CN101215564A - 扩张性心肌病病人m2－乙酰胆碱能受体突变基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及扩张性心肌病病人M₂乙酰胆碱能受体突变基因及其检测方法，突变位点及其检测方法详见说明书。本发明将CHRM2基因的突变与抗CHRM2自身抗体、DCM联系起来，进一步说明了三者之间的关系，为进一步研究DCM的病因奠定了必要的基础。该突变基因可以作为探针制成试剂盒、或制作基因芯片，用于体外检测生物样品中CHRM2突变基因的存在，为制定新的诊断、预防、治疗DCM的方案，筛选和开发新的药物提供依据。

Description

扩张性心肌病病人M2-乙酰胆碱能受体突变基因

本发明申请是申请号为200310103531.5的发明申请的分案申请，该原申请案于2003年11月07日提出申请，申请号为200310103531.5，发明创造名称为“扩张性心肌病病人M₂-乙酰胆碱能受体突变基因及其检测方法”。

技术领域

本发明涉及基因工程技术，更具体地说，是涉及扩张性心肌病病人M₂-乙酰胆碱能受体(CHRM2)突变基因及其检测的方法。

背景技术

扩张性心肌病(DCM)是-种病因不明的慢性心肌病，其临床症状是全心无明显诱因的扩大，主要为左心室的扩大，累及心功能，表现为心脏功能的明显下降，最终导致心力衰竭。由于病因不清楚，所以无特效的治疗方法，临床上治疗该病的方法是按常规方法用β-受体阻断剂、利尿剂、洋地黄、ACEI(血管紧张素转化酶抑制剂)等药物对症治疗，但疗效不甚理想，病人的死亡率达50％以上。

目前普遍认为扩张性心肌病可能的病因有三个方面：家族性的遗传因子、病毒性心肌炎和其他细胞毒素侵染和免疫学异常。对于扩张性心肌病来说，必需要有病人中的20-30％为家族性的DCM时才能确定为遗传病，而另外两种病因又不能解释大部分患者。

近10年来对DCM的研究结果表明，抗CHRM2自身免疫抗体参与了DCM的致病过程。例如瑞典研究者发现在DCM病人的血清中含有抗CHRM2的自身抗体，而日本的研究者认为抗CHRM2和β1-肾上腺素受体的自身抗体对DCM是特异的，而对其他的心脏疾病不特异(Fu MLX等Clin Immunol Immunopathol，1994，72：15-20；Matsui S等Autoimmunity，1995，Vol 21：85-88)。这些都说明抗CHRM2的自身抗体与DCM有关。自身抗体的产生及功能的研究目前正是热点，其功能的研究已经表明，自身抗体具有“拟乙酰胆碱能”样作用，可以使体外培养的豚鼠心肌细胞的跳动频率下降和cAMP的产生减少，它的靶点是细胞外第二环表位肽段。已有报导兔抗人CHRM2的细胞外第二环的抗体具有刺激性的电生理效应，它可降低豚鼠心肌细胞L型Ca²⁺电流(Nascimento，JHM.等Am J Physiol Cell Physiol 2001，281：c1251-1258)，抗CHRM2的自身抗体通过降低心肌细胞L型Ca²⁺电流而抑制心肌的收缩力，从而参与了DCM的致病过程。但该自身抗体产生的原因尚不清楚。

根据抗体与抗原免疫特异结合的原理，可以推测，该自身抗体的存在可能是由于其受体抗原CHRM2基因的突变而引起抗原组分改变的结果。但到目前为止，尚未有关于CHRM2基因突变与抗CHRM2自身抗体的产生、以及与DCM之间关系的报道。因此，有必要建立一种分离、检测扩张性心肌病病人CHRM2突变基因的方法，检测扩张性心肌病病人CHRM2突变基因的突变位点并分离该突变其因，进一步了解CHRM2基因的突变与抗CHRM2自身抗体的产生、以及与DCM之间关系，为制备用于诊断DCM的试剂盒和基因芯片提供必要的依据，也可为提供更好的诊断、治疗和预防DCM的方案、筛选和开发新的治疗和预防药物奠定基础。

发明内容

针对目前DCM的研究尚未涉及CHRM2基因突变的现状，本发明者建立了一种检测CHRM2突变基因的方法，并对大量DCM病人的血样进行了筛查，结果检测到两种类型的突变位点位于nt588-nt866的CHRM2突变基因，并测得DCM病人血清的抗CHRM2自身抗体阳性率为55.8％，CHRM2基因发生突变的DCM病人血清的抗CHRM2自身抗体阳性率为100％，同时还测得该阳性血清在体外可降低豚鼠单个心肌细胞L型Ca²⁺电流的峰强度及密度；而健康人对照组的CHRM2基因均未发生突变，其血清的抗CHRM2自身抗体阳性率仅为9.7％，从而说明CHRM2基因的突变所引起抗原组分改变，可能是产生具有上述功能的自身抗体的原因之一。因此，

本发明的一个目的是提供扩张性心肌病病人CHRM2突变基因中发生突变的部分编码区序列；

本发明的另一个目的是提供一种检扩张性心肌病病人CHRM2突变基因的突变位点的方法。

本发明的目的通过以下方案实现：

为了分离CHRM2突变基因中发生突变的编码区部分序列，和检测其突变位点，本发明的检测方法包括以下步骤：

(1)通过免疫分析，确定检测扩张性心肌病病人M₂-乙酰胆碱能受体突变基因突变位点的候选序列；

(2)根据步骤(1)确定的候选序列设计引物，从扩张性心肌病病人的血样提取DNA作为模板，通过PCR反应扩增该序列的DNA片段；

(3)用单链构象多态性SSCP法筛选由步骤(2)所得的PCR产物中碱基突变阳性的PCR扩增片段；

(4)定位克隆由步骤(3)筛选出的碱基突变阳性的PCR扩增片段，并测定其核苷酸序列；

(5)将测得的序列与GeneBank中正常的人CHRM2基因中相应的序列比较，确定该核酸分子的突变位点，从而确定CHRM2突变基因的突变位点。

其中步骤(1)进一步包括以下步骤：

(a)合成人CHRM2细胞外第二环E2区的表位肽段，该肽段以半胱氨酸为末端，包括位于CHRM2蛋白的第168-192位氨基酸残基；

(b)用步骤(a)合成的肽段作为抗原，从扩张性心肌病病人组和健康人对照组的血清中筛选抗CHRM2自身抗体阳性的血清；

(c)检测由步骤(b)筛选的扩张性心肌病患者的抗CHRM2自身抗体阳性血清的抗CHRM2自身抗体滴度。

根据以上检测方法，可以获得：

(1)扩张性心肌病病人M₂-乙酰胆碱能受体突变基因，其中编码区的第588-866位核苷酸序列，其第722位核苷酸的碱基由C突变为G，从而导致第176位半胱氨酸变为色氨酸，该核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

(2)含有权利要求1所述的核苷酸序列SEQ ID NO：4的重组质粒。

(3)扩张性心肌病病人M₂-乙酰胆碱能受体突变基因，其中编码区的第588-866位核苷酸序列，其第663位核苷酸的碱基由C突变为T，第624位核苷酸的碱基由A突变为G，从而导致第157位的脯氨酸变为丝氨酸，以及第144位的异亮氨酸变为缬氨酸，该核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

(4)含有权利要求2所述的核苷酸序列SEQ ID NO：5的重组质粒。

已知CHRM2属于G蛋白偶联受体家族，CHRM2细胞外第二环相应于第168-192位氨基酸的区域对G蛋白偶联的受体的配体结合是至关重要的，其中的EDXE氨基酸片段(172-175)是抗原组分(抗原决定部位)，根据已知的研究结果，抗CHRM2的自身抗体与DCM有关，DCM病人的CHRM2基因有可能在该区域附近发生突变。因此，本发明通过免疫分析，测定与CHRM2突变基因的表达产物免疫特异性结合的抗CHRM2自身抗体的存在及其滴度，来确定检测CHRM2突变基因的突变位点的候选区域。首先，根据已知的人CHRM2细胞外第二环E2区(参见图1)肽段的氨基酸序列，体外合成CHRM2蛋白的第168-192位氨基酸残基的肽段，其氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：1。然后用此合成的肽段作为抗原，在体外通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，从DCM病人组和健康人对照组的血清样品中筛选抗CHRM2自身抗体阳性的血清，DCM患者中抗CHRM2自身抗体的阳性率为55.8％(29/52)，而对照仅为9.7％(4/41)(P＜0.01)；DCM病人的抗CHRM2自身抗体的平均滴度为1∶128，而健康人对照组为1∶24(P＜0.01)。从统计学上分析，该结果具有显著性，说明DCM病人体内抗CHRM2自身抗体的产生与该肽段的组成改变相关，其CHRM2基因有可能发生突变，而突变位点有可能发生在编码上述肽段的编码区。因此本发明选取CHRM2基因编码区的588-866位核苷酸序列(相应于第132-224位氨基酸残基)作为候选的筛查序列，其中的第696-768位核苷酸片段相应于第168-192位氨基酸序列。

根据候选筛查序列设计引物，正向引物为序列表中的SEQ ID NO：2，反向引物为SEQ ID NO：3，从DCM病人和健康人(对照)的血样中分离白细胞，提取DNA作为模板进行PCR扩增，所得276bp的PCR扩增产物(图2)随后用于检测其突变位点。

已知单链核酸的二级结构根据其一级结构的不同而异，PCR产物变性后产生二条单链，如果扩增的片段内含有单个或多个碱基的置换、插入或缺失，由此引起的一级结构的变化，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率就会有所不同。根据该区别可以检测出甚至单个碱基的改变。因此，本发明利用SSCP(单链构象多态性)，通过非变性凝胶电泳检测单个碱基对的变化，根据异常条带的出现(图3)，从PCR扩增产物中筛选出发生突变的片段，采用PCR产物克隆试剂盒(pGEM-T7 Vector System，美国Promaga公司产品)按产品说明书进一步进行定位克隆、测序并与正常人的CHRM2基因相应序列(Genbank NT007680核苷酸588-866)比较。

临床数据表明，DCM有明显的家族遗传性，本发明利用上述方法，通过对一个18位成员的中国DCM家族(此家族有4个患者)，和67位散发DCM病人的CHRM2基因突变位点进行检测，分离并检测出两种类型与DCM有关的CHRM2突变基因中发生突变的编码区部分序列。其中之一是该基因编码区的第722位核苷酸的碱基由C突变为G，从而导致第176位的半胱氨酸突变为色氨酸(图5A)，该序列设定为SEQ ID NO：4。DCM家族中的4位DCM患者和2位无临床表现的成员，以及5位散发的DCM患者的CHRM2突变基因属于这种类型的突变。另一种是从其他DCM散发病人分离出的CHRM2突变基因中发生突变的编码区部分序列，该基因编码区的第663位核苷酸的碱基由C突变为T(图5B)，从而导致第157位的脯氨酸变为丝氨酸，以及第624位核苷酸的碱基由A突变为G(图5C)，从而使第144位的异亮氨酸变为缬氨酸，该序列设定为SEQ ID NO：5。DCM家族中其他成员和对照者的CHRM2基因的相应序列未发生变异。

根据本发明的上述检测结果，DCM病人中的一部分，其CHRM2基因在588-866位核苷酸区域内发生了碱基置换的突变，尤其是家族性的DCM病人，CHRM2基因突变的发生率为100％，而且该家族成员中还有二位未发病成员的CHRM2基因也发生了突变。与此同时，本发明还测定了CHRM2基因发生突变的DCM病人血清中的抗CHRM2自身抗体，其阳性率为100％。此外，本发明还使用全细胞膜片钳技术测定了CHRM2基因发生突变的DCM病人血清中的抗CHRM2自身抗体阳性血清在体外对豚鼠单个心肌细胞L型Ca²⁺电流的峰强度及密度的影响，并进一步与CHRM2的激动剂碳酰胆碱、β-肾上腺素的兴奋剂异丙肾上腺素、和CHRM2的阻滞剂阿托品，以及作为对照的CHRM2自身抗体阴性血清(健康人对照)对豚鼠单个心肌细胞L型Ca²⁺电流的峰强度及密度的影响比较。结果表明，该自身抗体减少了心肌细胞L型Ca²⁺电流，而且可以使异丙肾上腺素激动所增大的L型Ca²⁺电流减小，而CHRM2的阻滞剂阿托品可以阻断此作用；由此证明了抗CHRM2自身抗体的该作用类似于CHRM2的激动剂碳酰胆碱，在DCM病人体内，它通过减少心肌细胞L型Ca²⁺电流而降低其收缩力，从而参与DCM病人的致病机制。

根据本发明的检测方法和检测结果可知，中国DCM病人中部分病人的CHRM2基因发生了碱基置换的突变，其中DCM家族中发病者CHRM2基因突变的阳性率为100％，二名无临床表现的成员其CHRM2基因也发生了突变，而DCM家族中其他成员和46位对照者的CHRM2基因均未发生突变。DCM病人中，血清的抗CHRM2自身抗体阳性率为55.8％，健康人为9.7％(P＜0.01)，而CHRM2基因发生突变的DCM病人的阳性率为100％。说明CHRM2基因的突变与抗CHRM2自身抗体的产生有更直接的关系。由此可推论CHRM2基因的突变引起其表达产物CHRM2抗原组分的改变，从而产生与该抗原组分特异结合的抗CHRM2自身抗体。

因此，本发明与现有技术相比有以下优点：

本发明利用其检测扩张性心肌病病人CHRM2突变基因的方法，首次获得了扩张性心肌病病人CHRM2突变基因，并将其与抗CHRM2自身抗体、DCM联系起来，进一步说明了三者之间的关系，表明CHRM2基因的突变是DCM的病因之一，尤其是DCM的遗传病因之一。为进一步研究DCM的病因奠定了必要的基础。该突变基因可以作为探针制成试剂盒、或制作基因芯片，用于体外检测生物样品中CHRM2突变基因的存在，尤其是通过对DCM家族成员样本的体外检测，可以为制定新的诊断、预防、治疗DCM的方案，筛选和开发新的药物提供依据。

附图说明

图1是表示CHRM2的结构及其生物学特征的示意图。图中E2为CHRM2细胞外第二环，相应于氨基酸残基168-192。

图2是CHRM2基因编码区第588-866位核苷酸片段的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图中第1泳道是pBR322/Hinf分子量标志，第2、3、4泳道是PCR产物。

图3是检测CHRM2基因编码区第588-866位核苷酸片段的PCR扩增产物单链构象多态性(SSCP)的非变性凝胶电泳图。图中第1、2泳道是碱基突变阳性的PCR扩增产物，箭头所指为异常条带；第3、4泳道为碱基未发生突变的PCR扩增产物；第5泳道是健康人(对照)血样的PCR扩增产物。

图4是T-载体克隆CHRM2基因编码区第588-866位核苷酸片段的PCR扩增产物的示意图。

图5是正常CHRM2基因和CHRM2突变基因部分序列的测序图谱。↓为碱基发生突变的位点，图5A为第722位核苷酸突变；图5B为第663位核苷酸突变；图5C为第624位核苷酸突变。

图6是遗传性DCM家族图。图中□代表男性；○代表女性；/表示已死亡的个体；黑色图标表示感染的个体；

为先证者。

图7是在不同条件下的豚鼠心肌细胞L型Ca²⁺的电流曲线。其中抗CHRM2自身抗体阳性血清取自CHRM2基因发生突变的DCM病人。

图中：

A1、C1、D1：对照；

A2：加入抗CHRM2自身抗体阴性血清；

B1、C2、D2：加入β₁-肾上腺素的激动剂异丙肾上腺素；

B2：加入β₁-肾上腺素的激动剂异丙肾上腺素后，再加入抗CHRM2自身抗体阴性血清；

C3：加入CHRM2的激动剂碳酰胆碱；

D3：加入抗CHRM2自身抗体阳性血清；

C4：加入碳酰胆碱后再加入CHRM2的阻滞剂阿托品；

D4：加入自身抗体阳性血清后再加入阿托品。

具体实施方式

以下通过三个实施例，结合附图对本发明作进一步说明。

实施例一DCM病人CHRM2自身抗体阳性血清的筛选

1.抗原肽的合成

由北京SBSGenatech有限公司采用Merrifield的固相法(Fu MLX等，Clin Immunol Immunopathol，72：15-20(1994))合成相应于人乙酰胆能碱受体CHRM2的细胞外第二环氨基酸序列的肽段(氨基酸残基第168-192位)，然后用HPLC分析法在Vydac C-18柱上分析该合成肽段的纯度，并用自动氨基酸分析仪(Beckman instruments，Inc，Palo Alto，CA)分析其氨基酸序列。该序列设定为SEQ ID NO：1，其末端为半胱氨酸：V-R-T-V-E-D-G-C-Y-I-Q-F-F-S-N-A-A-V-T-F-G-T-A-I-C；

2.样本的选择

从在医院就医的病人中选出52位DCM病人，其中33位女性，19位男性。入选的标准为出现CHF(充血性心力衰竭，纽约心脏协会功能分级II-IV)症状1年以上。所有的病人呈现出心脏结构和功能的改变，在超声心动图中，左心室射血分数为45％以下。患有肥大性心肌病、糖尿病、自身免疫性疾病和某些感染疾病的病人除外。收集血清之前，所有病人停用β-肾上腺素受体拮抗剂和ACEI。对照组为41位健康的血液提供者，对照组的年龄和性别与DCM病人相配。其临床症状、ECG和超声心动图检查都正常，且不服用药物。

3.样本血清的酶联免度吸附试验(ELISA)

酶联免疫吸附试验：将上述病人组和对照组采集的血样在-20℃下储存备用。取50μl溶于100mM Na₂CO₃(pH 11)的肽溶液(5μg/ml)涂布在NUNC微量滴定板上，4℃过夜。用PBS-T使孔饱和，PBS-T是在磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS，pH7.3-7.4)中添加了0.2％(v/v)Tween-20(Sigma，USA)和0.01％(v/v)硫柳汞(Sigma，USA)的溶液。将20μl按1∶20～1∶160稀释的血清加入涂布了肽溶液的微量滴定板中，4℃下放置过夜。用PBS-T将孔洗涤三次后，使其与亲和纯化的生物素化兔抗IgG(H+L)抗体(用PMT按1∶500稀释)反应1小时。PMT是添加了胎牛血清的PBS-T液，浓度10％。洗涤三次后，使平板与链霉抗生物素-过氧化物酶(Jachson Laboratories，PA，USA)的PMT溶液(2μl/ml)反应1小时。然后用PBS洗涤三次，并加入底物2.5mM H₂O₂-2mM ABTS(Sigma’s，Louis，MO.USA)。30分钟后在微量板读数器中读出405nm下的光密度(O.D)(Keeling PJ等，Br Heart J 73：417-421(1995))。

4.结果

抗CHRM2自身抗体阳性血清的分析数据如表1所示。

表1DCM和NC(对照)抗M₂受体的自身抗体比较

	阳性率(％)	几何平均滴度
			DCM(n＝52)NC(n＝41)P	29(55.8)4(9.7)＜0.01	12824＜0.01

表中的数据以平均值±SD表示。阳性定义为阳性/阴性(p/n＝样本OD-空白OD/阴性对照OD-空白OD)比≥2.1。

由以上数据可知，DCM病人的抗CHRM2自身抗体阳性率为55.8％(29/52)，而对照为9.7％(4/41)(p＜0.01)。这些结果表明，在中国的DCM病人体内不仅存在抗CHRM2的自身抗体，而且其抗体的几何平均滴度在蛋白水平上明显高于对照，说明DCM病人体内抗CHRM2自身抗体的产生与其相应的抗原肽的组成改变相关。

实施例二DCM病人CHRM2基因突变位点的检测

1.检测样本的选择

按实施例一同样的标准选择67位散发DCM病人(其中包括38位女性和29位男性)，和一个18位成员的中国山西省DCM家族(其中有4个DCM患者)作为被检对象，并选择46位年龄和性别与DCM病人相配的健康供血者，作为对照组。

2、PCR扩增

根据已知的编码人CHRM2细胞外第二环的第588-866位核苷酸的序列设计以下引物：

正向引物为：5′AGTCAAGCGGACCACAAAAATGGC-3′该序列设定为SEQ ID NO：2

反向引物为：5′GGCTCCTTCTTGTCCTTCTTTATCC-3′该序列设定为SEQ ID NO：3

参照文献(Grimberg J，Nawoschik S，Belluscio L，.等Nucleic AcidsRes.1989(17)，8390)所述的方法，从待测样本的血液中分离白细胞，用酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法提取DNA用作模板。通过PCR反应，扩增相应于CHRM2基因编码区位于588-866核苷酸序列的DNA片段，PCR反应条件为：

25μl PCR反应总体积中含有：

DNA模板            0.5μl

引物               0.7μl

dNTP               0.5μl

10×缓冲液+Mg²⁺    2.5μl

Tag聚合酶          0.2μl

dH₂O               20.6μl

反应混合物在95℃变性5min后，94℃变性1min，51℃退火1min，70℃延伸1min，共进行30个循环，然后在72℃延伸10min后，4℃保存。PRC产物的2％琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，图中泳道1为pBR322/HinfI分子量标志，第2、3、4泳道为PCR产物，其片段为276bp。

3.SSCP法筛选碱基突变阳性的PCR产物

用SSCP银染法(Hayashi，K，1991.PCR-S SCP：A simple andsensitive method  for detection of mutations in genomic DNA.PCRMethods Appl.1：34-38)筛选碱基突变阳性的PCR扩增产物。

将DCM病人组和对照组的PCR产物进行SSCP电泳，其步骤如以下所述。

(1)按以下组分制备8％聚丙烯酰胺凝胶，(总体积34ml)：

20％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺(49∶1)    13.6ml

5×TBE          3.4ml

20％APS         34μl

TEMED           34μl

dH₂O            17ml

(2)将制备的凝胶在160V下预电泳1h；

(3)然后将PCR产物在98℃下变性10min后，按下述条件进行电泳、固定、染色：

单链PCR扩增产物6ml+变性剂6ml→电泳10-12小时后，固定15分钟，染色4分钟并显色。

图3为PCR产物的SSCP非变性凝胶电泳图，电泳出现两种不同的SSCP模式，模式I(第3泳道：对照；第4、5泳道：DCM病人，碱基未发生突变)的DNA序列与GeneBank中的完全相同，而模式II(第1、2泳道：DCM病人，碱基突变阳性，箭头所指为异常条带)的DNA序列则发生了变化。

4.PCR产物的克隆

经过SSCP电泳检测，挑选碱基突变阳性的PCR扩增产物，采用PCR产物克隆试剂盒(pGEM-T7 Vector System，美国Promaga公司产品)按产品说明书和J.Sambrook等的分子克隆：实验室指南，第二版中所述方法进行定位克隆。

(1)连接：

碱基突变阳性的PCR扩增产物  7μl(1.377μg或

                           1.89μg)

PGEM-T7                    1μl

10×缓冲液                 1μl

连接酶                     1μl

连接反应温度、时间         室温、1小时

(2)细菌转化：

100μl DH5α感受态细胞加入10ml转化管中，加入5μl连接反应液，温和混合后在冰上放置30分钟，然后在42℃(水浴)静置2分钟，再加入900μl LB(无抗菌素)，37℃下振摇45分钟(100-150rpm)。取160μl细菌转化液在含有氨苄青霉素/IPTG/X-gal的LB平板培养基上培养，挑选白色克隆，用BstZI进行酶切、鉴定，选出插入了碱基突变阳性的PCR扩增片段的阳性质粒进一步用于序列分析，检测突变位点。用同样方法克隆健康人对照组相应的PCR产物，构建含有CHRM2对照基因编码区588-866位核苷酸片段的PCR产物的重组对照质粒。图4是T-载体克隆CHRM2基因编码区588-866位核苷酸片段的PCR扩增产物的示意图。图中1是pGEM-T7载体，2是碱基突变阳性的PCR扩增产物或对照PCR扩增产物，3是含有CHRM2突变基因或对照基因编码区第588-866位核苷酸片段的PCR产物的重组质粒。黑色图标表示插入片段。

5.CHRM2基因部分编码区序列的测定

用反向通用引物测定由上述4中筛选出的阳性质粒和对照质粒中276bp的DNA插入片段的序列，其结果如图5所示。将CHRM2突变基因和对照基因的nt588-nt866与正常CHRM2基因(Genbank NT007680)的nt588-nt866的序列比较，发现对照质粒的插入序列与正常基因的完全一致，而阳性质粒的插入序列有两种类型的突变，其中一种是DCM家族的4个DCM患者(图6的II：1、III：1、III：3、III：7)和2个12岁以下的未发病的成员(图6的IV：1和IV：2)，以及5位DCM散发病人的CHRM2基因中的第722位核苷酸的碱基C突变为G，从而导致第176位的半胱氨酸变为色氨酸(图5A)，其nt588-nt866的序列为SEQ ID NO：4；另一种类型是在其他DCM散发病人的CHRM2基因中，第663位核苷酸的碱基C突变为T，从而导致第156位脯氨酸变为丝氨酸(图5B)，以及第624位核苷酸的碱基A突变为G，导致第144位的异亮氨酸变为缬氨酸(图5C)，其nt588-nt866的序列为SEQ ID NO：5。DCM家族的未发病成员和对照组成员的CHRM2基因未发生突变。

实施例三CHRM2基因突变的DCM病人抗CHRM2自身抗对豚鼠心肌细胞L型Ca²⁺电流峰强度和密度的影响

1.抗CHRM2自身抗体阳性血清的制备

选择9例CHRM2基因突变的DMC病人和9例健康的供血者，按照实施例一所述的ELISA方法筛选抗CHRM2自身抗体阳性血清，其结果为所有病人的血清均为阳性，健康供血者的血清为阴性。采集的阳性血清(稀释度1∶160)作为研究对象保存在-70℃下备用。

2.细胞的分离

(1)选用健康成年豚鼠，雌雄不拘，体重250～320g，断头处死。

(2)在室温20-25℃下，迅速开胸取出心脏放入冰冷的无钙台氏液中，心脏跳动几次排除心腔内血液，转入无钙台氏液，去除心包膜。

(3)分辨主动脉，将心脏安置于Langedorff灌流架上，由主动脉逆行灌流心脏[灌流压为70cmH₂O(1cmH₂O＝0.098kPa)，温度37℃]，所有溶液通以95％O₂+5％CO₂，灌流滴速为7ml/min，循环液37℃，并确定灌流入心脏的管中无气泡。

(4)无钙液灌流心脏5分钟，心脏逐渐停止跳动。

(5)改用含0.1mg/mL蛋白酶E，0.5mg/mL去脂肪酸的牛血清白蛋白的低钙液灌液心脏5分钟。至心脏变得柔软，松驰为止。

(6)将心脏从灌流装置系统上取下，剪去心房，心室肌切为小块，置于上述含酶溶液中，37℃条件下温孵、搅拌约5分钟。

(7)吸取少量细胞悬液在显微镜下观察细胞的多少及形状，细胞纹理，可搅拌三次，用滤膜过滤，取细胞悬液。

(8)将细胞悬液用含Ca²⁺1.8mM的无钙液台氏液稀释5倍，静置1小时以备使用。

3.电生理测定

用全细胞膜片钳技术(刘泰槰，心肌电生理学，北京大学出版社，1988)测定了豚鼠心肌细胞在以下不同条件下的L型Ca²⁺电流峰强度和密度：

(1)不加任何试剂(对照)如图7中的A1、C1、和D1；

(2)加入抗CHRM2自身抗体阴性血清，如图7的A2；

(3)加入β₁-肾上腺素的激动剂异丙肾上腺素，如图7中的B1、C2和D2；

(4)加入β₁-肾上腺素的激动剂异丙肾上腺素和抗CHRM2自身抗体阴性血清，如图7的B2；

(5)加入CHRM2的激动剂碳酰胆碱，如图7的C3；

(6)加入抗CHRM2自身抗体阳性血清，如图7中的D3；

(7)加入碳酰胆碱后再加入CHRM2的阻滞剂阿托品；如图7的C4；

(8)加入自身抗体阳性血清后再加入阿托品，如图7的D4。

4、结果

电生理学测定结果如图7和表2所示。

表2在不同条件下豚鼠心肌细胞L型Ca²⁺电流峰强度和密度

图号	测定条件	L型Ca2+电流峰强度pA	L型Ca2+电流峰密度pA/pF
				图7A-1图7A-2图7B-1图7B-2图7C-1图7C-2图7C-3图7C-4图7D-1图7D-2图7D-3图7D-4	对照抗CHRM2自身抗体阴性血清1.6μM异丙肾上腺素1.6μM异丙肾上腺素+抗CHRM2自身抗体阴性血清对照1.6μM异丙肾上腺素10μM碳酰胆碱10μM碳酰胆碱+14μM阿托品对照1.6μM异丙肾上腺素抗CHRM2自身抗体阳性血清抗CHRM2自身抗体阳性血清+阿托品	1466.62±205.951466.62±205.952111.65±203.152111.65±203.151466.62±205.952111.65±203.151230.87±208.141843.27±225.981466.62±205.952111.65±203.15636.42±110.071251.37±183.26	12.73±1.1112.73±1.1118.83±1.1418.83±1.1412.73±1.1118.83±1.1410.72±1.0615.40±1.0112.73±1.1118.83±1.145.54±0.8110.86±1.04

参照图7和表2，加入自身抗体阴性血清(图7，A2)对细胞L型Ca²⁺电流(图7，A1)无影响；加入β-肾上腺素受体的激动剂异丙肾上腺素，再加入自身抗体阴性血清后(图7，B2)对异丙肾上腺素的刺激作用产生的电流增大(图7，B1)无影响；加入异丙肾上腺素(图7，C2、图7，D2)，细胞L型Ca²⁺电流的峰强度和密度比对照(图7，C1、图7，D1)明显增加；加入CHRM2的激动剂碳酰胆碱(图7，C3)，细胞L型Ca²⁺电流峰强度和密度比对照(图7，C1)降低；加入自身抗体阳性血清(图7，D3)，细胞L型Ca²⁺电流峰强度和密度明显降低；其作用类似于CHRM2的激动剂碳酰胆碱；加入激动剂碳酰胆碱后再加入CHRM2的阻滞剂阿托品(图7，C4)，和加入自身抗体阳性血清后再加入阿托品(图7，D4)，阻断了激动剂碳酰胆碱和自身抗体阳性血清对细胞L型Ca²⁺电流的转移。由以上数据可证明，循环的抗CHRM2自身抗体通过降低基础的收缩力，参与DCM病人的病理生理改变，其作用与CHRM2的激动剂碳酰胆碱类似。

本发明为进一步研究DCM的病因奠定了必要的基础。本发明的CHRM2突变基因可以作为探针制成试剂盒、或制作基因芯片，用于体外检测生物样品中CHRM2突变基因的存在，尤其是通过对DCM家族成员样本的体外检测，可以为制定新的诊断、预防、治疗DCM的方案，筛选和开发新的药物提供依据。

                    序列表

Claims (2)

1.扩张性心肌病病人M₂-乙酰胆碱能受体基因，其中编码区的第588-866位核苷酸序列，其特征在于第663位核苷酸的碱基由C突变为T，第624位核苷酸的碱基由A突变为G，该核苷酸序列如SEQ ID NO：5的48-326位核苷酸所示，其中所说的第663位核苷酸和624位核苷酸分别相应于SEQ ID NO：5中的第123位和第84位核苷酸。

2.含有权利要求1所述的核苷酸序列SEQ ID NO：5中第48-326位核苷酸的重组质粒。

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