KR20120099431A - 비-복합체화된 보툴리눔 신경독소를 정제하기 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

비-복합체화된 보툴리눔 신경독소를 정제하기 위한 방법 및 시스템 Download PDF

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Abstract

보툴리눔 신경독소를 크로마토그래피에 의해 정제하기 위한 방법 및 시스템이 개시된다. 이들 방법 및 시스템은 약제학적 제제(pharmaceutical preparation)에서 활성성분으로 사용될 수 있는 고순도 및 수율로 보툴리눔 신경독소의 비-복합체화된 형태의 효율적인 정제를 가능하게 한다.

Description

비-복합체화된 보툴리눔 신경독소를 정제하기 위한 방법 및 시스템{Methods and systems for purifying non-complexed botulinum neurotoxin}
본 출원은 2009년 10월 21일에 출원된 미국 가출원 제61/253,810호에 기초한 우선권을 주장한다. 이 미국 가출원의 내용은 그 전부가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은 세포 배양물로부터 유리 보툴리눔 신경독소(free botulinum neurotoxin)를 정제하여 고순도, 고효능 생성물을 생산하기 위한 크로마토그래피 방법 및 시스템에 관한 것이다.
발명의 배경
보툴리눔 독소는 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum) 및 클로스트리디움 바라피 (Clostridium baraffi)와 같은 다른 클로스트리디움 종뿐만 아니라 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 박테리아에 의해서 생산된 신경독소 단백질이다. 이 독소는 신경근육 전달을 차단하고, 인간 및 동물에게서 보툴리누스 중독(botulism)으로 알려진 신경-마비성 질병을 야기한다. 클로스트리디움 보툴리눔 및 그것의 포자는 토양 및 부패하는 동물 사체에서 흔히 나타나며, 많은 보툴리누스 중독 증례의 원인인 부적절하게 멸균되거나 부적절하게 밀봉된 식품 용기 내에서 성장할 수 있다. 보툴리누스 중독 증상에는 보행, 연하 및 말하기의 곤란이 포함될 수 있으며, 호흡 근육의 마비 및 최종적으로 사망으로 진행할 수 있다.
보툴리눔 독소 A형은 인간에 대해서 알려진 가장 치명적인 천연물질이다. 혈청형 A 이외에도, 6 가지의 다른 일반적으로 면역학적으로 상이한 보툴리눔 독소, 즉 보툴리눔 독소 혈청형 B, C1,　D, E, F, 및 G가 규명되었다. 상이한 혈청형은 형-특이적 항체에 의한 중화에 의해서 식별될 수 있으며, 이들이 유발하는 마비의 중증도 및 이들이 가장 영향을 미치는 동물 종은 상이하다. 공지된 보툴리눔 독소 혈청형 각각에 대한 보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은 약 50 kD 경쇄에 접합된 약 100 kD의 중쇄로 구성된, 약 150 kD이다. 그러나, 보툴리눔 독소는 클로스트리디움 박테리아에 의해서 150 kD 독소와 하나 또는 그 이상의 비-독소 단백질(non-toxin protein)과의 복합체로 방출된다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 A형은 900 kD, 500 kD 및 300 kD 복합체 (대략의 분자량)로 존재한다.
공지된 독성 효과에도 불구하고, 보툴리눔 독소 A형은, 예를 들어 골격근 활동항진을 특징으로 하는 신경근육 장애를 포함하여 다양한 증상을 치료하기 위해서 임상적으로 사용된다. 예를 들어, 보톡스 (BOTOX®)는 캘리포니아주 어바인의 Allergan, Inc.로부터 상업적으로 입수할 수 있는 보툴리눔 독소 A형의 상표이다. 보툴리눔 독소 A형은, 예를 들어 본태성 안검경련, 사시, 경부 근긴장이상(cervical dystonia), 및 미간 (안면) 주름살의 치료에 있어서 용도를 갖는다. 다른 혈청형들도 또한 임상적으로 사용되어왔다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 B형은 경부 근긴장이상을 치료하는데 사용하도록 권고된다. 보툴리눔 독소는 운동 뉴론의 전시냅스성 막에 높은 친화도로 결합하고, 뉴론 내로 전위하며, 그 후에 아세틸콜린의 전시냅스성 방출을 차단한다고 여겨진다.
임상적 사용을 위한 보툴리눔 독소는 일반적으로 세포 배양물로부터 분리되며, 다양한 정제 방법이 사용되었다. 역사적으로, 보툴리눔 독소는 일련의 침전 및 접선 유동 여과 단계에 의해서 복합체화된 형태(complexed form)로 정제된다. [참조: 예를 들어, Schantz E. J., et al ., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 March 56(l):80-99] 그러나, 이러한 방법은 전형적으로는 약 10% 미만의 상대적으로 낮은 수율을 제공하였다. 그 밖의 다른 방법들은 크기 배제, 이온 교환, 및/또는 친화성 크로마토그래피를 사용하였다. [참조: 예를 들어, Schmidt J. J., et al ., Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography, Anal. Biochem. 1986 July; 156(1):213-219; Simpson L. L., et al., Isolation and characterization of the botulinum neurotoxins, Harsman S, ed. Methods in Enzymology. Vol. 165, Microbial Toxins: Tools in Enzymology San Diego, Calif.: Academic Press; vol 165: pages 76-85 (1988); Kannan K., et al., Methods development for the biochemical assessment of Neurobloc (botulinum toxin type B), Mov Disord 2000; 15(Suppl 2):20 (2000); Wang Y.C., The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection (BTXA) and its clinical use, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002; 58 (2002); 및 미국 특허출원 공보 제2003/0008367호]
또 다른 방법은 완전하고 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소 단백질보다는 보툴리눔 독소의 중쇄 또는 경쇄 중의 하나에만 초점을 맞춘다. 예를 들어, 쇄 중의 하나를 재조합 수단에 의해서 개별적으로 합성한다. [참조: 예를 들어, Zhou L., et al., Expression and purification of the light chain of botulinum neurotoxin A: A single mutation abolishes its cleavage of SNAP-25 and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain, Biochemistry 1995; 34(46): 15175-81 (1995); 및 Johnson S. K., et al., Scale-up of the fermentation and purification of the recombination heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin serotype F expressed in Pichia pastoris, Protein Expr and Purif 2003; 32: 1-9 (2003)] 그러나, 이들 접근법들은 완전하고 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소 단백질을 재형성시키기 위한 추가 단계를 필요로 한다.
더욱 최근의 방법은 복합체로서 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피의 사용을 포함한다. [참조: 예를 들어, 본 명세서에서 참조로 포함된 미국 특허 제7,452,697호 및 제 7,354,740호]
그러므로 본 기술분야에서는 안정하고 생물학적으로 활성이지만 비-복합체화된 형태(non-complexed form)인 완전한 보툴리눔 독소 단백질을 분리하기 위한 개선된 정제방법이 요청된다. 따라서, 본 발명의 목적은 이러한 요구 및 그 밖의 다른 요구에 부응하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
전술한 논의는 단지 본 기술분야에서 직면하는 문제의 성질에 대한 더 나은 이해를 제공하기 위해서 제시된 것이며, 어떤 식으로든 선행기술에 대한 인정으로 이해되거나, 본 명세서에 인용된 어떤 문헌도 이러한 문헌이 본 출원에 대한 "선행기술"을 구성한다는 것을 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
발명의 요약
본 발명은 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 조(crude) 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 정제하여 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 수득하는 것을 포함한다. 이러한 구체예에서, 상기 방법은 음이온 교환 칼럼에 조 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 적재시켜 음이온 교환 칼럼 상에 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포획하고; 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 완충제로 용리시켜 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 용리액을 생성하고; 양이온 교환 칼럼에 상기 음이온 교환 칼럼으로부터의 용리액을 적재시켜 비-복합체화된 보툴리눔 독소의 포획이 이루어지도록 하고; 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 또 다른 완충액으로 용리시켜 용리액을 제공함으로써 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 수득하는 것을 포함한다.
특정한 구체예에서, 보툴리눔 독소 복합체는 다수의 크로마토그래피 단계에 의해서 그 자체로 수득된다. 일부 구체예에서, 보툴리눔 독소 복합체를 수득하는 방법은 보툴리눔 독소 복합체를 포함하는 시료를 수득하는 단계; 소수성 상호작용 칼럼에 상기 시료를 적재시켜 독소의 포획을 수행하고, 여기에서, 포획된 보툴리눔 독소는 복합체화된 보툴리눔 독소를 포함한는 것인 단계; 및 상기 복합체화된 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계를 포함한다. 그 후, 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 상기 복합체로부터 해리시키고, 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 상술한 방법에 따라 정제한다. 일부 구체예에서, 시료는 보툴리눔 독소를 포함하는 발효 배양액을 산에 적용하여 산 침전물을 수득하고, 이것을 비-제한적인 예로서 침전물의 불용성 물질을 농축시키는 접선 유동 여과, 뉴클레아제 분해, 청정화 원심분리(clarifying centrifugation) 및/또는 여과를 포함하는 추가의 전-크로마토그래피 정제(pre-chromatography purification) 단계에 적용할 수 있다.
일부 구체예에서는, 상기 시료를 소수성 상호작용 칼럼 상에 적재(load)시키기 전에 뉴클레아제 분해에 적용한다. 바람직하게는, 뉴클레아제는 동물-생성물-불포함(free) 공정으로 유래되며, 훨씬 더 바람직하게는 전체 정제 방법이 동물 생성물 불포함이거나, 적어도 실질적으로 동물 생성물 불포함이다.
일부 구체예에서, 크로마토그래피 분리에서 사용되는 시료는 바람직하게는 상청액 또는 여액(filtrate) 분획이다.
정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A, B, C1, D, F, F 및 G형 중 하나 이상을 포함하고, 바람직하게는 약 150 kD의 분자량을 가진 보툴리눔 독소 A형을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소는 98% 이상의 순도이고 및/또는 200 LD50　유닛/ng 이상의 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 발효 배양액의 L당 약 2 ㎎ 이상의 수율을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 발효 배양액의 L당 약 1 내지 약 2 ㎎의 수율을 제공한다.
본 발명의 이들 및 기타 양태는 이하의 본 발명의 상세한 설명을 참고로 하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 직접적으로 정제하는 본 발명에 따른 방법의 일 구체예 (도 1a)를 복합체화된 보툴리눔 독소를 정제하는 방법 (도 1b)과 비교하는 요약 흐름도이다.
상세한 설명
본 발명은 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 정제하는 시스템 및 방법에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 상기 방법은 음이온 교환 칼럼에 조(crude) 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 적재시켜 음이온 교환 칼럼에 의해서 비-복합체화된 보툴리눔 독소가 포획되도록 함으로써 조 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 정제하는 단계를 포함한다. 그 후, 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 완충제로 용리시켜 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 용리액을 제공한다. 음이온 칼럼으로부터의 용리액을 양이온 교환 칼럼에 적재시켜 비-복합체화된 보툴리눔 독소의 포획이 이루어지도록 하고, 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 완충제에 의해서 용리시킴으로써 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 수득한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 비교적 소수의 단계로 고수율, 고순도 및 고효능 생성물을 생산하는 비-복합체화된 보툴리눔 독소의 정제를 제공한다. 본 발명의 범위 내의 방법 및 시스템은, 발효 배양액으로부터 안정하지만 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 효율적으로 생산하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 보툴리눔 독소 복합체를 포함하는 시료를 제공하는 단계, 소수성 상호작용 칼럼에 의해서 보툴리눔 독소 복합체가 포획되도록, 소수성 상호작용 칼럼에 상기 시료를 적재시키는 단계를 더 포함한다. 그 후, 상기 보툴리눔 독소 복합체를 완충제에 의해서 칼럼으로부터 용리시킨다. 조 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 상기 보툴리눔 독소 복합체로부터 해리시켜 조 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 혼합물을 수득한다. 이러한 구체예에서, 조 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 혼합물은 상술한 방법에 따라 순수하거나 실질적으로 순수한 보툴리눔 독소를 수득하기 위해 정제된다.
본 발명의 일 양태는, 활성성분으로서 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 약제학적 조성물이 복합체화된 형태를 포함하는 약제학적 조성물에 비해 더 큰 순도를 제공할 수 있다는 것의 인식이다. 전형적으로 보툴리눔 독소 복합체와 결합된 비-독소 단백질은 보툴리눔 독소 복합체의 약 90 중량% 이상을 차지할 수 있다. 따라서, 보툴리눔 독소를 복합체로 제공하는 것은 필연적으로 약 90 중량% 이상의 불순물을 포함한다. 즉, 약제학적 조성물의 약 80 내지 약 90 중량% 이상은 활성 분자의 일부분도 아니고 그것의 생물학적 활성에 필요하지도 않은 세포-유래 불순물을 포함할 것이다. 그러나, 이러한 불순물은 환자에게 투여하는 경우에 약물에 대한 원치 않는 면역학적 반응의 위험을 증가시킬 수 있고; 원치 않는 부작용의 위험을 증가시킬 수 있고; 및/또는 병원체의 전파의 위험을 증가시킬 수 있는 세포-유래 물질을 나타낸다. 대조적으로, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템에 의해서 수득할 수 있는 비-복합체화된 생성물의 고순도는 약제학적 조성물 내에 잔류할 수 있는 숙주 세포 불순물의 양을 감소시킴으로써, 원치 않는 반응 및/또는 전파의 부수적인 위험을 감소시킨다. 따라서, 본 명세서에 기술된 공정 및 시스템은 더 안전하고, 더 순수한 약제학적 조성물의 제조에 더 쉽게 적합한 형태로 보툴리눔 독소를 제공할 수 있다.
또한, 복합체화된 형태와는 달리, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 제조된 유리(free) 보툴리눔 독소는 혈액-유래 생성물에서 저장을 위해서 안정화될 필요가 없다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 A형 복합체는 전형적으로, 인간 혈액으로부터 유래된 알부민을 포함하는 부형제 내에서 안정화된다. 예를 들어, 보톡스 (BOTOX®)는 진공-건조된 형태로 포장된 정제된 보툴리눔 독소 A형 복합체, 인간 혈청 알부민, 및 염화나트륨으로 구성된다. 이것은 디스포트 (Dysport) 및 제노민 (Xeomin)의 경우에도 마찬가지이다. 스크리닝은 병원체에 의한 오염의 가능성을 감소시키지만, 약제학적 제제에서 인간 혈액의 사용은 일반적으로, 특정의 병원체, 예를 들어, 제거되지 않거나 여전히 제거될 수 없는 성분의 원치 않는 전파의 위험을 증가시킨다. 대조적으로, 본 발명에 따라 제조된 유리 보툴리눔 독소는 본 명세서에 교시된 바와 같이 황산암모늄 중에서 안정적으로 저장될 수 있다. 또한, 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법 및 시스템은 본 명세서에서 검토된 바와 같이 실질적으로, 본질적으로, 또는 완전히 동물 생성물 불포함이다. 또한 독소 생성물을 실질적으로, 본질적으로 또는 완전히 동물-생성물이 없이 안정적으로 저장하는 능력은 동물-유래 생성물과 연관된 잠재적인 위험을 더 감소시킨다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은, 예를 들어, 약제학적 조성물이 실질적으로, 본질적으로 또는 완전히 동물-생성물 불포함으로 제조 및 저장될 수 있는 경우에, 안전성의 측면에서 약제학적 적용에 특히 적합한 형태의 보툴리눔 독소를 제공한다.
특정의 바람직한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 확장시킬 수 있고(scalable) 및/또는 cGMP 준수성이 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 예를 들어, 약제학적 조성물에서 사용하기 위한 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 생산하기 위해, 상업적, 산업적 스케일로 사용될 수 있다. cGMP 준수성(compliance) 공정 또는 시스템은 미국연방규정집 (U.S. Code of Federal Regulations)에 의해서 요구되는 것으로서 현행 우수 제조 관리기준 (current good manufacturing practices)에 따른 규제 요건에 부합할 수 있는 것을 의미한다. 일부 바람직한 구체예에서, 비-복합체화된 보툴리눔 독소 생성물은 그의 저장 용이성 및 유용성, 고활성, 고순도, 안정성 및/또는 개선된 안전성으로 인하여 대규모 생산에 특히 적합하다.
본 명세서에서 사용된 "보툴리눔 독소(Botulinum toxin)"는 클로스트리디움 박테리아에 의해서 생산될 수 있는 신경독소 단백질 분자뿐만 아니라 그것의 재조합적으로 생산된 형태를 나타낸다. 재조합 보툴리눔 독소는 재조합 기법, 예를 들어, 재조합 클로스트리디움 및/또는 비-클로스트리디움 종에 의한 재조합 기법에 의해서 합성된 독소 단백질의 경쇄 및/또는 중쇄를 가질 수 있다. "보툴리눔 독소"는 본 명세서에서 관련된 표현 "보툴리눔 신경독소", "신경독소", 또는 간단하게 "독소"와 호환성 있게 사용된다. "보툴리눔 독소"는 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C1,　D, E, F 및 G를 포함하며, 또한 복합체화 및 비-복합체화된 형태 모두를 포함한다.
"복합체화된 형태(complexed form)"는 보툴리눔 독소 단백질 (즉, 약 150 kD의 분자량을 갖는 독소 분자) 및 하나 이상의 결합된 천연 비-독소 단백질을 포함하는 보툴리눔 독소 복합체를 의미한다. 복합체를 구성하는 비-독소 단백질은 전형적으로, 비-독소 헤마글루티닌 단백질 및 비-독소 비-헤마글루티닌 단백질을 포함한다. 따라서, 복합체화된 형태는 보툴리눔 독소 분자 (신경독소 성분) 및 하나 또는 그 이상의 비-독소 헤마글루티닌 단백질 및/또는 하나 또는 그 이상의 비-독소 비-헤마글루티닌 단백질을 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 복합체의 분자량은 약 150 kD보다 크다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 A형의 복합체화된 형태는 약 900 kD, 약 500 kD 또는 약 300 kD의 분자량을 가질 수 있다. 보툴리눔 독소 B형 및 C1형의 복합체화된 형태는 500 kD의 분자량을 가질 수 있다. 보툴리눔 독소 D형의 복합체화된 형태는 약 300 kD 또는 약 500 kD의 분자량을 가질 수 있다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 E형 및 F형의 복합체화된 형태는 약 300 kD의 분자량을 가질 수 있다.
"비-복합체화된(non-complexed)" 보툴리눔 독소는 약 150 kD의 분자량을 가진 단리(isolated)되거나, 본질적으로 또는 실질적으로 단리된 보툴리눔 독소 단백질을 나타낸다. 즉, "비-복합체화된" 형태는 복합체화된 형태와 통상적으로 결합된 비-독소 헤마글루티닌 및 비-독소 비-헤마글루티닌 단백질과 같은 비-독소 단백질을 배제한다. "비-복합체화된" 보툴리눔 독소는 본 명세서에서 "유리(free)" 보툴리눔 독소와 호환적으로 사용된다. 천연 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아에 의해서 만들어진 모든 보툴리눔 독소 혈청형은, 신경활성형(neuroactive)이 되기 위해 후에 프로테아제에 의해서 절단되거나 닉 (nick)이 형성되는 불활성 단일쇄 단백질로 박테리아에 의해서 합성된다. 상기 단백질은 디설파이드 결합에 의해서 약 50 kD 경쇄에 접합된 약 100 kD 중쇄를 포함한다.
보툴리눔 독소 복합체는, 예를 들어 pH를 약 7.0으로 상승시키는 것, 복합체를 약 7.3의 pH에서 적혈구로 처리하는 것, 및/또는 복합체를 약 7 내지 약 8의 pH에서 적합한 완충제에서 칼럼 크로마토그래피와 같은 분리방법에 적용하는 것을 포함하는 다양한 수단에 의해서 독소 단백질과 비-독소 단백질로 해리될 수 있다.
본 발명은, 안정성을 유지하기 위해서 정제 공정 동안 필요한 것이라고 통상적으로 여겨지는 결합된 비-독소 단백질이 없이, 비-복합체화된 보툴리눔 독소의 정제를 가능하게 하는 시스템 및 방법을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본원에 기술된 방법 및 시스템은 안정성의 손실 없이 유리 보툴리눔 독소의 정제를 용이하게 한다. "안정성" 또는 "안정한"은 보툴리눔 독소 단백질 분자가 생물학적 활성을 허용하는 구조로 디설파이드 결합에 의해서 서로 접합된 약 100 kD 중쇄 및 약 50 kD 경쇄 둘 모두를 보유하는 것을 의미한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 범위 내의 특정 시스템은 본 발명의 범위 내의 특정 방법과 함께 작동될 수 있다. 본 발명의 범위 내의 시스템은 상응하는 다수(바람직하게는 연속적 시리즈)의 크로마토그래피 단계에 의해 사용하기 위한 다수(바람직하게는 연속적 시리즈)의 크로마토그래피 칼럼을 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명의 범위 내의 시스템은, 예를 들어 전-크로마토그래피 단계로서 상응하는 다수 (바람직하게는 연속적 시리즈)의 비-크로마토그래피 단계에 의해 사용하기 위한, 여과 및/또는 원심분리 기기와 같은 다수(바람직하게는 연속적 시리즈)의 비-크로마토그래피 장치를 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 범위 내의 방법은 발효 배양액으로부터 보툴리눔 독소를 포함하는 시료를 수득하고; 이것을 다수의 전-크로마토그래피 정제에 적용하고; 그것을 그 후 다수의 크로마토그래피 칼럼을 통해서 통과시켜 고도로 정제된 고효능의 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 수득하는 것을 포함한다. 이러한 정제된 유리 보툴리눔 독소는, 활성성분으로서 유리 보툴리눔 독소를 포함하는 약제학적 조성물의 제조에 있어서 용도를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 구체예의 경우의 전-크로마토그래피 및 크로마토그래피 공정, 모두에 대한 전반적인 단계들이 도 1a에 도시된다. 비교를 위해서, 도 1b는 정제된 보툴리눔 독소 복합체를 수득하는 통상적인 방법을 나타낸다. 간략히, 도 1b는 발효 배양액의 심층 여과(depth filtration)에 이어 수득된 여액의 접선 유동 여과(300 kD 초미세여과를 사용), 및 뒤이어 청정화 원심분리 단계를 포함하는 방법을 도시한다. 그 후, 원심분리 단계로부터 생성된 펠릿(불용성 분획)을 염화나트륨에 재-현탁시키고, 소수성 상호작용 또는 이온 교환 칼럼 상에 적재시킨다. 크로마토그래피 정제 단계를 3 회 이상 반복하여, 900 kD 보툴리눔 독소 A형 복합체를 함유하는 최종 용리액을 제공한다.
발효 및 산 침전
도 1a에서 도시되는 바와 같이, 비-복합체화된 보툴리눔 독소는 일반적으로 발효 배양액으로부터 정제된다. 본 명세서에서 사용된 "발효 배양액(fermentation culture)"은 하나 이상의 보툴리눔 독소를 합성하고 및/또는 합성한 세포 및/또는 그의 성분을 포함하는 배양액 또는 배지를 나타낸다. 예를 들어, 클로스트리디움 보툴리눔과 같은 클로스트리디움 박테리아를 가온된 혐기성 대기와 같은 박테리아 성장을 유도하는 환경에서 한천 플레이트 상에서 배양시킬 수 있다. 배양 단계는 일반적으로, 수득되어야할 바람직한 형태 및 그 밖의 다른 특징을 가진 클로스트리디움 콜로니의 형성을 가능하게 한다. 그 후, 선택된 배양된 클로스트리디움 콜로니는 적합한 배지에서 발효 배양액으로 발효될 수 있다. 배양된 세포는, 재조합 기술에 의해서 보툴리눔 독소를 생합성할 수 있게 된, 대장균(E. coli) 또는 효모 세포와 같은 비-클로스트리디움 종을 숙주 세포로서 포함할 수 있다. 적합한 발효 배양 조건은 사용된 숙주 세포에 의존할 수 있으며, 본 기술분야에서 일반적으로 공지되어 있다.
바람직한 구체예에서, 발효는 세포가 성숙하여 보툴리눔 독소를 생합성할 정도로 완료될 때까지 진행될 수 있다. 클로스트리디움 보툴리눔 배양물의 성장은 대개 약 24 내지 약 36 시간 후에 완료된다. 특정한 추가의 시간 후에, 박테리아는 일반적으로 용해되어 배지 내로 복합체화된 형태의 합성된 보툴리눔 독소 복합체를 방출한다. 예를 들어, 약 60 내지 약 96 시간의 발효 중에 대부분의 클로스트리디움 보툴리눔 세포는 용해를 일으키고, 보툴리눔 독소 A형 복합체를 방출한다.
일부 구체예에서 발효 배양액은, 통상적인 발효 배양 절차에서 사용된, 동물 단백질과 같은 하나 또는 그 이상의 동물 생성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소는 잘 알려진 스캔츠 (Schantz) 공정의 변형된 버전을 사용한 클로스트리디움 보툴리눔의 혐기성 발효에 의해서 생산될 수 있다 [참조: 예를 들어, Schantz E. J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 March; 56(1):80-99; Schantz E. J., et al., Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment, chapter 3 in Jankovic J, ed. Neurological Disease and Therapy. Therapy with botulinum toxin (1994), New York, Marcel Dekker; 1994, pages 41-49; 및 Schantz E. J., et al., Use of crystalline type A botulinum toxin in medical research, in: Lewis G E Jr, ed. Biomedical Aspects of Botulism (1981) New York, Academic Press, 143-50쪽; 이들은 각각 본 발명에 참조로 포함된다]. 보툴리눔 독소를 수득하기 위한 스캔츠 및 변형된 스캔츠 공정 둘 모두는 배양 바이알 내의 동물-유래-Bacto-Cooked Meat 배지(animal-derived-Bacto-Cooked Meat medium), 및 발효 배지 내의 카제인을 포함한 동물 생성물을 이용한다. 추가로, 스캔츠 독소 정제는 발효 배양액 내에 존재하는 핵산을 가수분해시키기 위해서 소(bovine) 유래의 DNase 및 RNase를 사용한다.
그러나, 동물-유래 생성물을 포함하는 공정을 이용하여 정제된 활성성분을 함유하는 약제의 투여는, 환자를 다양한 병원체를 받게 될 잠재적인 위험에 처하게 할 수 있다. 예를 들어, 오염된 동물-유래 생성물을 포함하는 약제학적 조성물 내에는, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob disease)의 원인이 되는 프리온과 같은 프리온이 존재할 수 있다. 또 다른 예로서는, 동물 생성물이 약제학적 조성물을 제조하는 방법에서 사용된 경우에 광우병(bovine spongiform encephaolopathy, BSE)과 같은 해면양뇌증 (TSE) 전파 의 위험이 있다. 그러나, 동물 생성물 불포함 공정을 통해서 수득된 보툴리눔 독소의 사용은 이러한 위험을 감소시킨다. 따라서 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명은 동물 생성물 불포함하거나, 본질적으로 또는 실질적으로 동물-생성물-불포함(animal-product-free, APF)인 방법을 제공한다. "동물 생성물 불포함(animal product free)", "본질적으로 동물 생성물 불포함(essentially animal product free)" 또는 "실질적으로 동물 생성물 불포함(substantially animal product free)"은 각각 "동물 단백질 불포함", "본질적으로 동물 단백질 불포함", 또는 "실질적으로 동물 단백질 불포함"을 포함하며, 각각 그의 비-제한적 예로서 혈액 또는 혼주(pooled) 혈액으로부터 유래된 생성물을 포함하는, 동물로부터 유래된 생성물의 부재, 본질적 부재, 또는 실질적 부재를 의미한다. 본 명세서에서 사용된, "동물"은 포유동물(예를 들어, 인간), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 거미 또는 그 밖의 다른 동물 종을 의미하지만, 박테리아 및 효모와 같은 미생물은 제외한다.
동물-생성물-불포함 공정 (또는 실질적으로 또는 본질적으로 동물-생성물-불포함-공정)은, 면역글로불린, 기타 혈액 생성물, 부산물 또는 분해물; 육류 생성물, 육류 부산물, 육류 분해물; 및 우유 또는 유제품, 부산물 또는 분해물과 같은 동물-유래 생성물, 시약 및 단백질이 완전히, 실질적으로 또는 본질적으로 존재하지 않는 것인 방법을 나타낸다. 따라서, 동물-생성물 불포함 발효 배양 절차의 예는 혈액, 육류 및 유제품, 부산물 및 분해물을 배제한, 박테리아 배양과 같은 발효 방법이다. 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 수득하기 위한 동물-생성물-불포함 발효 방법은 바이러스, 프리온, 또는 인간에게 투여하는 경우에 독소를 수반할 수 있는 그 밖의 다른 바람직하지 않은 성분에 의한 오염의 가능성을 감소시킨다.
클로스트리디움 배양물을 사용하는 동물-생성물-불포함 발효 방법은, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제7,452,697호 및 제7,354,740호에 기술되어 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소의 생산을 위한 성장 배지는 동물-유래 생성물 대신, 대두-기반 생성물 및/또는 루피누스 캄페스트리스(Lupinus campestris)의 쓴맛을 제거한 종자(debittered seed)와 같은 식물-기반 생성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 동물 생성물 불포함 발효 배양에 사용하기 위한 대두-기반 발효 배지는 대두-기반 생성물, 글루코오스와 같은 탄소의 공급원, NaCl 및 KC1과 같은 염류, Na2HP04　및 KH2P04와 같은 인산염-함유 성분, 철 및 마그네슘과 같은 2가 양이온, 철 분말, L-시스테인 및 L-티로신과 같은 아미노산 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 대두는 가수분해된 대두이고, 가수분해는 동물로부터 유래되지 않은 효소를 사용하여 수행하였다. 가수분해된 대두의 공급원은 하이-소이(Hy-Soy; Quest International), 소이 펩톤(Soy peptone; Gibco), 박-소이톤(Bac-soytone; Difco), 아미소이(AMISOY; Quest), NZ 소이(Quest), NZ 소이 BL4, NZ 소이 BL7, SE50M (DMV International Nutritionals, Fraser, N.Y.), 및 SE50MK (DMV)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
도 1a가 예시하는 바와 같이, 특정의 구체예에서 보툴리눔 독소를 포함하는 시료는 발효 배양액으로부터 수득된다. 예를 들어, 특정한 발효의 기간 후에, 동물 생성물 불포함 또는 비-동물 생성물 불포함 배지 내에서 보툴리눔 독소 복합체는 배지 내로 방출되며, 침전에 의해서 수집될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서는, 잘 알려진 스캔츠 공정에서와 같이, 보툴리눔 독소를 포함하는 발효 배지를 산 침전에 적용하여 보툴리눔 독소 복합체가 세포 파편과 결합하여 산 침전을 형성하도록 촉진시킬 수 있다. 일부의 특히 바람직한 구체예에서는, 약 3 M 황산 용액을 발효 배양액에 첨가하여 산 침전을 형성시킬 수 있다. 바람직하게는, pH는 약 3 내지 약 4로, 더 바람직하게는 약 3.2 내지 약 3.8로, 훨씬 더 바람직하게는 약 3.5로 감소된다. 일부 구체예에서, 배양 온도도, 예를 들어 약 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 또는 20℃ 미만으로 저하된다. 이들 조건은 보툴리눔 독소 복합체와 세포 파편의 결합을 더욱 증진시킨다. 형성된 산 침전물은 결합된 보툴리눔 독소 복합체를 포함할 수 있으며, 청정화(clarification) 단계와 같은 추가의 정제 단계에서 출발물질로 사용될 수 있고, 반면 여액은 버린다.
대조적으로, 도 1b에 도시된 통상적인 공정은 산 침전 단계를 포함하지 않는다. 즉, 정제 절차는 또한 보툴리눔 독소 복합체를 포함하는 발효 배양액으로 시작하는 한편, 배양 배지를 심층 여과(depth filtration)에 적용하고, 세포 파편이 아니라, 여액을 후속 정제 단계에서 사용한다. 도 1b 공정에서는, 여액이 아닌 세포 파편은 버리는 반면에, 도 1a에 예시된 바와 같이 여액은 버리고, 세포 파편 (산 침전물)을 추가의 정제 단계를 위해서, 예를 들어 이하에 기술되는 전-크로마토그래피 정제에서 사용한다.
전-크로마토그래피 정제
일부 구체예에서, 발효 배지로부터 수득된 시료를 하나 또는 그 이상의 전-크로마토그래피 정제에 적용한다. 전-크로마토그래피 정제는 접선 유동 여과, 뉴클레아제 분해, 및 청정화 원심분리 및/또는 여과 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명에 의해서 고려되는 전-크로마토그래피 정제를 포함하는 공정 흐름의 비-제한적인 예는 도 1a에 제시된다. 상술한 바와 같이, 바람직한 구체예에서, 전-크로마토그래피 절차는 도 1b에 예시된 공정에서와 같이 발효 배양액 자체 또는 그로부터 유래된 여액이 아니라, 보툴리눔 독소를 포함하는 발효 배양액의 침전물 (또는 불용성 분획)을 대상으로 수행된다. 즉, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 전-크로마토그래피 (청정화) 단계는 산 침전물 (불용성 분획)로 시작한다.
일부 구체예에서, 보툴리눔 독소를 포함하는 시료 (산 침전물 또는 불용성 분획)가 접선 유동 여과에 적용된다. 접선 유동 여과는 단백질을 청정화, 농축 및/또는 정제하기 위해서 일반적으로 사용되는 방법이다. 유체가 적용된 압력 하에서 여과막 쪽으로 직접 이동하는 것인 정규 유동 여과(normal flow filtration)와는 대조적으로, 접선 유동 여과에서는 유체가 막의 표면을 따라서 접선으로 또는 그에 평행하여 이동한다. 적용된 압력은 유체의 일부분이 여과막을 통해서 나아가도록 하는 작용을 한편, 막 공극을 통해서 통과하기에는 너무 큰 입자 및 거대분자는 보유된다. 그러나 정규 유동 여과와는 달리, 보유된 성분은 막 표면에서 축적되지 않고 접선으로 유동하는 유체에 의해서 함께 쓸려간다. 특정의 바람직한 구체예에서는, 접선 유동 여과를 이용하여 여액은 막 공극을 통해서 통과하도록 하면서, 보툴리눔 복합체가 결합된 불용성 물질 (세포 파편)은 농축시킨다. (예를 들어, 도 1a 참조.) 공극 크기, 공급 유량(feed flow), 적용된 압력 등과 같은 접선 유동 여과 파라미터는, 세포 파편을 농축시키고 보툴리눔 독소 복합체를 포함하는, 더 농축된 시료를 생산하도록 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 선택될 수 있다. 일부의 특히 바람직한 구체예에서는, 예를 들어, 약 0.1 ㎛의 공극 크기를 가진 필터를 사용한 접선 유동 여과가 이용될 수 있다.
일부 구체예에서는, 보툴리눔 독소를 포함하는 시료를 뉴클레아제 분해에 적용한다. 뉴클레아제 분해는 보툴리눔 독소 복합체가 결합하는 경향이 있는 핵산 성분의 제거를 촉진할 수 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, 뉴클레아제 분해는 접선 유동 여과의 다음에 이어지며, 그로부터 수득된 농축된 세포 파편에 대해서 수행된다. (예를 들어, 도 1a 참조.) 예를 들어, 농축된 세포 파편 시료는 뉴클레아제 활성을 허용하도록 그것의 pH를 조정할 수 있으며, 각각 DNA 및/또는 RNA를 분해 (가수분해)시키는 DNases 및/또는 RNases와 같은 하나 또는 그 이상의 적합한 뉴클레아제와 함께 배양할 수 있다. 사용된 뉴클레아제 효소에 따라 적합한 pH는 약 5 내지 약 7, 바람직하게는 약 6일 수 있다. 일부 구체예에서는, 벤즈아미딘을 프로테아제 억제제로 사용하여 뉴클레아제 분해 단계 동안 독소의 단백질 분해를 방지한다. 사용된 뉴클레아제는, 동물 공급원 및/또는 비-동물 공급원을 포함한, 적합한 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다.
더욱 바람직한 구체예에서, 뉴클레아제는 동물-생성물-불포함 뉴클레아제 및 동물-생성물-불포함 공정을 제공하기 위해서 비-동물 공급원으로부터 수득된다. 따라서, 본 발명은 뉴클레아제의 사용을 포함하는, 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 동물-생성물-불포함 공정 및 시스템 (또는 실질적으로 또는 본질적으로 동물 생성물 불포함 공정 및 시스템)을 포함한다. 동물-생성물-불포함 뉴클레아제 분해는 재조합적으로, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 뉴클레아제 분해단계에서 사용하기 위한 DNase 및/또는 RNase를 발현하도록 형질전환된 재조합 박테리아, 효모, 또는 그 밖의 다른 미생물을 사용하여 제조될 수 있다. 뉴클레아제 분해는 일반적으로, 숙주 세포 핵산을 분해시키고, 그들의 제거를 촉진시킴으로써, 시료의 핵산 함량을 감소시킨다. 예를 들어, 가수분해된 핵산 및 그 밖의 다른 저분자량 불순물은 추가의 정제 단계에 의해서 제거될 수 있다.
특정의 구체예에서, 보툴리눔 독소를 포함하는 시료는 청정화 원심분리 및/또는 여과에 적용될 수 있다. 청정화 원심분리 또는 여과는, 시료로부터 전체 및 용해된 세포 및 세포 파편과 같은 육안적 요소를 제거하여 측정가능하게 더 청정한 시료를 제공하기 위해서 사용되는 원심분리 또는 여과 단계를 의미한다. 특정의 구체예에서, 원심분리는 약 10,000xg 내지 약 30,000xg, 더욱 바람직하게는 약 15,000xg 내지 약 20,000xg, 가장 바람직하게는 약 17,700xg에서 수행된다. 청정화 여과는 일반적으로, "전량" 여과 ("dead end" filtration)로도 불리는 정규 유동 여과를 포함하며, 여기에서 유체는 적용된 압력 하에서 여과 매체 쪽으로 직접 이동하고, 필터 공극을 통해서 통과하기에 너무 큰 입자들은 표면에서 또는 매체 자체 내에 축적되는 반면에 더 작은 분자는 여액으로 통과한다. 일부의 특히 바람직한 구체예에서는, 시료를 황산 암모늄과 혼합시키고, 정규 유동 여과는 약 0.1 내지 약 0.3 ㎛의 공극 크기, 더욱 바람직하게는 약 0.2 ㎛의 공극 크기를 갖는 필터를 사용하여 수행한다. (예를 들어, 도 1a 참조.) 특정의 특히 바람직한 구체예에서는, 하나 또는 그 이상의 청정화 단계(들)가 뉴클레아제 분해 단계 다음에 이어진다. 특정의 훨씬 더 바람직한 구체예에서는, 하나 또는 그 이상의 청정화 단계(들)는 크로마토그래피에 의한 정제에 바로 선행한다.
특히, 바람직한 구체예에서는, 버려지는 불용성 분획보다는 청정화된 상청액 또는 여액이, 크로마토그래피 정제 단계와 같은 추가의 정제 단계에서 사용하기 위한 보툴리눔 독소-함유 시료를 제공한다. 이것은 보툴리눔 독소 복합체가, 예를 들어 원심분리 펠릿과 같은, 산 침전을 포함하지 않는 전-크로마토그래피 단계로부터의 불용성 분획 내에 함유되고 상청액은 버려지는 것인 도 1b에 개략적으로 나타낸 공정과는 대조적이다.
또한, 다시 도 1b에 개략적으로 나타낸 공정과는 대조적으로, 본 발명의 일부 구체예에서의 전-크로마토그래피 단계는 발효 배양액으로부터 수득된 여액의 접선 유동 여과 단계를 필요로 하지 않는다. 즉, 본 발명의 일부 구체예에서 크로마토그래피 정제를 위해서 사용된 시료는 발효 배양액의 가용성 분획을 접선 유동 여과에 적용하는 것에 의해 수득되지 않는다. 오히려 특정의 구체예에서, 본 발명은 불용성 물질 (예를 들어, 산 침전물)을 사용하므로, 가용성 보툴리눔 독소 복합체를 농축시키기 위한 시도에서 발효 배양 여액을 접선 유동 여과에 적용하는 모든 단계를 제거한다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 전-크로마토그래피 단계는 대신에 산을 사용하여, 불용성 물질 (세포 파편)과 함께 바람직한 독소 복합체를 침전시킴으로써 이러한 임의의 단계에 대한 필요성을 제거한다.
크로마토그래피 정제 단계
도 1a는 또한, 본 발명의 특정의 구체예에 따른 크로마토그래피 정제 단계를 예시한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 정제하는 크로마토그래피 방법은 보툴리눔 독소를 포함하는 시료를 다수의 크로마토그래피 칼럼을 통해서 통과시켜 고도로 정제되고, 고도로 강력한 비-복합체화된 형태의 신경독소를 수득하는 것을 포함한다.
특정의 구체예에서, 복합체화된 보툴리눔 독소는 소수성 상호작용 칼럼을 사용하여 다른 세포 성분으로부터 분리된다 (예를 들어, 도 1a 참조.). 이러한 칼럼은 불순물이 칼럼을 통해서 흐르도록 허용하면서 보툴리눔 독소를 복합체화된 형태로 포획한다. 사용된 칼럼은, GE Healthcare Life Sciences로부터 상업적으로 입수할 수 있는 부틸 세파로오스 고속 유동 (Fast Flow) 칼럼 또는 페닐 세파로오스 HP와 같은, 이러한 목적에 적합한 본 기술분야에서 공지된 어떤 소수성 상호작용 칼럼이라도 될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 추가로 시료를 칼럼 상에 적재시키기 전에 소수성 상호작용 크로마토그래피에 대해서 컨디셔닝하는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 페닐 세파로오스 HP 칼럼에서의 사용을 위해, 시료를 적재시키기 전에 pH 6의 0.5 M 황산 암모늄 용액, 및 50 mM 인산염과 조합할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 칼럼, 완충제 및 pH 조건에는 페닐 세파로오스 고속 유동 고치환(high substitution), 페닐 세파로오스 고속 유동 저치환(low substitution), 부틸 세파로오스 및 옥틸 세파로오스와 같은 칼럼; 각각 약 4.0 내지 약 7.0, 더욱 바람직하게는 약 4.5 내지 약 6.5, 훨씬 더 바람직하게는 약 5.5의 pH 범위인 아세테이트, 시트레이트, MES, 히스티딘, 피페라진, 및 말로네이트와 같은 완충제가 포함된다. 다른 완충제 및 pH 조건은, 본 기술분야에서 공지된 바와 같이, 본 명세서에 제시된 내용을 기초로 하여, 사용된 특정의 칼럼으로부터의 수율을 최적화하도록 결정될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 바라지는 않지만, 분리는, 예를 들어 더 작은 단백질, 핵산 등과 같은 다수의 세포-유래 불순물은 관통하도록 하면서, 이 단계에서의 해리를 피하기 위해서 7 미만의 pH에서 독소 복합체의 수지로의 결합을 수반하는 것으로 사료된다.
소수성 상호작용 칼럼으로부터 포획된 (결합된) 독소를 용리시키기 위해서, 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 적합한 완충제가 사용될 수 있다. 일부의 특히 바람직한 구체예에서는, 황산 암모늄의 하향 구배 (descending gradient)가 사용된다. 하향 구배의 농도 범위는 약 0.6 M부터 약 0.0 M, 약 0.5 M부터 약 0.0 M, 또는 약 0.4 M부터 약 0.0 M일 수 있다. 사용될 수 있는 다른 용리 완충제는, 예를 들어 하향 구배의 황산나트륨 (Na2S04); 염화나트륨 (NaCl); 염화칼륨 (KCl); 암모늄 아세테이트 (NH4OAc) 등을 포함한다. 생성물 피크를 함유하는 분획(들)은 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 확인될 수 있다. 피크 분획은 일반적으로, 예를 들어, 황산 암모늄을 사용한 경우에 pH는 복합체를 유지시키도록 약 6에서 유지하면서 약 0.4 M 내지 약 0.0 M; 더욱 바람직하게는 약 0.3 M 내지 약 0.0 M; 가장 바람직하게는 약 0.25 M 내지 약 0.0 M 황산 암모늄의 농도 범위에서 발견된다. 즉, 용리된 보툴리눔 독소 복합체를 함유하는 분획(들)을 확인하고, 후속 정제 단계에서 사용할 수 있다.
바람직한 구체예에서는, 수득된 보툴리눔 독소 복합체를 해리되도록 하여 비-복합체화된 형태를 제공한다. 특정의 바람직한 구체예에서, 해리 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계 후에 및/또는 후속 크로마토그래피 단계 전에 수행된다 (예를 들어, 도 1a 참조). 따라서, 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명은 크로마토그래피 표적 분자가 각 크로마토그래피 단계마다 서로 다른 것인 방법 및 시스템을 포함한다. 즉, 초기 크로마토그래피 단계에서 표적은 보툴리눔 독소 복합체를 포함하는 반면에, 후속 크로마토그래피 단계에서 표적은 헤마글루티닌 및 비-헤마글루티닌 단백질과 같은 비-독소 단백질로부터 해리된, 유리 보툴리눔 독소를 포함한다. 대조적으로, 도 1b에 개략적으로 나타낸 공정은 모두 보툴리눔 독소 복합체를 정제하도록 고안된 크로마토그래피 단계를 포함한다.
비-복합체화된 보툴리눔 독소 단백질을 생산하기 위한 보툴리눔 독소 복합체의 해리는, 예를 들어 본 기술분야에서 공지되고 및/또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 다수의 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, pH를 약 7.0으로 상승시킴으로써; 또는 동물 단백질 불포함 정제가 필요하지 않은 구체예에서는, 복합체를 약 7.3의 pH에서 적혈구로 처리함으로써 해리가 달성될 수 있다.
바람직한 구체예에서 동물 불포함 독소를 제공하기 위해, 복합체는 적합한 완충제 중 복합체의 pH 조정에 기초한 분리 공정에 적용된다. 적합한 완충제에는 양이온성 완충제, 바람직하게는 음이온 교환 칼럼과 상호작용하지 않거나 실질적으로 상호작용하지 않는 양이온성 완충제가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 양이온성 완충제는 예를 들어, 트리스(Tris), 비스(bis)-트리스, 트리에탄올아민, N-메틸 디에탄올아민을 포함한다. 약 7 내지 약 8.4; 더욱 바람직하게는 약 7.4 내지 약 8.2의 pH; 가장 바람직하게는 약 7.8의 pH가 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 방출하도록 복합체를 해리시키는데 일반적으로 적합하다. 일부의 특히 바람직한 구체예에서는, 예를 들어, 소수성 상호작용 칼럼의 용리제의 pH를 약 7.5, 약 7.8, 또는 바람직하게는 약 8.0으로 상승시킨다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 용리제는, 복합체를 약 150 kD 비-복합체화된 보툴리눔 독소 단백질을 포함하여, 각각의 성분으로 해리시키기 위해 약 7.8의 pH를 갖는 트리스 완충제로 희석할 수 있다. 그 후, 결과적으로 수득된 해리된 성분들을 포함하는 혼합물은, 비-복합체화된 독소를 포획하고 추가로 정제하도록 고안된 이온 교환 크로마토그래피 단계와 같은, 하나 또는 그 이상의 추가적인 크로마토그래피 정제 단계에 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 특정의 구체예에서, 비-복합체화된 보툴리눔 독소는 하나 또는 그 이상의 이온 교환 크로마토그래피 단계를 사용하여 정제될 수 있다 (예를 들어, 도 1a 참조). 이온 교환 크로마토그래피는 정전기 전하를 기초로 한 분별을 달성한다. 소정의 단백질이 칼럼 매트릭스에 결합하는 정도는, 그것의 개별적인 아미노산 조성 및 칼럼 매트릭스의 전하를 기초로 한 단백질의 순전하의 함수이다. 양이온성 이온 교환 칼럼은 순 양전하 매트릭스를 갖는 반면에, 음이온성 이온 교환 칼럼은 순 음전하 매트릭스를 갖는다. 결합된 단백질은, 하전된 단백질에 대한 결합을 위한 하전된 매트릭스 지지체와 경쟁하는, 염 이온과 같은 하전된 물질을 함유하는 용매 (용리제)를 사용하여 칼럼으로부터 선택적으로 용리될 수 있다. 따라서, 결합된 단백질은 그들의 전하의 강도를 기초로 하여 분별될 수 있다. 대안적으로, 단백질의 순전하를 변화시킴으로써 하전된 매트릭스에 대한 그것의 친화성을 변화시킬 수 있는 pH를 조정함으로써 단백질이 용리될 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구체예에 따르면, 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 혼합물을 음이온 교환 칼럼 상에 적재시킨다 (예를 들어, 도 1a 참조). 특히, 이러한 칼럼은 비-복합체화된 형태로 보툴리눔 독소를 포획함으로써 독소 단백질 및 해리된 비-독소 단백질이 별개의 분획으로 용리될 수 있다. 사용된 칼럼은 하전된 단백질을 분리시키는데 적합한 본 기술분야에서 공지된 임의의 음이온 칼럼일 수 있으며, 그것의 비-제한적인 예로는 GE Healthcare Life Sciences로부터 상업적으로 입수할 수 있는 Q 세파로오스 HP, Q 세파로오스 고속 유동, 또는 Q XL 세파로오스가 포함된다. 일부의 특히 바람직한 구체예에서는, Q XL 세파로오스 칼럼이 사용된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 추가로 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 혼합물을 칼럼 상에 적재시키기 전에 음이온 교환 크로마토그래피를 위해서 컨디셔닝하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 완충제 및 pH 조건은, 본 기술분야에서 공지된 바와 같이, 본 명세서에 제시된 내용을 기초로 하여 사용된 특정 칼럼으로부터의 수율을 최적화하도록 결정화될 수 있다. 칼럼에서의 적재 및 사용을 위해서, 예를 들어 적합한 완충제는 양이온성 완충제, 바람직하게는 음이온 교환 칼럼과 상호작용하지 않거나 실질적으로 상호작용하지 않을 양이온성 완충제를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 양이온성 완충제에는 예를 들어, 트리스, 비스-트리스, 트리에탄올아민, N-메틸 디에탄올아민이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 칼럼을 적재시키고 평형화하기 위해서, 약 7.2 내지 약 8.6; 더욱 바람직하게는 약 7.4 내지 약 8.2; 가장 바람직하게는 약 7.8의 pH가 사용될 수 있다.
음이온 교환 칼럼으로부터 포획된 (결합된) 독소 및 다른 해리된 성분을 용리시키기 위해서, 본 기술분야에서 공지된 적합한 완충제가 사용될 수 있다. 적합한 완충제의 예로는 예를 들어, 염화나트륨(NaCl) 및 염화칼륨(KCl)이 포함된다. 일부의 특히 바람직한 구체예에서는, 염화나트륨의 상향 구배(ascending gradient)가 사용된다. 예를 들어, 약 0.0 M부터 약 0.4 M NaCl, 더욱 바람직하게는 약 0.0 M부터 약 0.5 M NaCl, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.0 M부터 약 0.6 M NaCl의 농도 범위를 갖는 염화나트륨 완충제가 사용될 수 있다. 상이한 분획에서 분리된 불순물은, 예를 들어 비-독소 헤마글루티닌 및/또는 비-독소 비-헤마글루티닌 단백질과 같은 해리된 복합체의 하나 또는 그 이상의 비-독소 단백질을 포함할 수 있다. 생성물 피크를 함유하는 분획(들)은 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 확인될 수 있다. 상기 피크는 예를 들어, 약 0.08 M 내지 약 0.18 M NaCl에 상응하는, 약 7.4 내지 약 8.4, 바람직하게는 약 7.8의 pH에서 약 8 mSem 내지 약 22 mSem에서 나타날 수 있다. 역으로, 다른 불순물은 약 0.25 M 내지 약 0.35 M NaCl에 상응하는 약 30 내지 약 45 mSem에서 용리될 수 있다.
용리된 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 함유하는 분획(들)을 확인하여 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 용리액을 제공할 수 있다. 피크는 본 기술분야에서 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 HPLC, 웨스턴 블럿 분석, ELISA, 비-환원형 SDS-PAGE 등을 사용하여 확인될 수 있다. 비-환원성 조건 하에서의 SDS-PAGE는, 예를 들어 약 150 kDa 독소 밴드(band)를 확인할 수 있는 반면에 다른 불순물은 더 작은 분자에 상응하는 밴드에서 나타날 수 있다. 그 후, 비-복합체화된 형태를 포함하는 이 용리액을 추가의 크로마토그래피 정제 단계에 적용할 수 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 독소 순도는 SDS-PAGE에 의해서 평가될 수 있다. 숙련된 전문가가 인식할 수 있는 바와 같이, SDS-PAGE 분석은 단백질 내에 존재하는 디설파이드 결합을 절단시키는 성분의 존재 또는 부재 (즉, 각각 비-환원성 또는 환원성 조건) 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 A형에 관해서, 보툴리눔 독소 A형 단백질 분자의 성숙한 활성 형태는 디설파이드 결합뿐만 아니라 비-공유 상호작용에 의해서 서로 묶인, 각각 100 kD 및 50 kD의 2 개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 본 발명의 방법에 의해서 생산된 보툴리눔 독소 A형을 비-환원성 조건을 사용하여 분석하는 경우에, 보툴리눔 독소 A형 단백질 분자는 약 150 kD의 단일 단백질 밴드로서 이동하며, 측정된 순도는 일반적으로 98%보다 높다. 겔 레인 (lane)당 적재된 보툴리눔 독소 A형 단백질의 양이 농도계(densitometer)의 동작 범위(dynamic range) 내에 있도록 유지되는 경우에는, 검출가능한 불순물 밴드는 거의 없어서, 100%의 측정된 순도를 가져온다. 주된 독소 밴드가 농도계의 동작 범위를 초과하도록 A형 보툴리눔 독소가 과적재되는 경우에는, 약간의 미소 불순물 밴드가 검출될 수 있다 (1-2% 정도).
그러나, 보툴리눔 독소 A형의 SDS-PAGE 분석이 환원성 조건 하에서 수행되는 경우에는, 보툴리눔 독소의 디설파이드 결합이 분해되고, 보툴리눔 독소 A형 단백질은 각각 100 kD 및 50 kD의 분자량을 갖는 2 개의 성분으로서 이동한다. 보툴리눔 독소 A형 단백질이 주된 종(species)이 농도계의 동작 범위를 초과하도록 적재되고, SDS-PAGE가 환원성 조건 하에서 수행되는 경우에, 소수의 불순물 종은 더 쉽게 검출될 수 있다. 예를 들어, 이들 조건 하에서는 발효 및 회수 공정 중의 불완전한 단백분해 처리공정으로 인해 5% 정도의 150 kD 종이 존재할 수 있다. 이들 조건 하에서, 본 발명의 방법은 일반적으로 총 단백질의 90%보다 높은, 보다 가능성 잇게든 더욱 크게는 총 단백질의 95% 높은 독소 생성물 (활성형의 분해된 100 kD 및 50 kD 폴리펩티드 쇄로 이루어짐)을 생성한다. 따라서, 독소의 보고된 측정 순도는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 채택된 SDS-PAGE 방법의 세부사항에 따라 좌우된다. 또한, 전술한 예는 보툴리눔 독소 A형에 관한 것이지만, 숙련된 전문가는 본 명세서에 기술된 SDS-PAGE 분석은 보툴리눔 독소의 다른 혈청형의 순도를 평가하기 위해 쉽게 개조될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
특정의 구체예에서, 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 음이온성 칼럼으로부터의 용리액을 양이온 교환 칼럼 상에 적재시킨다 (참조: 예를 들어, 도 1a). 특히, 이러한 칼럼은 또한 보툴리눔 독소를 비-복합체화된 형태로 포획함으로써 독소 단백질 및 해리된 비-독소 단백질을 별개의 분획으로 용리시킬 수 있다. 사용된 칼럼은 단백질을 분리시키는데 적합한 본 기술분야에서 공지된 양이온 칼럼일 수 있으며, 그것의 비-제한적 예로는 SP 세파로오스 HP 또는 SP 세파로오스 고속 유동을 포함하는 SP 세파로오스 칼럼; 모노 S 칼럼; 또는 소스 (Source)-30S 칼럼 또는 바람직하게는 소스-15S 칼럼과 같은 소스-S 칼럼(이들은 모두 GE Healthcare Life Sciences로부터 상업적으로 입수할 수 있다)이 포함된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 추가로 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 음이온 교환 칼럼으로부터의 용리액을 칼럼 상에 적재시키기 전에 양이온 교환 크로마토그래피를 위해서 컨디셔닝하는 단계를 더 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, pH는 칼럼 상에 적재될 용리액의 pH가 칼럼에 대한 유리 독소의 효율적인 결합을 허용하도록 조정된다. 예를 들어, pH는 약 4 내지 약 8, 바람직하게는 약 5 내지 약 7.5, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 약 7, 가장 바람직하게는 약 7의 범위 내에서 유지될 수 있다. 또한, 일부 구체예에서, 음이온성 칼럼으로부터의 용리액은, 예를 들어, 그의 비-제한적 예는 약 20 mM NaH2PO4의 나트륨 인산염 완충제인, 나트륨 인산염 완충제를 사용하여 양이온 교환 칼럼 상에 적재시키기 전에 전도성을 감소시키도록 처리될 수 있다. 예를 들어, 음이온성 칼럼으로부터의 용리액은 약 0.15 M NaCl 정도를 함유할 수 있으므로, 약 20 mM NaH2PO4 완충제에서 희석시켜 전도성을 감소시킨다. 일부의 특정한 구체예에서, 전도성은 약 12 mSem으로부터 약 3.3 mSem으로 감소된다. 또한, 본 기술분야에서 공지된 완충제 중에서의 희석, 투석 또는 그 밖의 다른 방법을 사용하여 전도성을 감소시킬 수도 있다.
칼럼에서의 적재 및 사용을 위해서, 예를 들어, 적합한 완충제에는 음이온성 완충제, 바람직하게는 양이온 교환 칼럼과 상호작용하지 않거나 실질적으로 상호작용하지 않을 음이온성 완충제가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 음이온성 완충제는, 예를 들어 MES, HEPES 등으로서, 바람직하게는 나트륨 인산염 완충제가 포함된다. 칼럼을 적재 및 평형화시키기 위해서, 약 4 내지 약 8, 바람직하게는 약 5 내지 약 7.5, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 약 7의 pH, 가장 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7의 pH가 사용될 수 있다.
포획된 (결합된) 독소를 양이온 교환 칼럼으로부터 다른 해리된 비-독소 단백질 및 다른 불순물과 별도로 용리시키기 위해서는, 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 적합한 완충제가 사용될 수 있다. 일부의 특히 바람직한 구체예에서는 상향 구배의 염화나트륨이 사용된다. 염화나트륨 구배를 위한 적합한 농도 범위는 약 0.0 M부터 약 1 M NaCl일 수 있다. 사용될 수 있는 다른 염에는 예를 들어, 약 0.0 M부터 약 0.5 M KC1의 농도 구배로 사용될 수 있는 염화칼륨이 포함된다. 생성물 피크를 포함하는 분획(들)은 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 확인될 수 있다. 상기 피크는 예를 들어, 약 6.7의 pH에서, 약 0.3 M 내지 약 0.4 M NaCl에 상응하는 약 18 내지 약 25 mSem에서 나타날 수 있다. 즉, 용리된 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 함유하는 분획(들)을 확인하여 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 양이온성 칼럼으로부터의 용리액을 제공할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 양이온성 칼럼으로부터의 용리액은 고수율로 높은 활성을 갖는 고순도의 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 나타낸다. 이에 반해, 도 1b에 개략적으로 나타낸 방법은 최종 용리액에서 900 kD 보툴리눔 독소 A형 복합체를 제공한다.
정제된 비- 복합체화된 보툴리눔 독소 생성물
본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 고수율로 높은 활성을 갖는 고순도의 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 제공하는데 유용하다. 하기 실시예 1을 참조한다. 상기 생성물은 또한, 안전한 약제학적 조성물의 제조를 위해서 쉽게 안정화되고, 편리하게 사용된다.
일부 바람직한 구체예에서, 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소는 약 80% 이상 순수하고, 바람직하게는 약 90% 이상 순수하며, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상 순수하고, 훨씬 더 바람직하게는 약 98% 이상 순수하며, 가장 바람직하게는 약 99% 이상 순수하거나, 약 100%까지도 순수하다. "정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소(purified non-complexed botulinum toxin)"는, 비-복합체화된 보툴리눔 독소가 배양 또는 발효 공정으로부터 수득됨에 따라서 다른 경우에는 이에 동반될 수 있는 다른 단백질 및 불순물로부터 분리되거나 실질적으로 분리된 유리 보툴리눔 독소 단백질 분자를 의미한다. 예를 들어, "80% 순수"한 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소는, 그의 비-제한적 예는 SDS-PAGE, CE, 및 HPLC를 포함하는, 적합한 분석방법에 의해서 결정된 것으로서 독소 단백질이 존재하는 총 단백질의 80%를 구성하는, 단리되거나 실질적으로 단리된 비-복합체화된 보툴리눔 독소 단백질을 의미한다. 예를 들어, 일부 바람직한 구체예에서, 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 양이온성 칼럼 용리액은 약 99% 이상 순수하며, 원래 존재하는 약 150 kD 보툴리눔 독소가 아닌 숙주 세포 단백질을 약 1% 미만으로 함유한다.
일부 바람직한 구체예에서, 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소는 적어도 약 150 LD50　유닛/ng, 바람직하게는 적어도 약 180 LD50　유닛/ng, 더욱 바람직하게는 적어도 약 200 LD50　유닛/ng, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 210 LD50　유닛/ng, 가장 바람직하게는 적어도 약 220 LD50　유닛/ng의 활성을 갖는다. 1 유닛의 보툴리눔 독소는 각각 체중이 약 18-20 그램인 암컷 스위스 웹스터 마우스(Swiss Webster mice)에게 복강 내 주사한 후의 LD50으로 정의된다. 즉, 보툴리눔 독소 1 유닛은 암컷 스위스 웹스터 마우스의 그룹의 50%를 사멸시키는 보툴리눔 독소의 양이다. "활성(activity)"은 본 명세서에서 보툴리눔 독소의 작용을 기술하기 위해서 관련된 표현 "생물학적 활성", "효력(potency)" 및 "독성(toxicity)"과 호환적으로 사용된다.
바람직한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템에 의해서 수득할 수 있는 비-복합체화된 보툴리눔 독소는 생물학적 활성을 나타낸다. 즉, 바람직한 구체예에서, 비록 독소 단백질과 천연적으로 결합된 비-독소 단백질은 정제 중에 제거되지만, 생성물의 생물학적 활성 또는 독성은 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 정제 후에 상실되지 않는다. 훨씬 더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 범위 내의 방법 및 파라미터의 제시된 세트를 사용하여 수득된 효능은 일관되고 및/또는 재현가능하다. 예를 들어, 효능 측정은 약 40% 미만의 가변성(variability), 바람직하게는 약 35% 미만의 가변성, 더욱 바람직하게는 약 30% 미만의 가변성, 훨씬 더 바람직하게는 약 25% 미만의 가변성, 가장 바람직하게는 약 20% 미만의 가변성으로 이루어질 수 있다.
일부 바람직한 구체예에서, 정제방법은 고수율로 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 제공한다. 예를 들어, 30 L의 발효 배양액으로부터 수득된 수율은 각각 약 1 ㎎/L 이상, 바람직하게는 약 1.3 ㎎/L 이상, 더욱 바람직하게는 약 2.3 ㎎/L 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 2.7 ㎎/L 이상, 가장 바람직하게는 약 3 ㎎/L 이상의 수율에 상응하는, 약 30 ㎎ 이상, 바람직하게는 약 40 ㎎ 이상, 더욱 바람직하게는 약 70 ㎎ 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 80 ㎎ 이상, 가장 바람직하게는 약 90 ㎎ 이상일 수 있다. 훨씬 더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 범위 내의 방법 및 파라미터의 제시된 세트를 사용하여 수득된 수율은 재현가능하다. 예를 들어, 수율은 약 40% 미만의 가변성, 바람직하게는 약 35% 미만의 가변성, 더욱 바람직하게는 약 30% 미만의 가변성, 훨씬 더 바람직하게는 약 25% 미만의 가변성, 가장 바람직하게는 약 20% 미만의 가변성으로 측정될 수 있다.
일부의 특히 바람직한 구체예에서, 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소는 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템을 사용한 정제 동안 안정하다. 보툴리눔 독소 A형 복합체와 같은 보툴리눔 독소 복합체로부터 결합된 비-독소 단백질의 제거는 현저하게 불안정한 보툴리눔 독소 생성물을 초래한다. 그러나, 본 발명은 상술한 바와 같이, 안정성을 유지시키기 위해 정제 공정 중에 필요한 것으로 통상 여겨지는 결합된 비-독소 단백질이 없이 유리 보툴리눔 독소를 안정적으로 단리시킬 수 있는 방법 및 시스템을 제공한다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 후-크로마토그래피 단계, 예를 들어, 저장 중의 안정성을 유지하는 측면에서, 및 약제학적 용도에 대한 적용성의 측면에서의 단계를 거의 필요로 하지 않는 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 제공한다. 예를 들어, 본 기술분야에서 공지된 바와 같이, 황산 암모늄을 유리 보툴리눔 독소에 첨가하여 저장을 위한 황산 암모늄 현탁액을 제조할 수 있다. 유리 보툴리눔 독소 및 황산 암모늄을 포함하는 조성물은 냉장고에서 쉽게 저장될 수 있으며, 후에 약제학적 적용에서 사용하기 위해서 쉽게 복구시킬 수 있다. 실제로, 본 명세서에 기술된 방법에 의해서 수득할 수 있는 독소의 안정성, 고수율 및 순도, 및 일관된 효능은 이하에 더 상세히 기술되는 바와 같이 정제된 생성물의 약제학적 사용을 용이하게 한다.
정제된 비- 복합체화된 보툴리눔 독소의 용도
본 발명에 따라 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소는 이러한 약제학적 조성물로부터 효과를 얻을 수 있는 개체에게 투여하기 위한 활성성분으로서 상기 독소를 포함하는 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 치료대상 개체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 본 명세서에서 사용된, "약제학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 활성성분이 보툴리눔 독소일 수 있는 것인 제제(formulation)를 나타낸다. 상기 제제는 하나 이상의 추가 성분을 함유하고, 인간 환자와 같은 개체로의 진단, 치료 및/또는 미용적(cosmetic) 투여에 적합할 것이다. 약제학적 조성물은 액체 또는 고체일 수 있으며; 단일 또는 다중-성분 시스템, 예를 들어, 식염수와 같은 희석제로 재구성된 동결건조된 조성물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 환자에게 정제된 보툴리눔 독소 분자를 투여하는 것을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 "투여(administration)"는 개체 또는 환자에게 약제학적 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 약제학적 조성물은 예를 들어, 근육내 (i.m.), 피내, 비강내 또는 피하 투여, 척수관 투여, 두개내, 복강내 (i.p.) 투여, 또는 국소 (경피) 및 (예를 들어, 서방성 장치의) 이식 투여 경로를 포함하는, 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 투여될 수 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소는 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허출원 제09/910,432호; 제10/793,138호; 제11/072,026호; 제11/073,307호, 제11/824,393호, 및 제12/154,982호에 기술된 바와 같은 조성물로 국소적으로 또는 주사에 의해서 투여된다.
특정의 구체예에서, 황산 암모늄 현탁액 중에 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 조성물은 쉽게 약제학적 조성물로 배합될 수 있다. 예를 들어, 비-복합체화된 보툴리눔 독소 단백질을 포함하는 황산 암모늄 현탁액을 원심분리하여 단백질을 회수할 수 있으며, 상기 단백질을 재-용해시키고, 희석하고, 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 배합시킬 수 있다. 특정의 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 활성 약제학적 성분으로서 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함할 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 완충제, 담체, 안정화제, 보존제 및/또는 증량제를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 저장을 위해서 분말로 동결건조될 수 있으며, 추가적 용도를 위해서 재구성될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 보툴리눔 독소를 제조의 용이성의 약제학적 적용 측면에 특히 적합한 형태로 제공할 수 있다.
약제학적 조성물은 치료, 진단, 연구 및/또는 미용적 적용분야에서 용도를 가질 수 있다. 예를 들어, 앞서 검토된 바와 같이, 보툴리눔 독소 A형은 본태성 안검경련, 사시, 경부 근긴장이상, 및 미간 (안면) 주름살과 같이 골격근 활동항진을 특징으로 하는 신경근육 장애를 치료하기 위해서 임상적으로 사용된다. 또한, 특정의 적용 시에 비-복합체화된 (약 150 kD) 보툴리눔 독소는 인간을 치료하기 위한 바람직한 형태이다.. 예를 들어, Kohl A., et al., Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox®) with the highly-purified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15(Suppl 3): 165를 참조한다. 따라서, 특정의 보툴리눔 독소 약제학적 조성물은 바람직하게는, 보툴리눔 독소 복합체와는 대조적으로 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 사용하여 제조된다.
실시예
실시예 1: 변형된 스캔츠 방법과 본 발명의 방법의 비교
본 발명의 범위 내의 방법 ("본 발명의 방법")을 사용한 비-복합체화된 보툴리눔 독소 A형의 정제를, 비-복합체화된 형태를 제공하도록 크로마토그래피 단계를 부가함으로써 더 변형된 전통적인 스캔츠 방법 ("변형된 스캔츠 방법")을 기초로 하는 정제와 직접 비교하였다. 간략히, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하고, 발효가 완료될 때까지 (접종부터 회수까지 통상적으로 약 72 내지 약 120 시간) 성장시켰다. 그 후, 30 L의 용적의 발효 배양액을 이하의 정제 절차 각각에서 사용하였다.
사용된 변형 스캔츠 방법은 독소를 침전시키기 위한 발효 배양액의 전형적인 산성화에 이어서 정제되지 않은 독소를 농축시키기 위한 초미세여과 (UF) 및 정용여과 (DF)를 포함하였다. DNase 및 RNase를 회수된 독소에 첨가하여 핵산을 분해 (가수분해)시킨 다음에, 이것을 접선 유동 여과 (300 kD UF)를 사용하여 추가의 UF 단계에 의해서 제거하였다. 수득된 독소를 다음에 인산염 완충제로 추출하고, 이어서 3 회의 순차적인 침전 단계, 즉 냉 에탄올 침전, 염산 침전, 및 황산 암모늄 침전을 수행하였으며, 여기에서 매회의 상청액은 통상적으로 버렸다. 이러한 절차는 900 kD 보툴리눔 독소 A형 복합체를 제공하였으며, 이것을 그 후에 추가의 크로마토그래피 단계에 적용하여 유리 독소를 제공하였다. 구체적으로, 독소 복합체를 재가용화시키고, DEAE 수지 상에서의 음성 배취 흡착(negative batch adsorption)에 적용하였다. 그 후, 용리액을 중력 유동 음이온 교환 칼럼 (DEAE-세파로오스) 상에서 전재시키고, 이어서 중력 유동 양이온 교환 칼럼 (CM-세파로오스) 상에서 전개시켰다. 수율을 결정하고, 공정에 소요된 시간의 길이를 기록하고 (발효 기간은 계산하지 않음), 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소 A형을 SDS-PAGE 분석에 의해서 순도에 대해 측정하고, 예를 들어 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 기법에 의해서 효능에 대해서 분석하였다. 변형된 스캔츠 방법 전체를 3 개의 상이한 로트(lots)인 로트 번호 1, 2 및 3에 대해서 반복하고, 결과를 하기 표 1에 기록하였다.
본 발명의 방법을 본 명세서에 기술된 시스템 및 방법에 따라 3 개의 상이한 로트인 로트 번호 4, 5 및 6에 대해서 사용하였다. 요약하면, 발효 배양액을 3 M 황산을 사용하는 산 침전에 적용하여 25℃ 미만의 온도에서 pH를 3.5로 감소시켰다. 그 후, 산 침전물을 0.1 ㎛ 접선 유동 여과에 적용하여 세포 매스(mass)를 농축시켰다. 그 후, pH를 6으로 조정하고, 뉴클레아제를 첨가하여 숙주 세포 핵산 함량을 감소시키고, 이어서 세포 파편을 제거하기 위해 원심분리에 의한 청정화, 및 첨가된 황산암모늄과 함께 0.2 ㎛에서 전량 여과(dead end filtration)를 수행하였다. 그 후, 여액을 직접 소수성 상호작용 칼럼인 페닐 세파로오스 HP (GE Life Sciences) 상에 적재시키고, 하향 구배의 황산 암모늄으로 용리시키고, 생성물 피크를 분리시켰다. 그 후, 용리액을 트리스 완충제 pH 7.8로 희석하여 독소 복합체를 해리시킨 다음에, 이것을 음이온 교환 칼럼 Q XL 세파로오스 (GE Lifesciences) 상에 적재시키고, 상향 구배의 염화나트륨으로 용리시키고, 다시 생성물 피크를 수집하였다. 그 후에, 이 용리액을 나트륨 인산염 완충제에서 희석하고 (전도성을 감소시키기 위함), 음이온 교환 칼럼인 Q XL 세파로오스 (로트 # 4 및 5에 대해서), 또는 양이온 교환 칼럼인 소스-S (GE Life Sciences) (로트 #6에 대해서) 상에 적재시키고, 다시 상향 구배의 염화나트륨으로 용리시키고, 최종 생성물 피크를 수집하고 저장하였다. 이러한 공정은 비-복합체화된 보툴리눔 독소 A형을 제공하였다. 수율을 결정하고, 공정 시간의 길이를 기록하고 (발효 기간은 포함되지 않음), 독소를 SDS-PAGE 분석에 의해서 순도에 대해서 측정하고, 예를 들어, 본 기술분야에서 공지된 기법에 의해 효능에 대해 분석하였다. 결과를 또한, 다음의 표 1에 기록하였다.
변형된 스캔츠 방법 본 발명의 방법
로트 # 1 2 3 4 5 6
공정 시간 10 일 4 일
순도 % 99 n/a 97 98.6 95.3 100
수율 (30 L 스케일) 11 ㎎ 0 ㎎ 4 ㎎ 43 ㎎ 99 ㎎ 89 ㎎
효력
( LD50 유닛/ ng ) 		255 n/a 173 259 252 250
표 1에 표시된 바와 같이, 변형된 스캔츠 방법에서는 로트 #2에 관해서 로트 실패가 있었다. 전체 로트가 실패하여 0의 수율을 제공하였다. 또한, 로트 #3에 관해서 부분적인 로트 실패가 있었다. 실패는 염산 침전 단계에서 나타났지만, 일부의 생성물은 통상적으로 버려지는 상청액으로부터 구제되었다. 구제된 생성물을 편차(deviation) 단계로 재처리하였으며, 이는 로트 #1 대비 관찰된 감소 수율 (11 ㎎ 대비 4 ㎎) 및 로트 #1 대비 관찰된 감소 효능 (255 LD50 유닛/ng 대비 173 LD50 유닛/ng)을 설명했다.
본 발명의 방법에 의해서 사용된 로트에 관해서, 로트 #4는 칼럼의 고농도 염 세척을 수반하는 크로마토그래피 시스템 실패에 기인하여 예를 들어, 로트 #5와 비교하여 감소된 수율 (99 ㎎ 대비 43 ㎎)을 보였다. 이 실패에 의해서 독소의 일부분의 조기 용리가 있었으며, 관찰된 감소된 수율을 초래하였지만 더 큰 순도가 관찰되었다(95.3% 순도 대비 98.6% 순도).
로트 #6은 양이온 교환 칼럼이 제3 크로마토그래피 단계에서 사용된 것인 본 발명의 방법 및 시스템의 매우 바람직한 구체예의 결과를 나타낸다. 표 1에 표시된 바와 같이, 이 구체예는 예를 들어, 로트 #5와 비교하여 개선된 순도 (95.3% 순도 대비 100% 순도)를 제공하였으며, 한편 고수율 (99 ㎎ 대비 89 ㎎) 및 높은 효능 (252 LD50 유닛/ng 대비 250 LD50 유닛/ng)을 유지하였다.
또한, 표 1에 표시된 바와 같이, 정제의 총 길이는 본 발명의 바람직한 구체예에서 단축될 수 있다. 예를 들어, 통상적인 스캔츠 방법 후에 3 개의 추가의 크로마토그래피 단계를 수반한 변형된 스캔츠 방법을 사용하여 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 정제하는데 10일이 소요된 것에 비해서, 로트 #6은 단지 4일 만에 정제되었다.
전술된 결과는 본 명세서에 교시된 방법 및 시스템을 사용하여 높은 효능 및 순도로 고수율의 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 제조할 수 있음을 나타내며, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템이 예를 들어, 약제학적 조성물 내의 활성성분으로서 사용하는데 적합한 비-복합체화된 보툴리눔 독소의 대규모의 효율적인 정제에 사용될 수 있음을 시사한다.
본 명세서에서 인용된 특허출원 및 간행물을 포함한 모든 문헌들은, 마치 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 또는 특허출원이 모든 목적으로 전체가 참조에 의해 포함되는 것으로 구체적이며 개별적으로 표시된 된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해서 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 다수의 변형 및 변화는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기술된 특정의 구체예는 단지 예로서 제공되며, 본 발명은 단지 첨부된 특허청구범위의 등가물의 전체 범위와 함께, 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되는 것이다.

Claims (24)

  1. (i) 조(crude) 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 조 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 음이온 교환 칼럼 상에 적재시켜 음이온 교환 칼럼에 의한 상기 비-복합체화된 보툴리눔 독소의 포획을 수행하는 단계;
    (iii) 상기 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 음이온 교환 칼럼으로부터 용리시켜 상기 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 용리액을 수득하는 단계;
    (iv) 상기 음이온 교환 칼럼으로부터의 용리액을 양이온 교환 칼럼에 적재시켜 양이온 교환 칼럼에 의한 상기 비-복합체화된 보툴리눔 독소의 포획을 수행하는 단계; 및
    (v) 상기 양이온 교환 칼럼으로부터 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계를 포함하는, 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 정제하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조 비-복합체화된 보툴리눔 독소는,
    보툴리눔 독소 복합체를 포함하는 시료를 수득하는 단계;
    소수성 상호작용 칼럼에 상기 시료를 적재시켜 소수성 상호작용 칼럼에 의한 보툴리눔 독소 복합체의 포획을 수행하는 단계;
    상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼으로부터 상기 보툴리눔 독소 복합체를 용리시키는 단계; 및
    상기 보툴리눔 독소 복합체를 해리시켜 조 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계에 의해 수득되는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 시료는 보툴리눔 독소 복합체를 포함하는 상청액 또는 여액(filtrate)인 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 시료는,
    상기 보툴리눔 독소를 포함하는 발효 배양액을 산 침전에 적용하여 산 침전물을 수득하는 단계; 및
    상기 침전물에 대해서 접선 유동 여과(tangential flow filtration)를 수행하여 침전물을 농축시키는 단계에 의해 수득되는 것인 방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 시료는 발효 배양액의 불용성 분획을 접선 유동 여과에 적용하는 것에 의해 수득되는 것인 방법.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 시료는 상기 소수성 상호작용 칼럼 상에 적재하기 전에 뉴클레아제 분해에 적용되는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 뉴클레아제는 동물 생성물 불포함(animal product free) 공정으로부터 유래되는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 실질적으로 동물 생성물 불포함인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C1형, D형, F형, F형 및 G형 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 A형을 포함하는 것인 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소가 95% 이상의 순도를 갖는 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 정제된 비-복합체화된 보툴리눔 독소가 200 LD50　유닛/ng 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 발효 배양액의 L당 약 2 ㎎ 이상의 수율을 제공하는 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 음이온성 칼럼은 Q 세파로오스 HP, Q 세파로오스 고속 유동(Fast Flow), 및 Q XL 세파로오스 칼럼으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 양이온성 칼럼은 SP 세파로오스, SP 세파로오스 HP, SP 세파로오스 고속 유동, 모노 S, 소스(Source)-S, 소스-30S, 및 소스-15S 칼럼으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 음이온성 칼럼 상에 상기 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 적재시키기 위한 완충제는 트리스(Tris), 비스-트리스(bis-Tris), 트리에탄올아민, 및 N-메틸 디에탄올아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 완충제는 pH 7.4 내지 8.2에서 사용되는 것인 방법.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 양이온성 칼럼 상에 상기 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 적재시키기 위한 완충제는 나트륨 인산염, MES, 및 HEPES로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 완충제는 pH 6.0 내지 7.0에서 사용되는 것인 방법.
  19. 청구항 1에 있어서, 상기 음이온성 칼럼의 pH는 7.4 내지 8.2인 것인 방법.
  20. 청구항 1에 있어서, 상기 양이온성 칼럼의 pH는 6.0 내지 7.0인 것인 방법.
  21. 청구항 1에 있어서, 상기 음이온성 칼럼으로부터 상기 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 용리시키기 위한 구배는 염화나트륨의 상향 구배(ascending gradient) 및 염화칼륨의 상향 구배로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 구배는 7.4 내지 8.4의 pH에서 사용되는 것인 방법.
  23. 청구항 1에 있어서, 상기 양이온성 칼럼으로부터 상기 비-복합체화된 보툴리눔 독소를 용리시키기 위한 구배는 염화나트륨의 상향 구배 및 염화칼륨의 상향 구배로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 구배는 6.0 내지 7.0의 pH에서 사용되는 것인 방법.
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