，以回收蛋白，且蛋白可以再溶解、稀释和与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合。在某些实施方案中，药物组合物可包含非复合的肉毒杆菌毒素作为活性药物成分，并还可包含一种或多种缓冲剂、载体、稳定剂、防腐剂和/或填充剂。药物组合物可以被冻干成粉末用于储存，和被重构以进一步使用。因此，本文描述的方法和系统可提供在易于制备方面特别适合于药物应用的形式的肉毒杆菌毒素。

药物组合物可用于治疗性、诊断性、研究性和/或美容性应用。例如，如上文所讨论的，A型肉毒杆菌毒素在临床上用于治疗以骨骼肌活动过度为特征的神经肌肉障碍，诸如自发性睑痉挛、斜视、颈部肌张力障碍和眉间纹(面部)皱纹。此外，在某些应用中，非复合的(约150kD)肉毒杆菌毒素是用于治疗人类的优选形式。参见例如Kohl A.等人Comparisonof the effect of botulinum toxin A

with thehighly-purified neurotoxin(NT 201)in the extensor digitorumbrevis muscle test(肉毒杆菌毒素A

与高度纯化的神经毒素(NT 201)在趾短伸肌试验中的效力的比较)，Mov Disord 2000；15(增刊3)：165。因此，不同于肉毒杆菌毒素复合物，优选地使用非复合的肉毒杆菌毒素来制备某些肉毒杆菌毒素药物组合物。

实施例

实施例1：本发明的方法与改进的Schantz方法的对比

将使用本发明范围内的方法的非复合的A型肉毒杆菌毒素的纯化(“本发明的方法”)直接对比基于传统的Schantz方法，且通过加入色谱步骤(以提供非复合形式)而进一步改进的纯化(“改进的Schantz方法”)。简而言之，培养肉毒梭菌细菌，并使之生长，直到发酵完成(从接种到收获，通常约72小时至约120小时)。然后，在以下纯化程序的每一个中，使用30L体积的发酵培养物。

所使用的改进的Schantz方法包括，常规地酸化发酵培养物以沉淀毒素，随后超微过滤(UF)和渗滤(DF)以浓缩粗制毒素。将DNA酶和RNA酶加入到收获的毒素中以消化(水解)核酸，然后通过另外的UF步骤，使用切向流过滤(300kD UF)将核酸除去。随后，毒素用磷酸盐缓冲液提取，随后是三个连续的沉淀步骤：冷乙醇沉淀；盐酸沉淀和硫酸铵沉淀；其中每次通常弃去上清液。该程序提供了900kD A型肉毒杆菌毒素复合物，然后其经受额外的色谱步骤以提供游离毒素。具体地，将毒素复合物再溶解，并经受阴性成批吸附(negative batch adsorption)到DEAE树脂上。然后，洗脱液在重力流动阴离子交换柱(DEAE-Sepharose)上运行，随后是重力流动阳离子交换柱(CM-Sepharose)。测定产量，记录该方法花费的时间长度(不计算发酵时间)，并通过SDS-PAGE分析测量纯化的非复合的A型肉毒杆菌毒素的纯度，并通过例如本领域技术人员已知的技术测定其效价。整个改进的Schantz方法重复三个不同批次(批号1、2和3)，且结果记录在以下的表1中。

根据本文描述的系统和方法，本发明的方法进行三个不同批次(批号4、5和6)。简而言之，发酵培养物在低于25℃的温度下经受使用3M硫酸(将pH降至3.5)的酸沉淀。然后，酸沉淀物经受0.1μm切向流过滤以浓缩细胞物质。然后，将pH调整至6，并加入核酸酶以减少宿主细胞核酸含量，随后离心净化以除去细胞碎片，并加入硫酸铵以0.2μm死端过滤。然后，将滤液直接装载至疏水相互作用柱，苯基琼脂糖HP(GELife Sciences)，用下降梯度的硫酸铵洗脱，并分离产物峰。然后，将洗脱液稀释至Tri s缓冲液pH 7.8中，以解离毒素复合物，然后将其装载到阴离子交换柱Q XL琼脂糖(GE Lifesciences)上，用上升梯度的氯化钠洗脱，并再次收集产物峰。然后，将该洗脱液在磷酸钠缓冲液中稀释(以减少导电率)并装载到阴离子交换柱Q XL琼脂糖(对于批号4和5)或阳离子交换柱Source-S(GE Life Sciences)(对于批号6)上，再次用上升梯度的氯化钠洗脱，并收集和储存最终的产物峰。该方法产生非复合的A型肉毒杆菌毒素。测定产量，记录该方法花费的时间长度(不计算发酵时间)，并通过SDS-PAGE分析测量毒素的纯度，并例如通过本领域技术人员已知的技术测定其效价。结果也记录在以下的表1中。

表1

如表1所示，在改进的Schantz方法中存在关于批号2的批次失败。失败的全部批次给予0产量。还存在关于批号3的部分批次失败。失败出现在盐酸沉淀步骤，但是一些产物从通常弃去的上清液中挽救回来。挽救的产物用一个偏离步骤再次处理，结果是观察到的与批号1相比的降低的产量(4mg相比于11mg)和观察到的与批号1相比的降低的效价(173 LD50单位/ng相比于255 LD50单位/ng)。

关于使用本发明的方法的批次，由于色谱系统的失败，包括柱的高度盐洗涤，批号4相比于例如批号5显示出降低的产量(43mg相比于99mg)。因为失败，一部分毒素过快洗脱，导致观察到的降低的产量，但还是具有观察到的较高纯度(98.6％的纯度相比于95.3％的纯度)。

批号6显示本发明的方法和系统的高度优选的实施方案的结果，其中在第三色谱步骤中使用阳离子交换柱。如表1所示，这一实施方案产生例如与批号5相比提高的纯度(100％纯度相比于95.3％纯度)，并保持了高产量(89mg相比于99mg)和高效价(250 LD50单位/ng相比于252LD50单位/ng)。

还如表1所示，在本发明的优选实施方案中，缩短了纯化的总长度。例如，批号6在仅4天内纯化，相比之下，使用在常规Schantz方法之后包括三个额外色谱步骤的改进的Schantz方法来纯化非复合的肉毒杆菌毒素花费了10天。

该结果表明，本文教导的方法和系统可用于以高效价和纯度制备高产量的非复合的肉毒杆菌毒素，并且表明，本文描述的方法和系统可用于大规模有效纯化适合用作例如药物组合物中的活性成分的非复合的肉毒杆菌毒素。

本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，通过引用以其整体并入本文并且用于所有目的，其程度如同具体地和单独地指出，每个单独的出版物或专利或专利申请通过引用以其整体并入本文用于所有目的。如对本领域技术人员而言是显然的，可对本发明进行许多改进和变化，而不偏离本发明的精神和范围。本文描述的具体实施方案仅通过举例的方式提供，并且本发明仅由所附权利要求的范围以及这些权利要求赋予的等价物的全部范围来限制。

Claims

1.一种用于纯化非复合的肉毒杆菌毒素的方法，所述方法包括：

(i)提供粗制的非复合的肉毒杆菌毒素；

(ii)将所述粗制的非复合的肉毒杆菌毒素装载到阴离子交换柱上，以允许通过所述阴离子交换柱俘获所述非复合的肉毒杆菌毒素；

(iii)从所述阴离子交换柱洗脱所述非复合的肉毒杆菌毒素，以得到包含所述非复合的肉毒杆菌毒素的洗脱液；

(iv)用来自所述阴离子交换柱的所述洗脱液装载阳离子交换柱，以允许通过所述阳离子交换柱俘获所述非复合的肉毒杆菌毒素；和

(v)从所述阳离子交换柱洗脱纯化的非复合的肉毒杆菌毒素。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述粗制的非复合的肉毒杆菌毒素通过以下获得：

获得包含肉毒杆菌毒素复合物的样品；

用所述样品装载疏水相互作用柱，以允许通过所述疏水相互作用柱俘获所述肉毒杆菌毒素复合物；

从所述疏水相互作用色谱柱洗脱所述肉毒杆菌毒素复合物；和

解离所述肉毒杆菌毒素复合物，以获得包含所述粗制的非复合的肉毒杆菌毒素的混合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品是包含所述肉毒杆菌毒素复合物的上清液或滤液。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品通过以下获得：

使包含肉毒杆菌毒素的发酵培养物经受酸沉淀，以得到酸沉淀物；和

对所述沉淀物进行切向流过滤以浓缩沉淀物。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品通过下列来获得：使发酵培养物的不溶性级分经受切向流过滤。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品在装载至所述疏水相互作用柱之前，经受核酸酶消化。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸酶源自不含动物产物的过程。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法基本上不含动物产物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化的非复合的肉毒杆菌毒素包括A、B、C₁、D、F、F和G型肉毒杆菌毒素中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化的非复合的肉毒杆菌毒素包括A型肉毒杆菌毒素。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化的非复合的肉毒杆菌毒素是至少95％纯的。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化的非复合的肉毒杆菌毒素具有至少200 LD₅₀单位/ng的活性。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法产生至少约2mg/L发酵培养物的产量。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述阴离子柱选自Q琼脂糖HP柱、Q琼脂糖快流柱和Q XL琼脂糖柱，且其中所述阳离子柱选自SP琼脂糖柱、SP琼脂糖HP柱、SP琼脂糖快流柱、Mono S柱、Source-S柱、Source-30S柱和Source-15S柱。

15.根据权利要求1所述的方法，其中用于将所述非复合的肉毒杆菌毒素装载到所述阴离子柱上的缓冲液选自Tris、bis-Tris、三乙醇胺和N-甲基二乙醇胺。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述缓冲液在7.4至8.2的pH下使用。

17.根据权利要求1所述的方法，其中用于将所述非复合的肉毒杆菌毒素装载到所述阳离子柱上的缓冲液选自：磷酸钠、MES和HEPES。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述缓冲液在6.0至7.0的pH下使用。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述阴离子柱的pH是7.4至8.2。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述阳离子柱的pH是6.0至7.0。

21.根据权利要求1所述的方法，其中用于将所述非复合的肉毒杆菌毒素从所述阴离子柱洗脱的梯度选自氯化钠的上升梯度和氯化钾的上升梯度。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述梯度在7.4至8.4的pH下使用。

23.根据权利要求1所述的方法，其中用于将所述非复合的肉毒杆菌毒素从所述阳离子柱洗脱的梯度选自氯化钠的上升梯度和氯化钾的上升梯度。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述梯度在6.0至7.0的pH下使用。