CN107129531B

CN107129531B - 一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法

Info

Publication number: CN107129531B
Application number: CN201710242772.XA
Authority: CN
Inventors: 张晨光; 王宏伟; 陈磊; 汪铖; 孙金星; 孔祥林; 汪军
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2037-04-14
Also published as: CN107129531A

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法。具体而言，本发明优化了阳离子交换色谱分离纯化PEG‑G‑CSF，并进行适当的缓冲液置换制备PEG‑G‑CSF原液的方法，通过一步柱层析纯化并置换缓冲液即可获得HPLC、电泳纯度均在98％以上的PEG‑G‑CSF。本发明纯化工艺不仅简化了工艺路线，节省了生产时间，并且蛋白回收率高，获得的蛋白原液纯度高，加入适当的药用辅料即可制备成药物制剂，十分适合大规模工业化放大生产。

Description

一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法

技术领域

本发明涉及高纯度药用蛋白质溶液的纯化领域，具体涉及聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子(Peglylation recombinant human granulocyte colony stimulatingfactor，PEG-G-CSF)修饰产物的纯化，属于医药技术领域。

背景技术

近几年来，随着生物技术的突飞猛进，越来越多的蛋白和多肽类药物被发现并成功的应用于人类疾病的治疗。其中，重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant humangranulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)是一个非常成功的基因工程药物。G-CSF由单核细胞及成纤维细胞产生，可刺激粒细胞集落形成，对中性粒细胞有刺激作用，因此常用于接受放射治疗或化疗的癌症病人以及骨髓移植后白血病患者的辅助治疗，其序列是公知的，如序列1所示。1991年，Amgen公司的rhG-CSF获得FDA批准上市用于化疗引起的中性粒细胞减少症的治疗，但是，由于蛋白药物自身的特性，该药物在临床上的使用受到了很大的限制，比如较短的体内半衰期、容易受到体内的酶解作用从而被迅速清除出体外、容易产生免疫原和抗原、较低的溶解性等。为了解决这些问题，改善蛋白类药物在人体内的药代动力学，科学家做了很多方面的努力和尝试，目前最成功的技术是聚乙二醇化学修饰技术(Peglylation)。Amgen公司开发的Pegfilgrastin(商品名Neulasta)就是利用聚乙二醇修饰技术，对G-CSF进行了修饰，延长了其体内半衰期，提高生物利用度，从而取得了很好的临床效果，2002年1月和2002年8月，Amgen公司生产的Neulasta分别由美国的FDA和欧洲批准上市，为Amgen公司带来了巨大的经济效益。

PEG-G-CSF的纯化需要去除聚乙二醇修饰产物中的过量聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)、未交联的G-CSF、二交联甚至多交联的G-CSF，较常采用的分离方法为分子排阻色谱分离配合离子交换分离。虽然分子排阻色谱分离能够去除二交联及多交联的G-CSF，但是由于受上样体积的限制，该方法很难在工业化生产规模使用。因此迫切需要开发一种工艺路线简单、适合工业化放大生产，同时易于控制产品质量的PEG-G-CSF纯化工艺。

CN101172161A公开了一种聚乙二醇修饰的G-CSF偶联物，其具有天然人源G-CSF生理活性，而且具有比G-CSF更长的体内循环半衰期和更好的粒细胞刺激因子活性。

CN1663962A公开了采用SP Sepharose FF层析柱进行PEG-G-CSF纯化的工艺，该款层析介质平均粒径为90μm，具有流速快，易于放大的优点，但是分辨率较低，获得的PEG-G-CSF纯度低，而SP Sepharose HP作为高分辨率的层析介质平均粒径为34μm，我们曾将SPSepharose FF层析柱与本发明中的SP Sepharose HP层析柱用于PEG-G-CSF纯化的效果进行比较，SP Sepharose HP层析柱的纯化效果明显优于SP Sepharose FF层析柱。

CN102234310A公开了一种通过MacroCap SP阳离子层析柱进行聚乙二醇修饰蛋白分离纯化的方法，该方法应用于PEG-G-CSF的分离纯化，选择在pH4.0-5.0过柱，先以一个较低浓度的NaCl(5％～15％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液)洗脱多PEG修饰的G-CSF，再以20％-50％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液洗脱单修饰的目标峰，一步纯化蛋白纯度只能达到90％，即使再次进行MacroCap SP柱层析纯化，纯度也只能达到95％。

发明内容

本发明提供了一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，包括：将PEG-G-CSF修饰产物上样至阳离子交换层析柱进行层析纯化，先采用缓冲液进行杂质洗脱，再采用缓冲液A液与B液进行线性梯度洗脱，收集样品峰。

其中，所述阳离子交换层析柱的层析介质聚合物可以是交联葡聚糖Sephadex、琼脂糖Sepharose、纤维素Cellulose或聚苯乙烯Source，优选Sepharose HP。

所述的缓冲液包含1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH 4.5-5.5，优选20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH 5.0。所述的缓冲液A包含1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH为4.5-5.5，缓冲液B包含1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH为6.0-9.0，优选缓冲液A包含20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH 5.0，缓冲液B包含20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH 7.0。

PEG-G-CSF粗品上样于层析柱使用的线性流速可为10-100cm/h，优选为40-50cm/h。

上样于层析柱的PEG-G-CSF粗品蛋白量可为每1ml层析介质上样1-10mg蛋白，优选为每1ml层析介质上样2mg蛋白。

杂质洗脱使用的线性流速可以是10-100cm/h，优选为50-80cm/h；杂质洗脱液可以是3-5倍柱体积，优选为5倍柱体积。

线性梯度洗脱条件可以采用从0％B液到100％B液的线性梯度，梯度体积为10-30倍柱体积，优选15倍柱体积；洗脱使用的线性流速可为10-100cm/h，优选为60-80cm/h，更优选为70cm/h。

进一步地，本发明的纯化方法还可包括在上样前对PEG-G-CSF修饰产物进行缓冲液置换的步骤。

进一步地，本发明的纯化方法还可包括将收集得到的纯化样品进行缓冲液置换的步骤。

所述的缓冲液置换的方法可以是透析、脱盐柱层析、超滤中的一种或多种，所述超滤可以是中空纤维超滤或膜包超滤；如若采用超滤方式进行缓冲液置换，对于39KD的PEG-G-CSF，超滤膜孔径包括但不限于3KD-30KD，优选5KD或10KD，更优选为10KD；中空纤维超滤使用的中空纤维管内径包括但不限于0.5mm，0.75mm，1mm和1.75mm，更优选为1mm；如若采用GE Healthcare公司的中空纤维柱进行超滤缓冲液置换，剪切速率应控制在16000sec-¹以下，更优选为约8000sec^-1。

如若采用中空纤维超滤进行缓冲液置换，超滤条件可以是：①澄清反应液在超滤系统中适当浓缩；②采用恒体积置换，在超滤系统内保持样品体积恒定，使流加的洗滤液速度与透出液速度相同；③跨膜压力(TMP)不大于50PSI，更优选为20-30PSI；④共超滤置换样品体积的3倍以上，考虑到合理的工艺用时，更优选为5倍体积，即共流加洗滤液体积为置换起始样品体积的3倍以上，更优选为约5倍体积。

缓冲液置换所使用的缓冲液包含1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，pH3.0-6.0，优选为20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0；缓冲液温度控制在2-30℃，更优选为2-8℃。

在本发明提供的纯化方法中，阳离子交换层析柱在上样前已经过缓冲液平衡，平衡缓冲液可包含1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，pH3.0-6.0，优选为20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0；层析柱平衡液可为3-5倍柱体积，优选为5倍柱体积；层析柱平衡使用的线性流速为10-100cm/h，优选为60-80cm/h。

进一步地，本发明的纯化方法还可包括在对PEG-G-CSF修饰产物进行缓冲液置换前将修饰产物经过澄清过滤的步骤。所述澄清过滤可选用醋酸纤维素滤膜或聚偏氟乙烯(PVDF)材质的滤芯(如Millipore CVHL71TP3)作为介质，过滤孔径优选0.45μm。

本发明还提供了一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，包括：

(1)将PEG-G-CSF修饰产物经澄清过滤得澄清反应液；

(2)将澄清反应液经缓冲液置换，得PEG-G-CSF粗品；

(3)将PEG-G-CSF粗品上样于平衡好的层析柱；

(4)将PEG-G-CSF修饰产物上样至阳离子交换层析柱进行层析纯化，先采用缓冲液进行杂质洗脱，再采用缓冲液A液与B液进行线性梯度洗脱，收集样品峰；

(5)层析收样进行缓冲液置换，除菌过滤后得PEG-G-CSF原液，

其中，步骤(2)和(5)中缓冲液为1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，pH3.0-6.0，步骤(4)中缓冲液为1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH4.5-5.5，缓冲液A液为1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH4.5-5.5，缓冲液B液为1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH6.0-9.0，所述线性梯度洗脱的梯度体积为10-30倍柱体积，优选15倍柱体积。

更多地，本发明所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子中的聚乙二醇可采用分子量5-100KD的PEG，优选采用20KD的PEG。

更多地，本发明所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子可具有如式Ⅰ所示的结构

其中m选自50-2500的整数，优选自400-500的整数，G为Met-G-CSF。

本发明的有益效果包括：

(1)G-CSF蛋白液的PEG化修饰产物经过澄清过滤处理，可保护后续缓冲液置换装置(如超滤膜)及层析纯化步骤的离子交换层析介质，提高置换装置及层析介质使用寿命；

(2)柱层析纯化前进行缓冲液置换，降低样品电导率，保证目标蛋白PEG-G-CSF能够结合到离子交换层析柱；

(3)一步柱层析纯化即可获得SDS-PAGE、SEC-HPLC和RP-HPLC检测纯度均大于98％，比活性范围在(8.6±3.4)×10⁷IU/mg蛋白药液；

(4)工艺路线简单，并可实现线性放大；

(5)纯化周期短，工艺成本低；

(6)工艺易于控制，便于操作，重复性好；

(7)获得的蛋白原液具有可靠的安全性及良好的生活学活性，可直接用于制剂生产。

附图说明

图1：PEG-G-CSF原液的SDS-PAGE电泳纯度检测图谱，其中泳道1：供试品A(实施例一获得的PEG-G-CSF原液)，泳道2：供试品B(实施例二获得的PEG-G-CSF原液)，泳道3：供试品C(实施例三获得的PEG-G-CSF原液)，泳道4：分子量标准蛋白Mark 12。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。

实施例中所使用的PEG-G-CSF修饰产物是由CN101172161B中实施例一至三的方法制备获得的。

实施例一:

步骤1、PEG-G-CSF修饰产物缓冲液置换

PEG-G-CSF修饰产物经0.45μm滤芯(CVHL71TP3)澄清过滤，得澄清反应液；

20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0缓冲液平衡中空纤维柱UFP-10-E-55及中空纤维系统FlexStand；

将澄清反应液泵入FlexStand中空纤维系统储罐，启动系统，调节回流阀，控制跨膜压(TMP)在20-30PSI；

以20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0缓冲液为置换液，恒体积置换，使流加的置换液速度与透出液速度相同，在中空纤维系统储罐内保持样品体积恒定，置换液用量约为样品体积的5倍时置换结束；

从FlexStand中空纤维系统底阀处收集样品，得PEG-G-CSF粗品。

步骤2、PEG-G-CSF粗品的SP Sepharose HP柱层析纯化

以20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0缓冲液平衡SP Sepharose HP层析柱，流速60cm/h，平衡5倍柱体积，至紫外及电导均稳定；

以40cm/h的流速将PEG-G-CSF粗品上样；

上样完成后，用20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH5.0的缓冲液冲洗层析柱5倍柱体积，流速70cm/h；

以20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH5.0溶液为A液，以20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH7.0溶液为B液，采用从0％到100％B液的线性梯度洗脱样品，流速70cm/h，梯度体积为15倍柱体积，收集目标蛋白峰。

步骤3、纯化样品缓冲液置换

用20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0缓冲液平衡Pellicon 2膜包及Cogent M1超滤系统；

将SP Sepharose HP层析收样泵入超滤系统储罐，启动系统，调节回流阀，控制跨膜压(TMP)在20-30PSI；

从超滤系统底阀处收集样品，除菌过滤后得PEG-G-CSF原液。

实施例二:

步骤1、PEG-G-CSF修饰产物缓冲液置换

同实施例一：步骤1

步骤2、PEG-G-CSF粗品的SP Sepharose HP柱层析纯化

以40cm/h的流速将PEG-G-CSF粗品上样；

上样完成后，用20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH4.5的缓冲液冲洗层析柱5倍柱体积，流速70cm/h；

以20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH4.5溶液为A液，以20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH8.0溶液为B液，采用从0％到100％B液的线性梯度洗脱样品，流速70cm/h，梯度体积为20倍柱体积，收集目标蛋白峰。

步骤3、纯化样品缓冲液置换

同实施例一：步骤3

实施例三:

步骤1、PEG-G-CSF修饰产物缓冲液置换

同实施例一：步骤1

步骤2、PEG-G-CSF粗品的SP Sepharose HP柱层析纯化

按照CN101172161B实施例三中的纯化条件操作，先用0.5M NaOH溶液洗5倍体积，再用纯化水洗至中性，再以20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0缓冲液平衡SP Sepharose HP层析柱，流速120cm/h，平衡5倍柱体积，至紫外及电导均稳定；

以120cm/h的流速将PEG-G-CSF粗品上样；

上样完成后，用20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0的缓冲液冲洗层析柱10倍柱体积，流速120cm/h；

以20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0溶液为A液，以20mmol/L乙酸-乙酸钠，1mol/LNaCl，pH4.0溶液为B液，采用从0％到50％B液的线性梯度洗脱，流速120cm/h，梯度体积为8倍柱体积，将杂质、产物以及未反应的蛋白依次洗脱，收集目标蛋白峰。

步骤3、纯化样品缓冲液置换

同实施例一：步骤3

实施例四：PEG-G-CSF原液的纯度分析及体外生物活性测定

取实施例一、实施例二、实施例三获得的PEG-G-CSF原液作为供试品A、B、C，分别用SDS-PAGE、RP-HPLC、SEC-HPLC法对供试品进行纯度分析及活性测定，检测方法及结果如下：

1、SDS-PAGE法检测PEG-G-CSF原液纯度

采用4-12％Bis-Tris的胶，上样量为10μg，150V恒压电泳至溴酚蓝迁移胶底处，考马斯亮蓝快速染色法染色，凝胶成像仪进行纯度分析。

2、RP-HPLC法检测PEG-G-CSF原液纯度

色谱柱：Symmetry ShieldTM RP18，3.5μm，100mm×4.6mm

A相：三氟乙酸－水溶液(取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀超声脱气20min)

B相：三氟乙酸－乙腈溶液(取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，超声脱气20min)

室温条件下，按下表进行梯度洗脱。上样量不低于10μg，检测长220nm。

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	100	0
15	30	70
			25	30	70
26	100	0
			40	100	0

3、SEC-HPLC法检测PEG-G-CSF原液纯度

色谱柱：Phenomenex SEC 2000

流动相：0.1mol/L磷酸氢二钾0.1mol/L氯化钠水溶液(pH4.0)

上样量均为20μl，检测波长214nm，流速0.5ml/min，柱温40℃。

4、PEG-G-CSF原液的生物学活性测定

以重组人粒细胞集落刺激因子活性测定国家标准品为活性标准品，用NFS-60细胞/MTT比色法测定PEG-G-CSF原液的生物学活性，并根据样品蛋白浓度计算原液比活性。

5、测定结果

采用实施例一、实施例二、实施例三所述的方法进行聚乙二醇重组人粒细胞刺激因子的分离纯化，制备PEG-G-CSF原液(分别为供试品A、B、C)，测定纯度及比活性，对比结果如下表。

可见，采用本发明所述的聚乙二醇重组人粒细胞刺激因子的分离纯化方法获得的蛋白纯度可达到98％以上，可直接用于制剂生产，纯化周期短，工艺成本低；而按照CN101172161B方法纯化得到的产品纯度较低，无法达到制剂生产的要求，需反复进行纯化才能获得纯度合格产品，纯化周期长，工艺成本高，不利于工业放大。

虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，但是这并非用以限制本发明的内容，本发明的保护范围以申请专利的实际权利要求范围为准。

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司

<120> 一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 175

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu

1 5 10 15

Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu

20 25 30

Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu

35 40 45

Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser

50 55 60

Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His

65 70 75 80

Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile

85 90 95

Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala

100 105 110

Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala

115 120 125

Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala

130 135 140

Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser

145 150 155 160

Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

165 170 175

Claims

1.一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，包括：

将PEG-G-CSF修饰产物上样至Sepharose HP阳离子交换层析柱进行层析纯化，先采用缓冲液进行杂质洗脱，再采用缓冲液A液与B液进行线性梯度洗脱，收集样品峰，其中，所述杂质洗脱的缓冲液包含1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH为4.5-5.5，所述的缓冲液A包含1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH 4.5-5.5，缓冲液B液包含1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH 6.0-9.0，所述PEG-G-CSF修饰产物的结构如式Ⅰ所示，

其中m选自50-2500的整数，G为Met-G-CSF。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述的杂质洗脱的缓冲液包含20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH为5.0。

3.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述的缓冲液A液包含20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH 5.0，缓冲液B液包含20mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH 7.0。

4.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于所述线性梯度洗脱的梯度体积为10-30倍柱体积。

5.根据权利要求4所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于所述线性梯度洗脱的梯度体积为15倍柱体积。

6.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于所述杂质洗脱的梯度体积为3-5倍柱体积。

7.根据权利要求6所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于所述杂质洗脱的梯度体积为5倍柱体积。

8.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，还包括在上样前对PEG-G-CSF修饰产物进行缓冲液置换的步骤。

9.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，还包括将收集得到的纯化样品进行缓冲液置换的步骤。

10.根据权利要求8所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液置换的方法选自透析、脱盐柱层析、超滤中的一种或多种。

11.根据权利要求10所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述超滤选自中空纤维超滤或膜包超滤。

12.根据权利要求11所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述中空纤维超滤的超滤膜孔径为3KD-30KD。

13.根据权利要求12所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述中空纤维超滤的超滤膜孔径为5KD或10KD。

14.根据权利要求12所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述中空纤维超滤的超滤膜孔径为10KD。

15.根据权利要求8所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液置换使用的缓冲液包含1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，pH3.0-6.0。

16.根据权利要求15所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液置换使用的缓冲液包含20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0。

17.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析柱在上样前经缓冲液平衡，平衡缓冲液为1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，pH3.0-6.0。

18.根据权利要求17所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，平衡缓冲液为20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0。

19.根据权利要求8所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，还包括在对PEG-G-CSF修饰产物进行缓冲液置换前将修饰产物经过澄清过滤的步骤。

20.根据权利要求19所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述澄清过滤采用醋酸纤维素滤膜或聚偏氟乙烯材质的滤芯。

21.根据权利要求20所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述澄清过滤孔径为0.45μm。

22.一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，包括：

1)将PEG-G-CSF修饰产物经澄清过滤得澄清反应液；

2)将澄清反应液经缓冲液置换，得PEG-G-CSF粗品；

3)将PEG-G-CSF粗品上样于平衡好的层析柱；

4)将PEG-G-CSF修饰产物上样至阳离子交换层析柱进行层析纯化，先采用缓冲液进行杂质洗脱，再采用缓冲液A液与B液进行线性梯度洗脱，收集样品峰；

5)层析收样进行缓冲液置换，除菌过滤后得PEG-G-CSF原液，

其中，步骤2)和5)中缓冲液为1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，pH3.0-6.0，步骤4)中缓冲液为1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH 4.5-5.5，缓冲液A液为1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH 4.5-5.5，缓冲液B液为1-100mmol/L磷酸氢二钠–柠檬酸，pH 6.0-9.0，所述线性梯度洗脱的梯度体积为10-30倍柱体积，其中所述PEG-G-CSF修饰产物的结构如式Ⅰ所示，

其中m选自50-2500的整数，G为Met-G-CSF。

23.根据权利要求22所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述线性梯度洗脱的梯度体积为15倍柱体积。

24.根据权利要求1-23任一项权利要求所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述PEG-G-CSF修饰产物中PEG的分子量为5-100KD。

25.根据权利要求24所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述PEG-G-CSF修饰产物中PEG的分子量为20KD。

26.根据权利要求1-23任一项权利要求所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，m选自400-500的整数。