CN104293762A - 聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法。包括以下步骤：将表达葡激酶突变体Sak-E80C的工程菌接种诱导培养收集上清液；将上清液加入到阳离子交换层析柱中进行洗脱，收集洗脱组分；用Bradford法测定收集液中Sak-E80C的浓度，然后将Sak-E80C、羟基-马来酰亚胺聚乙二醇在室温下反应，修饰完成后，将修饰反应液加入阳离子交换层析柱中进行洗脱，收集相应组分；将收集液加入到凝胶过滤层析柱中，用缓冲液进行冲洗,分别收集两个主要洗脱峰；将获得的含有Sak-E80C-HPG的收集液加入到阴离子交换层柱中进行洗脱并收集相应组分，将含有Sak-E80C-HPG的收集液分装，进行冷冻干燥。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
葡激酶（staphylokinase, Sak）是来源于金黄色葡萄球菌的一种蛋白质。Sak不能直接使纤溶酶原 (Plg) 转变为纤溶酶(plasmin, Plm) , 而是先与纤溶酶原结合形成无活性的 Sak·plg，在少量纤溶酶启动下，形成活性 Sak·plm，后者进一步激活纤溶酶原分子转变为纤溶酶，纤溶酶溶解血栓基质纤维蛋白从而溶解血栓。在血浆中，Sak·plm 很快被 α2-抗纤溶酶抑制，不激活纤溶系统；当有血栓存在时 Sak·plm 与血栓中的纤维蛋白结合，α2-抗纤溶酶对 Sak·plm 复合物的抑制速度会下降100倍。临床研究结果表明，葡激酶与美国治疗急性心肌梗塞的标准溶栓药物阿特普酶有等同的溶栓疗效，且葡激酶激活纤溶酶原的纤维蛋白特异性更强。然而，葡激酶作为一种外源性的蛋白，有较高的免疫原性，且其半衰期较短，存在易被血液中的蛋白酶降解等缺点，因而，限制了葡激酶的临床应用。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种惰性大分子，其水溶性好、不挥发、无味、不带电荷,可以获得多种分子量不同、结构不同的聚合物形式。而且PEG本身免疫原性极弱,通常在PEG修饰物免疫的动物血清中检测不到特异性的抗PEG抗体。当其偶联到药物分子或药物表面时,可以在其修饰的药物周围产生空间屏障,减少药物的酶解,避免在肾脏中被很快滤过。因而，Sak经聚乙二醇修饰后可以克服其免疫原性高、半衰期短、易被肾脏过滤等缺点，使聚乙二醇化葡激酶药物更适于临床应用。目前，已有许多与葡激酶及聚乙二醇-葡激酶偶联物的制备方法相关的专利申请，如《一种制备葡激酶的方法》（专利号：ZL200610157156.6），《一种低热原葡激酶及其制备方法》（专利号：ZL200510022492.5）《一种低免疫原性葡激酶突变体及其制备方法和应用》（专利号：ZL200910075186.6）等。上述专利只涉及到重组葡激酶的基因构建、诱导表达、分离纯化，制得高纯度的葡激酶纯品，而未涉及后续的聚乙二醇修饰及修饰产物的分离纯化。《聚乙二醇-葡激酶偶物及其制备方法和应用》（专利号：ZL99804195.5）提供了以高纯度的葡激酶纯品为原料制备和纯化聚乙二醇-葡激酶偶联物的工艺，该工艺需经过两次冷冻干燥；《一种聚乙二醇化的葡激酶突变体及其制备方法和应用》（专利号:ZL201110102611.3）和《免疫原性降低和/或清除率降低的葡激酶衍生物的鉴定、生产和应用》（专利号：ZL200910075186.6），虽然全面提供了重组葡激酶突变体基因构建、诱导表达、分离纯化以及聚乙二醇-葡激酶突变体的制备和纯化的工艺过程，但聚乙二醇-葡激酶突变体的整体制备和纯化工艺过程繁琐。以上所有聚乙二醇-葡激酶偶联物纯品制备相关专利所提供的工艺路线可以分割成了三个阶段：一，葡激酶或其突变体经过色谱柱层析纯化后冷冻干燥，获得葡激酶或其突变体纯品；二，以葡激酶或其突变体纯品为原料，与修饰剂反应，制备聚乙二醇-葡激酶或其突变体的偶联物；三，通过色谱柱层析纯化出聚乙二醇-葡激酶或其突变体偶联物，冷冻干燥获得纯品。这种工艺路线存在制备工艺繁琐、周期长、生产成本高、可连续化生产程度低等不足。并且，制备工艺均需经过两次冷冻干燥，导致蛋白质变性聚集和活性降低，而蛋白质变性聚集导致蛋白质产品体内免疫原性升高。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法，克服了现有工艺存在的不足。
本发明是使用聚乙二醇修饰剂共价修饰葡激酶突变体（Sak-E80C；80位的谷氨酸突变成半胱氨酸）特定位点来制备聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的，其中，聚乙二醇修饰剂为羟基-马来酰亚胺聚乙二醇(MAL-PEG-OH；Maleimide PEG Hydroxyl),购自北京键凯科技有限公司，其分子量为2000或5000或7500。葡激酶突变体为Sak-E80C，按摩尔比，葡激酶突变体：修饰剂=1:（3-10）。
具体的，本发明的聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法，包括以下步骤：
（1）将表达葡激酶突变体Sak-E80C的工程菌接种于液体培养基中，37℃培养6h后，升温至42℃诱导培养4h，然后，4℃、5,000 rpm离心10 分钟收菌，弃上清，用含有0.01M EDTA（乙二胺四乙酸）和0.01M二硫苏糖醇的0.02M NaAC-HAC(醋酸钠-醋酸)缓冲液，pH=5-6，悬浮菌体进行超声破碎，破碎后4℃、12,000 rpm高速离心20 min，收集上清液；
（2）将上清液pH调至5.6，加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.7×30 cm）中，然后用pH=5-6、含有80-1000mM NaCl和0.01M二硫苏糖醇的10-50mM NaAc-HAc缓冲液进行洗脱，分别收集洗脱组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定突变体葡激酶（Sak-E80C）所在的洗脱峰，从而确定含Sak-E80C的收集液；
将含Sak-E80C的收集液加入到Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）中，上样量为凝胶体积的5%，然后用pH= 5-6、含0.01M二硫苏糖醇的10-50mM NaAc-HAc缓冲液进行冲洗，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含Sak-E80C的收集液；
（3）用Bradford 法测定收集液中Sak-E80C的浓度，然后按照摩尔比，Sak-E80C：羟基-马来酰亚胺聚乙二醇 =1:（3-10），在室温下，反应进行3-5小时，修饰完成后，用SDS-PAGE电泳和SEC-HPLC分析聚乙二醇-葡激酶偶联物(HO-PEG-MAL-Sak-E80C；Sak-E80C-HPG)的产率；
将修饰反应液加入SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.6×25 cm）中，然后用pH=5-6、含有100-200mM NaCl 的10-50mM NaAc-HAc缓冲液进行洗脱，收集相应组分；
将SP-Sepharose FF阳离子交换层析获得的收集液加入到 Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱（2.6×100 cm）中，上样量为凝胶体积的5%，然后用pH=8-9、10-50mM Tris-HCl（tris-盐酸）缓冲液进行冲洗, 分别收集两个主要洗脱峰，用SDS-PAGE电泳显示，其中一个洗脱峰主要成分为聚乙二醇-葡激酶偶联物（HO-PEG-MAL- Sak-E80C-HPG；Sak-E80C-HPG），另一洗脱峰主要为未被修饰的Sak-E80C；
将含有Sak-E80C-HPG的收集液加入到 Q-Sepharose FF阴离子交换层柱（1.5×15 cm）中，然后用pH=8-9、含有100-200mM NaCl 的10-50 mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C-HPG的收集液，最后将含有Sak-E80C-HPG的收集液分装，进行冷冻干燥。
冻干粉末复溶后，用SEC-HPLC检测纯度、酪蛋白平板溶圈法检测活性，包括：
聚乙二醇-葡激酶偶联物免疫原性检测； 聚乙二醇-葡激酶偶联物药代动力学检测。
本发明所用表达葡激酶突变体Sak-E80C的工程菌是通过公开号为CN102212512A，公布日：2011,10.12，发明名称：一种聚乙二醇化的葡激酶突变体及其制备方法和应用提供的方法构建的。
本发明取得的有益效果是：
本发明将葡激酶突变体的纯化与聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化过程整合统一起来，减少了工艺环节和产品冷冻干燥次数，缩短了生产周期，降低了生产成本，保留了产品活性，提高了产品收率和可连续化生产程度。
附图说明
图1：本发明的工艺路线流程图。
图2：实施例1中Sak-E80C-HPG5冻干粉复溶HPLC纯度检测图。
图3：Sak-E80C-HPG2冻干复溶HPLC纯度检测图。
图4：Sak-E80C-HPG7.5冻干复溶 HPLC纯度检测图。
图5：野生型葡激酶（wt-sak）、Sak-E80C、Sak-E80C-HPG5酪蛋白平板溶圈法活性比较图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。
实施例 1
(1)葡激酶突变体 Sak-E80C 的诱导表达
将表达葡激酶突变体Sak-E80C的工程菌接种于2L的M9CA液体培养基中，首先在37℃培养6h，然后升温到42℃诱导表达4h，然后，4℃、5,000 rpm离心10 min收菌，用含有10 mM EDTA和0.01 M二硫苏糖醇的NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）800ml悬浮菌体进行超声破碎（分两次超声），功率400 W，每次40 min循环破碎，共破碎6次（显微镜下镜检确定细胞破碎完全）。破碎后，4℃、12,000 rpm高速离心10 min 收集上清液800ml。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示，表达量约占菌体蛋白总量的40％～45％。
(2)葡激酶突变体 Sak-E80C 的初步分离纯化
将离心上清液pH调至5.6，用蠕动泵加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.6×30 cm）中，上样完成后，以20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）洗脱至基线，然后用含0.01M二硫苏糖醇 的80-1000mM NaCl的 20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）进行梯度洗脱，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C的收集液。
将含Sak-E80C的收集液加入到Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）中（上样量为胶体积的5%左右），然后用含0.01M二硫苏糖醇的20 mM NaAc-HAc缓冲液(pH 5.6)进行冲洗，收集各个洗脱组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C的收集液。
(3)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物（Sak-E80C-HPG5）的制备和纯化
用Bradford 法 (Bio-Rad试剂盒)测定经Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）获得的收集液中Sak-E80C的浓度，使用分子量为5000的羟基马来酰亚胺聚乙二醇（MAL-PEG-OH: Maleimide PEG Hydroxyl）修饰Sak-E80C，按照摩尔比，Sak-E80C：修饰剂=1:10，在室温环境下反应3h。用SDS-PAGE电泳和SEC-HPLC检测反应过程，发现反应3h后，Sak-E80C-HPG5产率最高。
修饰完成后，将反应修饰液用蠕动泵加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.5×25 cm）中，上样完成后，以 20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）洗脱至基线，然后用含有160mM NaCl的 20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）进行洗脱，收集相应组分。
将经SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.5×25 cm）获得的收集液加入到Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱（2.6×100 cm）中（上样量为胶体积的5%左右），然后用 20mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）进行冲洗,分别收集完全分开的两个洗脱峰，用SDS-PAGE 电泳分析显示，其中一个洗脱峰主要成分为聚乙二醇-葡激酶偶联物（HO-PEG-MAL- Sak-E80C-HPG5；Sak-E80C-HPG5），另一洗脱峰主要为未被修饰的Sak-E80C。
将经过Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱纯化的含Sak-E80C-HPG5的洗脱液，加入到Q-Sepharose FF阴离子交换层析柱（2.5×25 cm）中，上样完成后，以20mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）洗脱至基线，然后用含有150mM NaCl的Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）进行洗脱，收集相应组分，将收集液pH调至7.4后分装到无菌的西林瓶中，进行冷冻干燥。
(4)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物 Sak-E80C-HPG5 纯品的表征
纯度检测:SEC-HPLC 流动相：0.02M PBS；层析柱：Thermo BioBasic SEC-300 、5um 、150×7.8（mm）；流速：0.2ml/min；
将冻干粉末用0.02M PBS复溶，SEC-HPLC检测纯度。
SEC-HPLC检测结果显示：Sak-E80C-HPG5冻干纯品纯度高达98%以上。
活性检测方法：酪蛋白平板溶圈法
具体步骤：琼脂糖溶于0.02 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH 7.4），加热溶解，冷却至60 ℃后与纤维蛋白原和凝血酶溶液混合，加入NaN3和纤溶酶原，混匀，浇灌于平板上。凝胶形成后用打孔器打直径3-4 mm小孔。在各孔中加等体积葡激酶标准品或样品，37 ℃湿盒保温过夜。测定各孔溶圈直径，以标准品（购自中国药品生物制品检验检定所）活性的对数和溶圈直径的对数作标准曲线，计算样品的比活性。
检测显示：Sak-E80C-HPG5的比活性为11.1×104，野生型wt-sak的比活性为9.7×104 HU/mg，Sak-E80C-HPG5比活性稍强。
(5)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物 Sak-E80C-HPG5 免疫原性检测
野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG5诱导Balb/c小鼠产生特异性抗体的能力10只6-8周的Balb/c小鼠随机分成2组，每组5只。采用皮下注射的方法分别注射（10 μg/200μl）野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG5，初次免疫记为第0天，以后每隔14天免疫一次，一共免疫4次，每次免疫后第10天取血，将制备好的血清分装，-20℃保存。
间接ELISA法分析野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG5在小鼠体内的抗体水平：将野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG5样品用包被缓冲液稀释至10 μg/m1，100 μ1/孔包被酶标板（每一样品包被3个复孔），4 ℃ 湿盒过夜，含0.5％吐温-20的0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.4，简称PBST）洗涤3次。每孔中分别加入封闭液（1%BSA溶液）100 μl，37 ℃湿盒温育2小时，PBST洗涤3次。用PBS将阴性小鼠血清以及野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG5免疫后的小鼠血清分别稀释250～100000倍，加入对应的包被了野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG5的孔中（100 μl/孔），37℃湿盒温育l 小时，PBST洗涤3次。每孔分别加入1:4000稀释的HRP标记的兔抗小鼠IgG 100 μl，37 ℃湿盒温育1 h，PBST洗涤3次。加入TMB-过氧化氢溶液100 μl，避光显色 15 min，加入终止液50 μl终止反应，在酶标仪上检测OD450值，确定抗原诱导的抗体滴度。大于或者等于阴性对照孔OD450值2倍的确定为阳性，低于阴性对照孔OD450值2倍的确定为阴性。
结果显示：与野生型wt-sak诱导的抗体滴度（滴度为80000）对比，突变体Sak-E80C-HPG5所诱导特异性抗体滴度（滴度为20000）显著下降（p<0.05）。
(6)野生型wt-Sak及其聚乙二醇化葡激酶突变体Sak-E80C-HPG5在新西兰兔体内的药代动力学
药代动力学实验在新西兰兔体内进行，耳缘静脉2％戊巴比妥钠30 mg/kg 麻醉，静脉内500 μg/kg野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG5注射给药，分别于给药后1、2.5 、5 、10 、15、20 、30 、45 、60 、90 min股动脉插管取血，取血后立即以8000 rpm离心5 min, 离心后血浆立即置于-40 ℃冰箱保存。
血浆中wt-Sak和Sak-E80C-HPG5浓度采用双抗体夹心ELISA法分析：将鼠源野生型Sak多克隆抗体（由石家庄赛尔生物技术有限公司制备）
用包被缓冲液稀释至10 μg/m1，100 μl/孔包被酶标板（每一样品包被3个复孔），4℃ 湿盒过夜，PBST洗涤3次；每孔中分别加入封闭液（1%BSA溶液）100 μl，37 ℃湿盒温育2 h，PBST洗涤3次；用PBS将适当稀释的兔血浆和葡激酶标准品加入对应的包被了多克隆抗体的孔中（100 μl/孔），37 ℃湿盒温育l h，PBST洗涤3次（3 min/次）；每孔分别加入1:3000稀释的HRP标记的兔源野生型Sak多克隆抗体（由石家庄赛尔生物技术有限公司制备） 100 μl，37 ℃湿盒温育1 h，PBST洗涤3次；加入TMB-过氧化氢溶液100 μl，避光显色 15 min，加入终止液50 μl终止反应，在酶标仪上检测OD450值。根据葡激酶标准品浓度与OD450值之间的关系，计算血浆样品中野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG5的浓度；
根据给药后不同时间血药浓度的测定数据，采用中国药理学会数学专业
委员会编制的3p87药代动力学软件在微机上拟合药物浓度-时间曲线，计算药代动力学参数。结果表明，野生型wt-Sak的血浆分布半衰期（t1/2a）为3.4 min，血浆清除率为13.1±0.3 ml/min；而聚乙二醇化葡激酶突变体Sak-E80C-HPG5的t1/2a为7.2 min，血浆半衰期比野生型Sak显著延长（p<0.05）,血浆清除率为6.5±0.2 ml/min, 血浆清除率比野生型Sak显著降低（p<0.05）。
实施例 2
(1)葡激酶突变体 Sak-E80C 诱导表达
将表达葡激酶突变体Sak-E80C的工程菌接种于2L的M9CA(Na2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4，葡萄糖，酪蛋白水解物)液体培养基中，首先在37℃培养6h，升温到42℃诱导表达4h，然后，4℃、5,000 rpm高速离心10min收集菌体，用含有10mM EDTA和0.01M二硫苏糖醇的20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）800ml悬浮菌体进行超声破碎（分两次超声），功率400W，每次40min循环破碎，共破碎6次（显微镜下镜检确定细胞破碎完全）。破碎后4℃、12,000 rpm高速离心10min 收集上清液800ml。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示，表达量约占菌体蛋白总量的40％～45％。
(2)葡激酶突变体 Sak-E80C 的初步分离纯化
将离心上清液pH调至5.6，用蠕动泵加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.7×30 cm）中，上样完成后，用20mM NaAc-HAc（pH 5.6）洗脱至基线，然后用含80-1000mM NaCl和0.01M二硫苏糖醇的 20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）进行梯度洗脱，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳鉴定，以确定Sak-E80C所在的洗脱峰。
将含Sak-E80C的收集液加入到Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）中（上样量为胶体积的5%左右），然后用含0.01M二硫苏糖醇的20mM NaAc-HAc缓冲液(pH 5.6)进行冲洗，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C的收集液。
(3)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物（Sak-E80C-HPG2）的制备和纯化
用Bradford 法 (Bio-Rad试剂盒)测定经Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）获得收集液中Sak-E80C的浓度，使用分子量为2000的羟基马来酰亚胺聚乙二醇修饰Sak-E80C，按照摩尔比，Sak-E80C：修饰剂=1:10，在室温环境下反应3h。
修饰完成后，将反应修饰液用蠕动泵加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.5×25 cm）中，上样完成后，以20 mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）洗脱至基线，然后用含有160mM NaCl的 20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）进行洗脱，收集相应组分。
将经SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱获得的收集液用无菌注射器加入到Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱（2.6×100 cm）中（上样量为胶体积的5%左右），然后用20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）进行冲洗, 分别收集完全分开的两个洗脱峰，用SDS-PAGE 电泳分析显示，其中一个洗脱峰主要成分为聚乙二醇-葡激酶偶联物（HO-PEG-MAL- Sak-E80C-HPG2；Sak-E80C-HPG2），另一洗脱峰主要为未被修饰的Sak-E80C。
将经过Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱获得的含E80C-HPG2的相应收集液，用蠕动泵加入到Q-Sepharose FF阴离子交换层析柱（2.5×25 cm）中，上样完成后，以20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)洗脱至基线，然后用含有150 mM NaCl的 20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）进行洗脱，收集相应组分，将收集液pH调至7.4后分装到无菌的西林瓶中，进行冷冻干燥。
(4)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物 Sak-E80C-HPG2 纯品的表征
纯度检测:SEC-HPLC 流动相：0.02M PBS；层析柱：Thermo BioBasic SEC-300 、5um 、150×7.8（mm）；流速：0.2ml/min；
将冻干粉末用0.02M PBS复溶，SEC-HPLC检测纯度。
SEC-HPLC检测结果显示：Sak-E80C-HPG2冻干纯品纯度高达98%以上。
活性检测方法：酪蛋白平板溶圈法
具体步骤：具体实验步骤与实施例1相同。
检测显示：Sak-E80C-HPG2的比活性为10.5×104， wt-sak的比活性为9.7×104，Sak-E80C-HPG2相比活性稍强。
(5)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物 Sak-E80C-HPG2 免疫原性检测
野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG2诱导Balb/c小鼠产生特异性抗体的能力的具体实验步骤与实施例1相同，差异仅是使用Sak-E80C-HPG2代替
Sak-E80C-HPG5。
实验结果显示：与野生型wt-sak诱导的抗体滴度（滴度为80000）对比，突变体Sak-E80C-HPG2所诱导特异性抗体滴度（滴度为25000）显著下降（p<0.05）。
(6)野生型wt-Sak及其聚乙二醇化葡激酶突变体Sak-E80C-HPG2在新西
兰兔体内的药代动力学
Sak-E80C-HPG2的药代动力学研究实验方法、所用药物剂量、采样方法与实施例1完全相同，差异仅是使用Sak-E80C-HPG2代替Sak-E80C-HPG5。
采用3p87药代动力学软件在微机上拟合药物浓度-时间曲线，计算药代动力学参数。结果表明，野生型Sak的血浆分布半衰期（t1/2a）为3.4 min，血浆清除率为13.1±0.3 ml/min；而聚乙二醇化葡激酶突变体Sak-E80C-HPG2的t1/2a为5.6 min，血浆半衰期比野生型wt-Sak显著延长（p<0.05）,血浆清除率为8.5±0.2 ml/min, 血浆清除率比野生型Sak显著降低（p<0.05）。
实施例 3
(1)葡激酶突变体 Sak-E80C 诱导表达
将表达葡激酶突变体Sak-E80C的工程菌接种于2L的M9CA(Na2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4，葡萄糖，酪蛋白水解物)液体培养基中，首先在37℃培养6h，升温到42℃诱导表达4h，然后，4℃、5,000rpm高速离心10min收集菌体；用含有10mM EDTA和0.01M二硫苏糖醇的 NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）800ml悬浮菌体进行超声破碎（分两次超声），功率400W，每次40min循环破碎，共破碎6次（显微镜下镜检确定细胞破碎完全）。破碎后4℃、12,000rpm高速离心10min 收集上清液800ml。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示，表达量约占菌体蛋白总量的40％～45％。
(2)葡激酶突变体 Sak-E80C 的初步分离纯化
将离心上清液pH调至5.6，用蠕动泵加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.7×30 cm）中，上样完成后，以20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6） 洗脱至基线，然后用80-1000mM NaCl和0.01M二硫苏糖醇 的 20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）进行梯度洗脱，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C的收集液。
用无菌注射器将含有Sak-E80C的收集液加入到Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）中（上样量为胶体积的5%左右），然后用 含0.01M二硫苏糖醇的20mM NaAc-HAc缓冲液(pH 5.6)进行冲洗，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C的收集液。
(3)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物 Sak-E80C-HPG7.5 的制备和纯化
用Bradford 法 (Bio-Rad试剂盒)测定经Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）获得的收集液中Sak-E80C的浓度，使用分子量为7500；羟基马来酰亚胺聚乙二醇（MAL-PEG-OH: Maleimide PEG Hydroxyl）修饰Sak-E80C，按照摩尔比，Sak-E80C：修饰剂=1:10，在室温环境下反应3h。
修饰完成后，将反应修饰液用蠕动泵加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.5×25 cm）中，上样完成后，以 20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）洗脱至基线，然后用含有160mM NaCl的 20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）进行洗脱，收集相应组分。
将经SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱获得的收集液用无菌注射器加入到Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱（2.6×100 cm）中（上样量为胶体积的5%左右），然后用 20mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）进行冲洗,分别收集完全分开的两个洗脱峰，用SDS-PAGE 电泳分析显示，其中一个洗脱峰主要成分为聚乙二醇-葡激酶偶联物（HO-PEG-MAL- Sak-E80C-HPG7.5；Sak-E80C-HPG7.5），另一洗脱峰主要为未被修饰的Sak-E80C。
将经过Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱获得的含Sak-E80C-HPG7.5的相应收集液，用蠕动泵加入到Q-Sepharose FF阴离子交换层析柱（2.5×25 cm）中，上样完成后，以 20mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）洗脱至基线，然后用含有150mM NaCl的 20mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）进行洗脱，收集相应组分，将收集液pH调至7.4后分装到无菌的西林瓶中，进行冷冻干燥。
(4)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物 Sak-E80C-HPG7.5 纯品的表征
纯度检测:SEC-HPLC 流动相：0.02M PBS；层析柱：Thermo BioBasic SEC-300 、5um 、150×7.8（mm）；流速：0.2ml/min；
将冻干粉末用0.02M PBS复溶，SEC-HPLC检测纯度。
SEC-HPLC检测结果显示：Sak-E80C-HPG7.5冻干纯品纯度高达98%以上。
活性检测方法：酪蛋白平板溶圈法
具体步骤：与实施例1相同。
检测显示： Sak-E80C-HPG7.5的比活性为9.5×104， wt-sak的比活性为9.7×104， Sak-E80C-HPG7.5 与wt-sak相比活性基本不变。
(5)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物 Sak-E80C-HPG7.5 免疫原性检测
野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG7.5诱导Balb/c小鼠产生特异性抗体的能力
具体实验步骤与实施例1相同。
动物实验结果显示：与野生型wt-sak诱导的抗体滴度（滴度为80000）对比，突变体Sak-E80C-HPG7.5所诱导特异性抗体滴度（滴度为16000）显著下降（p<0.05）。
(6)野生型Sak及其聚乙二醇化葡激酶突变体Sak-E80C-HPG7.5在新西兰兔体内的药代动力学
Sak-E80C-HPG7.5的药代动力学研究实验方法、所用药物剂量、采样方法与实施例1完全相同，差异仅是使用Sak-E80C-HPG7.5代替Sak-E80C-HPG5。
采用3p87药代动力学软件在微机上拟合药物浓度-时间曲线，计算药代动力学参数。结果表明，野生型w-Sak的血浆分布半衰期（t1/2a）为3.4 min，血浆清除率为13.1±0.3 ml/min；而聚乙二醇化葡激酶突变体E Sak-80C-HPG7.5的t1/2a为8.6 min，血浆半衰期比野生型wt-Sak显著延长（p<0.05）,血浆清除率为4.5±0.2 ml/min, 血浆清除率比野生型Sak显著降低（p<0.05）。
实施例 4
(1)葡激酶突变体 Sak-E80C 的诱导表达
将表达突变体Sak-E80C的工程菌接种于2L的M9CA(Na2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4，葡萄糖，酪蛋白水解物)液体培养基中，首先在37℃培养6h，再升温到42℃诱导表达4h；然后，进行4℃、5,000rpm高速离心10min收菌，用含有10mM EDTA和0.01M二硫苏糖醇的NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）800ml悬浮菌体进行超声破碎（分两次超声），功率400W，每次40min循环破碎，共破碎6次（显微镜下镜检确定细胞破碎完全）。破碎后4℃、12,000rpm高速离心10min 收集上清液800ml。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示，表达量约占菌体蛋白总量的40％～45％。
(2)葡激酶突变体Sak-E80C 的初步分离纯化
将离心上清液pH调至5，用蠕动泵加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.7×30 cm）中，上样完成后，以50mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5） 洗脱至基线，然后用含 80-1000mM NaCl和0.01M二硫苏糖醇的 50mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5）进行梯度洗脱，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C的收集液。
用无菌注射器将含Sak-E80C的收集液加入到Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）中（上样量为胶体积的5%左右），然后用含0.01M二硫苏糖醇的50mM NaAc-HAc缓冲液(pH 5)进行冲洗，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C的收集液。
(3)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物(Sak-E80C-HPG5)的制备
用Bradford 法 (Bio-Rad试剂盒)测定经Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）获得的收集液中Sak-E80C的浓度，使用分子量为5000，羟基马来酰亚胺聚乙二醇（MAL-PEG-OH: Maleimide PEG Hydroxyl）修饰Sak-E80C，按照摩尔比，Sak-E80C：修饰剂=1:3，在室温环境下反应5h。
修饰完成后，将反应修饰液用蠕动泵加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.5×25 cm）中，上样完成后，以50mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5）洗脱至基线，然后用含200mM NaCl的 50mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5）进行洗脱，收集相应组分。
将经SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱获得的收集液用无菌注射器加入到Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱（2.6×100 cm）中（上样量为胶体积的5%左右），然后用50mM Tris-HCl缓冲液（pH 9）进行冲洗,收集相应组分，用SDS-PAGE 电泳鉴定，以确定含有聚乙二醇-葡激酶偶联物Sak-E80C-HPG5 的收集液。
将经过Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱（2.6×100 cm）获得的含聚乙二醇-葡激酶偶联物 Sak-E80C-HPG5 的相应收集液，用蠕动泵加入到Q-Sepharose FF阴离子交换层析柱（2.5×25 cm）中，上样完成后，以50mM Tris-HCl缓冲液（pH 9）洗脱至基线，然后用含有200mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液（pH 9）进行洗脱，收集相应组分，将收集液pH调至7.4后分装到无菌的西林瓶中，进行冷冻干燥。
(4)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物 Sak-E80C-HPG5 纯品的表征
纯度检测:SEC-HPLC 流动相：0.02M PBS； 层析柱：Thermo BioBasic SEC-300、5um、150×7.8（mm）；流速：0.2ml/min；
将冻干粉末用0.02M PBS复溶，SEC-HPLC检测纯度。
SEC-HPLC检测结果显示：Sak-E80C-HPG5冻干纯品纯度高达98%以上。
活性检测方法：酪蛋白平板溶圈法，具体实验步骤与实施例1相同。
检测显示： Sak-E80C-HPG5的比活性为11.3×104， wt-sak的比活性为9.7×104，Sak-E80C-HPG5相比活性稍强。
(5)干粉纯品免疫原性检测
野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG5诱导Balb/c小鼠产生特异性抗体的能力的具体实验步骤与实施例1相同。
实验结果显示：与野生型wt-sak诱导的抗体滴度（滴度为80000）对比，突变体Sak-E80C-HPG5所诱导特异性抗体滴度（滴度为20000）显著下降（p<0.05）。
实施例5
(1)葡激酶突变体 Sak-E80C 的诱导表达
将表达突变体Sak-E80C的工程菌接种于2L的M9CA(Na2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4，葡萄糖，酪蛋白水解物)液体培养基中，首先在37℃培养6h，然后升温到42℃诱导表达4h，进行4℃、10,000rpm高速离心10min收菌，用含有10mM EDTA和0.01M二硫苏糖醇的20mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.6）800ml悬浮菌体进行超声破碎（分两次超声），功率400W，每次40min循环破碎，共破碎6次（显微镜下镜检确定细胞破碎完全）。破碎后4℃、12,000rpm高速离心10min 收集上清液800ml。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示，表达量约占菌体蛋白总量的40％～45％。
(2)葡激酶突变体 Sak-E80C 的初步分离纯化
将离心上清液pH值调至6，用蠕动泵加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.7×30 cm）中，上样完成后，以10mM NaAc-HAc缓冲液（pH 6） 洗脱至基线，然后用含 80-1000mM NaCl和0.01M二硫苏糖醇的 10mM NaAc-HAc缓冲液（pH 6）进行梯度洗脱，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C的收集液。
用无菌注射器将含Sak-E80C的收集液加入到Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）中（上样量为胶体积的5%左右），然后用含0.01M二硫苏糖醇的10mM NaAc-HAc缓冲液(pH 6)进行冲洗，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C的收集液。
(3)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物（Sak-E80C-HPG5）的制备和纯化
用Bradford 法 (Bio-Rad试剂盒)测定经Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）获得的收集液中Sak-E80C的浓度，使用分子量为5000，羟基马来酰亚胺聚乙二醇（MAL-PEG-OH: Maleimide PEG Hydroxyl）修饰Sak-E80C，按照摩尔比，Sak-E80C：修饰剂=1:5，在室温环境下反应5h。
修饰完成后，将反应修饰液用蠕动泵加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.5×25 cm）中，上样完成后，以10mM NaAc-HAc缓冲液（pH 6）洗脱至基线，然后用含100mM NaCl的 10mM NaAc-HAc缓冲液（pH6）进行洗脱，收集相应组分。
将经SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱获得的收集液用无菌注射器加入到Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱（2.6×100 cm）中（上样量为胶体积的5%左右），然后用10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）进行冲洗,分别收集完全分开的两个洗脱峰，用SDS-PAGE 电泳分析显示，其中一个洗脱峰主要成分为聚乙二醇-葡激酶偶联物（HO-PEG-MAL- Sak-E80C-HPG5；Sak-E80C-HPG5），另一洗脱峰主要为未被修饰的Sak-E80C。
将经过Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱（2.6×100 cm）获得的含聚乙二醇-葡激酶偶联物(Sak-E80C-HPG5)的相应收集液，用蠕动泵加入到Q-Sepharose FF阴离子交换层析柱（2.5×25 cm）中，上样完成后，以10mM Tris-HCl缓冲液洗（pH 8）脱至基线，然后用含100mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）进行洗脱，收集相应组分，将收集液pH调至7.4后分装到无菌的西林瓶中，进行冷冻干燥。
(4)聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物 Sak-E80C-HPG5 纯品的表征
纯度检测:SEC-HPLC 流动相：0.02M PBS；层析柱：Thermo BioBasic SEC-300 、5um 、150×7.8（mm）；流速：0.2ml/min；
将冻干粉末用0.02M PBS复溶，SEC-HPLC检测纯度。
SEC-HPLC检测结果显示：Sak-E80C-HPG5冻干纯品纯度高达98%以上。
活性检测方法：酪蛋白平板溶圈法， 具体实验步骤与实施例1相同。
检测显示：Sak-E80C-HPG5的比活性为11.0×104， wt-sak的比活性为9.7×104，Sak-E80C-HPG5相比活性稍强。
(5)干粉纯品免疫原性检测
野生型wt-Sak和Sak-E80C-HPG5诱导Balb/c小鼠产生特异性抗体的能力的具体实验步骤与实施例1相同。
动物实验结果显示：与野生型wt-sak诱导的抗体滴度（滴度为80000）对比，突变体Sak-E80C-HPG5所诱导特异性抗体滴度（滴度为20000）显著下降（p<0.05）。
| 实施例一 | 实施例二 | 实施例三 | 实施例四 | 实施例五 | |
| 总蛋白的质量（g） | 3.20 | 3.86 | 4.05 | 4.12 | 3.94 |
| 目的蛋白表达量（%） | 43.5 | 41.7 | 42.4 | 42.8 | 42.3 |
| E80C-HPG的质量（g） | 0.596 | 0.681 | 0.72 | 0.714 | 0.685 |
| 目的蛋白干粉纯度（%） | 98.3 | 98.1 | 98.7 | 98.5 | 98.3 |
附表1：各实施例中主要实验数据
Claims (1)
1.一种聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将表达葡激酶突变体Sak-E80C的工程菌接种于液体培养基中，37℃培养6h后，升温至42℃诱导培养4h，然后，4℃、5000 rpm离心10 分钟收菌，弃上清，用pH=5-6、含有0.01M EDTA和0.01M二硫苏糖醇的0.02M NaAC-HAC缓冲液，悬浮菌体进行超声破碎，破碎后4℃、12000 rpm高速离心20 min，收集上清液；
（2）将上清液pH调至5.6，加入到SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.7×30 cm）中，然后用pH=5-6、含有80-1000mM NaCl和0.01M二硫苏糖醇的10-50mM NaAc-HAc缓冲液进行洗脱，分别收集洗脱组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定突变体葡激酶Sak-E80C所在的洗脱峰，从而确定含Sak-E80C的收集液；
将含Sak-E80C的收集液加入到Sephadex G-50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）中，上样量为凝胶体积的5%，然后用pH=5-6、含0.01M二硫苏糖醇的10-50mM NaAc-HAc缓冲液进行冲洗，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含Sak-E80C的收集液；
（3）用Bradford 法测定收集液中Sak-E80C的浓度，然后按照摩尔比，Sak-E80C：羟基-马来酰亚胺聚乙二醇 =1:（3-10），在室温下，反应进行3-5小时，修饰完成后，用SDS-PAGE电泳和SEC-HPLC分析聚乙二醇-葡激酶偶联物(HO-PEG-MAL-Sak-E80C；Sak-E80C-HPG)的产率；
将修饰反应液加入SP-Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.6×25 cm）中，然后用pH=5-6、含有100-200mM NaCl 的10-50mM NaAc-HAc缓冲液进行洗脱，收集相应组分；
将SP-Sepharose FF阳离子交换层析获得的收集液加入到 Toyopearl HW-50F凝胶过滤层析柱（2.6×100 cm）中，上样量为凝胶体积的5%，然后用pH=8-9、10-50mM Tris-HCl缓冲液进行冲洗, 分别收集两个主要洗脱峰，用SDS-PAGE电泳显示，其中一个洗脱峰主要成分为聚乙二醇-葡激酶偶联物（HO-PEG-MAL- Sak-E80C-HPG；Sak-E80C-HPG），另一洗脱峰主要为未被修饰的Sak-E80C；
将含有Sak-E80C-HPG的收集液加入到 Q-Sepharose FF阴离子交换层柱（1.5×15 cm）中，然后用pH=8-9、含有100-200mM NaCl 的10-50 mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集相应组分，用SDS-PAGE电泳分析，以确定含有Sak-E80C-HPG的收集液，最后将含有Sak-E80C-HPG的收集液分装，进行冷冻干燥得到产品。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150121 |