发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷,提供一种稳定、高效、特异性高的抗新型隐球菌荚膜多糖抗原GXM的多克隆抗体及其制备方法。
为实现上述目的,本发明一方面提供一种抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体,按以下步骤制得:
(1)用灭活的新型隐球菌菌体作为免疫原免疫动物,经分离纯化后得到初步纯化的多克隆抗体;
(2)将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原交联于亲和层析基质,得到新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱;
(3)步骤(1)得到的初步纯化的多克隆抗体经步骤(2)得到的免疫亲和层析柱纯化后,得到抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体。
优选的,所述步骤(1)中,将灭活的新型隐球菌菌体进行破碎,用破碎后的新型隐球菌菌体作为免疫原;更优选的,可采用反复冻融法、超声破碎法、高速离心法、高速组织捣碎法和渗透压差法中的一种或几种进行破碎;更优选的,采用反复冻融法和/或超声破碎法进行破碎。
优选的,所述步骤(1)中,动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴中的一种或多种。
优选的,所述步骤(1)中,免疫采用皮下注射法、脾内注射法、静脉注射法、腹腔注射法中的一种;所述的免疫的免疫剂量依照动物的种类确定,优选为10-1000μg/只/次。
优选的,为获得较好的免疫效果,所述步骤(1)中,每隔5-9天(优选6-8天,更优选为7天)测定免疫后动物的血清效价;免疫次数优选为3-5次,例如4次。
优选的,所述步骤(1)中,分离纯化的方法包括饱和硫酸铵盐析法、辛酸沉淀法、DEAE离子交换层析法、羟基磷灰石层析法、凝胶层析法等。优选的,采用饱和硫酸铵盐析法进行分离纯化。
在本发明一个具体的实施方式中,所述步骤(1)具体包括:用反复冻融法和超声破碎法将灭活的新型隐球菌菌体进行破碎,用破碎后的新型隐球菌菌体免疫动物;测定免疫后动物的血清效价,从免疫后的动物体内取血;用饱和硫酸铵盐析法进行纯化,得到初步纯化的多克隆抗体。
优选的,所述步骤(2)中,所述亲和层析基质选自蛋白A微珠、蛋白G微珠、活性微珠;更优选为蛋白A微珠。
优选的,所述步骤(2)中,所述新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原与亲和层析基质的比例为:每1mL亲和层析基质结合1-4mg新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原。
优选的,所述步骤(2)中,采用双功能结合剂将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原交联于亲和层析基质,所述双双功能结合剂选自二甲基庚二酸酯、羰基二咪唑、溴化氰、羟基丁二酰亚胺、乙酰基碘,优选二甲基庚二酸酯。
在本发明一个具体的实施方式中,所述步骤(2)具体包括如下步骤:
将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原溶于碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液中,并与亲和层析基质混合成匀浆,其中,每1mL蛋白A微珠结合1-4mg新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原;
用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液洗涤得到的匀浆,并离心,得到抗原与亲和层析基质的混合物,其中,硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5,用量为5-15倍亲和层析基质体积;
用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液重悬得到的抗原与亲和层析基质的混合物,向得到的混悬液中加入二甲基庚二酸酯,室温孵育20-40min,并混匀,液固分离,得到亲和层析基质-抗原交联复合物,其中,硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5,用量为5-15倍亲和层析基质体积,二甲基庚二酸酯在混悬液中的终浓度为10-30mmol/L;
用0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液洗涤得到的亲和层析基质-抗原交联复合物;
将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物重悬于0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液中,室温孵育1.5-2.5h,混匀;
将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物填充入层析柱中,制得新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱。
优选的,所述步骤(3)具体包括如下步骤:
用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱;
将步骤(1)初步纯化的抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体上样;
用10-25倍柱床体积的结合缓冲液洗柱;
用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱;
采用分段洗脱法,连续以0.4-0.8倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱,分别收集洗脱组分,得到抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体。
在本发明一个具体实施方式中,所述结合缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种,优选为PBS缓冲液;所述预洗脱缓冲液为碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液;所述洗脱缓冲液选自0.1M甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液,pH为3.0。
在本发明一个具体的实施方式中,检测各洗脱组分中的多克隆抗体含量,将浓度高的多克隆抗体洗脱组分合并。此外,可用10-25倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱,使所述免疫亲和层析柱再生,当加入0.01%硫柳汞时,免疫亲和层析柱可长期保存于4℃的环境中。
本发明还提供了一种抗新型隐球菌荚膜多糖抗原GXM的多克隆抗体的制备方法,包括如下步骤:
(1)用灭活的新型隐球菌菌体作为免疫原免疫动物,经分离纯化后得到初步纯化的多克隆抗体;
(2)将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原交联于亲和层析基质,得到新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱;
(3)步骤(1)得到的初步纯化的多克隆抗体经步骤(2)得到的免疫亲和层析柱纯化后,得到抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体。
优选的,所述步骤(1)中,将灭活的新型隐球菌菌体进行破碎,用破碎后的新型隐球菌菌体作为免疫原;更优选的,可采用反复冻融法、超声破碎法、高速离心法、高速组织捣碎法和渗透压差法中的一种或几种进行破碎;更优选的,采用反复冻融法和/或超声破碎法进行破碎。
优选的,所述步骤(1)中,动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴中的一种或多种。
优选的,所述步骤(1)中,免疫采用皮下注射法、脾内注射法、静脉注射法、腹腔注射法中的一种;所述的免疫的免疫剂量依照动物的种类确定,优选为10-1000μg/只/次。
优选的,为获得较好的免疫效果,所述步骤(1)中,每隔5-9天(优选6-8天,更优选为7天)测定免疫后动物的血清效价;免疫次数优选为3-5次,例如4次。
优选的,所述步骤(1)中,分离纯化的方法包括饱和硫酸铵盐析法、辛酸沉淀法、DEAE离子交换层析法、羟基磷灰石层析法、凝胶层析法等。优选的,采用饱和硫酸铵盐析法进行分离纯化。
在本发明一个具体的实施方式中,所述步骤(1)具体包括:用反复冻融法和超声破碎法将灭活的新型隐球菌菌体进行破碎,用破碎后的新型隐球菌菌体免疫动物;测定免疫后动物的血清效价,从免疫后的动物体内取血;用饱和硫酸铵盐析法进行纯化,得到初步纯化的多克隆抗体。
优选的,所述步骤(2)中,所述亲和层析基质选自蛋白A微珠、蛋白G微珠、活性微珠;更优选为蛋白A微珠。
优选的,所述步骤(2)中,所述新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原与亲和层析基质的比例为:每1mL亲和层析基质结合1-4mg新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原。
优选的,所述步骤(2)中,采用双功能结合剂将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原交联于亲和层析基质,所述双双功能结合剂选自二甲基庚二酸酯、羰基二咪唑、溴化氰、羟基丁二酰亚胺、乙酰基碘,优选二甲基庚二酸酯。
在本发明一个具体的实施方式中,所述步骤(2)具体包括如下步骤:
将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原溶于碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液中,并与亲和层析基质混合成匀浆,其中,每1mL亲和层析基质结合1-4mg新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原;
用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液洗涤得到的匀浆,并离心,得到抗原与亲和层析基质的混合物,其中,硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5,用量为5-15倍亲和层析基质体积;
用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液重悬得到的抗原与亲和层析基质的混合物,向得到的混悬液中加入二甲基庚二酸酯,室温孵育20-40min,并混匀,液固分离,得到亲和层析基质-抗原交联复合物,其中,硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5,用量为5-15倍亲和层析基质体积,二甲基庚二酸酯在混悬液中的终浓度为10-30mmol/L;
用0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液洗涤得到的亲和层析基质-抗原交联复合物;
将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物重悬于0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液中,室温孵育1.5-2.5h,混匀;
将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物填充入层析柱中,制得新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱。
优选的,所述步骤(3)具体包括如下步骤:
用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱;
将步骤(1)初步纯化的抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体上样;
用10-25倍柱床体积的结合缓冲液洗柱;
用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱;
采用分段洗脱法,连续以0.4-0.8倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱,分别收集洗脱组分,得到抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体。
在本发明一个具体实施方式中,所述结合缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种,优选为PBS缓冲液;所述预洗脱缓冲液为碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液;所述洗脱缓冲液选自0.1M甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液,pH为3.0。
在本发明一个具体的实施方式中,检测各洗脱组分中的多克隆抗体含量,将浓度高的多克隆抗体洗脱组分合并。此外,可用10-25倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱,使所述免疫亲和层析柱再生,当加入0.01%硫柳汞时,免疫亲和层析柱可长期保存于4℃的环境中。
本发明还一方面提供一种用于检测新型隐球菌的试剂盒,所述试剂盒包括如本发明所述的抗新型隐球菌荚膜多糖抗原的多克隆抗体或者如本发明所述的制备方法制备得到的抗新型隐球菌荚膜多糖抗原的多克隆抗体。
优选的,所述试剂盒还包括稀释剂,所述稀释剂选自生理盐水、磷酸盐缓冲液,PBS缓冲液,Tris-HCl缓冲液,硼酸盐缓冲液,琥珀酸盐缓冲液,或柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
优选的,所述试剂盒还可包括一种或多种药学上可接受的药物载体和/或赋形剂,其在使用时通常可冻干保存。
优选的,所述试剂盒还可包括酶标试剂,显色剂,终止液,洗涤液等。
本发明采用新型隐球菌灭活菌体作为免疫原产生多克隆抗体,并采用新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原对多克隆抗体进行特异性纯化,本发明得到的多克隆抗体为国内首例使用免疫亲和层析提纯的抗新型隐球菌荚膜多糖抗原的多克隆抗体,填补了国内空白。实验证明,用本发明所述方法制得的多克隆抗体具有效价高,特异性好的特点,且多克隆抗体性质稳定,有很强的应用前景。