WO2012144784A2 - 인간 간-카르복실에스터라제 １을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 - Google Patents

인간 간-카르복실에스터라제 １을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention provides a monoclonal antibody that specifically recognizes human liver-carboxyesterase 1 that can be used to objectively analyze the amount of human liver-carboxyesterase 1 expression in human clinical specimens such as tissues and blood, A hybridoma cell line producing the antibody and a use thereof.
  • Human carboxylesterase can be classified mainly as isoforms with different properties and structures, such as hCE1, hCE2, hCE3 (Imai T, Drug Metab Pharmacokinet. , Vol . 21) . , pp. 173-185, 2006).
  • Human liver-carboxyesterase 1 (hCE1) is an enzyme that is mainly biosynthesized by the liver and recognizes and decomposes acyl groups of hydrophilic components to chemicals absorbed into tissues.
  • human carboxyesterase 2 (hCE2) is an enzyme mainly expressed in the intestine, and has a homology with hCE1 (47%) as a separate protein and reacts with the acyl group of hydrophobic components absorbed into the intestine.
  • Human carboxyesterase 3 (hCE3) is an enzyme mainly expressed in the brain and has 50% homology with hCE1, which is also a separate protein.
  • Liver carboxyesterase 1 is an enzyme expressed in liver, intestine, kidney, lung, heart, macrophages, etc., but is expressed more than 10-fold higher in liver, and is classified into three major roles.
  • a pharmacological metabolism xenobiotic metabolism
  • lovastatin is converted into an active form, resulting in a cholesterol-lowering effect
  • cocaine and heroin which are toxic in the body, are non-toxic cocaethylene and morphine.
  • it regulates cholesterol metabolism by breaking down and combining ester structure of cholesterol and fatty acid in the body as needed.
  • C-reactive protein which is a recognition protein of macrophage immunity in endoplasmic reticulm, Directly binds to regulate function (Redinbo MR., Biochem. Soc. Trans ., 31, pp. 620-624, 2003; Redinbo MR., Drug Discov. Today ., 10, pp. 313-325 , 2005).
  • Other properties of liver-carboxyesterase 1 include a drastic reduction in the activity of enzymes in liver microsomes of rats induced by liver cancer by chemicals (Maki T., Jpn. J. Cancer Res ., 82, pp. 800-806, 1991), and this mechanism is not yet known.
  • liver carboxyesterase 1 in vivo has been carried out using p-nitriphenylphosphate or p-nitrophenylacetate, a nonspecific substrate of esterase enzyme. Analyzed by value. In this method, albumin, acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, etc., which have esterase function in the blood, have the same activity, and thus it is impossible to measure the specific activity of liver-carboxyesterase 1 alone ( Li B., Niochem.Pharmacol. , 70, pp. 1673-1684, 2005).
  • the enzyme immunoassay method induces antigen-antibody binding by reacting an antibody that binds a protein (antigen) of interest, and the degree of binding by using an enzyme-substrate-combined reaction with an antibody bound to the antibody. It is a method of quantifying a target protein.
  • liver-carboxyesterase 1 in human plasma and, on the contrary, the expression level of liver cancer tissues is lower than that of normal liver tissues.
  • the antibody of hepatic carboxyesterase 1 used in the above experiment is a commercially produced polyclonal antibody (Abcam, ab1875), which has other disadvantages that other nonspecific proteins can be bound and immunoprecipitation efficiency is inferior.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the antibody for separating and purifying liver-carboxyesterase 1 using the monoclonal antibody, detecting it in the blood, or specifically diagnosing liver cancer.
  • the present invention provides a monoclonal antibody that specifically binds to human liver-carboxyesterase 1 protein, produced by hybridoma with accession number KCLRF-BP-00282.
  • the present invention also provides hybridoma cells with Accession No. KCLRF-BP-00282 for producing monoclonal antibodies according to the present invention.
  • the invention also provides a composition for the separation and purification of human liver-carboxyesterase 1 protein comprising a monoclonal antibody according to the invention.
  • the present invention also provides a composition for detecting human liver-carboxyesterase 1 comprising the monoclonal antibody according to the present invention.
  • the present invention also provides a method for detecting the concentration of human liver-carboxyesterase 1 in urine or blood, comprising contacting a monoclonal antibody according to the invention with a sample sample to detect antigen-antibody complex formation.
  • the present invention also provides a liver cancer diagnostic kit comprising a monoclonal antibody according to the present invention.
  • the monoclonal antibody of human hepatic-carboxyesterase 1 of the present invention is characterized in that hepatic carboxyesterase 1 is expressed in tissues, cells, blood and the like through high specific binding to human hepatic-carboxyesterase 1 protein. Can be used for detection. In particular, it can be usefully used for the early diagnosis of liver cancer simply in the blood.
  • Figure 1 shows the results of analysis of liver-carboxyesterase 1 by separating the serum from the tail of the mouse after the immunization of the antigenic peptide group to the mouse 3rd.
  • Figure 2 is a photograph showing the reactivity of splenocytes and Maeloma fused cells of the immunized mouse to the antigen peptide of liver-carboxyesterase 1.
  • FIG. 3 shows hybridoma cell line selection results for producing liver-carboxyesterase 1 monoclonal antibody using splenocytes of immunized mice highly reactive by antigen-peptide of liver-carboxyesterase 1 will be.
  • FIG. 4 is a result of comparing the antigen-antibody binding degree between the monoclonal antibody of the present invention and the polyclonal antibody of known liver-carboxyesterase 1.
  • Figure 5 compares the antigen-antibody binding degree in the plasma of normal, hepatitis patients, cirrhosis transducer, liver cancer patients using a monoclonal antibody of the present invention and a known polyclonal antibody of liver-carboxyesterase 1 One result.
  • Figure 6 shows the results of color development (a) of the sample according to antigen-antibody binding using a monoclonal antibody of the present invention and a known polyclonal antibody of hepatic-carboxyesterase 1, and hepatic-carboxyesterase 1 Absorbance values according to antigen-antibody binding for each concentration are shown (b).
  • the inventors have developed a monoclonal antibody that is more efficient than the conventional commercially available human liver-carboxyl esterase 1 and a hybridoma cell line producing the antibody.
  • the present invention has been completed by providing a means to isolate the first and objectively compare the amount of this enzyme.
  • the present invention provides a monoclonal antibody specifically binding to human liver-carboxyesterase 1 protein, produced by hybridoma with Accession No. KCLRF-BP-00282, a hybridoma producing the monoclonal Provided are cells and methods for their preparation.
  • 'human liver-carboxyesterase 1' includes the protein itself, its recombinant protein and its artificial variants and mutants, as well as the natural form of the protein and its functional equivalents.
  • Monoclonal antibodies specific for human liver-carboxyesterase 1 of the invention can be prepared by fusion methods well known in the art (Kohler and Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6: 511-519).
  • One of two populations of cells fused to make a 'hybridoma' secreting monoclonal antibodies utilizes cells from an immunologically suitable host animal, such as a mouse injected with human liver-carboxyesterase 1
  • the other population uses cancer or myeloma cell lines. These two populations of cells are fused by methods known in the art, such as polyethylene glycol, and then antibody-producing cells are propagated by standard tissue culture methods.
  • Hybridoma cell lines capable of producing a specific cell population by subcloning by the limited dilution technique and then producing antibodies specific for human liver-carboxyesterase 1 were subjected to enzyme immunoassay. Selected by -linked immunosorbent assay (ELISA) or Western blot analysis, and culture in large quantities in vitro or in vivo according to standard techniques.
  • the in vivo mass culture means the hybridoma cell line is injected into the abdominal cavity of the mouse to induce high concentration of antibody production, and then separated from the ascites.
  • the monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line may be used without purification, or may be purified and used in high purity (eg, 95% or more) according to a method well known in the art.
  • purification techniques can be separated from the culture medium or ascites using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity antigen column chromatography, and the like.
  • hybridoma producing monoclonal antibody is named as hybridoma YPRC 10E8, and the Korean Cell Line Research Foundation, an international depository institution within the Cancer Research Institute of Seoul National University, Yongun-dong, Jongno-gu, Seoul, on March 28, 2012. Deposited as KCLRF-BP-00282 with the Cell Line Research Foundation.
  • the monoclonal antibody produced by the 'hybridoma YPRC 10E8' was named 'YPRC 10E8'.
  • phage display peptide libraries are used for biopanning, immunoblotting and screening fragments generated by digesting antigen polypeptides with proteases to determine fragments comprising epitope sequences, activated membranes or solid phases such as polyethylene pins. Screening peptide arrays immobilized on, competitive ELISA assays using soluble peptides, and the importance of each amino acid sequence residue in an epitope sequence.
  • Epitopes on human liver-carboxyesterase 1 recognized by the monoclonal antibodies of the present invention were analyzed on the tertiary structure of human liver-carboxyesterase 1 using AbFrontier's software and immunized on the analyzed peptide list. After confirming the difference from the amino acid sequence of the corresponding protein of the mouse to be selected, it was selected by reselection based on the peptide specific for the human liver-carboxyesterase 1 analyzed.
  • the antigen binding affinity of the monoclonal antibody can be determined according to a conventional method, but is not particularly limited, but more specifically, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation, immunofluorescence, and color particle binding Binding affinity to the antigen is determined by methods, chemiluminescent binding or immunoblotting.
  • Monoclonal antibodies of the present invention exhibit a binding affinity of at least 20-fold over polyclonal antibodies.
  • the monoclonal antibody according to the invention may be an immunoglobulin isotype of IgG1.
  • the present invention recognizes a linear epitope of SEQ ID NO: 1 corresponding to 554 to 567 of the C-terminus among the amino acid sequences of human liver-carboxyesterase 1, and to human liver-carboxyesterase 1 Provided are monoclonal antibodies that specifically bind.
  • the term 'monoclonal antibody' refers to a highly specific antibody directed against a single antigenic site as it is known in the art. Typically, unlike polyclonal antibodies that include different antibodies directed against different epitopes (antigenic determinants), monoclonal antibodies are directed against a single determinant on an antigen. Monoclonal antibodies have the advantage of improving the selectivity and specificity of diagnostic and analytical assays using antigen-antibody binding, and also have the advantage that they are not contaminated by other immunoglobulins because they are synthesized by hybridoma culture. As used herein, antibodies against human liver-carboxyesterase 1 include not only whole antibody forms but also functional fragments of antibody molecules.
  • the whole antibody is a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, and each light chain is linked by a heavy chain and disulfide bond.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types and subclasses gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), and gamma 3 ( ⁇ 3). ), Gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant regions of the light chains have kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types (cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, MJ, Ed., Chapter 45, pp. 41-50, WB Saunders Co. Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4, pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
  • Functional fragments of antibody molecules refer to fragments having antigen binding functions and include Fab, F (ab '), F (ab') 2, Fv and the like.
  • Fab in the antibody fragment has a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain and the first constant region (CH1) of the heavy chain has one antigen binding site.
  • a cysteine residue in the hinge region of Fab' forms a disulfide bond.
  • dsFv double-chain Fv
  • scFv short chain Fv
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., by limiting cleavage of the entire antibody to papain, Fab can be obtained and pepsin cleavage can yield F (ab ') 2 fragment). Can be produced through genetic recombination techniques.
  • the antibody is preferably in the form of Fab or in the form of whole antibody.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) or epsilon ( ⁇ ).
  • the light chain constant region may be of kappa or lambda type.
  • the antibody of the present invention may be a humanized antibody or a CDR-grafted antibody to further reduce the immunogenicity of the chimeric antibody or chimeric antibody.
  • Chimeric antibodies are antibody variable domains derived from animals other than humans (eg, mice, rabbits, poultry, etc.), and antibody constant domains refer to antibodies derived from humans. do. Such chimeric antibodies can be prepared by methods such as genetic recombination known in the art.
  • Humanized antibodies or CDR-grafted antibodies may be used to maintain the high affinity and specificity of animal-derived monoclonal antibodies and to reduce immunogenicity in humans.
  • the antibody refers to an antibody prepared by implanting an antigen binding region (CDR) into a human antibody.
  • CDR antigen binding region
  • the degree of humanization may be selected in consideration of the affinity for the antigen and the degree of immunity in the human body.
  • the invention also relates to a composition for the separation and purification of human liver-carboxyesterase 1 protein comprising a monoclonal antibody according to the invention.
  • the separation and purification composition comprising the antibody can be used for purification methods such as conventional ion exchange chromatography and affinity chromatography to easily separate and purify human liver-carboxyesterase 1 protein from a sample. To be.
  • the present invention also provides a composition for detecting human liver-carboxyesterase 1 comprising the monoclonal antibody according to the present invention.
  • the present invention provides a method for detecting the concentration of human liver-carboxylase 1 in urine or blood, comprising contacting a monoclonal antibody according to the present invention with a sample sample to detect antigen-antibody complex formation.
  • the present invention can detect human liver-carboxyesterase 1 by contacting the monoclonal antibody with human urine, serum or plasma to detect antigen-antibody complex formation.
  • the term 'antigen-antibody complex' refers to the enzyme and the monoclonal that recognizes the same to confirm the presence or absence of human liver-carboxyesterase 1 in a biological sample such as human urine, serum or plasma.
  • a biological sample such as human urine, serum or plasma.
  • the antigen-antibody complex can be detected using a detection label.
  • a detection label may be selected from enzymes, fluorescent materials, ligands, light emitting materials, microparticles, redox molecules or radioisotopes, but is not particularly limited thereto.
  • the enzyme is, for example, ⁇ -glucuronidase, ⁇ -D-glucosidase, ⁇ -D-galactosidase, urease, peroxidase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, glucose oxidase, Hexokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphphenolpyruvate decarboxylase, ⁇ -latama And the like.
  • Fluorescent materials include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde, fluorescamine, and the like.
  • Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.
  • Luminescent materials include, but are not limited to, acridinium ester, luciferin, luciferase, and the like.
  • Microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like.
  • Redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K 4 W (CN) 8 , [Os (bpy) 3 ] 2+ , [RU (bpy) 3 ] 2+ or [MO (CN) 8 ] 4-, and the like.
  • Radioisotopes include, but are not limited to, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I or 186 Re.
  • the antigen-antibody complex may be formed by colorimetric method, electrochemical method, fluorimetric method, luminometry, particle counting method, visual assessment, or visual assessment. It can be detected using a scintillation counting method. For example, flow cytometry, immunocytochemistry, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), western blotting, immunoprecipitation assay, immunodiffusion assay Can be detected by a complement fixation assay, a protein chip, or the like. More specifically, it can be detected through immunoprecipitation and immunoblotting useful for recovering small amounts of the desired protein.
  • the antigen-antibody complex can be detected using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of an antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, and a solid support.
  • Various ELISA methods include indirect sandwich ELISA using labeled secondary antibodies.
  • a biological sample such as urine, blood, serum or plasma is contacted with a monoclonal antibody of the present invention coated on a solid support such as a microtiter plate, a membrane, a test strip or the like.
  • a monoclonal antibody of the present invention coated on a solid support such as a microtiter plate, a membrane, a test strip or the like.
  • the wells of the coated plate are incubated with the sample sample, The presence of the antigen-antibody complex can then be determined.
  • the presence of the antigen-antibody complex can be confirmed using an antibody specific for the antigen of the antigen-antibody complex, for example a monoclonal or polyclonal antibody that specifically binds to human liver-carboxyesterase 1.
  • the monoclonal or polyclonal antibody may have a detection label, and in the absence of the detection label, the monoclonal or polyclonal antibody may be identified by treatment with another antibody capable of detecting these monoclonal or polyclonal antibodies.
  • a capture monoclonal antibody attached to a support is reacted with a biological sample, and then a monoclonal antibody that specifically binds to human liver-carboxyesterase 1 is bound to measure a detection label signal therefrom or these complexes.
  • Human liver-carboxyesterase 1 can be detected by adding a secondary antibody having a label capable of producing a detectable signal to and measuring the detection label signal therefrom.
  • the invention also relates to a liver cancer diagnostic kit comprising a monoclonal antibody according to the invention.
  • the monoclonal antibody used in the liver cancer diagnostic kit of the present invention can also be used as a fragment of the monoclonal antibody as long as the antibody can selectively recognize human liver-carboxyesterase 1.
  • Such antibody fragments may include F (ab ') 2, Fab, Fab', Fv fragments, and the like.
  • the liver cancer diagnostic kit may be prepared in the form of a protein chip to which the monoclonal antibody of the present invention is attached.
  • Liver cancer diagnostic kits of the present invention may include monoclonal antibodies or fragments thereof that selectively recognize human liver-carboxyesterase 1 and tools / reagents used for immunological analysis.
  • Tools / reagents used in such immunological assays include suitable carriers, labeling substances capable of producing detectable signals, solubilizers, detergents and the like.
  • the labeling substance when it is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyesters, Polyacrylonitrile, fluorine resin, crosslinked dextran, polysaccharides, polymers such as magnetic fine particles plated with latex metal, other papers, glass, metals, agarose and combinations thereof.
  • physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyesters, Polyacrylonitrile, fluorine resin, crosslinked dextran, polysaccharides, polymers such as magnetic fine particles plated with latex metal, other papers, glass, metals, agarose and combinations thereof.
  • Assay systems for use in the detection methods and diagnostic kits of the present invention include, but are not limited to, ELISA plates, dip-stick devices, immunochromatography test strips and radiation split immunoassay devices, and flow-through through) devices and the like.
  • liver tissue 50 mg was refrigerated at 4 ° C in cytolytic RIPA buffer [50 mM Tris, 150 mM sodium chloride (NaCl), 1% NonidetP-40, 0.25% sodium deoxycholate, pH 7.4]. The mixture was ground under conditions and centrifuged at 14000 rpm for 20 minutes to recover the protein solution.
  • cytolytic RIPA buffer 50 mM Tris, 150 mM sodium chloride (NaCl), 1% NonidetP-40, 0.25% sodium deoxycholate, pH 7.4.
  • Plasma collected from hepatitis patients, liver cirrhosis patients, and liver cancer patients with pathologically individual information was obtained from Yonsei Severance Hospital Gene Bank.
  • Plasma from normal individuals was tested for HIV-1 and HIV-2 antibodies, HIV-1 antigen, hepatitis B surface antigen, and hepatitis B nuclear antigen (HIV) derived from immunodeficiency virus (HIV).
  • HIV hepatitis B core antigen
  • hepatitis C virus hepatitis C virus
  • T cell leukemia virus (HTLV-I / II) antigen samples identified as negative in syphilis test were used. It was stored and used. The acquisition of plasma was in accordance with the rules of the Institutional Review Board of the Yonsei Medical Center.
  • auxiliary antigen (Freund's adjuvant) of each peptide group was emulsified and immunized by first injection into the abdominal cavity of four female BALB / c mice, followed by a second injection four weeks later, and another three weeks later.
  • Serum was isolated from the tails of all mice prior to each injection to determine the degree of antibody reaction produced in the mouse with the peptide antigen from enzyme immunoassay.
  • NC nitrocelluose
  • M in the gel picture means a standard marker (5 ⁇ g) by protein molecular weight, 5 ⁇ g represents a liver tissue protein it means.
  • mice were selected because of their high antigen-antibody reactivity in # 3 mice.
  • Splenocytes of mouse # 3 selected in Example 3 were isolated, fused with Sp2 / 0-Ag14 Maeloma cells, diluted in HAT medium and aliquoted into eight 96-well plates.
  • the cultured cells were subjected to enzyme immunoassay using a peptide synthesized at 250 ng / well as an antigen to select 11 wells with the highest absorbance.
  • Each cell was cultured in 24-well to obtain 5 wells from the enzyme immunoassay of the same method. Dog wells (# 1B2, # 1G11, # 2F4, # 3C1, # 3F2) were selected.
  • Each cell was again cultured in a 96-well plate and subjected to three repeated enzyme-immunoassays, with five clone cells showing the highest reactivity (# 1A9, # 4H3, # 6A10, # 8F11, # 10E8). was selected.
  • FIG. 2 is a photograph showing Western blot analysis of a culture solution of each # 3 well-cell having high titer in the enzyme immunoassay, and shows the position and degree of binding of liver-carboxyesterase 1.
  • FIG. High reactivity was observed in # 3F2 fusion cells.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of Western blot analysis of cells of the final selected wells by dispensing the selected five # well cells into 96-well plates and analyzing the wells showing high titers in a third iteration. It showed high reactivity in hybridoma cells.
  • Subclass isotype of final monoclonal antibody # 10E8 was found to be IgGl type (see Table 2).
  • Magnetic beads, 'Dynabead MyOne TM Tosylactivated' were prepared according to the manufacturer's manual for anti-inter-carboxyl esterase 1 polyclonal antibody (Abcam, # Ab1875) and anti-inter-carboxyl esterase 1 single. Each was coated with clone antibody (clone # 10E8). 10 ⁇ l, 20 ⁇ l, 30 ⁇ l, 40 ⁇ l, 50 ⁇ l of beads bound to each anti- liver-carboxyesterase 1 antibody were immunoprecipitated for 2 hours in a 1 mL tube with 100 ⁇ g of liver tissue protein.
  • the protein bound to the antibody was recovered using PBS-T buffer adjusted to pH 2, and immunoblotting was performed to determine the binding of liver-carboxyesterase 1 bound from polyclonal antibody and monoclonal antibody (clone # 10E8). Changes were compared to polyclonal antibodies using the ImageQuant program.
  • Figure 4 is a comparison of the antigen-antibody binding degree of polyclonal antibody and monoclonal antibody (clone # 10E8), pHCC is immunized with 30 ⁇ l of antibody-bound beads with 200 ⁇ l of a sample of plasma of 15 liver cancer patients Settled, 5 ⁇ g means liver tissue protein.
  • monoclonal antibody # 10E8 showed 20-fold higher antigen-antibody reactivity than polyclonal antibody under the same conditions.
  • liver cirrhosis After 10 plasma of normal, hepatitis, liver cirrhosis and liver cancer patients were mixed, the same 200 ⁇ l was immunoprecipitated with hepatic carboxyesterase 1 polyclonal antibody and monoclonal antibody # 10E8 used in Example 5. Western blot analysis was then performed. The signal intensity of the liver-carboxyesterase 1 analyzed when the scan resolution was 100 microns to scan under the same conditions was analyzed using the ImageQuant program.
  • Figure 6 is a result of comparing the antigen-antibody binding degree of the monoclonal antibody # 10E8 and the two polyclonal antibodies (# Ab1875, # Ab77730) of the two antibody 1 and the antibody 2 of Abcam applicable to ELISA, according to the antigen-antibody binding
  • the results of color development of the sample (a) and the absorbance values according to antigen-antibody binding for each concentration of liver-carboxyesterase 1 are shown (b).
  • the present invention can be used in the field of protein or disease diagnosis.

Abstract

본 발명은 인간 간-카르복실에스터라제 1을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도에 관한 것으로, 인간 간-카르복실에스터라제 1에 특이적으로 결합하여 조직, 혈액 등에서 인간 간-카르복실에스터라제 1 발현량을 객관적으로 분석하는데 사용할 수 있어 뇨 또는 혈액으로부터 간암을 간편하고 빠르게 진단할 수 있다.

Description

인간 간-카르복실에스터라제 １을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도
본 발명은 조직 및 혈액과 같은 인간 임상 검체에서 인간 간-카르복실에스터라제 1 발현량을 객관적으로 분석하는데 사용할 수 있는 인간 간-카르복실에스터라제 1을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다.
인간 카르복실에스터라제(human carboxylesterase, hCE)는 주요하게 hCE1, hCE2, hCE3 등의 서로 다른 성질과 구조를 갖는 이성질체(isoform)로 분류될 수 있다(Imai T, Drug Metab Pharmacokinet., vol.21, pp.173-185, 2006). 인간 간-카르복실에스터라제 1(hCE1)은 주로 간에서 생합성되는 효소로서 조직내로 흡수되는 화학물질에 대해 친수성분자의 아실기(acyl group)을 인식하여 분해시킨다. 반면, 인간 카르복실에스터라제 2(hCE2)는 주로 장에서 발현되는 효소로서, hCE1과의 동질성(homology)이 47%로 별개의 단백질이며, 장내로 흡수되는 소수성분자의 아실기와 반응한다. 인간 카르복실에스터라제 3(hCE3)는 주로 뇌에서 발현되는 효소로서 hCE1과 50%의 동질성이 있어, 이것 또한 별개의 단백질이라고 할 수 있다.
간-카르복실에스터라제 1은 간, 장, 신장, 폐, 심장, 대식세포 등에서 발현되는 효소이지만, 간에서 10배-100배 이상 높게 발현되며, 주요 역할은 크게 3가지로 분류된다. 첫째, 약물학적 대사기능(xenobiotic metabolism)으로서 인체내로 유입되는 비활성 약물의 에스테르(ester), 아미드(amid) 구조를 변형시켜 활성 약물로 전환하는 작용을 한다. 그 예로서, 로바스타틴(lovastatin)을 활성형으로 전환하여 콜레스테롤 저하 효과를 나타내게 하고, 체내에서 독성작용을 하는 코카인(cocain) 및 헤로인(heroin)을 비독성형인 코카틸렌(cocaethylene)과 모르핀(morphine)으로 각각 전환시키는 역할을 한다. 둘째, 체내의 콜레스테롤과 지방산의 에스테르 구조를 필요에 따라 분해 및 결합하여 콜레스테롤 대사를 조절하기도 하며, 셋째, 세포내 소포체(endoplasmic reticulm)에서 대식세포 면역의 인식 단백질인 C-reactive protein (CPR)과 직접적으로 결합하여 기능을 조절하는 역할을 한다(Redinbo MR., Biochem. Soc. Trans., 31, pp.620-624, 2003; Redinbo MR., Drug Discov. Today., 10, pp.313-325, 2005). 간-카르복실에스터라제 1의 다른 특성으로는 화학물질에 의해 간암이 유도된 랫트의 간 마이크로좀에서 효소의 활성이 급격히 낮아진다(Maki T., Jpn. J. Cancer Res., 82, pp.800-806, 1991)는 것이며, 이 기전은 아직까지 밝혀지지 않았다.
지금까지 생체내의 간 카르복실에스터라제 1의 활성도 분석은 에스터라제 효소의 비특이적 기질인 파라-니트로페닐포스파타제(p-nitriphenylphosphate)나 파라-니트로페닐아세테이트(p-nitrophenylacetate)를 사용하여 효소역가반응값으로 분석하였다. 이러한 방법은 특히 혈액내에서 에스터라제 기능을 갖는 알부민, 아세틸콜린에스터라제, 부티릴콜린에스터라제 등도 동일한 활성이 있어 간-카르복실에스터라제 1만의 특이적인 활성을 측정하기 불가능하다 (Li B., Niochem. Pharmacol., 70, pp.1673-1684, 2005). 따라서, 빠른 시간에 많은 양의 검체로부터 간-카르복실에스터라제 1 단백질을 선택적이고 효과적으로 분석할 수 있는 방법이 필요한데, 이러한 방법으로는 효소면역분석방법이 있다. 효소면역분석방법은 목적하는 단백질(항원)과 결합하는 항체를 반응시켜 항원-항체 결합을 유도하고, 결합 정도를 항체에 결합된 효소와 기질복합 반응을 이용함으로써 발색 또는 형광발색 등으로부터 임상 검체내의 목적 단백질을 정량하는 방법이다.
최근, 본 발명자들은 인간 혈장에서 간-카르복실에스터라제 1의 존재를 증명하고, 간암조직에서 정상 간조직보다 발현량이 낮아진 것과는 반대로, 간암환자의 혈장에서는 정상인의 혈장에 비해 평균 2.8배 이상 증가한다는 것을 증명하였다(Na K. et al., Proteomics. 9, pp.3989-3999, 2009). 그러나, 상기 실험에서 사용된 간-카르복실에스터라제 1의 항체는 상업적으로 제품화된 다클론항체(Abcam, ab1875)로서 비특이적인 다른 단백질들이 결합될 수 있고 면역침강반응 효율성이 떨어지는 단점이 있다.
본 발명의 목적은 조직, 혈액 등에서 간-카르복실에스터라제 1을 효과적으로 분석할 수 있는 간-카르복실에스터라제 1의 단일클론 항체와 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단일클론 항체를 이용하여 간-카르복실에스터라제 1을 분리 정제하거나, 혈중에서 검출하거나, 특이적으로 간암을 진단하는 상기 항체의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCLRF-BP-00282인 하이브리도마에 의해 생산되는, 인간 간-카르복실에스터라제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 단일클론 항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00282인 하이브리도마 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 단일클론 항체를 포함하는 인간 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 분리 및 정제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 단일클론 항체를 포함하는 인간 간-카르복실에스터라제 1 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 단일클론 항체를 시료 샘플과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 뇨 또는 혈중 인간 간-카르복실에스터라제 1의 농도 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 단일클론 항체를 포함하는 간암 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 인간 간-카르복실에스터라제 1의 단일클론 항체는 인간 간-카르복실에스터라제 1 단백질과의 높은 특이 결합을 통해, 조직, 세포, 혈액 등에서 간-카르복실에스터라제 1의 탐지에 사용될 수 있다. 특히, 혈액에서 간편하게 간암을 조기 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 항원 펩타이드 그룹을 마우스에 3차까지 면역화한 후 마우스의 꼬리에서 혈청을 분리하여 간-카르복실에스터라제 1을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 간-카르복실에스터라제 1의 항원 펩타이드에 대한 면역화된 마우스의 비장세포와 마엘로마의 융합세포에 대한 반응성을 나타낸 사진도이다.
도 3은 간-카르복실에스터라제 1의 항원 펩타이드에 의해 반응성이 높은 면역화된 마우스의 비장세포를 이용하여 간-카르복실에스터라제 1 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 선별 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 단일클론 항체와 공지의 간-카르복실에스터라제 1의 다클론 항체의 항원-항체 결합 정도를 비교한 결과이다.
도 5는 본 발명의 단일클론 항체와 공지의 간-카르복실에스터라제 1의 다클론 항체를 이용하여 정상인, 간염환자, 간경변환자, 간암환자의 혈장(plasma)에서 항원-항체 결합 정도를 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명의 단일클론 항체와 공지의 간-카르복실에스터라제 1의 다클론 항체를 이용하여 항원-항체 결합에 따른 시료의 발색 결과(a)와, 간-카르복실에스터라제 1의 농도별 항원-항체 결합에 따른 흡광도 수치를 나타낸 것이다(b).
이하 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 기존의 상업적으로 판매되고 있는 인간 간-카르복실에스터라제 1의 항체보다 효율성이 높은 단일클론 항체와 그 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 개발하여, 혈장내 간-카르복실에스터라제 1을 분리하고 이 효소의 양을 객관적으로 비교 분석하는 수단을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 기탁번호 KCLRF-BP-00282인 하이브리도마에 의해 생산되는, 인간 간-카르복실에스터라제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 상기 단일클론을 생산하는 하이브리도마 세포 및 이들의 제조방법을 제공한다.
본 명세서에서, '인간 간-카르복실에스터라아제 1'은 단백질 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체 및 돌연변이체뿐만 아니라 단백질의 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함한다.
본 발명의 인간 간-카르복실에스터라제 1 에 대해 특이적인 단일클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 제조될 수 있다(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조). 단일클론 항체를 분비하는 '하이브리도마'를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 인간 간-카르복실에스터라제 1을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득하고 나서, 인간 간-카르복실에스터라제 1에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 웨스턴블럿 분석법으로 선별하고, 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 상기 생체내 대량배양은 하이브리도마 세포주를 마우스의 복강에 주사하여 고농도의 항체 생산을 유도한 후, 복수액(ascites)에서 분리하는 것을 의미한다.
상기 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론 항체는 정제하지 않고 사용하거나, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 항원 컬럼 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites)에서 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 하이브리도마 YPRC 10E8로 명명하고 이를 2012년 3월 28일자로 서울시 종로구 연건동 소재 서울대학교 의과대학 암연구소 내의 국제기탁기관인 한국세포주연구재단(Korean Cell Line Research Foundation)에 기탁번호 KCLRF-BP-00282로 기탁되었다. 본 명세서에서, '하이브리도마 YPRC 10E8'이 생산하는 단일클론 항체를 'YPRC 10E8'로 명명하였다.
항원을 검출하기 위해 단일클론 항체를 사용하는 경우의 이점은 단일 에피토프를 인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는 다는 것이다. 이와 같이 항원과 항체간의 상호작용에 관여하는 에피토프를 맵핑(mapping)하기 위해 다양한 접근 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 파아지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 바이오패닝, 항원 폴리펩타이드를 프로테아제로 분해하여 생성된 단편을 면역블럿팅하여 스크리닝함으로써 에피토프 서열을 포함하는 단편을 결정, 활성화된 막 또는 폴리에틸렌 핀과 같은 고체상에 고정된 펩타이드 어레이를 스크리닝, 에피토프 서열내의 각각의 아미노산 서열 잔기의 중요성을 가용성 펩타이드를 사용한 경쟁적 ELISA 검정방법 등이 있다.
본 발명의 단일클론 항체가 인지하는 인간 간-카르복실에스터라제 1 상의 에피토프는 AbFrontier사의 소프트웨어를 사용하여 인간 간-카르복실에스터라제 1의 3차 구조에서 분석하고, 분석된 펩타이드 리스트에서 면역화시킬 마우스의 해당 단백질의 아미노산 배열과 다른 것을 확인한 후, 분석된 인간 간-카르복실에스터라제 1에 특이적인 펩타이드를 기준으로 재선별하여 선정하였다.
이러한 에피토프를 토대로 하여 인간 간-카르복실에스터라제 1의 아미노산 서열 중 C-말단의 554 내지 567에 해당하는 서열목록 서열번호 1의 선형 에피토프를 지정할 수 있었다.
상기 단일클론 항체의 항원 결합 친화성은 통상의 방법에 따라 결정할 수 있어 특별히 제한하지는 않으나, 보다 구체적으로는 방사능면역분석법(RIA), 효소면역측정법(ELISA), 면역침강법, 면역형광법, 색채입자결합법, 화학발광물질결합법 또는 면역블럿팅을 통해 항원과의 결합 친화성을 측정한다. 본 발명의 단일클론 항체는 다클론 항체 대비 20배 이상의 결합 친화도를 나타낸다.
본 발명에 따른 단일클론 항체는 IgG1의 면역글로불린 단위형(isotype)일 수 있다.
따라서, 본 발명은 인간 간-카르복실에스터라제 1의 아미노산 서열 중 C-말단의 554 내지 567에 해당하는 서열목록 서열번호 1의 선형 에피토프를 인식하며, 인간 간-카르복실에스터라제 1에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 '단일클론 항체'란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단일클론 항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 장점을 갖는다. 본 명세서에서는 인간 간-카르복실에스터라제 1에 대한 항체로서, 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다(cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed.,Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제 공개특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. dsFv(이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 scFv(단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C 말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.
이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 키메릭 항체 또는 키메릭 항체의 면역원성을 더욱 감소시키기 위한 인간화 항체 (humanized antibody) 또는 CDR-이식항체 (CDR-grafted antibody) 일 수 있다.
키메릭(chimeric) 항체란 항체 가변영역(variable domain)은 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 토끼, 가금류 등)에서 유래하고, 항체 불변 영역(constant domain)은 인간에서 유래한 항체를 의미한다. 이러한 키메릭 항체는 당업계에 공지된 유전자 재조합 등의 방법으로 제조될 수 있다.
인간화 항체(humanized antibody) 또는 CDR-이식항체 (CDR-grafted antibody)는 동물유래 단일클론 항체의 높은 친화도와 특이성은 유지하도록 하고 인체 내에서의 면역유발능을 감소시키기 위하여, 동물 유래 단일클론 항체의 항원결합영역(Complementarity determining region; CDR)을 인간항체에 이식시켜 제조되는 항체를 의미하며, 항원에 대한 친화도와 인체 내에서의 면역유발 정도를 고려하여 인간화시키는 정도를 선택할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 단일클론 항체를 포함하는 인간 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 분리 및 정제용 조성물에 관한 것이다.
상기 항체를 포함하는 분리 및 정제용 조성물은 통상의 이온교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법 등에 사용되어, 시료로부터 인간 간-카르복실에스터라제 1 단백질을 용이하게 분리 및 정제할 수 있게 한다.
다른 양태로서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 단일클론 항체를 포함하는 인간 간-카르복실에스터라제 1 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 단일클론 항체를 시료 샘플과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 뇨 또는 혈중 인간 간-카르복실에스터라제 1의 농도 검출방법을 제공한다.
본 발명은 상기 단일클론 항체를 인간의 뇨, 혈청 또는 혈장과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 인간 간-카르복실에스터라제 1을 검출할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '항원-항체 복합체'는 인간의 뇨, 혈청 또는 혈장 등의 생물학적 시료 중의 인간 간-카르복실에스터라제 1의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 상기 효소와 이를 인지하는 단일클론 항체의 결합물을 의미한다.
상기 항원-항체 복합체는 검출 표지체(detection label)를 이용하여 검출할 수 있다. 예컨대, 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 또는 방사선동위원소 등에서 선택될 수 있으며, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 효소는 예컨대, β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물질에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물질에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미세입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+ 또는 [MO(CN)8]4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 또는 186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
상기 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment), 또는 섬광계수법(scintillation counting method) 등을 사용하여 검출할 수 있다. 예컨대, 유세포 분석법(flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역측정법(ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침강 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 단백질 칩(protein chip) 등에 의해 검출할 수 있다. 보다 구체적으로, 소량의 목적 단백질을 회수하는데 유용한 면역침강법(immune precipitation) 및 면역블럿팅을 통해 검출할 수 있다.
가장 구체적으로, 항원-항체 복합체를 효소면역측정법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 검출할 수 있다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지를 하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 ELISA 검출방법에 따라, 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장 등의 생물학적 시료는 고체 지지체, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 테스트 스트립 등에 코팅된 본 발명의 단일클론 항체와 접촉된다. 구체적 일례로서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 본 발명의 단일클론 항체로 코팅하고 점유되지 않은(nonoccupied) 결합 부위를 예를 들어 BSA로 차단한 후, 코팅된 플레이트의 웰을 시료 샘플과 인큐베이션하고, 이어서 항원-항체 복합체의 존재를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체의 존재는 항원-항체 복합체의 항원에 대해 특이적인 항체, 예를 들어 인간 간-카르복실에스터라제 1에 특이적으로 결합하는 단일클론 또는 다클론 항체를 사용하여 확인할 수 있다. 상기 단일클론 또는 다클론 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출 표지를 갖지 않는 경우 이들 단일클론 또는 다클론 항체를 검출할 수 있는 또 다른 항체로 처리하여 확인할 수 있다.
구체적 예시로서, 지지체에 부착된 포획 단일클론 항체를 생물학적 시료와 반응시키고 이어서 인간 간-카르복실에스터라제 1에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 결합시켜 이로부터 검출 표지 신호를 측정하거나 이들 복합체에 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지를 갖는 2차 항체를 첨가하여 이로부터 검출 표지 신호를 측정하여 인간 간-카르복실에스터라제 1를 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 단일클론 항체를 포함하는 간암 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명의 간암 진단 키트에 사용되는 단일클론 항체는 이 항체가 인간 간-카르복실에스터라제 1를 선별적으로 인지할 수 있는 한, 단일클론 항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.
상기 간암 진단 키트는 본 발명의 단일클론 항체가 부착된 단백질 칩 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 간암 진단 키트에는 인간 간-카르복실에스터라제 1를 선별적으로 인지하는 단일클론 항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.
상기 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로즈 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 검출방법 및 진단키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 간조직과 혈장 시료의 수급
간조직 50 mg은 세포용해 RIPA 완충용액[50 mM 트리스(Tris), 150 mM 염화나트륨(NaCl), 1% NonidetP-40, 0.25% 디옥시콜레이트나트륨(sodium deoxycholate), pH 7.4]에 넣어 4℃ 냉장 조건에서 분쇄하였고, 14000 rpm으로 20분간 원심분리하여 단백질용액을 회수하였다.
병리학적으로 환자의 개별 정보가 확보된 정상인, 간염환자, 간경변환자, 간암환자로부터 분취된 혈장들은 연세 세브란스병원 유전자은행에서 제공받았다. 정상인의 혈장은 간암 지표 표준 검사 요소인 면역결핍바이러스(HIV) 유래인 HIV-1 및 HIV-2 항체, HIV-1 항원, B형 간염 표면항원(hepatitis B surface antigen), B형 간염 핵항원(hepatitis B core antigen), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), T세포백혈병 바이러스(HTLV-I/II) 항원, 매독균 검사에서 음성으로 판별된 시료를 사용하였고, 시료는 -70℃에서 실험 전까지 보관하여 사용하였다. 혈장의 입수는 연세의대암연구소(yonsei medical center)의 임상시험위원회(IRB) 규정에 따랐다.
<실시예 2> 최적 항원결정기 선정
간-카르복실에스터라제 1의 3차 구조에서 최적의 항원결정기를 갖는 펩타이드의 선정은 국내의 항체 제작회사인 AbFrontier사의 소프트웨어를 사용하여 분석하였으며, 분석된 펩타이드 리스트에서 면역화 시킬 마우스의 해당 단백질의 아미노산 배열과 다른 것을 확인하였고, 실제 연구에서 분석이 되고 간-카르복실에스터라제 1에 특이적인 펩타이드를 기준으로 재선별하여 최종 13개의 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 합성하였다(표 1 참조).
표 1
종 아미노산 배열 (n) 아미노산 위치
Human KAVEKPPQTEHIEL 13 554~567
Mouse LRAKKPPQTGHTEL 13 554~567
<실시예 3> 마우스의 면역화
펩타이드 그룹 각각 동량의 보조항원(Freund's adjuvant)을 유상화하여 암컷 BALB/c 4마리의 복강에 1차 주사하고 4주 후, 2차 주사, 다시 2주 후 3차 주사를 하여 면역화시켰다.
상기 각각의 주사 전에 모든 마우스의 꼬리에서 혈청을 분리하여 효소면역분석법으로부터 펩타이드 항원과 마우스에서 생산된 항체반응 정도를 측정하였다.
동시에 단백질 수준에서도 분석될 수 있도록 웨스턴블럿 분석법도 함께 진행하였다. 간-카르복실에스터라제 1 단백질과의 결합성 측정은 웨스턴블럿 방법으로 실시하였고, 기준 시료(standard sample)로서 간조직 단백질을 사용하였다.
정량되어 첨가된 간조직 단백질 5㎍은 10% SDS-PAGE에서 분리되었고, 겔은 니트로셀룰로오스(nitrocelluose; NC) 막에 붙인 후(transfer) 5% 탈지유(skimmed milk)가 포함된 TBS-T 완충용액 [20 mM 트리스, 137 mM 염화나트륨, 0.1% 트윈 20(Tween-20), pH 7.6]으로 1시간 동안 블로킹하였다. 펩타이드로 면역화된 마우스의 혈청을 1차 항체로서 500:1 비율로 5% 탈지유와 함께 반응시켰고, 2차 항체로서 항-마우스 IgG-HRP (Santa Cruz)를 5000:1 비율로 반응시켰다. 최종 NC 막은 ECL Plus 웨스턴블럿 시약(GE Healthcare)으로 3분간 반응시켰고, Typhoon 9400 스캐너로 스캔하여 항원-항체결합으로 반응한 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 신호를 분석하였다.
도 1은 면역화 기간별 마우스 혈청에서의 간-카르복실에스터라제 1의 분석도를 나타낸 사진도로, 겔 사진에서 M은 단백질 분자량별 표준 마커(5㎍)를 뜻하고, 5㎍은 간조직 단백질을 의미한다.
도 1에 나타난 바와 같이, #3마우스에서 높은 항원-항체 반응성을 나타내어 상기 마우스를 선택하였다.
<실시예 4> 단일클론 항체를 생산하는 최적 하이브리도마 세포주의 선별
상기 실시예 3에서 선택한 #3 마우스의 비장세포를 분리하여 Sp2/0-Ag14 마엘로마 세포와 융합시킨 후 HAT 배지에 희석시켜 8개의 96-웰 플레이트에 분주하여 배양하였다. 배양된 세포는 250 ng/well로 합성된 펩타이드를 항원으로 하여 효소면역분석법을 수행하여 흡광도가 가장 높은 11개 웰을 선택하였고, 각 세포는 24-웰에서 배양되어 같은 방법의 효소면역분석법으로부터 5개 웰(#1B2, #1G11, #2F4, #3C1, #3F2)을 선정하였다. 각 세포는 다시 96-웰 플레이트에 분주되어 배양되었으며, 효소면역분석법을 3회 반복 수행하여 이 중 가장 높은 반응성을 나타내는 5개의 클론 세포(#1A9, #4H3, #6A10, #8F11, #10E8)를 선택하였다.
도 2는 상기 효소면역측정법에서 높은 역가를 갖는 각각 하나의 #3웰-세포의 배양액을 웨스턴블럿 분석한 결과로서, 간-카르복실에스터라제 1의 위치와 결합정도를 나타낸 사진도이다. #3F2 융합세포에서 높은 반응성을 나타냈다.
도 3은 선별된 5개의 #웰 세포를 다시 96-웰 플레이트에 분주하여 높은 역가를 나타내는 웰을 3차 반복으로 분석하여 최종 선별된 웰의 세포를 웨스턴블럿 분석한 결과를 나타낸 사진도로, #10E8 하이브리도마 세포에서 높은 반응성을 나타냈다.
따라서, 높은 항원-항체 반응성을 나타내는 #10E8 하이브리도마 세포주를 최종 선택하고, 이를 마우스의 복강에 주사한 1주일 후, 복수액을 취하여 항원-친화성 정제 컬럼을 사용하여 최종 농도가 2 mg/mL이 되도록 농축하여 실험 전까지 냉동보관하였다.
최종 단일클론 항체 #10E8의 소단위형 아이소타입(subclass isotype) 측정 결과, IgG1형으로 판명되었다(표 2 참조).
표 2
클론 IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgA IgM κ λ H-체인 L-체인
10E8 0.518 0.072 0.104 0.097 0.097 0.084 0.738 0.149 IgG1 κ
<실시예 5> 단일클론 항체의 항원-항체반응 효율성 분석: 면역침강법 및 면역블럿팅
자석형비드인‘Dynabead MyOne™ Tosylactivated’(Invitrogen)는 제조사 매뉴얼에 따라 항-간-카르복실에스터라제 1 다클론항체(Abcam사, #Ab1875)와 항-간-카르복실에스터라제 1 단일클론항체(클론 #10E8)로 각각 코팅되었다. 각 항-간-카르복실에스터라제 1 항체가 결합된 비드 10 ㎕, 20 ㎕, 30 ㎕, 40 ㎕, 50 ㎕ 각각은 간조직 단백질 100 ㎍과 함께 1mL 튜브에서 2시간 동안 면역침강시켰다. pH 2로 맞춘 PBS-T 완충용액을 사용하여 항체에 결합한 단백질을 회수하였고, 면역블럿팅을 수행하여 다클론 항체와 단일클론 항체(클론 #10E8)로부터 결합된 간-카르복실에스터라제 1의 변화를 ImageQuant 프로그램을 사용하여 다클론 항체와 비교 분석하였다.
도 4는 다클론 항체와 단일클론 항체(클론 #10E8)의 항원-항체 결합 정도를 비교한 것으로, pHCC는 간암환자 15명의 혈장을 혼합한 시료 200 ㎕를 항체가 결합된 비드 30 ㎕와 함께 면역침강한 것이고, 5 ㎍는 간조직 단백질을 의미한다.
도 4에 나타난 바와 같이, 동일한 조건에서 다클론 항체보다 단일클론 항체 #10E8이 20배 높은 항원-항체 반응성을 나타내었다.
<실시예 6> 단일클론 항체를 이용한 혈장내 간-카르복실에스터라제 1 단백질 분석: 면역침강 및 면역블럿팅
정상인, 간염환자, 간경변환자, 간암환자 각각 10명의 혈장을 혼합한 후, 동일한 200 ㎕를 실시예 5에서 사용된 간-카르복실에스터라제 1 다클론 항체 및 단일클론 항체 #10E8과 면역침강반응 후 웨스턴블럿 분석법을 실행하였다. 동일한 조건으로 스캔하기 위해 스캔 해상도를 100 마이크론으로 하였을 때 분석된 간-카르복실에스터라제 1의 신호 강도를 ImageQuant 프로그램을 사용하여 분석하였다.
도 5 및 표 3에 나타난 바와 같이, 단일클론 항체와 결합한 간-카르복실에스터라제 1의 강도가 다클론 항체를 사용하였을 때보다 평균 30배 이상 분석 효율이 증가된 것을 확인하였다.
표 3
항체 종류 정상인 간염환자 간경변환자 간암환자
다클론 항체 191,363 182,431 178,140 738,366
본 발명의 단일클론 항체 5,586,315 6,676,570 3,314,999 24,906,430
<실시예 7> 단일클론 항체를 이용한 혈장내 간-카르복실에스터라제 1 단백질 분석: ELISA 분석
희석 농도가 0.5mg/mL인 상기 단일클론 항체 #10E8, ELISA 적용 가능한 Abcam 사의 두 다클론 항체 1과 항체 2의 다클론 항체(#Ab1875, #Ab77730) 200㎕를 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 상기 96-웰 플레이트에 첨가하고 냉장 상태에서 10시간 반응시킨 후, 비교 시료로 간-카르복실에스터라제 1의 표준 단백질을 혼합한200 ㎕를 상기 웰에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 2차 결합 항체로서 HRP 효소가 결합된 hCE1 항체(#Ab34595)를 5000:1로 동일하게 첨가하고 1시간 반응시킨 후 TMB 발색시약을 첨가하였다.
도 6은 상기 단일클론 항체 #10E8와 ELISA 적용 가능한 Abcam 사의 두 항체 1과 항체 2의 다클론 항체(#Ab1875, #Ab77730)의 항원-항체 결합 정도를 비교한 결과로서, 항원-항체 결합에 따른 시료의 발색 결과(a)와, 간-카르복실에스터라제 1의 농도별 항원-항체 결합에 따른 흡광도 수치를 나타낸 것이다(b).
도 6에 나타난 바와 같이, 표준 곡선의 분석된 흡광도 수치를 비교하여 보면 본원발명의 #10E8 항체는 같은 함량의 항체 대비 본원발명의 단일클론 항체의 결합 효율성은 기존 항체들보다 현저히 높음을 확인하였다.
본 발명은 단백질 또는 질병 진단 분야에서 사용할 수 있다.
[규칙 제26조에 의한 보정 25.06.2012]　
Figure WO-DOC-108
[규칙 제26조에 의한 보정 25.06.2012]　
Figure WO-DOC-110

Claims (8)

  1. 기탁번호 KCLRF-BP-00282인 하이브리도마에 의해 생산되는, 인간 간-카르복실에스터라제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    단일클론 항체는 인간 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 C-말단의 아미노산 554 내지 567의 에피토프 서열을 인식하는 것인 단일클론 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    IgG1의 면역글로불린 단위형(isotype)인 단일클론 항체.
  4. 제1항의 단일클론 항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00282인 하이브리도마 세포.
  5. 제1항에 따른 단일클론 항체를 포함하는 인간 간-카르복실에스터라제 1 단백질의 분리 및 정제용 조성물.
  6. 제1항에 따른 단일클론 항체를 포함하는 인간 간-카르복실에스터라제 1 검출용 조성물.
  7. 제1항에 따른 단일클론 항체를 시료 샘플과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 뇨 또는 혈중 인간 간-카르복실에스터라제 1의 농도 검출방법.
  8. 제1항에 따른 단일클론 항체를 포함하는 간암 진단 키트.
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