CN103193878A - 突变hFGF-21蛋白成熟肽及其与聚乙二醇的交联物以及它们的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种突变hFGF-21蛋白成熟肽及其编码基因和应用，以及聚乙二醇修饰的突变hFGF-21蛋白成熟肽及其应用。本发明提供的突变hFGF-21蛋白成熟肽为序列表的序列3所示的蛋白质。本发明还保护所述蛋白质与聚乙二醇的偶联物，即将所述蛋白质进行聚乙二醇修饰。本发明提供的治疗糖尿病的药物具有良好的降血糖活性，特别是以所述偶联物为活性成分的药物，还具有稳定性高、半衰期长、免疫原性低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种突变hFGF-21蛋白成熟肽及其编码基因和应用，以及聚乙二醇修饰的突变hFGF-21蛋白成熟肽及其应用。
背景技术
糖尿病是血中胰岛素绝对或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，临床上可出现多尿、烦渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。
糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，1980年我国患病率为0．67%，上海统计1978-1989年患病率由1．01%上升为2．23%，其中增加主要是2型患者。以上事实说明，随着人们社会经济生活的提高，糖尿病（特别是2型）病人有迅速增加的势头不容忽视。
2000年，Tetsuya Nishimura等人最先在小鼠胚胎中分离出FGF家族中的一个新成员并将其命名为成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)。FGF-21是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员，主要在肝脏中表达，蛋白N端前28个氨基酸为信号肽（去除信号肽后的多肽为成熟肽），因此FGF21可以分泌到细胞外。FGF-21具有调节血糖、降低血脂和改善胰岛素抵抗等作用，在医药领域有着广泛的应用前景。但长期的研究及临床实验结果显示，FGF-21与其他蛋白药物一样，稳定性差、体内半衰期短、易产生抗原抗体反应，这直接影响了其在临床上的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种突变hFGF-21蛋白成熟肽及其编码基因和应用，以及聚乙二醇修饰的突变hFGF-21蛋白成熟肽及其应用。
本发明提供的突变hFGF-21蛋白成熟肽为序列表的序列3所示的蛋白质。
编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下1）或2）或3）或4）或5）的DNA分子：
1）编码区如序列表中序列4自5’末端第1至546位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列4所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
本发明还保护所述蛋白质与聚乙二醇的偶联物，即将所述蛋白质进行聚乙二醇修饰（又称PEG化）。聚乙二醇修饰是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白质、多肽、小分子有机药物和脂质体上，从而增加具有药效的蛋白质的稳定性，延长其体内半衰期，降低免疫原性。
本发明还保护所述偶联物的制备方法，包括如下步骤：在氰基硼氢化钠的作用下，所述蛋白质与mPEG-ALD反应，得到所述偶联物。所述反应中：所述蛋白质与mPEG-ALD的质量比具体可为1:4，所述反应具体可在pH6.0的柠檬酸缓冲液中进行。所述反应的初始时刻，所述蛋白质的浓度可为2.0mg/ml。所述反应的初始时刻，氰基硼氢化钠的加入量可为10倍于mPEG-ALD的摩尔数。所述反应的温度具体可为4℃，时间具体可为8小时。所述mPEG-ALD的分子量为5kD到80kD，具体可为20kD-40kD。所述方法还可包括如下纯化步骤：取含有所述偶联物的反应液，用Sephadex G25脱盐并将PEG-mFGF-21成熟肽置换于脱盐缓冲液（pH8.0、20mM的Tris-HCl缓冲液），然后进行Capto Q阴离子交换层析。Capto Q阴离子交换层析的具体参数：XK16/26柱，柱高10cm，填充GE Capto Q阴离子交换树脂；洗脱液为A液、B液或A液和B液的混合物，A液为pH8.0、20mM的Tris–HCl缓冲液，B液为含1M NaCl的pH8.0、20mM的Tris–HCl缓冲液；洗脱过程，0-20min，B液在洗脱液中的体积比由0%线性上升至100%，流速为10mL/min，收集电导在3ms/cm到20ms/cm之间的过柱后溶液，即为PEG-mFGF-21成熟肽溶液。本发明提供的偶联物的制备方法，具有工艺简单、修饰率和回收率高的优点。
所述蛋白质或所述偶联物可用于制备治疗糖尿病的药物。所述治疗糖尿病的效果体现为降低血糖浓度。
本发明还保护一种治疗糖尿病的药物，其活性成分为所述蛋白质或所述偶联物。所述药物还包括其它药学上可接受的载体或辅料。所述药物中，除了所述活性成分外，可以添加药学上允许的赋形剂、填充剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、增效剂和添加剂等。所述药物的给药形态可为针剂（如粉剂、水剂、油剂）。所述制剂都可采用本领域技术人员熟知常用的制备方法而获得。所述药物的给药途径可为皮下注射、静脉注射或肌肉注射。所述治疗糖尿病的效果体现为降低血糖浓度。
本发明提供的治疗糖尿病的药物具有良好的降血糖活性，特别是以所述偶联物为活性成分的药物，还具有稳定性高、半衰期长、免疫原性低等优点。
附图说明
图1为实施例1的步骤三中上清液和沉淀进行12%SDS-PAGE电泳图。
图2为实施例1的步骤三中融合蛋白溶液和mFGF-21成熟肽溶液的电泳图。
图3为实施例1的步骤三中的亲和层析图谱。
图4为实施例2中细胞活性检测的结果。
图5为实施例2中体内活性检测的结果。
图6为实施例3中修饰物的选择过程中的电泳图。
图7为实施例3中pH选择和反应时间选择过程中的电泳图。
图8为实施例3中mFGF-21成熟肽与mPEG-ALD的质量比和蛋白浓度选择过程中的电泳图。
图9为mPEG-ALD与mFGF-21成熟肽的偶联示意图。
图10为实施例5中分子量和纯度检测的结果。
图11为实施例5中温度稳定性的测定结果。
图12为实施例6中PEG-mFGF-21成熟肽的免疫原性的测定结果。
图13为实施例7中PEG-m-FGF-21成熟肽体内稳定性的检测结果。
图14为实施例8中PEG-mFGF-21成熟肽的体外细胞活性检测结果。
图15为实施例9中PEG-mFGF-21体内生物学活性的检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
FGF-21成熟肽如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。mFGF-21成熟肽如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所示。
原核表达载体pSUMO（在文献中被称为“pHisSUMO”）：参考文献：姜媛媛,尹成凯,李晋南,任桂萍,张薇,李德山.利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究.东北农业大学学报,2008,39(10):57-62；李璐,尹成凯,李德山.高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUMO.生物技术,2009,19(3):11-14.。
大肠杆菌Rosetta(DE3)：北京全式金生物技术有限公司，目录号：CD801。
SUMO蛋白酶I（具有His标签）：制备方法见文献：傅俊华,王琪,尹杰超,刘铭瑶,李宁,姚文兵,任桂萍,李璐,李德山.融合蛋白GST-Ulplp在大肠杆菌中的高效可溶性表达及其活性鉴定.生物工程学报,2010,26(6):837-842.。
HepG2细胞（人肝癌细胞）：上海艾研生物科技有限公司。
db/db小鼠(2型糖尿病模型小鼠，SPF级，雄性，10-11周周龄)：上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号SCXK2012-0002(沪)。
实施例1、FGF-21成熟肽和mFGF-21成熟肽的制备
一、重组质粒pSUMO-FGF-21的构建
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤1得到的双链DNA分子为模板，采用P1和P2组成的引物对，采用rTaq酶，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
P1：5′-GGTCTCTAGGT CACCCCATCCCTGACTCCAGT-3′；
P2：5’-CGCGGATCCTTA GGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGG-3。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃30s、56℃30s、72℃45s，25个循环；72℃延伸10min。
3、用限制性内切酶BsaI和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BsaI和BamHI双酶切原核表达载体pSUMO，回收5700bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pSUMO-FGF-21。重组质粒pSUMO-FGF-21中，序列表的序列2所示的FGF-21成熟肽的编码基因和载体骨架上的分子伴侣SUMO的编码序列、以及载体骨架上的His标签的编码序列（位于SUMO的编码序列的上游，由6个组氨酸残基组成）融合，形成融合基因，表达融合蛋白（融合蛋白自N端至C端依次为His标签、分子伴侣SUMO和FGF-21成熟肽）。
FGF-21成熟肽的预期分子量为21KD（推算分子量为21KD,SDS-PAGE电泳显示分子量为25KD左右）,分子伴侣SUMO的预期分子量为12KD（推算分子量为12KD,SDS-PAGE电泳显示分子量为18KD左右）。
二、重组质粒pSUMO-mFGF-21的构建
1、以重组质粒pSUMO-FGF-21为模板，采用P3和P4组成的引物对，采用rTaq酶，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
P3：5′-GGTCTCTAGGT GCATACCCCATCCCTGACTCC-3′；
P4：5’-CGCGGATCCTTA GGAAGTGTAGCTGGGGCTTCGG-3。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃30s、56℃30s、72℃45s，25个循环；72℃延伸10min。
2、用限制性内切酶BsaI和BamHI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶BsaI和BamHI双酶切原核表达载体pSUMO，回收约5700bp的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pSUMO-mFGF-21。重组质粒pSUMO-mFGF-21中，序列表的序列4所示的mFGF-21成熟肽的编码基因和载体骨架上的分子伴侣SUMO的编码序列、以及载体骨架上的His标签的编码序列（位于SUMO的编码序列的上游，由6个组氨酸残基组成）融合，形成融合基因，表达融合蛋白（融合蛋白自N端至C端依次为His标签、分子伴侣SUMO和mFGF-21成熟肽）。
三、mFGF-21成熟肽的制备和纯化
1、将重组质粒pSUMO-mFGF-21导入大肠杆菌Rossetta(DE3)，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌的单菌落接种至5mL LB培养基中，37℃、120rpm振荡培养10h，然后取菌液，以1:100的体积比接种于500mL含50mg/mL青霉素的LB培养基中，37℃、120rpm振荡培养2h，此时OD600nm为0.35左右。
3、向步骤2得到的菌液中加入IPTG并使其浓度为0.25mmol/L以进行诱导（30℃、70rpm振荡培养4h），然后4℃、4000rpm离心30min，收集菌体。
4、取步骤3得到的菌体，进行超声破碎（AMP35%，8-12min，工作1s停1s），4℃、12000rpm离心，分别收集上清液和沉淀。
分别将上清液和沉淀进行12%SDS-PAGE电泳分析（上清液的电泳图见图1的泳道3，沉淀的电泳图见图1的泳道2，泳道1为marker）。结果表明，可溶性表达的目的蛋白占菌体总目的蛋白的90％以上。
5、取步骤4得到的上清液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为10ml。
洗脱过程：先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：40mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3PO4；pH7.4）洗脱以去除杂蛋白，流速为1ml/min；然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：500mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3PO4；pH7.4）洗脱，流速为1ml/min，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于80mAU的峰），即为融合蛋白溶液。融合蛋白溶液的电泳图见图2的泳道3。
6、采用HiPrepTM26/10Desalting将步骤5得到的融合蛋白溶液进行脱盐。
7、取步骤6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I（SUMO蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比为1:50）和终浓度为2mmol/L的DTT4℃切割过夜。酶切产物的电泳图见图2的泳道2。
8、取步骤7得到的溶液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为15ml，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于30mAU的峰），即为mFGF-21成熟肽溶液。
亲和层析图谱见图3。
mFGF-21成熟肽溶液的电泳图见图2的泳道1。回收目的带并进行N端测序，结果表明，N端前15个氨基酸残基如序列表的序列3自N末端第1至15位氨基酸残基所示。
四、FGF-21成熟肽的制备和纯化
用重组质粒pSUMO-FGF-21代替重组质粒pSUMO-mFGF-21，其它同步骤三，得到FGF-21成熟肽溶液。
实施例2、FGF-21成熟肽和mFGF-21成熟肽的活性比较
一、细胞活性检测
分别将实施例1制备的FGF-21成熟肽和实施例1制备的mFGF-21成熟肽作为待测蛋白进行如下鉴定：
HepG2细胞饥饿12h后，分别用蛋白浓度为10、100或1000nmol/L（采用细胞培养基为DMEM培养基，待测蛋白是以实施例1制备的FGF-21成熟肽溶液或mFGF-21成熟肽溶液的形式加入的）的待测蛋白刺激细胞24h，然后采用葡萄糖(Glu)测定试剂盒(北京金豪制药）用GOD-POD法（描述“GOD-POD法”的文献：杨桂枝,高小平,晏菊芳,等.GOD-POD法微量化测定方法的建立及其在3T3-L1脂肪细胞和HepG2细胞糖摄取中的应用.四川解剖学杂志,2003,11(1):12～15）检测培养体系中的葡萄糖浓度。设置不加入待测蛋白的空白组。
葡萄糖浓度(mmol/L)=OD500nm实验组/OD500nm标准×5.55mmol/L；
OD500nm标准是采用试剂盒的试剂并按试剂盒说明操作得到的数据。
细胞葡萄糖消耗率（%）=[（空白组葡萄糖浓度-实验组葡萄糖浓度）/空白组葡萄糖浓度]×100%。
结果见图4。在三种浓度的刺激下，mFGF-21成熟肽处理组的细胞葡萄糖消耗率均高于FGF-21成熟肽处理组，即mFGF-21成熟肽的活性优于FGF-21成熟肽。
二、体内活性检测
取db/db小鼠30只，预饲养1周后称重，次日禁食不禁水6h，然后尾静脉取血，用强生OneTouchTM稳豪型血糖仪检测小鼠的空腹血糖。
取体重正常（即44g-48g范围内），血糖值相对接近均值（即15-20mmol/L范围内）的小鼠24只，均为份3组，分别进行如下平行处理：
mFGF-21处理组：早上8点左右给予实施例1制备的mFGF-21成熟肽溶液一次，皮下注射，剂量为25μmol/kg（即按小鼠体重，每千克小鼠给予25μmol蛋白），用生理盐水调整注射体积为0.2mL；
FGF-21处理组：早上8点左右给予实施例1制备的FGF-21成熟肽溶液一次，皮下注射，剂量为25μmol/kg，用生理盐水调整注射体积为0.2mL；
对照组：早上8点左右给予生理盐水一次，皮下注射，注射体积为0.2mL。
实验过程中自由饮食、饮水，分别在给药前（0小时）、给药后3小时、给药后5小时和给药后24小时，尾静脉取血，用强生OneTouchTM稳豪型血糖仪检测血糖浓度。
结果见图5。mFGF-21处理组小鼠的血糖在注射后3h后降至正常水平，为7.5±0.91mmol/L。FGF-21处理组小鼠的血糖在注射后3h后降至10.2±0.95mmol/L。mFGF-21处理组和FGF-21处理组差异显著(P<0.05)。结果表明，mFGF-21成熟肽的活性优于FGF-21成熟肽。
实施例3、对mFGF-21成熟肽进行修饰的相关参数的建立
mPEG-SPA（甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯）：20KD，购自北京凯正生物工程发展有限责任公司。mPEG-ALD（单甲氧基聚乙二醇丙醛）：20KD，购自北京凯正生物工程发展有限责任公司。
一、修饰物的选择
取蛋白浓度为2mg/mL的mFGF-21成熟肽溶液，加入修饰物（mPEG-ALD或mPEG-SPA）使mFGF-21成熟肽与修饰物的质量比为1:4或1:6，加入氰基硼氢化钠使其10倍于mPEG-ALD的摩尔数，调pH为6.0，4℃反应6小时或8小时，取样进行SDS-PAGE分析。结果见图6。泳道1为mFGF-21与PEG-ALD之间质量比1：4、反应6h下的产物，泳道2为mFGF-21与PEG-ALD之间质量比1：4、反应8h下的产物，泳道3为mFGF-21与PEG-ALD之间质量比1：6、反应8h下的产物，泳道4为mFGF-21与PEG-ALD之间质量比1：6、反应6h下的产物。泳道5为mFGF-21与mPEG-SPA之间质量比1：4、反应6h下的产物，泳道6为mFGF-21与mPEG-SPA之间质量比1：4、反应8h下的产物，泳道7为mFGF-21与mPEG-SPA之间质量比1：6、反应8h下的产物，泳道8为mFGF-21与mPEG-SPA之间质量比1：6、反应6h下的产物。
SDS-PAGE结果显示，PEG-SPA修饰mFGF-21反应率低，而PEG-ALD修饰mFGF-21较PEG-SPA高。
二、采用mPEG-ALD作为修饰物时各个参数的优化
取蛋白浓度为2mg/mL的mFGF-21成熟肽溶液，加入mPEG-ALD使mFGF-21成熟肽与mPEG-ALD的质量比为1:4，加入氰基硼氢化钠使其10倍于mPEG-ALD的摩尔数，调pH为5.5、6.0、6.5或7.0，4℃反应8小时，取样进行SDS-PAGE分析。结果见图7的泳道1至泳道4，泳道1为pH5.5反应条件下的反应产物，泳道2为pH6.0反应条件下的反应产物，泳道3为pH6.5反应条件下的反应产物，泳道4为pH7.0反应条件下的反应产物。结果表明，pH6.0条件下反应最彻底。
取蛋白浓度为2mg/mL的mFGF-21成熟肽溶液，加入mPEG-ALD使mFGF-21成熟肽与mPEG-ALD的质量比为1:4，加入氰基硼氢化钠使其10倍于mPEG-ALD的摩尔数，调pH为6.0，4℃反应8h、12h、16h或20h，取样进行SDS-PAGE分析。结果见图7的泳道5至泳道8，泳道5为反应8小时后的反应产物，泳道6为反应12小时后的反应产物，泳道7为反应16小时后的反应产物，泳道8为反应20小时后的反应产物。结果表明，8小时后反应最彻底。
取蛋白浓度为2mg/mL的mFGF-21成熟肽溶液，加入mPEG-ALD使mFGF-21成熟肽与mPEG-ALD的质量比为1:4、1:6、1:8或1:10，加入氰基硼氢化钠使其10倍于mPEG-ALD的摩尔数，调pH为6.0，4℃反应8小时，取样进行SDS-PAGE分析。结果见图8的泳道2至泳道5，泳道2为质量比为1:4反应条件下的反应产物，泳道3为质量比为1:6反应条件下的反应产物，泳道4为质量比为1:8反应条件下的反应产物，泳道5为质量比为1:10反应条件下的反应产物。结果表明，质量比为1:4条件下反应最彻底。
取蛋白浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL或2mg/mL的mFGF-21成熟肽溶液，加入mPEG-ALD使mFGF-21成熟肽与mPEG-ALD的质量比为1:4，加入氰基硼氢化钠使其10倍于mPEG-ALD的摩尔数，调pH为6.0，4℃反应8小时，取样进行SDS-PAGE分析。结果见图8的泳道6至泳道9，泳道6为蛋白浓度为2mg/mL的反应产物，泳道7为蛋白浓度为1.5mg/mL的反应产物，泳道8为蛋白浓度为1mg/mL的反应产物，泳道9为蛋白浓度为0.5mg/mL的反应产物。结果表明，蛋白浓度为2mg/mL反应最彻底。
综上所述，采用mPEG-ALD修饰mFGF-21成熟肽的最佳条件为：pH为6.0，反应时间为8小时，mFGF-21成熟肽与mPEG-ALD的质量比为1:4，mFGF-21成熟肽溶液中的蛋白浓度为2mg/mL。
mPEG-ALD与mFGF-21成熟肽的偶联示意图见图9。
实施例4、聚乙二醇修饰的mFGF-21成熟肽（PEG-mFGF-21成熟肽）的制备
一、制备PEG-mFGF-21成熟肽
取实施例1制备的mFGF-21成熟肽溶液，用Sephadex G25脱盐并将mFGF-21成熟肽置换于柠檬酸缓冲液（溶剂为水，溶质及其浓度如下：20mM柠檬酸钠、80mM氯化钠；pH6.0）中，用中空纤维柱超滤浓缩至蛋白浓度为2.0mg/ml，加入mPEG-ALD使mFGF-21成熟肽与mPEG-ALD的质量比为1:4，加入氰基硼氢化钠使其10倍于mPEG-ALD的摩尔数，4℃反应8h，加甘氨酸终止反应。
二、纯化PEG-mFGF-21成熟肽
取步骤一得到的反应液，用Sephadex G25脱盐并将PEG-mFGF-21成熟肽置换于脱盐缓冲液（pH8.0、20mM的Tris-HCl缓冲液），然后进行Capto Q阴离子交换层析。
Capto Q阴离子交换层析的具体参数：XK16/26柱，柱高10cm，填充GE Capto Q阴离子交换树脂；洗脱液为A液、B液或A液和B液的混合物，A液为pH8.0、20mM的Tris–HCl缓冲液，B液为含1M NaCl的pH8.0、20mM的Tris–HCl缓冲液；洗脱过程，0-20min，B液在洗脱液中的体积比由0%线性上升至100%，流速为10mL/min，收集电导在3ms/cm到20ms/cm之间的过柱后溶液，即为PEG-mFGF-21成熟肽溶液。
实施例5、PEG-mFGF-21成熟肽的理化特性
一、分子量和纯度检测
分别用SDS-PAGE电泳和HPLC高效液相色谱两种不同的方法测定实施例4制备的PEG-mFGF-21成熟肽和实施例1制备的mFGF-21成熟肽的分子量及纯度。
SDS-PAGE：浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%，用考马斯亮蓝R-250染色。
HPLC高效液相色谱：分析柱型号Biosuit250，5μm HR SEC，流动相为pH7.0、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，检测波长为280nm，流速为0.5mL/min。
SDS-PAGE结果见图10A，mFGF-21成熟肽和PEG-mFGF-21成熟肽的分子量分别为25kD和55kD左右。HPLC高效液相色谱结果见图10B（mFGF-21成熟肽）和图10C（PEG-mFGF-21成熟肽）。mFGF-21成熟肽在16.5min处出现一纯度较高的峰，而PEG-mFGF-21成熟肽由于分子量增加，出峰时间提前，在12min处有一纯度较高的峰出现。mFGF-21成熟肽和PEG-mFGF-21成熟肽的纯度都可达95%以上。
二、温度稳定性的测定
分别检测实施例4制备的PEG-mFGF-21成熟肽和实施例1制备的mFGF-21成熟肽的温度稳定性，方法如下：将待测样本室温放置1个月，用-80℃储存的待测样本作对照甲，用刚制备的待测样本作为对照乙，分别进行15%SDS-PAGE分析和细胞活性检测（方法同实施例2的步骤一，蛋白浓度为1000nmol/L）。
SDS-PAGE结果见图11A，泳道1为PEG-mFGF-21成熟肽-80℃储存1个月，泳道2为PEG-mFGF-21成熟肽室温放置1个月，泳道3为mFGF-21成熟肽室温放置1个月，泳道4为mFGF-21成熟肽-80℃放置1个月。mFGF-21成熟肽室温放置1个月后降解率约为42%，而PEG-mFGF-21成熟肽室温放置1个月后没有出现明显的降解现象。
细胞活性检测结果见图11B。mFGF-21成熟肽放置于在室温放置1个月后活性保留率约为27%，而PEG-mFGF-21成熟肽在室温保存1个月后细胞活性保留率约为80%。
以上结果说明经PEG修饰后mFGF-21成熟肽的温度稳定性显著增加。
实施例6、PEG-mFGF-21成熟肽的免疫原性
取体重约2kg的家兔6只，随机分为2组，每组三只。每两天一次分别皮下注射实施例4制备的PEG-mFGF-21成熟肽或实施例1制备的mFGF-21成熟肽，连续给药3周，每次给药剂量为25μmol/kg（即按家兔体重，每千克家兔给予25μmol蛋白）。分别在给药前（第0周）、第一次给药后的1、2、3、4或5周，耳缘静脉采血500μL左右，12000r/min离心10min，取上清，保存于-20℃备
分别用实施例4制备的PEG-mFGF-21成熟肽和实施例1制备的mFGF-21成熟肽包被酶标板，包被浓度为1μg/ml，应用ELISA间接法测定各血清中的抗体水平。
结果见图12。PEG-mFGF-21成熟肽诱导产生抗体的能力明显低于mFGF-21成熟肽。结果表明，mFGF-21成熟肽经PEG修饰后免疫原性明显下降。
实施例7、PEG-m-FGF-21成熟肽体内稳定性的检测
取体重约2kg的家兔6只，随机分为2组，每组三只。分别皮下注射实施例4制备的PEG-mFGF-21成熟肽或实施例1制备的mFGF-21成熟肽，剂量25μmol/kg，在给药前（0h），给药后的0、1h、3h、5h、7h、24h，于耳缘静脉采血250μL左右，12000r/m离心10min，取上清，保存于-20℃备用。
ELISA间接法测定PEG-mFGF-21成熟肽与mFGF-21成熟肽的体内半衰期：用稀释好的不同浓度的PEG-mFGF-21成熟肽与mFGF-21成熟肽分别建立蛋白浓度含量的标准曲线，各种稀释好的血清包被酶标板，应用ELISA间接法测定各血清中目标蛋白的含量，统计学分析并计算出PEG-mFGF-21成熟肽与mFGF-21成熟肽的体内半衰期。体内半衰期t1/2=0.301*（t2-t1）/log（OD1/OD2），其中OD1和OD2分别表示t1和t2时取出血清所对应酶标板上的平均光吸收值。
结果如图13所示，经公式计算出mFGF-21成熟肽与PEG-mFGF-21成熟肽的体内半衰期分别约为48min和380min。mFGF-21成熟肽经PEG修饰后体内半衰期提高了约8倍，差异极显著。
实施例8、PEG-mFGF-21成熟肽的体外细胞活性检测
检测实施例4制备的PEG-m-FGF-21成熟肽或实施例1制备的mFGF-21成熟肽的细胞活性。
方法同实施例2的步骤一，蛋白浓度为1000nmol/L。
结果见图14。mFGF-21成熟肽经PEG修饰后，其细胞活性并没有下降，反而随着蛋白作用细胞时间的增加。
实施例9、PEG-mFGF-21体内生物学活性的研究
取db/db小鼠30只，预饲养1周后称重，次日禁食不禁水6h，然后尾静脉取血，用强生OneTouchTM稳豪型血糖仪检测小鼠的空腹血糖。
取体重正常（即44g-48g范围内），血糖值相对接近均值（即15-20mmol/L范围内）的小鼠24只，均为份3组，分别进行如下平行处理：
mFGF-21处理组：每天早上8点左右给予实施例1制备的mFGF-21成熟肽溶液一次，皮下注射，剂量为25μmol/kg（即按小鼠体重，每千克小鼠给予25μmol蛋白），用生理盐水调整注射体积为0.2mL；连续注射7天；
PEG-mFGF-21处理组：每天早上8点左右给予实施例4制备的PEG-mFGF-21成熟肽溶液一次，皮下注射，剂量为25μmol/kg，用生理盐水调整注射体积为0.2mL；连续注射7天；
对照组：每天早上8点左右给予生理盐水一次，皮下注射，注射体积为0.2mL；连续注射7天。
实验过程中自由饮食、饮水，分别在每天给药前以及停药的第1天、第2天和第3天的相同时间尾静脉取血，用强生OneTouchTM稳豪型血糖仪检测血糖浓度。
结果见图15。PEG-mFGF-21处理组或mFGF-21处理组小鼠的血糖变化趋势一致，但mFGF-21处理组小鼠给药后血糖较PEG-mFGF-21处理组小鼠给药后血糖下降缓慢、且停药后回升快。说明了PEG-mFGF-21成熟肽的长期降糖效果优于mFGF-21成熟肽，作用持续时间长，并且PEG-mFGF-21成熟肽在停药后控制血糖的能力也高于mFGF-21成熟肽。
Claims (7)
1.序列表的序列3所示的蛋白质。
2.编码权利要求3所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1）或2）或3）或4）或5）的DNA分子：
1）编码区如序列表中序列4自5’末端第1至546位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列4所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
4.权利要求1所述蛋白质与聚乙二醇的偶联物。
5.权利要求4所述偶联物的制备方法，包括如下步骤：在氰基硼氢化钠的作用下，权利要求1所述蛋白质与mPEG-ALD反应，得到所述偶联物。
6.权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述偶联物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
7.一种治疗糖尿病的药物，其活性成分为权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述偶联物。
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