CN102234310A - 一种聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法。本发明发现一种新型阳离子层析介质MacroCap SP能够灵敏的感应蛋白质表面电荷的分布关系，蛋白质表面正电荷越多，则与MacroCap SP结合能力越强，被洗脱所需要的离子梯度也越高。利用该性质可有效分离聚乙二醇修饰蛋白分子，所述方法包括如下步骤：(1)目标蛋白经过带有活性反应基团聚乙二醇修饰后，调节反应液的pH值低于聚乙二醇修饰蛋白的等电点；(2)将反应液上样于已平衡好的MacroCap SP阳离子交换柱；(3)在平衡缓冲液基础上加入钠盐溶液进行离子梯度洗脱，收集目标峰。本发明的方法适合聚乙二醇修饰的重组人粒细胞刺激因子和艾塞那肽的有效分离。

Description

一种聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及蛋白的分离纯化方法，更具体地说，涉及了一种聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法。

发明背景

大多数的蛋白药物只能采用皮下注射或静脉注射等方式给药，这类蛋白药物因蛋白酶的作用和肾小球的滤过，在人体内的半衰期比较短，体内清除率高，往往只有几分钟至几小时的半衰期，造成给药频繁，给患者造成诸多困难和不便。此外，其稳定性等也是影响其在体内发挥其功效的因素。因此，如何消除或降低此类蛋白类药物的抗原性、延长其体内半衰期及增加稳定性是生物制药领域的一个热门课题。

聚乙二醇(PEG)化学修饰是延长蛋白类药物半衰期的一个有效途径。聚乙二醇(简称PEG)是一种惰性、两亲、不带电荷的柔性长链高分子聚合物，化学式为HO(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂OOH，n为聚合单元的个数。PEG分子量随n的增加可由1kDa增至50kDa，有线性和分支两种构型，已经作为多种药物的安全载体用于临床应用。PEG通过共价键与蛋白质连接，可与蛋白质分子中的氨基(位于N末端的氨基或赖氨酸残基)或者巯基(位于半胱氨酸)反应对蛋白质分子进行修饰。该修饰可以有效地改变蛋白类药物在体内的分布和药物学特性，延长蛋白质药物的血药浓度，同时还可降低免疫原性。目前已经有多种聚乙二醇药物应用于临床，如聚乙二醇单修饰重组人干扰素α2a(PEG-IFNα2a)(Bailon P等，Bioconjugate Chem.，12：195-202(2001))、聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)(Harris JM等，Clin Pharmacokinet，40：539-551(2001))等。迄今已有6个采用该项技术的蛋白药物获得美国FDA批准进入市场，更有30多个PEG修饰的蛋白药物处于不同的临床研究阶段。

目前国外已批准上市的PEG化产品

目前聚乙二醇修饰蛋白较常采用的分离方法为分子排他色谱分离、离子交换树脂分离等，但存在一些问题。当聚乙二醇连接到蛋白质分子上后，由于聚乙二醇分子是中性的，而且一般分子量都较大，容易把蛋白质分子包裹在内，从而降低蛋白质分子的表面电荷分布，并且随修饰程度的不同，蛋白质表面电荷发生改变的程度不同。而且由于蛋白质存在多个修饰位点，由于反应条件的不同，修饰后的反应液里可能由多种混合物组成，如单位点修饰产物，多位点修饰产物，未参与反应的蛋白质和聚乙二醇分子等。上述的PEG化过程对蛋白的影响(分子量变大和低电荷分布)这就给后续的分离纯化工艺带来了困难，例如由于蛋白表面电荷的降低将影响其与离子交换树脂的结合能力，从而降低树脂的纯化效率和容量，对树脂的清洗和再生也带来麻烦，若清洗不充分可能带来污染，甚至影响树脂的使用寿命。因此，有必要发展一种更高效、更经济的聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种更高效、更经济的聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法。

本发明经过多次摸索，意外的发现一种新型阳离子层析介质MacroCap SP(GE Healthcare公司开发)，利用该介质可有效分离聚乙二醇修饰蛋白分子。阳离子层析介质MacroCap SP能够灵敏的感应蛋白质表面电荷的分布关系，蛋白质表面正电荷越多，则其与MacroCap SP结合能力越强，被洗脱所需要的离子梯度也越高。

现有技术已经表明，经过聚乙二醇修饰后，蛋白质表面电荷发生改变，并且随修饰程度的不同，蛋白质表面电荷发生改变的程度不同，利用这种变化可通过MacroCap SP阳离子层析介质实现有效分离。发明人经过多次实验研究发现，通过控制缓冲液体系的pH条件和离子洗脱梯度，能够实现将反应体系中的单位点修饰产物、多位点修饰产物、未参与反应的蛋白质和聚乙二醇分子有效分离。

因此，本发明提供了一种聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法，其包括如下步骤：

(1)、目标蛋白经过带有活性反应基团聚乙二醇修饰后，调节反应液的pH值至酸性，且pH值应低于聚乙二醇修饰蛋白的等电点；

(2)、将反应液上样于已平衡好的MacroCap SP阳离子交换柱；

(3)、在平衡缓冲液基础上加入钠盐溶液进行离子梯度洗脱，收集目标峰。

聚乙二醇(PEG)分子必须通过一个活化基团活化，才能与蛋白质表面的反应基团反应，以共价键形式连接到蛋白质分子上。目前国内外文献已经报道了相当多的利用聚乙二醇分子对蛋白质分子进行修饰的方法，如聚乙二醇修饰酶、酶抑制剂、抗原、抗体、抗体Fab片段、激素、凝血因子、细胞因子、干扰素、生长因子等等。具体地，可采用聚乙二醇修饰的蛋白质包括腺苷脱氨酶(ademase)，天冬酰胺酶(aspargase)，干扰素α2a(interferonα2a)，干扰素α2b(interferon α2b)，重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF，filgrastim)，生长激素(growth hormone)，抗白介-8Fab片段(Anti-interleukin-8F(ab)2)，抗肿瘤scFv片段(Anti-tumour scFv fragment)，精氨酸酶(Asparaginase)，降钙素(Calcitonin)，木瓜凝乳蛋白酶(Chymopapain)，内皮生长因子(Epidermal growth factor)，Gelonin，血红蛋白(Hemoglobin)，Immunoadhesin，免疫球蛋白抗原结合区(Immunoglobulin antigen binding domains)，免疫球蛋白(Immunoglobulins)，胰岛素(Insulin)，白介素2(interleukin-2)，α-乳球蛋白(α-lactoglobulin)，β-乳白蛋白(β-lactalbumin)，溶菌酶(Lysozyme)，Methioninase，Myelopoietin，甲状腺素(Parathyroid hormone)，核糖核酸酶A(Ribonuclease A)，葡激酶(Staphylokinase)，Staphylkinase，天花粉蛋白(Trichosanthin)，肿瘤坏死因子α(Tumour necrosis factorα)，肿瘤坏死因子1型(Tumour necrosis factor type 1)或尿酸酶(Uricase)等，具体修饰方法可参考Conan J.Fee等的论文(PEG-proteins：Reaction engineeringand separation issues，Chemical Engineering Science，2006，61：924-939)及其所列参考文献，该论文的全部内容在此引入作为参考。有关聚乙二醇分子的选择可参考该论文，另外也可参考Steven M等的论文(Modification ofCD4 Immunoadhesin with Monomethoxypoly(ethylene glycol)aldehyde viaReductive Alkylation，Bioconjugate.Chem，1994，5：133-140)和姜忠义等(蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化化学，《有机化学》2003年第23卷12期：1340-1347)。所述的聚乙二醇分子包括但不局限于：PEG琥珀酰亚胺碳酸酯，PEG对硝基苯碳酸酯，PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯，PEG碳酰咪唑，PEG苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG)，PEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯，甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidyl carbonate，mPE6-SC)，甲氧聚乙二醇醛如甲氧聚乙二醇丙醛(mPE6-propinaldehyde，mPEG-ALD)、甲氧聚乙二醇丁醛、聚乙二醇巯基等。这些活性聚乙二醇形状可以是单链或者分支状；可以是任意大小的PEG，其中优选分子量在5kDa到40kDa之间的线性或分枝PEGs。优选的聚乙二醇分子为甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯或甲氧聚乙二醇丙醛，为分子量在5kDa到20kDa之间的线性分子。

当PEG和目标蛋白修饰反应完成后，调节反应液的pH值至酸性。pH值优选应低于聚乙二醇修饰蛋白的等电点，一个优选的pH范围为4.0-6.0。

阳离子层析介质MacroCap SP层析柱可先经平衡缓冲液平衡。适用于本发明的平衡缓冲液为能够维持水溶液状态下pH值为酸性的任何一种缓冲液，可任选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸钠缓冲液、巴比妥钠缓冲液或柠檬酸缓冲液，浓度为5-100mmol/L，缓冲液的pH范围在3.0-7.0；优选浓度为10-30mmol/L，pH为4.0-6.0；更优选10-30mmol/L、pH范围为4.0-6.0的醋酸钠缓冲液。

待PEG修饰蛋白吸附在MacroCap SP层析柱上后，可采用离子梯度洗脱将PEG修饰蛋白从介质上洗脱下来。常用的离子梯度洗脱溶液为在上述平衡缓冲液(以A液表示)的基础上加入一定比例的钠盐溶液(以B液表示)，离子梯度洗脱溶液通常以钠盐的比例表示，例如90％的A液+10％的B液通常以10％的B液表示(以下同)。钠盐溶液可选用氯化钠、醋酸钠或硫酸钠等，常用的离子梯度洗脱条件为平衡缓冲液的基础上，先以5％～15％的0.5-1.5mol/L钠盐溶液洗脱多个PEG修饰的目标蛋白，再以20％～50％的0.5-1.5mol/L钠盐溶液洗脱单修饰的目标峰。优选的钠盐溶液为氯化钠溶液。

优选的离子梯度洗脱条件为在10-30mmol/L、pH范围为4.0-6.0的醋酸钠缓冲液基础上加入氯化钠溶液，即先以一个较低浓度的氯化钠溶液(5％～15％的0.5-1.5mol/L氯化钠溶液)洗脱多个PEG修饰的目标蛋白，再以20％～50％的0.5-1.5mol/L氯化钠溶液洗脱单修饰的目标峰。

本发明的一个优选用途是用于聚乙二醇修饰的重组人粒细胞刺激因子(PEG-rhG-CSF)的分离纯化。该药品最先由美国Amgen公司开发和销售，商品名为Neulasta，于2002年1月获得美国FDA的批准，适用于减少感染的发生率，如非髓性恶性肿瘤患者接受抗癌药物治疗后的中性粒细胞减少症。聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的生产工艺主要是参照Amgen公司的Kinstler OB等人发表的文献(Kinstler OB et al.，Pharmaceutical Research，Volume：13 Issue：7 Pages：996JUL 1996)和其申请的美国专利5824784。修饰后的反应液里由多种混合物组成，除了PEG-rhG-CSF，还有未修饰的聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)、rhG-CSF、多个PEG修饰的rhG-CSF和NaCNBH₃。为了分离纯化得到PEG-rhG-CSF，需要进行多次离子交换树脂柱纯化，分离效率较低。

而本发明采用MacroCap SP介质一次即可实现PEG-rhG-CSF的有效分离，纯度达到90％以上，仅含有少量的多个PEG修饰的rhG-CSF。聚乙二醇重组人粒细胞刺激因子的等电点在5.5～6.5之间，考虑到修饰反应的影响，因此选择在pH 4.0-5.0过MacroCap SP阳离子交换柱后，先以一个较低浓度的NaCl(5％～15％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液)洗脱多个PEG修饰的rhG-CSF，再以20％～50％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液洗脱单修饰的目标峰，蛋白纯度在90％以上。

因此，本发明提供了一种有效分离聚乙二醇修饰的重组人粒细胞刺激因子(PEG-rhG-CSF)的方法，包括如下步骤：

(1)、rhG-CSF经聚乙二醇丙醛修饰后，调节反应液的pH值至4.0-5.0；

(2)、将反应液上样于经10-30mmol/L、pH为4.0-5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡好的MacroCap SP阳离子交换柱；

(3)、在上述醋酸-醋酸钠缓冲液加入氯化钠溶液进行离子梯度洗脱，先以5％～15％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液洗脱杂蛋白，再以20％～50％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液洗脱，收集单修饰的目标峰。

为了进一步提高纯度，还可再次进行MacroCap SP介质分离，纯度可达到95％以上。

本发明的再一个优选用途是用于聚乙二醇修饰艾塞那肽(exenatide)分子的分离纯化。艾塞那肽是一种39个氨基酸的多肽，其氨基酸序列与类胰高血糖素(glucagon-like peptide-1，GLP-1)有约53％的同源性(Goke等，J.Biol.Chem.，26g：19650-55，1993)。Exendin-4可参照中国专利00806548.9公开的方法制备，其氨基酸序列结构如下：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-GIy-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser

艾塞那肽可以和人类GLP-l受体结合并且激活该受体，从而促进胰岛素的合成和分泌。在体内实验中，艾塞那肽能通过多种作用机制改善禁食和餐后的血糖浓度，适合用于2型糖尿病患者的长期治疗。但是艾塞那肽半衰期很短，需要每天注射两次，因此可以通过聚乙二醇修饰技术延长其半衰期。

因此，一方面，本发明提供了一种单聚乙二醇化修饰的艾塞那肽(PEG-exenatide)及其制备方法。该方法包括如下步骤：(1)酸性条件下，聚乙二醇丙醛与艾塞那肽N-末端组氨酸上的氨基反应得到比较均一的单聚乙二醇化修饰的艾塞那肽；(2)任选的从反应混合物中分离得到单聚乙二醇化修饰的艾塞那肽。较合适的修饰反应条件是艾塞那肽浓度大于1毫克/毫升，优选3-6毫克/毫升；蛋白质∶聚乙二醇丙醛的比例在1∶1-1∶20之间，优选1∶3-1∶5之间。pH条件为酸性，更优选为pH4.0-4.8。聚乙二醇丙醛为分子量在5kDa到40kDa之间的线性分子，优选分子量在5kDa到20kDa之间。

在酸性条件下(优选pH4.0-4.8)，由于赖氨酸残基上ε-氨基和N-末端α-氨基的pKa差异，在反应溶液中未质子化的N-末端α-氨基的分子数相对要比赖氨酸残基上ε-氨基多，因而带有未共用电子对的N-末端α-氨基更容易对聚乙二醇丙醛的羰基发生亲核进攻，通过西佛碱的形成聚乙二醇丙醛可以偶联到α-氨基上，在还原剂如氰基硼酸钠的催化下形成稳定的胺键。

经修饰反应后获得的为含有PEG-exenatide的混合物，其中还可能含有多位点修饰产物、未反应的活性PEG分子和艾塞那肽等。需要通过合适的分离纯化方法，例如通过MacroCap SP阳离子交换层析来纯化上述混合物体系，最终获得的制品含有至少90％以上的PEG-exenatide和至多10％的未发作聚乙二醇化的exenatide，优选制品含有至少95％以上的PEG-exenatide和至多5％的未发生聚乙二醇化的exenatide，更优选制品含有至少99％以上的PEG-exenatide和至多1％的未发生聚乙二醇化的exenatide。

因此，本发明还提供了一种有效分离单聚乙二醇化修饰的艾塞那肽(PEG-exenatide)的方法，包括如下步骤：

(1)、艾塞那肽经聚乙二醇丙醛修饰后，调节反应液的pH值至4.0-4.8；

(2)、将反应液上样于经10-30mmol/L、pH为4.0-4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡好的MacroCap SP阳离子交换柱；

(3)、在上述醋酸-醋酸钠缓冲液加入氯化钠溶液进行离子梯度洗脱，先以10％～15％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液洗脱杂蛋白，再以25％～50％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液洗脱，收集单修饰的目标峰。

本领域的技术人员可以理解，在本发明实施例的基础上，本发明提供的方法和条件经适当调整即可有效应用于各种聚乙二醇修饰的蛋白分子的分离纯化，例如Conan J.Fee等的论文(PEG-proteins：Reaction engineering andseparation issues，Chemical Engineering Science，2006，61：924-939)及其所列参考文献列举的各种聚乙二醇修饰的蛋白质。

以下实施例为对本发明进行进一步的详细阐述，但并不意味着作为一种限制。

附图说明

图1为聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子MacroCap SP线性梯度洗脱层析图，其中M1、M3为杂质峰，M2为单修饰的目标峰。

图2为聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子MacroCap SP线性梯度洗脱电泳图，其中泳道1为M2，泳道2为M3，泳道3为修饰混合物，泳道4为Marker(从上到下分子量依次为97.4K、66.2K、43K、31K、20K和14.4K)，泳道5为M1。

图3为聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子MacroCap SP再次纯化电泳图，胶浓度15％，左边为marker(从上到下分子量依次为97.4K、66.2K、43K、31K、20K和14.4K)，右边为再次纯化后样品峰。

图4为BHK-GLP1R经不同浓度exendin4和peg-exendin4刺激后，cAMP含量变化

具体实施方式

实施例1聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的分离纯化

1.1、重组人粒细胞刺激因子的聚乙二醇化修饰

修饰工艺参考中国专利95191454.5。取一管含140mg，分子量为20KDa的mPEG-ALD(7.09μmol)，加入20mg浓度为5mg/ml，缓冲液为0.1M乙酸钠，pH5.0，预冷到4℃的rhG-CSF溶液(1.06μmol)。在mPEG-ALD溶解后，加入0.082ml浓度为1M的氰基硼氰化钠，4℃搅拌反应16h。反应完成后，反应液先用1mM HCl稀释到50ml，蛋白质浓度为0.5mg/ml，再用1MHCl调节反应液pH到4.0。

1.2、MacroCap SP离子交换柱层析

纯化采用MacroCap SP阳离子交换柱层析。聚乙二醇重组人粒细胞刺激因子的等电点在5.5～6.5之间，考虑到修饰反应的影响，因此选择在pH 4.0过MacroCap SP阳离子交换柱。先用pH4.0、20mmol/L的NaAc平衡缓冲液平衡层析柱，将100ml修饰反应样品用1mol/L的盐酸调节pH到4.0后，再用注射用水对倍稀释后上样。采用20倍柱床体积的线性梯度洗脱目标蛋白，先以一个较低浓度的NaCl(7％的0.5mol/L NaCl溶液)洗脱多个PEG修饰的rhG-CSF，再洗脱单修饰的目标峰(25％的0.5mol/L NaCl溶液)。从层析图1可以看到，主峰出峰前形成肩峰，收集肩峰(见层析图：M1)和主峰(见层析图：M2)，随着线性梯度的增加，主峰后还洗脱出一个峰(见层析图：M3)，送电泳检测。

由层析图谱和电泳结果可以看出，上样样品中(泳道3)包括聚体、PEG-rhG-CSF和rhG-CSF，其中聚体(多修饰杂质)在离子交换柱出峰在目标蛋白之前(泳道5，M1峰)，rhG-CSF(未修饰的杂质)在目标蛋白之后(泳道2，M3峰)，PEG-rhG-CSF目标峰在中间出峰(泳道1，M2峰)。因此MacroCapSP为理想的分离介质，由图可看出一步纯化即可达到90％以上的纯度。

实施例2聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的分离纯化

洗脱条件为先以15％的0.5mol/L NaCl溶液洗脱多个PEG修饰的rhG-CSF，再以30％的0.5mol/L NaCl溶液洗脱单修饰的目标峰，其他条件基本与实施例1相似，电泳结果标明纯化后的目标峰得到90％以上。

实施例3实施例1纯化样品的的进一步分离纯化

具体实验过程与初次纯化过程相似。洗脱条件为先以10％的0.5mol/LNaCl溶液洗脱杂蛋白，再以35％的0.5mol/L NaCl溶液洗脱单修饰的目标峰，电泳结果标明纯化后的目标峰得到95％以上(图3)。

实施例4 MacroCap SP离子交换层析分离纯化PEG-exendin-4

4.1、PEG-Exendin-4结合物的制备

2～8℃冰箱中贮存的Exendin-4溶液中加入1M乙酸钠(pH5.0～pH6.0)缓冲液及注射用水使Exendin-4浓度为2.5～5mg/ml，乙酸钠的终浓度为0.1M，加入2.5～5倍摩尔比的mPEG-ALD，在mPEG-ALD溶解后，加入终浓度为10～20mM NaCNBH3，反应16～24h。修饰后的样品经SEC-HPLC分析修饰率应不低于70％。

4.2、MacroCap SP离子交换层析分离纯化PEG-exendin-4

选用MacroCap SP离子交换层析介质，用平衡缓冲液(20mmol/L NaAc，pH4.0)平衡层析柱。将100ml修饰反应样品用纯化水稀释3倍，再用1mol/L的盐酸调节pH到4.0后上样。采用20倍柱床体积的线性梯度，先以10％-15％的0.5mol/LNaCl洗脱杂蛋白，在30～50％梯度处洗脱出PEG-exendin-4目标峰。

4.3、PEG-exendin-4结合物生物学活性的测定

由于转染了GLP-1R基因的BHK细胞能接受GLP-1类多肽的信号刺激，从而通过胞内G蛋白产生第二信使，使cAMP含量大大升高。所以测定稳定转染的BHK-GLP1R细胞内的cAMP含量，可以测定GLP-1类似物Exendin-4的活性。操作步骤如下：①将BHK-GLP1R细胞传至24孔板中，培养液中不含G418，生长至70～80％汇合；②加样前细胞培养液中加入IBMX，终浓度为100μM/L，37℃、培养10min；③加样：Exendin-4(或GLP-1)用PBS溶解，稀释至不同浓度(1000nM，100nM，10nM，1nM，0.1nM)，然后加入各孔中，继续在37℃孵育30min；④吸尽培养液，加100μl 0.1N HCl至含细胞的24孔板中，室温放置20min；⑤将细胞吹打或刮下来，离心(1000×g，10min)；⑥将上清转移至一干净EP管中，可直接用于测活。

整个cAMP含量测定操作步骤主要参照R&D公司ELISA Kit说明书进行。加样前对所有标准品和样品进行了乙酰化，主要是提高检测的灵敏度。所有数据经Origin6.1软件进行4-PL曲线拟合。结果如下图所示。Exendin4浓度达到10nM以上时cAMP含量达到平台期。

从图4中可以看出同摩尔比的PEG-exendin4是exendin4活性的10％，这和文献上所讲的蛋白质和多肽经过peg修饰以后，其体外生物学活性下降是一致的，但这不代表体内生物学活性的下降。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)、目标蛋白经过带有活性反应基团聚乙二醇修饰后，调节反应液的pH值至酸性，且pH值应低于聚乙二醇修饰蛋白的等电点；

(2)、将反应液上样于已经缓冲液平衡好的MacroCap SP阳离子交换柱；

(3)、在平衡缓冲液基础上加入钠盐溶液进行离子梯度洗脱，收集目标峰。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的目标蛋白为酶、酶抑制剂、抗原、抗体、抗体Fab片段、激素、凝血因子、细胞因子、干扰素或生长因子等。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的目标蛋白为腺苷脱氨酶，天冬酰胺酶，干扰素α2a，干扰素α2b，重组人粒细胞集落刺激因子，生长激素，抗白介-8Fab片段，抗肿瘤scFv片段，精氨酸酶，降钙素，木瓜凝乳蛋白酶，内皮生长因子，Gelonin，血红蛋白，Immunoadhesin，免疫球蛋白抗原结合区，免疫球蛋白，胰岛素，白介素2，α-乳球蛋白，β-乳白蛋白，溶菌酶，Methioninase，Myelopoietin，甲状腺素，核糖核酸酶A，葡激酶，Staphylkinase，天花粉蛋白，肿瘤坏死因子α，肿瘤坏死因子1型或尿酸酶等。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中聚乙二醇为PEG琥珀酰亚胺碳酸酯，PEG对硝基苯碳酸酯，PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯，PEG碳酰咪唑，PEG苯并三唑碳酸酯，PEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯，甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯，甲氧聚乙二醇醛，甲氧聚乙二醇丙醛，甲氧聚乙二醇丁醛或聚乙二醇巯基等。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸钠缓冲液、巴比妥钠缓冲液或柠檬酸缓冲液，浓度为5-100mmol/L，缓冲液的pH范围在3.0-7.0。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的钠盐溶液可选自氯化钠、醋酸钠或硫酸钠等。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的离子梯度洗脱条件为在平衡缓冲液的基础上，先以5％～15％的0.5-1.5mol/L钠盐溶液洗脱多个PEG修饰的目标蛋白，再以20％～50％的0.5-1.5mol/L钠盐溶液洗脱单修饰的目标峰。

8.一种聚乙二醇修饰的重组人粒细胞刺激因子的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)、rhG-CSF经聚乙二醇丙醛修饰后，调节反应液的pH值至4.0-5.0；

(2)、将反应液上样于经10-30mmol/L、pH为4.0-5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡好的MacroCap SP阳离子交换柱；

(3)、在上述醋酸-醋酸钠缓冲液加入氯化钠溶液进行离子梯度洗脱，先以5％～15％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液洗脱杂蛋白，再以20％～50％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液洗脱，收集单修饰的目标峰。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，可将收集的单修饰的目标峰再次进行MacroCap SP介质分离。

10.一种单聚乙二醇化修饰的艾塞那肽(PEG-exenatide)的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)、艾塞那肽经聚乙二醇丙醛修饰后，调节反应液的pH值至4.0-4.8；

(2)、将反应液上样于经10-30mmol/L、pH为4.0-4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡好的MacroCap SP阳离子交换柱；

(3)、在上述醋酸-醋酸钠缓冲液加入氯化钠溶液进行离子梯度洗脱，先以10％～15％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液洗脱杂蛋白，再以25％～50％的0.5-1.5mol/L NaCl溶液洗脱，收集单修饰的目标峰。

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