WO2010038974A2

WO2010038974A2 - 이뮤노글로블린 에이 신증과 티지비엠 신증의 진단용 조성물 및 키트

Info

Publication number: WO2010038974A2
Application number: PCT/KR2009/005589
Authority: WO
Inventors: 백문창; 문평곤; 김용림
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2008-10-01
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2010-04-08
Also published as: KR100928403B1; WO2010038974A9; WO2010038974A3; US20110236913A1; US8927220B2

Abstract

본 발명은 타겟 프로테오믹스 기법으로 뇨를 이용한 IgA 신증과 TGBM(thin-glomerular-basement-membrane)의 진단 바이오마커로 사용 될 수 있는 단백질 개발에 관한 것으로서, 정상인의 뇨에서 보다 IgA 신증와 TGBM 신증 환자의 뇨에서 그 양이 증감되어지는 진단 바이오마커 단백질과 이를 이용한 IgA 신증과 TGBM의 진단 및 진행정도를 미리 예견하는 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 사람의 뇨로부터 IgA 신증과 TGBM의 발병여부, 조기진단 및 진행정도를 확인하여 그 증상의 경도를 파악할 수도 있다. 또한 본 발병의 진단 바이오마커 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 immunoassay 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, IgA 신증의 조기진단 및 진행정도를 판단하고, 치료용 목적으로는 신약 개발에 사용되어 질수 있다.

Description

이뮤노글로블린 에이 신증과 티지비엠 신증의 진단용 조성물 및 키트

본 발명은 IgA 신증과 thin-glomerular-basement-membrane(이하, “TGBM"이라 칭함) 신증의 진단 및 중증으로 진행될 때 바이오마커로 사용 될 수 있는 단백질 개발에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 정상인의 뇨와 비교하여 IgA 신증과 TGBM 신증환자의 뇨에서 증감하여 발현되는 바이오마커 단백질과 이를 이용한 IgA 신증과 TGBM 신증의 조기진단 및 진행정도를 미리 예측 및 판단하는 진단키트에 관한 것이다.

IgA 신증이란 사구체신염의 여러 가지 진단 가운데 하나로서 우리나라뿐 만 아니라 세계적으로도 가장 흔한 사구체신염으로 알려져 있다. 원인은 잘 모르지만 우리 몸 안에 세균이 침투했을 때 이 세균과 싸워 이기기 위해서는 "항체'라고 하는 면역물질이 필요한데, 그 항체들 가운데 하나가 면역글로불린 A(IgA)라는 물질이 세균과 싸우지 않고 신장의 사구체로 가서 사구체를 파괴시키는 현상이 바로 IgA 신증이라고 한다. 현재 IgA 신증의 진행정도를 판단하는 바이오마커로서는 대표적인 것이 단백뇨 및 크레아틴이 있다. 그러나 단백뇨는 IgA 신증 이외의 고혈압 및 심혈관 질환 발생을 의미하는 지표이기도 하는 등 다른 질환 표지자와의 연관성이 높아 직접적인 당뇨병성 신증의 진행정도를 판정하기가 어려운 상태이다. 또한 TGBM 신증은 혈뇨와 단백뇨 등의 증세를 보이는데 이는 IgA 신증의 증상과 비슷하나 TGBM은 비교적 예후가 나쁘지 않은 질환이다. 그러나, 이러한 병력(환자가 어떻게 해서 병이 생겼고 증상이나 시간적 경과가 어떤지 등등, history 라고 함)만으로는 IgA 신증을 확진할 수는 없고 신장 조직검사를 해야만 확진할 수가 있는 실정이다.

따라서, 임상적으로 특이성과 민감도가 높은 신규진단 마커와 아울러 이를 검출할 수 있는 단일클론항체를 개발할 경우, 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 미리 예측 할 수 있는 형태의 키트 개발을 도모할 수 있다. 이에 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 타겟 프로테오믹스(proteomics) 기법을 이용하여 IgA 신증 및 TGBM 신증 질환의 바이오마커들을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

IgA 신증은 우리나라에서도 가장 흔한 사구체신염으로서 전 연령층에서 발생할 수 있으나 10대와 20대에 주로 발병한다. 그 임상 양상은 다양하여 상기도 감염을 동반하는 간헐적인 육안적 혈뇨로 나타나거나, 지속적인 현미경적 혈뇨와 단백뇨로 나타나며, 일부에서는 신증후군 또는 급성 신염, 고혈압 형태로 발현되고, 모르고 지낸 채 진행되어 만성 신부전으로 발견되는 경우도 많다. IgA 신증은 서서히 진행하여 20년내에 약 30% 이상의 환자들이 말기 신장질환으로 진행된다고 보고되고 있으나 그 임상경과도 다양하다. 예후에 영향을 주는 위험 인자로는 지속적인 단백뇨, 신기능의 저하, 지속적 고혈압, 노령, 남자와 조직학적 소견 등이 알려져 있다. IgA 신증은 일종의 면역복합체 매개성 사구체질환으로서, 점막 등에 유입되는 항원에 대한 면역반응의 조절장애로 골수에서 polymeric IgA1이 과다 생산되고 동시에 IgA1의 구조 결함이 나타남이 그 기본 병인이며, 결과적으로 이들이 메산지움에 침착되고 매개인자들에 의한 손상이 초래된다. IgA 신증의 광학현미경 소견은 메산지움에서의 국소성 또는 미만성의 세포증식과 세포외 기질의 확장이 특징적이다. 세포증식은 다양하여 심하면 반월상을 형성하기도 하고, 혈관 병소와 세뇨간질 병소도 관찰된다. 면역형광 검사상 IgA가 현저하게 메산지움에 침착됨이 특징으로서 IgA 신증의 진단에 필수적이다. 흔히 C3와 IgG, IgM 등과 함께 침착된다. 전자현미경 소견상 메산지움 또는 그 주위에 큰 전자고밀도 침착들이 관찰됨이 특징이며 국소적인 메산지움 주위의 내피하 침착도 관찰된다.

이러한 IgA 신증의 진단방법에 대한 연구로는 IgA 신장병증 환자 백혈구에서 디퍼런셜ㆍ디스플레이법을 사용한 신규한 유전자의 취득방법 및 백혈구 유래 올리고뉴클레오티드를 포함하는 IgA 신증 진단약 및 치료약에 관한 것(한국공개특허 특1999-82292호), 당뇨망막을 진단 할 수 있는 IgA 단백질 및 IgA 단백질 항체를 포함하는 진단키트 및 진단방법(한국등록특허 제528664호), 신약개발 및 진단 마커를 동정하기 위한 자가면역질환 등을 포함하는 질환관련 표적 단백질을 동정하는데 있어서 유전자 발현 프로파일을 단백질 발현 프로파일과 연관시키는 방법에 관한 것(한국공개특허 제2004-54609호), 피검체의 혈액과 뇨로부터 생리적 검체를 채취한 다음 그 검체를 질량분석기로 분석하여 얻은 분광학적 피크로부터 얻게 되는 단백질 프로파일 분석 정보를 사용하여 질환의 진행정도를 진단하는 일반적인 방법에 관한 것(미국특허공보 제2007/87448호)과 함께 사람의 혈액으로부터 당뇨병성 신증 환자의 발병여부 및 당뇨병에서 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 확인하여 증상의 정도를 파악하는 것으로서 확인된 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 immunoassay 키트에 이용되며 아울러 당뇨병성 신증에 있어서는 당뇨병에서 당뇨병성 신증의 조기진단 및 진행정도를 판단하는 방법에 관한 것(한국등록특허 제792630호) 등이 알려져 있다.

한편, IgA 신증이나 TGBM 신증 환자에서 심각한 신장기능의 저하가 발생되기 이전에 조속한 진단을 통한 치료가 중요함에도 불구하고 이의 진단을 위해 젊은 성인에서 나타나는 무증상의 혈뇨나 단백뇨 만을 가지고 신장생검과 같은 침습적 검사의 시행을 결정하기란 힘든 일이며, 설사 신장생검 시행을 하려한다 해도 여러 가지 이유로 모든 환자에서 실제로 이를 시행하기는 어려운 실정이어서 간편하면서도 정확한 새로운 IgA 신증이나 TGBM 신증의 진단방법이나 키트의 개발이 요구되어 왔다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 주된 목적은 IgA 신증 및 TGBM 신증 질환의 조기진단 및 진행정도를 효과적으로 진단할 수 있는 새로운 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커 단백질에 대한 항체 및 이를 이용한 조성물 및 진단키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 정상인의 뇨와 비교하여 신증 개체의 뇨에서 보다 증감하는 하기 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 IgA 신증과 TGBM 신증 질환의 진단용 바이오마커를 제공한다. 진단 바이오마커 단백질 발굴의 위하여 label-free 정량법을 이용하였다. 분석의 편의성과 재현성을 위하여 IgA 신증 환자그룹(이하, “IgAN 그룹”이라 칭함), TGBM 환자그룹(이하, “TGBM 그룹”이라 칭함)을 모두 10대에 국한하여 실험을 진행하였고, 뇨 전체의 단백질을 분석하지 않고 뇨 내의 엑소좀만을 분리하여 실험을 진행 하였다.

본 발명에서 개체(subject)란 IgA 신증 또는 TGBM 신증 환자이며, 면역원성 단편이란 본 발명의 바이오 마커 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 바이오마커 단백질의 단편을 의미한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 IgA 신증 및/또는 TGBM 신증 질환의 진단제를 제공한다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체일 수도 있으나, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 면역원인 바이오마커 단백질 또는 그 단편을 외부숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리 정제한다.

모노클로날 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술[Koeher and Milstein 1975, Nature, 256:495)]에 의해 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 20 ㎍을 얻어서 Balb/C 쥐에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화 시킨다. 그 후에 쥐에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, 엘라이져(ELISA)방법을 사용하여 원하는 모노클노날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 모노클로날 항체를 분리 정제한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 개체의 체액에서 본 발명의 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 개체의 당뇨병성 신증 진행 정도에 대한 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 진단 방법에서, 인간 혈액인 것을 특징으로 하며, 상기 검출 단계는 개체의 간의 혈액 용액으로부터 2차원(2-D) 전기영동으로 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 직접 검출하거나, 혈액을 본 발명의 항체와 접촉시켜 항원항체반응을 통해 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 간접적으로 확인하는 것을 포함한다.

항원항체반응으로서 현재 널리 알려진 immunoassay 법은 효소면역측정법(ELISA, Coated tube), 항체결합 magnetic particle을 tube에 결합시킨 다음 antigen-tracer와 난분해성 오염물질을 서로 경쟁적으로 반응시켜 효소반응을 유발시켜 정량하는 magnetic particle법, 항체결합 latex particle을 이용한 latex particle법 등이 있다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증의 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 진단키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조되며, 전형적으로 동결건조형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함한다. 상기 항체는 방사종, 형광원, 효소 등에 의해 표지화 될 수 있다. 본 발명의 단일클론항체는 immunoassay 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 다양하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 당뇨병성 합병증 검출 스펙트럼을 갖는 단백질칩 개발에도 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 IgA 신증 또는 TGBM 신증 환자의 뇨에 증감하는 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 IgA 신증 또는 TGBM 신증 질환의 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 주사제 등의 제형으로 제조되어 정맥주사 등으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 질환의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준으로 1일 0.001~100 ㎎의 단백질을 투여할 수 있다.

본 발명은 IgA 신증 또는 TGBM 신증 질환을 뇨로부터 쉽게 진단할 수 있는 기술이다. 현재까지 IgA 신증이나 TGBM 신증 환자의 진단에 대한 상업적으로 판매되는 효율적인 진단제는 없다. 본 발명의 바이오마커 단백질 조성물은 IgA 신증과 TGBM 신증 환자의 뇨에서 간단히 측정할 수 있으며, 조기 진단 및 진행 정도를 미리 예견하고 파악할 수 있다는 점에서 매우 유용하다.

또한, 본 발명의 바이오마커 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 IgA 신증과 TGBM 신증 질환의 조기진단 및 진행 정도를 진단할 수 있는 immunoassay 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 사구체신염 중에서 IgA 신증과 TGBM 신증의 조기진단 및 진행정도의 검출 스펙트럼을 갖는 단백질 칩 개발에 이용될 수도 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

도 1은 엑소좀 분리 순도를 웨스턴 블랏으로 확인한 전기영동 사진이고,

도 2는 뇨 엑소좀에서 질환을 진단 할 수 있는 바이오마커 발굴의 전체 진행도이며,

도 3은 본 발명 환자에서 증감을 보이는 단백질에 대한 웨스턴 블랏 사진이다.

<실시예 1> 뇨 샘플 준비(Urinary sample preparation)

전체 환자와 정상인의 뇨는 경북대학교 병원에서 제공되었다. 2006년 7월부터 2008년 4월까지 수집된 뇨 중에서 10대의 신장 조직검사를 확인된 5명의 IgA 신증 환자, 7명의 TGBM환자 및 12명의 정상인의 뇨를 선택했다. 모든 제공자의 아침 첫 뇨를 채취하여 protease inhibitor(1.67 ㎖ of 100 mM NaN₃/2.5 ㎖ of 10 mM PMSF/50㎕ of 1 mM Leupeptin)를 처리하여 -80℃에 보관한다. 뇨 시료는 뇨 크레아티닌 수치로 표준화 했다. 표준화된 뇨 시료[IgA 신증 환자(IgAN): 88.1㎖, TGBM 환자(thinGBM): 65.2 ㎖]를 사용하여 녹는 즉시 강하게 볼텍스 하여 사용하였으며 사용된 뇨의 임상병리학적 정보는 표1 에 나타내었다.

표 1

<실시예 2> 엑소좀 정제(Purification of exosome)

2-1. 엑소좀 정제

뇨 시료는 각각의 뇨 크레아티닌 수치를 체액분석기를 통해 확인하고 동량의 크레아티닌이 포함될 수 있게 부피를 정한후 세 군의 뇨를 합친다. 합쳐진 뇨 시료를 1차 원심분리(17,000 g for 15 min at 4 ℃)를 통해 전체 세포나 큰 막단백질 등의 파편을 제거한다. 1차 원심분리의 상등액을 2차 원심분리(200,000×g for 1 h at 4 ℃)를 실시하여 저밀도 막 소포단백질을 침전시킨다. 침전된 결과물은 분리 버퍼(250 mM sucrose/10 mM triethanolamine/0.5 mM PMSF/1 μM leupeptin) 50 ㎕를 이용하여 재현탁시키고 1.5 ㎖ 폴리프로필렌 튜브에 옮기고 60 ㎎/㎖ DTT를 첨가하여 60 ℃ 에서 10 분간 반응시켜 THP를 분리한다. 그 후 분리 버퍼를 첨가하여 원심분리(200,000 g for 1 h at 4 ℃)를 실시 저밀도 막 소포단백질을 침전 및 분리한다.

2-2. 엑소좀 순도 확인(Confirmation of exosome purity)

분리된 엑소좀의 순도를 확인하기위해 다음 세가지 분획을 얻었다. ① 뇨 침전물 (10 ㎖의 뇨를 1차 원심분리 17.000×g 15분하여 얻어진 침전물); ②뇨 엑소좀(10 ㎖의 뇨를 1차 원심분리 17,000×g 15분의 상등액을 2차 원심분리 200,000×g 1 시간 하여 얻어진 침전물) ③10 ㎖의 1차 원심분리 상등액을 동량의 아세톤을 첨가하여 침전시킨 단백질. 얻어진 분획을 12 % 아크릴아마이드 젤에 로딩하여 전기영동 하였다. 젤의 단백질을 니트로셀룰로스 막에 옮기고 웨스턴 블랏을 실시하였다. 상온에서 한 시간동안 TBS-T(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.05 % Tween-20)에 녹인 5 % 탈지유에서 블락킹 한 후 엑소좀의 표지 단백질인 anti-AQP2(aquapolin 2) (Santa Cruz, CA, USA) 와 anti-NHE3(Na/H exchanger 3) (Chemicon, Temecula, CA, USA) 1차항체를 포함한 5 % 탈지유/TBS-T용액을 넣어 4 ℃에서 16 시간 반응시킨다. 그 후 horseradish peroxidase(Santa Cruz, CA, USA)와 결합된 2차 항체 secondary를 붙이고 chemiluminescence(ECL, Amersham Pharmacia Biotech)감지 방법을 이용하여 이미지를 얻는다. 엑소좀의 분리 순도를 확인하기 위하여 엑소좀 표지 단백질인 두가지 단백질(NHE3 and AQP2) 항체를 이용하여 ①뇨 침전물 (10 ㎖의 뇨를 1차 원심분리 17.000×g 15분하여 얻어진 침전물); ②뇨 엑소좀 (10 ㎖의 뇨를 1차 원심분리 17,000×g 15분의 상등액을 2차 원심분리 200,000×g 1시간 하여 얻어진 침전물) ③10 ㎖의 1차 원심분리 상등액을 동량의 아세톤을 첨가하여 침전시킨 단백질의 세가지 분획으로 웨스턴 블랏을 실시하였으며 도 1{(A) Rabbit anti-Na+/H+ exchanger-3 [NHE-3] polyclonal antibody (B) Mouse anti-Aquaporin-2 [AQP-2] monoclonal antibody. (1) urinary sediment(pellet after 17,000 g 15 min spin); (2) urinary exosome(pellet after 200,000 g 1hr spin from supernatant of 17,000 g 15 min spin) (3) a 10㎖ aliquot of 17,000 g supernatant was used to isolate urinary protein by acetone precipitation.}에 나타내었다. 2번 분획에서는 엑소좀의 마커인 두 단백질의 발현을 볼 수 있으나 나머지 두 분획에서는 확인되지 않았다.

<실시예 3> 효소 소화(Enzyme digestion)

얻어진 엑소좀 침전물을 14 ㎕ 0.3 % SDS용액에 현탁시킨 후 5 ㎕의 아크릴아마이드용액 (30%) 0.7 ㎕ of 1 % ammonium persulfate, 와 0.3 ㎕ of TEMED를 섞어 준 후 약 30 분 실온에서 중합시킨다. 작은 젤을 수술용 칼을 이용하여 1 mm³ 크기로 자른 후 25 mM ABC(pH 8.0) 버퍼와 25 mM ABC(pH 8.0)/50% ACN 버퍼를 번갈아서 20 분씩 씻어준다. 그 후 감압건조 이용하여 젤을 말리고 일반적인 인-젤 다이제스천 방법을 따른다. 각 단백질은 10 mM DTT를 첨가하여 56 ℃에서 30 분간 환원시키고 55 mM iodoacetamide(IAA)를 첨가하여 실온 암반응하여 알킬화한다. 다시 젤 조각을 25 mM ABC (pH 8.0) 버퍼와 25 mM ABC(pH 8.0)/50% ACN버퍼를 번갈아서 20 분씩 씻어주고 감압건조 이용하여 젤을 말린다. 25 mM ABC 버퍼에 100 ng/㎕l 농도가 되게 트립신을 녹여 젤 조각과 함께 37 ℃ 16 시간동안 반응시킨다. 트립신에 의해 잘린 펩타이드를 25 mM ABC, 5 % formic acid/25 mM ABC/50% ACN in water 용액을 이용하여 세 번 추출해내고 각 추출된 펩타이드 용액은 감압건조를 이용하여 말리고 고상 단백질 추출법에 의해 펩타이드 만을 모은다.

<실시예 4> 단백질 동정(Protein identification)

나노급 액상 크로마토그래피 분석에는 nanoAcquity system(Waters Corporation, Milford, MA)을 사용하였고 사용한 컬럼은 Symmetry C18 5 μm, 2 mm 180 μm 트랩컬럼과 BEH C18 1.7 μm, 25cm×5μm 분석용 역상 컬럼(Waters Corporation)이다. 앞에서 얻은 펩타이드는 0.1 % formic acid에 녹여서 분석한다. 이동상은 이동상 A 0.1 % formic/water, 이동상 B 0.1 % formic acid/ACN이 사용되었다. 10 μL/min의 유속으로 3분간 트랩컬럼으로 흘려준다. 이동상 B 3~40%농도로 300 nl/min 유속으로 360 분을 흘려서 펩타이드를 분리하고 이동상 B 90 %까지 15 분간 흘려 컬럼을 씻어 낸 후 컬럼 재 안정화를 위해 20 분간 이동상 B 3 %로 흘려준다. 컬럼 온도는 35 ℃를 유지하고, 보조 펌프를 이용하여 300 nL/min의 유속으로 100 fmol [Glu1]-Fibrinopeptide B/μL를 질량분석기의 나노 락 레퍼런스 스프레이로 이동시킨다. 모든 시료는 4반복 실험을 실시했다. 트립틱 펩타이드의 분석은 Q-Tof Premier mass spectrometer(Waters Corporation, Manchester, UK)를 이용하여 실시되었다. 질량분석기는 v-mode로 10,000 FWHM의 레졸루션을 가진다. 모든 분석은 양이온 모드로 진행되었고 TOF 분석은 m/z 50~1990범위에서 분석되었다. 30 초에 한번씩 2가 전하의 [Glu1]-Fibrinopeptide B를 이용하여 실시간 질량 값을 보정하게 된다. 저 충돌 에너지 질량분석은 4 eV로 1 초간 데이터를 모으고 고 충돌 에너지 분석은 15 eV에서 40 eV로 에너지를 증가시키면서 1 초간 데이터를 모은다. 저 충돌에너지 분석과 고 충돌 에너지 분석간에는 0.1 초의 시간차를 두고 데이터를 모으게 된다.

<실시예 5> 상대적 정량분석(Relative quantificatuon)

액상 크로마토그래피 질량분석기로 얻어진 데이터는 ProteinLynx GlobalServer v2.3 (Waters Corporation)소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 클러스터링과 노말라이즈 된 데이터로부터 ProteinLynx GlobalServer v2.3의 알고리즘을 이용하여 단백질을 동정한 후 동정된 결과의 정확한 질량값과 액상 크로마토그래피의 지연시간을 이용하여 클러스터링을 실시하였다 . 동정된 트립틱 펩타이드의 피크 강도(intensity)를 이용하여 각 단백질의 양을 계산하게 되고 이를 이용하여 각 군별로 단백질의 발현을 확인한다.

<실시예 6> 바이오마커 확인(Biomarker validation)

12명의 정상인과 5명의 IgA 신증 환자와 7명의 TGBM 환자의 뇨에서 엑소좀을 분리하여 anti-Aminopeptidase N, anti-Vasorin precursor, anti-Ceruloplasmin, anti-Alpha-1-antitrypsin, 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 실시하여 각 군에서 위 단백질의 발현 정도를 확인 하였다. 뇨 엑소좀에서 질환을 진단할 수 있는 바이오마커 발굴의 전체 실험과정은 도 2에 나타내었다.

본 발명은 상기와 같은 실험을 수행한 결과, 단백질 분석은 LC-MS/MS를 이용하여 정상인 그룹(Normal 그룹)과 질병의 두 그룹(IgAN 그룹, TGBM 그룹)의 3회 반복 실험에서 총 2059개의 단백질이 동정되었으며 그 중의 일부 단백질을 표2~표33 에 나타내었다.

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본 발명에서 IgA 신증과 TGBM 신증 환자에서 증감을 보인 단백질들 중에서 Aminopeptidase N, Vasorin precursor, Ceruloplasmin, Alpha-1-antitrypsin을 선택하여 웨스턴 블랏 실시한 결과는 도 3(Normal: 정상인, IgAN: IgA 신증 환자, TGBM: TGBM 신증 환자)에 나타내었다.

Claims

정상인에 비하여 IgA 신증 환자와 TGBM(thin-glomerular-basement-membrane) 신증 환자의 뇨에서 증감하는 하기 단백질 군에서 선택된 최소한 세 개 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 IgA 신증과 TGBM 신증 질환의 진단용 바이오 마커 조성물.

<IgA 신증과 TGBM 신증 환자에서 증감하는 단백질>

Aminopeptidase N (Accession No. IPI00221224.6);

Vasorin (Acccession No. IPI00395488.2);

Prominin-2 (Accession No. IPI00295988.4);

Myosin-Ic (Accession No. IPI00010418.4);

Kininogen-1 (Accession No. IPI00032328.2);

Deoxyribonuclease-1 (Accession No. IPI00031065.1);

Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2 (Accession No. IPI00556204.1)
상기 제 1 항의 IgA 신증 환자와 TGBM 신증 환자의 뇨에서 증감하는 단백질 군에서 선택된 최소한 세 개 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 IgA 신증과 TGBM 신증 질환의 진단제.
제 2 항에 있어서,

모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 IgA 신증과 TGBM 신증 질환의 진단제.
상기 제 1 항의 IgA 신증 환자와 TGBM 신증 환자의 뇨에서 증감하는 단백질 군에서 선택된 최소한 세 개 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 IgA 신증과 TGBM 신증 질환의 진단 키트.
정상인에 비하여 TGBM(thin-glomerular-basement-membrane) 신증 환자의 뇨에서 증가하는 하기 단백질 군에서 선택된 최소한 세 개 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 TGBM 신증 진단용 바이오 마커 조성물.

<TGBM 신증 환자에서 증가하는 단백질>

Heat shock 70 kDa protein 5 (Accession No. IPI:IPI00003362.2);

Clusterin (Accession No. IPI:IPI00400826.1);

Pyruvate kinase isozymes M1/M2 (Accession No. IPI:IPI00479186.5);

Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha (Accession No. IPI:IPI00095891.2);

CD9 antigen (Accession No. IPI:IPI00215997.5);

Ras-related protein Rab-37 (Accession No. IPI:IPI00073180.8)
상기 제 5 항의 TGBM 신증 환자의 뇨에서 증가하는 단백질 군에서 선택된 최소한 세 개 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 TGBM 신증 질환의 진단제.
상기 제 5 항의 TGBM 신증 환자의 뇨에서 증가하는 단백질 군에서 선택된 최소한 세 개 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 TGBM 신증 질환의 진단 키트.
제 7 항에 있어서,

모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 TGBM 신증 질환의 진단제.
정상인에 비하여 IgA 신증 환자의 뇨에서 증가하는 하기 단백질 군에서 선택된 최소한 세 개 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 IgA 신증 진단용 바이오 마커 조성물.

<IgA 신증에서 증가하는 단백질>

Ceruloplasmin precursor(Accession No. IPI00017601.1);

Alpha-1-antitrypsin precursor(Accession No. IPI00553177.1);

Serotransferrin precursor(Accession No. IPI00022463.1);

Transferrin variant (Fragment)(Accession No. IPI00798430.1);

Alpha-2-macroglobulin precursor(Accession No. IPI00478003.1)
상기 제 9 항의 IgA 신증 환자의 뇨에서 증가하는 단백질 군에서 선택된 최소한 세 개 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 IgA 신증 질환의 진단제.
제 10 항에 있어서,

모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 IgA 신증 질환의 진단제.
상기 제 9 항의 IgA 신증 환자의 뇨에서 증가하는 단백질 군에서 선택된 최소한 세 개 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 IgA 신증 질환의 진단 키트.