CN104977419A - 一种自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种自身免疫性抗原（简称自免原）阳性血清的纯化制备方法，包括用自身免疫性抗原对健康动物进行免疫、采血获得抗血清的步骤和对抗血清进行纯化获得阳性血清的步骤，纯化的具体方法为：对抗血清进行亲和纯化得到IgG抗体；将IgG抗体和人源IgGFc或人源IgMFc或人源IgAFc按质量比为1:1～2偶联后，经分离纯化获得IgG-IgGFc连接物浓溶液或IgG-IgMFc连接物浓溶液或IgG-IgAFc连接物浓溶液，然后稀释至浓度为0.5～1μg/ml，即得阳性血清。本发明方法可批量制备各种自身免疫性抗原的阳性血清，并且本制备方法简单易行。

Description

一种自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法。
背景技术
正常情况下，机体将自身组织成分识别为“自我”，一般不对其产生免疫应答，此为自身耐受。自身耐受的产生是由于在胚胎期发育的淋巴细胞克隆，凡能识别自身组织的均被破坏或禁忌，即Bumet的禁忌克隆学说。但在某些情况下，自身耐受遭到破坏，禁忌细胞株活跃，机体免疫系统针对某些自身组织成分产生了免疫应答，就可能导致自身免疫病的发生。发生自身免疫病的关键是机体产生了针对自身组织成分的自身抗体或致敏的T淋巴细胞，并在体内发生了自身免疫应答，导致自身组织细胞的损伤。机体为什么会产生自身抗体及致敏T细胞，其原因是非常复杂的，据研究与以下因素有关。
一、自身抗原的出现
(一)隐蔽抗原的释放
隐蔽抗原(sequestered antigen)是指体内某些组织成分如精子、眼内溶物、脑等，在正常情况下从未与免疫细胞接触过，其相对应的淋巴细胞克隆仍存在，并具免疫活性。一旦因手术、外伤、感染等原因破坏隔绝屏障，隐蔽抗原释放入血流或淋巴液，便与免疫系统接触。免疫系统将其误认为是“异物”，引发自身免疫应答，导致自身免疫病的发生。
(二)自身成分的改变
自身成分在受到物理因素(如冷、热、电离辐射)、化学因素(如药物)或生物因素(如细菌、病毒等)作用后，均可使其抗原性发生变化。改变了的自身成分可刺激免疫系统引起自身免疫应答，导致自身免疫性疾病。
(三)共同抗原引发的交叉反应
某些细菌、病毒与正常人体某些组织细胞上有相类似的抗原决定簇，针对这些细菌、病毒抗原决定簇产生的自身抗体和致敏淋巴细胞可与自身组织细胞发生交叉反应，引起自身免疫性疾病。
二、免疫调节异常
(一)淋巴细胞旁路活化
正常情况下，体内存在针对自身抗原的T/B淋巴细胞克隆。一般Th淋巴细胞对自身成分是处于耐受状态，B淋巴细胞仍能对自身成分发生应答。由于无Th细胞辅助，故正常情况下不出现自身免疫应答。某些外来抗原具有与自身成分相似或相同的B细胞识别的决定簇，但由于T细胞识别的载体决定簇不同，识别自身成分载体决定簇的Th细胞处于耐受状态，而识别外来抗原载体决定簇的Th细胞能被激活发生反应，故外来抗原可辅助B细胞产生免疫应答，即称为Th细胞旁路活化，从而引发自身免疫应答。
(二)多克隆刺激剂的旁路活化
某些多克隆刺激剂如EB病毒和超抗原，可激活处于耐受状态的Th细胞或者直接向B细胞发出辅助信号刺激其产生自身抗体，引发自身免疫应答。
(三)辅助刺激因子表达异常
在免疫应答过程中，免疫活性细胞的激活，除了免疫活性细胞对抗原递呈细胞表面的抗原肽复合物识别外，还必须有两细胞间辅助刺激因子的相互作用。如抗原递呈细胞表面辅助刺激因子的异常表达，便可激活自身免疫应答的T细胞，引发自身免疫性疾病。
此外，Thl和Th2细胞的功能失衡和自身免疫性疾病的发生也有一定关系。
三、Fas/FasL表达异常
Fas/FasL表达异常和自身免疫病的发生有关，Fas属TNFR/NGFR家族成员(又称CD95)，普遍表达于多种细胞包括淋巴细胞表面。其配体即FasL(Fas ligand)通常出现于活化的T细胞如CTL和NK细胞膜上，又可以分泌脱落至细胞外。无论是膜结合型或是游离型的FasL，与细胞膜上的Fas结合后均可诱导细胞凋亡。在Fas/FasL基因缺陷的患者体内，因为激活诱导自身免疫应答的淋巴细胞凋亡机制受损，T、B淋巴细胞克隆性增殖失控，故易发生多种自身免疫性疾病。
四、遗传因素
人类的自身免疫性疾病常有家族遗传倾向。研究中发现多种自身免疫性疾病的发生率与HLA的某些基因型检出率呈正相关。大多数HLA系统与自身免疫性疾病的相关性表现在HLA-B或DR抗原上。
如公布号为CN103018436A，公布日为2013-4-3的一种用家兔制备鸡传染性支气管炎阳性血清的方法，其在经过免疫取血后，仅将血液分离出血清，对血清进行离心过滤就得到阳性血清。但是，该阳性血清存在使用效果不好的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种使用效果优良的自身免疫性抗原(自免原)阳性血清的纯化制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，包括用自身免疫性抗原对健康动物进行免疫、采血后获得抗血清的步骤和对所述的抗血清进行纯化获得阳性血清的步骤，所述的纯化的具体方法为：
对所述的抗血清进行亲和纯化得到IgG抗体；将所述的IgG抗体和人源IgG Fc或人源IgM Fc或人源IgA Fc按质量比为1:1～2偶联后，经分离纯化获得IgG-IgG Fc连接物浓溶液或IgG-IgM Fc连接物浓溶液或IgG-IgA Fc连接物浓溶液，将所述的IgG-IgG Fc连接物浓溶液或IgG-IgM Fc连接物浓溶液或IgG-IgA Fc连接物浓溶液稀释至浓度为0.5～1μg/ml，即得所述的阳性血清。
优选地，采用琼脂糖亲和介质或者采用免疫亲和层析柱进行所述的亲和纯化。
进一步优选地，所述的琼脂糖亲和介质为Protein-A sepharose CL-4B。
进一步优选地，所述的免疫亲和层析柱为所述的自身免疫性抗原与琼脂糖凝胶连接成的亲和层析柱。
进一步优选地，所述的抗血清先经过硫酸铵处理后，再采用所述的免疫亲和层析柱进行所述的亲和纯化。
优选地，所述的人源IgG Fc或人源IgM Fc或人源IgA Fc，是将人源IgG或人源IgM或人源IgA溶解在木瓜蛋白酶消化液中，再用木瓜蛋白酶消化，再用碘乙酰胺终止消化反应后，用琼脂糖亲和介质提取获得的。
优选地，所述的IgG抗体和所述的人源IgG Fc或人源IgM Fc或人源IgAFc通过2-亚胺四氢噻吩偶联剂或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯偶联剂活化后，在pH 7.2～7.4的条件下进行所述的偶联。
进一步优选地，所述的2-亚胺四氢噻吩偶联剂的浓度为9～11mg/ml，所述的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯偶联剂的浓度为4～6mg/ml。
进一步优选地，采用Sephadex 200凝胶纯化柱进行所述的分离纯化。
进一步优选地，采用含质量比为0.4～0.6％的牛血清白蛋白、pH7.5～8.5、0.09～0.11mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液将所述的IgG-IgG Fc连接物浓溶液或IgG-IgM Fc连接物浓溶液或IgG-IgA Fc连接物浓溶液进行所述的稀释。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
我们可以根据市场需要来有计划的生产(从几毫升到几千毫升)，并且可以有效的控制批间差异。这是目前流行的阳性血清的制备方法无法做到的。另外，我们用人源的IgG Fc或IgM Fc或IgA Fc与抗血清中的IgG抗体连接，相比用人源IgG或IgM或IgA与抗体IgG直接连接分子量要小，这样就可以尽量避免交叉反应的发生。这样我们在提高特异性的同时，又能够在阳性血清上有效的保留了二抗的结合位点。
本发明方法可批量制备各种自身免疫性抗原的阳性血清，解决了检测试剂盒制备过程中的阳性质控问题，也可以作为校准品的生产原料，并且本制备方法简单易行。
附图说明
附图1为兔抗自免源抗体IgG-IgG Fc分离纯化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。
实施例1
(一)自身免疫性抗原的免疫和兔抗血清效价测定
材料与仪器
1、自身免疫性抗原：自身免疫性抗原冻干粉，自身免疫性抗原为LC-1；
2、佐剂：弗氏完全佐剂，购自sigma公司，货号(F5881)；弗氏不完全佐剂，购自sigma公司，货号(F5506)；
3、动物：选3只(每种自身免疫性抗原免疫3只兔子)2月龄、体重1.5～2.0kg的健康新西兰大白兔；
4、二抗：HRP标记的羊抗兔IgG；
5、耗材：三通器、一次性注射器、移液器等。
免疫步骤
1、免疫自身免疫性抗原准备：用BCA蛋白质测定法确定冻干粉溶解后自身免疫性抗原的浓度，取4mg自身免疫性抗原，并用PBS将其稀释至600μL，用三通器将自身免疫性抗原与完全佐剂或不完全佐剂(自身免疫性抗原V:佐剂V＝6:5)乳化，直至将一滴乳液滴入水中呈现球形而不分散则自身免疫性抗原准备好。首次免疫用弗氏完全佐剂，后续免疫均用弗氏不完全佐剂。
2、动物免疫：将购买的3只新西兰大白兔在动物房养殖1周，使动物适应环境；将制备好的乳液，用1ml注射器进行足垫、颈部或背部皮下免疫注射，每只新西兰大白兔注射3点，每点注射300μL；免疫周期为14天。
3、抗血清的制备：每只动物免疫前先于一侧耳缘静脉抽取2mL血(作为空白对照)，之后每次免疫14天后，下次免疫前进行耳缘静脉取血用于抗血清评价；取血后取下针头，将注射器中的血缓缓转移至离心管中，于4℃冰箱中过夜，，取上清即为血清，析出淡黄色抗血清；将抗血清转移至另一管中，血凝块以1500xg离心10min。吸出上清液合并收集到的抗血清管中；抗血清分装保存于－70℃。
4、抗血清效价的测定：采用酶联免疫吸附测定(enzyme linkedimmunosorbent assay；ELISA)，用包被缓冲液将自身免疫性抗原(LC-1)稀释至10μg/ml，除阴性孔外每孔加100μL即1μg，4℃包被过夜；阴性对照1包被1μg PCNA，4℃包被过夜；阴性对照2包被Scl-70，4℃包被过夜；空白对照1：免疫自身免疫性抗原前取血；空白对照2：不含一抗抗体的一抗孵育封闭液；空白对照3：HRP标记的羊抗兔IgG孵育封闭液；其余孔为按1:100、1:200倍比稀释的抗血清，进行效价测定。每次效价测定时平行进行上次收集抗血清的效价测定，免疫前后抗血效价相近时，则可以终止免疫杀兔取血，如果效价还有明显提高则继续免疫。
以LC-1免疫兔后抗血清评价结果表1：
表1
A B
名称 OD值 OD值
阴性对照1 0.066 0.073
阴性对照2 0.072 0.069
空白对照1 0.065 0.066
空白对照2 0.072 0.075
空白对照3 0.068 0.065
1:100 3.401 3.359
1:200 3.357 3.321
1:400 3.279 3.173
1:800 2.987 2.997
1:1600 2.873 2.816
1:3200 2.432 2.653
1:6400 1.754 1.697
1:12800 0.897 0.902
1:25600 0.532 0.553
1:51200 0.299 0.279
1:102400 0.175 0.189
1:200000 0.093 0.103
1:400000 0.065 0.066
1:800000 0.068 0.066
1:1600000 0.065 0.067
注：A列数据为免疫6次后测定的抗血清效价；B列数据为免疫7次后测定的抗血清效价
从上述表格中可以看出兔免疫6次和7次后，抗血清效价基本趋于稳定，按照实验设计评价的血清梯度为1:100-1:1600000，其中当血清稀释至1：102400时，OD值为空白孔的2倍左右，判断为阳性有效价，但当再进行稀释时OD值基本等于空白值或不到空白对照值的两倍，判断为无效价。A1-A2和B1-B2为阴性对照，从数值可以看出获取的兔抗血清与其他自身免疫性抗原没有反应性；A3-A5和B3-B5为空白对照，可以看出自身免疫性抗原与免疫前的兔血清、与二抗均不会产生非特异反应；其他孔的反应为LC-1和兔抗LC-1自身免疫性抗原的特异性反应。
(二)抗血清的亲和纯化
材料与仪器
1、仪器：Protein-A sepharose CL-4B、蠕动泵、离心管、离心机、过滤器、玻璃柱、分光光度计；
2、TBS缓冲溶液：6.06g Tris(50mM)，8.78g NaCl(150mM)以及0.5g叠氮化钠(0.05％)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH 7.4；
3、中和缓冲溶液：121.2g Tris(1M),87.8g NaCl(1.5M),0.37g EDTA(1mM)及5g叠氮化钠(0.5％)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH 8.0；
4、洗脱缓冲溶液(pH2.7)：将3.75g甘氨酸(50mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH 2.7；
5、洗脱缓冲溶液(pH1.9)：将3.75g甘氨酸(50mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH 1.9。
操作步骤
1、在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空约15min以除去填料中的气泡，否则在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。将Protein-A sepharose CL-4B缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1ml/min～2ml/min，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。
2、将制备得到的抗血清放入冰水或4℃冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37℃预热而溶解。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05％，4℃，15000xg离心5min，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂。
3、将溶解后的抗血清用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5ml的速度将抗血清上到柱上，为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至A 280nm<0.008后加pH 2.7洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100μL中和缓冲溶液的1.5ml EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH值，如果pH值低于7可利用中和缓冲液调至约pH 7.4以防止抗体的变性；
在柱中加入10ml、pH 1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至280nm<0.008；
利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于0.5mg/ml可加入10％的甘油以便保存，将纯化的IgG抗体分装后在2℃～8℃保存；
用含0.05％叠氮化钠的TBS缓冲溶液清洗柱子后将柱子储存在2℃～8℃环境。
(三)IgG抗体与人源IgG Fc偶联
材料与仪器
1、人源IgG Fc，由苏州浩欧博生物医药有限公司研制，以磷酸盐缓冲液保存；
2、木瓜蛋白酶消化液(Papain溶解液)：0.1M Tris、2mM EDTA、pH8.0。
3、Papain，购自Sigma公司；Iodoacetamide，购自Sigma公司；Protein-A购自GE公司；
4、偶联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，2-亚胺四氢噻吩(2-IT)购自THERMO公司，三羟甲基氨基甲烷(TRIS)等化学试剂均达到化学纯；
6、G-25凝胶柱和Sephadex 200凝胶纯化柱为GE公司产品。
操作步骤
1、将人源IgG溶解在Papain消化液中，再用木瓜蛋白酶消化，再用Iodoacetamide终止消化反应。然后用Protein-A提取出来Fc。
2、取1mg IgG抗体，并加入3μL的10mg/ml的偶联剂2-IT溶液，室温静置20min，加入10μL 0.1mol/L的甘氨酸溶液，在室温静置5min。用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，5℃保存备用；
3、取1.5mg的人源IgG Fc溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液15μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，5℃保存备用；
4、将上述活化的IgG抗体与活化的人源IgG Fc混合，在pH 7.3的条件下静置反应20小时，用Sephadex 200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得连接物浓溶液，5℃保存备用；
5、将IgG-IgG Fc连接物浓溶液用含0.5％牛血清白蛋白、pH8.0、0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到0.5μg/ml，即得LC-1自身免疫性抗原的阳性血清。
(四)用欧蒙公司生产的自免原(LC-1)IgG抗体检测盒对实施例1制备得到的阳性血清进行测定，结果如表2：
表2
注：欧蒙自免抗体IgG(IgM,IgA)检测：cut off值为20RU/mL
从表2可见，3批次(LOT 140325、LOT 140513、LOT 140719)的阳性血清质控样本，用欧蒙自身免疫性抗原IgG检测试剂盒测定为阳性样本，3倍、9倍稀释后仍为阳性。另外从表格中可以看到，指控样本倍比稀释后，测定值也为倍比稀释的。综合说明我们的样本制备成功，可以作为样本用于试剂盒的质控。
实施例2
(一)自身免疫性抗原的免疫和兔抗血清效价测定
材料与仪器
1、自身免疫性抗原：自身免疫性抗原冻干粉，自身免疫性抗原为PCNA；
2、佐剂：弗氏完全佐剂，购自sigma公司，货号(F5881)；弗氏不完全佐剂，购自sigma公司，货号(F5506)；
3、动物：选3只(每种自身免疫性抗原免疫3只兔子)2月龄、体重1.5～2.0kg的健康新西兰大白兔；
4、二抗：AP标记的羊抗兔IgG；
5、耗材：三通器、一次性注射器、移液器等。
免疫步骤
1、免疫自身免疫性抗原准备：用BCA蛋白质测定法来确定冻干粉溶解后自身免疫性抗原的浓度，首次免疫分别取0.05mg、0.15mg和0.2mg自身免疫性抗原用PBS稀释至300μl，将自身免疫性抗原与弗氏完全佐剂0.8:1(体积比)混合，混匀方式是用移液器吹打混合物10次以上，混匀产物必须马上进行免疫；第二次以后的免疫都是取0.05mg、0.15mg和0.2mg自身免疫性抗原用PBS稀释至500μL，与弗式不完全佐剂0.8:1(体积比)混合，其余步骤同首次免疫。
2、动物免疫：将购买的3只新西兰大白兔在动物房养殖1周，使动物适应环境；将制备好的乳白色混合物，首次免疫用1ml注射器取混合0.5ml进行兔子的足底免疫，其他免疫均采用进行腿部和胸部肌肉注射，免疫周期为7天。
3、抗血清的制备：每只动物免疫前先于一侧耳缘静脉抽取2mL血(作为空白对照)，之后每进行下一次免疫前进行耳缘静脉取血，用于抗血清评价；另外效价达到要求后采用心脏采血法获取大量免疫血液；取血后通过1000rpm离心15min，收集抗血清；抗血清分装保存于－70℃。
4、抗血清效价的测定：采用板式化学发光评价抗血清，用包被缓冲液将自身免疫性抗原稀释至5μg/ml，除阴性孔外每孔加100μL即0.5μg自身免疫性抗原，37℃包被2h；一抗为梯度稀释的抗血清，二抗为AP标记的羊抗兔IgG，其中阴性对照：一抗为免疫自身免疫性抗原前所取的同一只兔子的血清，与阳性抗血清一样进行梯度稀释；空白对照：一抗孵育不含有任何血清的封闭液；其中血清按1:200、1:400等倍比稀释。抗血清效价达到1：100000时，即达到我们要求。
以PCNA免疫兔后抗血清评价结果表3和表4：
表3
表4
表5
动物编号 750 751 752
抗血清效价 1：200000 1：200000 1：100000
注：上述数据为：阳性A为免疫4次后，阳性B为免疫5次后测定3只兔子的的抗血清效价；
从上述表格中可以看出兔免疫4次和5次后，3只兔子抗血清效价变化不大，均满足和效价大于1：100000，按照实验设计评价的血清梯度为1:200-1:3200000，其中当血清稀释至1：200000时，750和751RLU值大于稀释梯度为1:200的阴性对照的RLU值的2倍左右，判断为阳性有效价，752血清稀释至1：100000时，752RLU值大于稀释梯度为1:200的阴性对照的RLU值的2倍左右，判断为阳性有效价，当再进行大的梯度稀释时RLU值基本等于空白值或不到空白对照值的两倍，判断为无效价。
(二)抗血清的亲和纯化
材料与仪器
1、免疫亲和层析柱；蠕动泵；离心管；离心机；过滤器；层析柱；分光光度计；
2、TBS平衡缓冲溶液：6.06g Tris(50mM)，8.78g NaCl(150mM)以及0.5g叠氮化钠(0.05％)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH 7.4；
3、高盐缓冲溶液：121.2g Tris(1M),87.8g NaCl(1.5M),0.37g EDTA(1mM)及5g叠氮化钠(0.5％)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH8.0；
4、洗脱缓冲溶液(pH2.6)：将3.75g甘氨酸(50mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH 2.6；
5、0.2M碳酸盐缓冲液(pH9.5)，1.0mM HCL，1.0M甘氨酸溶液。
CNBr-actived Sepharose 4B-Cl，从GE购买。柱料储存液(0.1MPBS，含1％氨基己酸，pH 7.4)。
操作步骤
1、准备免疫亲和层析柱：将免疫使用的抗原与琼脂糖凝胶连接，做成亲和层析柱。具体为：将特异性的自身免疫性抗原用0.2M碳酸盐缓冲液(pH9.5)溶解稀释成1.0mg/ml。再用1.0mM HCL处理活化好的Sepharose4B-Cl(CNBr-actived Sepharose 4B-Cl)，然后用0.2M碳酸盐缓冲液(pH9.5)稀释成1.0g/ml。再将这两部分按1：1的比例进行混合，在室温下反应16～20小时。然后离心，收集上清液。测上清液的蛋白浓度，再与最初投放的自身免疫性抗原的浓度和量进行比较，算出有多少抗原接在柱子上。剩下的Sepharose4B-Cl放入1.0M甘氨酸溶液，溶液的量为Sepharose4B-Cl：1.0M甘氨酸溶液＝1：1，反应4小时。用0.1M的HCl，0.1M NaOH和2M尿素溶液分别以3倍柱体积依次进行清洗，最后用储存液保存。
2、在容器中将等体积的亲和层析柱与过硫酸铵处理后的动物血清充分混合，轻摇2小时。将混合物缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1ml/min～2ml/min，避免柱干，利用3～10倍于柱床体积缓冲溶液平衡柱子。
3、用TBS缓冲溶液清洗柱子至吸收值A在280nm<0.008后，再用高盐缓冲液洗去非特异结合蛋白。加pH2.6洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min的速度洗脱至吸收值A在280nm<0.008。用已经加入100μL中和缓冲溶液的1.5mlEP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性；
利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于0.5mg/ml可加入10％的甘油以便保存，将纯化的IgG抗体分装后在2℃～8℃保存；
用含0.05％叠氮化钠的TBS缓冲溶液清洗柱子后，将柱子储存在2℃～8℃环境。
(三)IgG抗体与人源IgG Fc偶联
材料与仪器
1、人IgG Fc，由浩欧博生物医药有限公司研制，以磷酸盐缓冲液保存；
2、木瓜蛋白酶消化液(Papain溶解液)：0.1M Tris，2mM EDTA，pH8.0。
3、Papain,Iodoacetamide,购自Sigma公司。Protein-A购自GE公司。
4、偶联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，2-亚胺四氢噻吩(2-IT)购自THERMO公司，三羟甲基氨基甲烷(TRIS)等化学试剂均达到化学纯；
5、G-25凝胶柱和Sephadex 200凝胶纯化柱为GE公司产品。
操作步骤
1、人IgG，纯度为95％，浓度为1mg/ml,先用Papain消化液(也叫溶解液)，pH＝8.0透析，然后加入浓度为Papain：IgG＝100:1(w/w)进行消化30min，再在消化液中加入Iodoacetamide终止反应，使用Protein A将IgG Fc部分纯化出来。
2、取1mg的IgG抗体溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液15μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除游离SMCC，收集活化后抗体，4℃保存备用；
3、取1.5mg人源IgG Fc部分，加入10mg/ml的偶联剂2-IT溶液3μL，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μl，室温静置5min。用G-25凝胶柱除游离的2-IT，收集活化后抗体，4℃保存备用；
4、将上述活化的IgG抗体与活化的人源IgG Fc部分混合，在pH 7.3的条件下静置20h，用Sephadex 200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得连接物浓溶液，4℃保存备用；
5、将IgG-IgG Fc连接物浓溶液用含0.5％牛血清白蛋白、pH 8.0、0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到0.5μg/ml，即得PCNA自身免疫性抗原的阳性血清。
(四)用欧蒙公司生产的自免原(PCNA)IgG抗体检测盒对实施例2制备得到的阳性血清进行测定，结果如表6：
表6
注：欧蒙自免抗体IgG(IgM,IgA)检测：cut off值为20RU/mL，即>20RU/mL判断为阳性，<20RU/mL判断为阴性；
从表6可见，3批次(LOT 140403、LOT 140517、LOT 140802)的阳性血清质控样本，用欧蒙自免原IgG检测试剂盒测定为阳性样本，3倍、9倍稀释后仍为阳性。另外从表格中可以看到，质控样本倍比稀释后，测定值也为倍比稀释的。综合说明我们的样本制备成功，可以作为样本用于试剂盒的质控。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1. 一种自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，包括用自身免疫性抗原对健康动物进行免疫、采血后获得抗血清的步骤和对所述的抗血清进行纯化获得阳性血清的步骤，其特征在于：所述的纯化的具体方法为：
对所述的抗血清进行亲和纯化得到抗体IgG；将所述的抗体IgG和人源IgG Fc或人源IgM Fc或人源IgA Fc按质量比为1:1～2偶联后，经分离纯化获得IgG-IgG Fc连接物浓溶液或IgG-IgM Fc连接物浓溶液或IgG-IgA Fc连接物浓溶液，将所述的IgG-IgG Fc连接物浓溶液或所述的IgG-IgM Fc连接物浓溶液或所述的IgG-IgA Fc连接物浓溶液稀释至浓度为0.5～1μg /ml，即得所述的阳性血清。
2. 根据权利要求1所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：采用琼脂糖亲和介质或者采用免疫亲和层析柱进行所述的亲和纯化。
3. 根据权利要求2所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的琼脂糖亲和介质为Protein-A sepharose CL-4B。
4. 根据权利要求2所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的免疫亲和层析柱为所述的自身免疫性抗原与琼脂糖凝胶连接成的亲和层析柱。
5. 根据权利要求2或4所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的抗血清先经过硫酸铵处理后，再采用所述的免疫亲和层析柱进行所述的亲和纯化。
6. 根据权利要求1所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的人源IgG Fc或人源IgM Fc或人源IgA Fc，是将人源IgG或人源IgM或人源IgA溶解在木瓜蛋白酶消化液中，再用木瓜蛋白酶进行消化，然后用碘乙酰胺终止消化反应后，用琼脂糖亲和介质提取获得的。
7. 根据权利要求1所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的IgG抗体和所述的人源IgG Fc或人源IgM Fc或人源IgA Fc通过2-亚胺四氢噻吩偶联剂或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯偶联剂活化后，在pH7.2～7.4的条件下进行所述的偶联。
8. 根据权利要求7所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的2-亚胺四氢噻吩偶联剂的浓度为9～11mg/ml，所述的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯偶联剂的浓度为4～6mg/ml。
9. 根据权利要求1所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：采用Sephadex 200凝胶纯化柱进行所述的分离纯化。
10. 根据权利要求1所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：采用含质量比为0.4～0.6%的牛血清白蛋白、pH7.5～8.5、0.09～0.11mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液将所述的IgG-IgG Fc连接物浓溶液或IgG-IgM Fc连接物浓溶液或IgG-IgA Fc连接物浓溶液进行所述的稀释。
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US9880181B2 (en) * 2014-10-17 2018-01-30 Hob Biotech Group Suzhou Co., Ltd. Method for preparation of purified autoimmune antigen positive serum
CN107490680A (zh) * 2016-06-09 2017-12-19 常州博闻迪医药科技有限公司 一种血液糖化血红蛋白酶联免疫检测方法
CN115337323A (zh) * 2017-07-14 2022-11-15 徐民桢 用于诱导m1优势免疫应答的方法和药物组合物

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5478753A (en) * 1993-06-29 1995-12-26 Pb Diagnostic Systems, Inc. Positive calibrator/control composition for an IgM serology assay and an IgM serology assay
CN1423131A (zh) * 2002-12-30 2003-06-11 陕西超英生物医学研究开发有限公司 糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片及其制备、检测方法
CN1924579A (zh) * 2005-07-04 2007-03-07 上海富纯中南生物技术有限公司 一种代替阳性血清用作诊断试剂标准品的交联复合物及其作为标准品的使用方法
CN101158681A (zh) * 2007-11-23 2008-04-09 东南大学 自身抗体的互补式亲和层析纯化方法
CN101215564A (zh) * 2003-11-07 2008-07-09 首都医科大学附属北京朝阳医院 扩张性心肌病病人m2－乙酰胆碱能受体突变基因

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5478753A (en) * 1993-06-29 1995-12-26 Pb Diagnostic Systems, Inc. Positive calibrator/control composition for an IgM serology assay and an IgM serology assay
CN1423131A (zh) * 2002-12-30 2003-06-11 陕西超英生物医学研究开发有限公司 糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片及其制备、检测方法
CN101215564A (zh) * 2003-11-07 2008-07-09 首都医科大学附属北京朝阳医院 扩张性心肌病病人m2－乙酰胆碱能受体突变基因
CN1924579A (zh) * 2005-07-04 2007-03-07 上海富纯中南生物技术有限公司 一种代替阳性血清用作诊断试剂标准品的交联复合物及其作为标准品的使用方法
CN101158681A (zh) * 2007-11-23 2008-04-09 东南大学 自身抗体的互补式亲和层析纯化方法

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