WO2019098603A2 - 소-임신 연관 글리코단백질 1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

소-임신 연관 글리코단백질 1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2019098603A2
WO2019098603A2 PCT/KR2018/013572 KR2018013572W WO2019098603A2 WO 2019098603 A2 WO2019098603 A2 WO 2019098603A2 KR 2018013572 W KR2018013572 W KR 2018013572W WO 2019098603 A2 WO2019098603 A2 WO 2019098603A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
antigen
bpag1
binding fragment
protein
Prior art date
Application number
PCT/KR2018/013572
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2019098603A3 (ko
Inventor
김봉휘
하영주
김세영
김지나
Original Assignee
(주)에스엘에스바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)에스엘에스바이오 filed Critical (주)에스엘에스바이오
Priority to CN201880074377.8A priority Critical patent/CN111587252B/zh
Priority to AU2018370072A priority patent/AU2018370072B2/en
Priority to EP18878115.7A priority patent/EP3712167A4/en
Priority to CA3082923A priority patent/CA3082923C/en
Priority to JP2020545029A priority patent/JP7013051B2/ja
Publication of WO2019098603A2 publication Critical patent/WO2019098603A2/ko
Publication of WO2019098603A3 publication Critical patent/WO2019098603A3/ko
Priority to US16/875,120 priority patent/US11953504B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/471—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour

Definitions

  • the present invention relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a bovine Pregnancy-associated glycoprotein 1 (bPAG1) protein.
  • bPAG1 bovine Pregnancy-associated glycoprotein 1
  • the above-mentioned radioimmunoassay uses radioactive materials, and it is necessary to use complex experimental equipment. Since the amount of progesterone differs depending on cattle, the standard is unclear and at least two experiments are required for accurate diagnosis There is a problem. Therefore, it is necessary to develop a new method that can solve the existing problems and diagnose the pregnancy of the cattle at an early stage more easily and quickly.
  • One aspect is to provide an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a bPAG1 protein.
  • Another aspect is to provide a hybridoma cell (Accession No. KCLRF-BP-00416) that specifically produces an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to bPAG1 protein.
  • Another aspect is to provide a composition comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a bPAG1 protein.
  • Another aspect is to provide a kit for pregnancy diagnosis of cattle comprising the composition.
  • Another aspect is a method of detecting a bPAG1 protein comprising contacting an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a bPAG1 protein with a test sample; And detecting the bPAG1 protein bound to the antibody or antigen-binding fragment.
  • the present inventors produced a hybridoma cell that produces a novel monoclonal antibody that specifically binds to bPAG1, which is a pregnant plasma protein of bovine spongiform encephalopathy, and massively purified and separated the antibody from the cell to confirm the pregnancy of the bovine by a relatively simple method , Thereby completing the present invention.
  • bovine Pregnancy-associated glycoprotein 1 (bPAG1) protein &quot is a bovine pregnancy plasma protein, collectively referred to as a blood flow protein that appears or increases according to pregnancy. Natural forms, variants thereof, and functional equivalents thereof.
  • the bPAG1 may be isolated from natural or recombinant cells, or may be artificially synthesized.
  • the term " antibody " refers to an antibody that specifically binds to a single antigenic site.
  • the antibody may be a molecule or an antigen-binding fragment thereof comprising an antigen-binding specific site formed by a heavy chain polypeptide and a light chain polypeptide known in the art, unless otherwise stated.
  • the antibody may be produced by plasma cells or hybridoma cells.
  • the antibody may be a monoclonal antibody. Specifically, it may be a monoclonal antibody that specifically binds to bPAG1 protein produced by a hybridoma cell having accession number KCLRF-BP-00416.
  • the term " antigen-antibody complex " refers to a combination of the bPAG1 protein and an antibody recognizing it.
  • the complex can be used to detect bPAG1 protein in a sample.
  • the complex can be used to detect bPAG1 in biological samples such as, for example, urine of cattle, serum or plasma.
  • the antibody according to the present invention may comprise an antigen-binding fragment as long as the antibody can selectively recognize bovine plasma protein bPAG1 protein, wherein the antigen-binding fragment is F (ab ') 2, 2, Fab, Fab, Fv fragments, and the like.
  • an epitope specifically binding to a monoclonal antibody against the bPAG1 protein was analyzed. As a result, it was confirmed that the amount of antibody specifically binding to the antigen was increased depending on the concentration of the antigen.
  • the antibody specifically binds specifically to the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, compared to the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2 to 4 at the same antigen concentration.
  • the antibody specifically binding to the bPAG1 protein may bind to an epitope polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the complete form of the antibody may be a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain may be linked to a heavy chain by a di-sulfide bond.
  • the heavy chain may be a full-length heavy chain comprising the variable region domain VH comprising the amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen and three constant region domains CH1, CH2 and CH3, and fragments thereof.
  • the light chain may refer to both the full length light chain and its fragments including the variable region domain VL and the constant region domain CL comprising the amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen.
  • the heavy chain comprises a constant region of gamma, mu, alpha, delta and epsilon and the light chain comprises an invariant region of kappa and lambda Region.
  • the antibody may be, for example, an immunoglobulin M (IgM).
  • hybridoma cell (Accession No. KCLRF-BP-00416) that produces an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to bPAG1 protein.
  • the specific contents of the antibody or its antigen-binding fragment specifically binding to the bPAG1 protein are as described above.
  • a splenocyte of a mouse is obtained, fused with mouse myeloma cells, and then hybridized with a hybridoma cell in which antibodies specifically binding to bovine plasma protein bPAG1 .
  • the hybridoma cells were deposited with the Korean Cell Line Research Foundation (KCLRF), and received the accession number KCLRF-BP-00416 on December 22, 2017.
  • Hybridoma cells producing such antibodies can be used to culture large quantities thereof in vitro or in vivo.
  • the antibody produced by the hybridoma cell can be used without purification, but it can be purified and used at a high purity, for example, 95% or more according to a known method in order to obtain the best results.
  • the antibody can be separated from the culture medium or ascites fluid using a purification method such as, for example, dialysis, salt electrophoresis, chromatography, and the like.
  • compositions for the detection of pregnancy in cattle comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a bPAG1 protein.
  • the specific contents of the antibody or its antigen-binding fragment specifically binding to the bPAG1 protein are as described above.
  • the composition may comprise a carrier, such as a diluent, buffer, stabilizer, etc., for the antibody.
  • the composition may comprise a detection reagent for detecting an antigen-antibody complex.
  • the cattle pregnancy diagnostic kit may include an antibody specifically recognizing the bPAG1 protein or an antigen-binding fragment thereof and a tool or reagent used for immunological analysis.
  • the antibody may specifically bind to an epitope polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the tools or reagents used in the immunoassay may include a suitable carrier, a labeling substance capable of generating a detectable signal, a solubilizer, a detergent, and the like.
  • the kit may include a substrate capable of measuring an enzyme activity and a reaction stopping reagent.
  • the carrier may be a soluble carrier, for example, a physiologically acceptable buffer such as PBS, an insoluble carrier such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluorocarbon resin, Crosslinked dextran, polysaccharide, polymer such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.
  • a physiologically acceptable buffer such as PBS
  • an insoluble carrier such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluorocarbon resin, Crosslinked dextran, polysaccharide, polymer such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.
  • Another aspect is a method of detecting a bPAG1 protein comprising contacting an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a bPAG1 protein with a sample of a sample; And detecting bPAG1 protein bound to the antibody or antigen-binding fragment.
  • the specific contents of the antibody or its antigen-binding fragment specifically binding to the bPAG1 protein are as described above.
  • the method of diagnosing cow pregnancy comprises contacting the specimen with an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the bPAG1 protein.
  • the sample may be a biological sample separated from the cow. Specifically, the sample may be milk, tissue, cell, blood, serum, plasma, saliva or urine of a cow to be examined for pregnancy.
  • the contacting may be incubating the antibody or antigen-binding fragment thereof and the sample in a liquid medium.
  • the incubation may be performed at a temperature, pH and stirring conditions suitable for antigen-antibody binding of the antigen and the antibody in the sample.
  • the incubation may be performed at 2 to 37 ⁇ ⁇ .
  • the incubation may be performed at pH 6-8.
  • the method of detecting pregnancy in cattle comprises detecting the antibody or antigen-binding complex.
  • the antigen-antibody complex may be directly isolated and its presence confirmed, or the complex may be detected by performing biochemical or immunochemical analysis without separating or separating the antigen-antibody complex.
  • the assay can be performed using enzyme immunoassay (ELISA), Western blotting, immunofluorescence, immunohistochemistry staining, flow cytometry, immunocytochemistry, radioimmunoassay RIA, Immunoprecipitation Assay, Immunodiffusion Assay, Complement Fixation Assay, and Protein Chip. [0035] The term " immunoprecipitation assay "
  • the antigen-antibody complex may be labeled with a detectable label or a substance capable of generating a detectable label.
  • the detectable label or the substance capable of generating a detectable label may be selected from the group consisting of an enzyme, a minerals, a ligand, a luminescent material, a microparticle, a redox molecule and a radioactive isotope.
  • Such enzymes include, for example, ⁇ -glucuronidase, ⁇ -D-glucosidase, ⁇ -D-galactosidase, urease, peroxidase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, glucose oxidase, It has been reported that a combination of hexokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructokutase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphoenolpyruvate decarboxylase, Or a combination thereof.
  • the fluorescent material includes, but is not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, picoeriterine, picocyanin, allophycocyanin, o-phthaldehyde, fluorescamine and the like.
  • Ligands include biotin derivatives.
  • the luminescent material may be an acridinium ester, luciferin, luciferase, or the like.
  • the fine particles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex and the like.
  • Redox molecules include ferrocene, ruthenium complex compounds, Biology hydrogen, quinone, Ti ions, Cs ions, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K 4 W (CN) 8 , [Os (bpy) 3] 2+ , [RU (bpy) 3 ] 2+ or [MO (CN) 8 ] 4 - , and the like.
  • the radioisotope may be 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I or 186 Re.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the bPAG1 protein according to the present invention specifically binds to plasma proteins that appear or increase according to the pregnancy of the bovine to form an antigen-antibody complex,
  • the antigen-antibody complex Through the analysis of the antigen-antibody complex, it is possible to diagnose the pregnancy of the cattle in a relatively simple manner, and thus the cattle breeding efficiency can be enhanced and the cattle can be usefully used in animal husbandry.
  • One aspect relates to an antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to bPAG1 protein, and the antibody specifically binds to bPAG1, a pregnant plasma protein of bovine, so that in an animal in which breeding is important, such as bovine, Therefore, it can be usefully used for animal husbandry by increasing breeding efficiency.
  • Figure 1 shows molecular information of the bPAG1 protein according to the present invention.
  • Figure 2 shows the isotype screening test results.
  • FIG. 3 shows the results obtained by Bradford assay after immunoglobulin M was isolated.
  • FIG. 3A shows a quantitative graph of the separated 3B1 clone
  • FIG. 3B shows a quantitative graph of the separated 3B3 clone
  • FIG. 3C is a photograph showing the degree of activity of the separated and purified antibody on the membrane.
  • Figure 4 shows the results of epitope analysis of monoclonal antibodies against bPAG1 protein.
  • 5 is a schematic diagram showing a method for diagnosing pregnancy of cattle.
  • FIG. 6 is a photograph showing a result of diagnosis of cow pregnancy using a kit made by a liver.
  • Antigenic peptides for antibody production were selected from among the 150th to 200th and 350th to 400th amino acid sequences of bPAG1 protein.
  • Four types of antigen peptides were prepared according to the presence or absence of keyhole limpet hemocyanin (KLH).
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • the amino acid sequence of the bPAG1 protein fragment has the sequence of SEQ ID NO: 5 (PAG1_100) and SEQ ID NO: 6 (PAG1_300).
  • An antigen emulsion was prepared using 100 ⁇ l of the preparation antigen (bPAG1_100) and the same amount of complete adjuvant, followed by administration to subcutaneous 8-week-old female mice (BALB / C) to induce an immune response. After the first administration, 100 ⁇ l of the same antigen and the same amount of Incomplete adjuvant were administered subcutaneously to the mice at intervals of 2 weeks. Antigen administration schedule and the like are shown in Table 1 below.
  • Antigen bPAG1_300 was used in place of the antigen bPAG1_300.
  • Example 1-1 The procedure of Example 1-1 was repeated except that the antigen bPAG1_300-KLH was used.
  • Example 1-1 After administering the antigen of Example 1-1 three times, a small amount of serum was collected from the tail vein of the mouse, and the activity of the polyclonal antibody in serum was confirmed by ELISA test. Specifically, 2 ⁇ g / ml of bPAG1_100 antigen was reacted at 100 ° C. for 18 hours at 4 ° C., followed by coating. The following day, the cells were blocked for 1 hour at room temperature using a blocking buffer. Thereafter, serum obtained from mouse blood was diluted to a magnification, 100 ⁇ l was dispensed into wells, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed with PBST, diluted with a 1: 2000 ratio of Goat anti-mouse IgG-HRP conjugated with HRP, and 100 ⁇ l was added to the wells and reacted at room temperature for 1 hour .
  • the TMB solution was dispensed and reacted for 15 minutes, and the reaction was terminated using the reaction stop solution. Absorbance values were measured at 450/620 nm to determine the titer in the serum. The results are shown in Tables 2 and 3 below.
  • Example 2-1 The same procedure as in Example 2-1 was carried out except that the antigen bPAG1_100-KLH was used.
  • Example 2-1 was performed in the same manner as in Example 2-1 except that the antigen bPAG1_300 was used.
  • Example 2-1 The same procedure as in Example 2-1 was performed except that the antigen bPAG1_300-KLH was used.
  • the prepared myeloma cells (SP2 / 0 Ag 14 - ATCC # CRL-1581) Were mixed at a ratio of 1: 5. Then, 1.7 ml of PEG1500 was added to the mixed cells to induce cell fusion. Cells were seeded in a 96-well plate at 200 per well and cultured in a CO 2 incubator. Two days after the cell fusion, 50% of each well was replaced with HAT medium (hypoxanthine-aminopterinthymidine medium). After 12 days, colony was confirmed and the reaction with the bPAG1 protein peptide (antigen for ELISA confirmation) was determined by proceeding in the same ELISA (Asb. 450 nm) method as in Example 2. In the ELISA results, when the OD value was 1.0 or more, the cells were selected as positive and selected as a parental cell for producing a monoclonal antibody. The results are shown in Table 4 below.
  • Cells that specifically reacted only with bPAG1 among the fused cell groups prepared in Example 3-1 were selected and screened using an enzyme immunoassay method to confirm the production of antibodies.
  • the medium was exchanged and an ELISA test was conducted using the exchanged medium as the primary antibody.
  • the wells positive for the corresponding antigen were selected and cultured in 24 wells.
  • Hybridoma cell lines cultured in 24 wells were again subjected to ELISA test in the same manner to identify antibody titers and secondary screening of antibody-producing cell lines.
  • the absorbance (OD value) of the fused cells grown in 24 wells was confirmed by ELISA, and only fused cells having an absorbance of more than 1 were selected and transferred to a 6-well culture flask.
  • the cells were cultured and centrifuged and the supernatant was collected and confirmed by ELISA Screening was performed.
  • the selected fusion cells were then transferred to a 75T / C culture flask and cultured.
  • the absorbance was checked by ELISA, and only fusion cells with absorbance above 1 were selected.
  • the cell lines selected through the above process are shown in Table 5 below.
  • the antibody having bPAG1-100 as a binding site was finally selected for the 1A6, 2A6, 2B6, 2C4, 3A6, 3B1, 3B3, and 3B5 cell lines.
  • Antibodies having bPAG- 4A3 cell line was selected.
  • the fusion cell 3B1 was deposited on December 5, 2017 (Korean Cell Line Research Foundation, KCLRF) (accession number: KCLRF-BP-00416).
  • Example 3-2 In order to mass-produce the monoclonal antibody against bPAG1 from the final selected fusion cell in Example 3-2, 0.5 ml of the incomplex adjuvant was administered to the abdominal cavity of the 6-week old mouse (BALB / C). After 3 days, 100 ⁇ l (1 x 10 6 cells) of each of the cells identified as having high OD value among the hybridoma cells selected in Example 3-1 was administered to each mouse. Six to ten days later, ascites were collected from the abdominal cavity of the mice.
  • a plurality of dialysis packs were put into a dialysis pack using a syringe. Then, 2 L of 2 mM PB was added to a beaker, dialyzed with a magnetic bar sample, and dialyzed at 4 ° C for 3 to 4 days. At this time, the buffer was changed once a day. After the dialysis was completed, the liquid in the dialysis solution was collected, centrifuged, and the supernatant was collected to quantify the protein and the antigen-antibody reaction was confirmed on the membrane.
  • the epitope mapping was performed using the peptides used for antibody production.
  • the peptides used for the mapping were only a part of 100 and 300 size of the PAG1 protein used for the production of the conventional antigen, and proceeded to four kinds as shown in Table 6 below.
  • the antigens bPAG1_100 and bPAG1_300 were dispensed at 25, 50, 100 and 200 ⁇ l per well of 100 ⁇ g / well, respectively, and reacted at room temperature for 2 hours. After blocking with blocking buffer at room temperature for 1 hour, 100 ⁇ l of the purified sample was added to the wells and reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the plate was washed with PBST, diluted with Goat anti-mouse IgM conjugated with HRP at a ratio of 1: 50000, and dispensed into wells for 100 minutes. After completion of the reaction, the cells were washed with PBST, and the TMB solution was dispensed and reacted for 15 minutes. Thereafter, the reaction was terminated using a reaction stopping solution, and the absorbance at 450/620 nm was measured to determine the activity in the sample.
  • the antibody selected in Example 3 above was used to detect bPAG1, which is known to be present in the blood of pregnant cows. Specifically, the antibody was fractionated on the membrane and the blood was collected from the cattle at 6, 7, and 8 weeks after artificial insemination using the other antibody having the antigen binding site to which the gold particles were bound, and the serum was separated by centrifugation. 0.05 ml of the separated serum was loaded on the specimen part of the kit prepared for the liver, and after 15 minutes, the result was judged.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 bPAG1(bovine Pregnancy-associated glycoprotein 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포; 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 소의 임신 진단용 조성물; 소의 임신 진단 키트; 및 소의 임신 진단방법에 관한 것으로, 상기 항체는 소의 임신성 혈장 단백질인 bPAG1에 특이적으로 결합하므로, 소와 같이 번식이 중요한 동물에 있어서 임신을 간단하게 진단할 수 있는바 번식 효율을 높여 축산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

소-임신 연관 글리코단백질 1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
본 출원은 2017년 11월 15일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2017-0152257호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서의 개시 내용은 전체로서 원용에 의하여 본 출원의 명세서에 포함된다.
본 발명은 소 임신-연관 글리코단백질1 (bovine Pregnancy-associated glycoprotein 1, bPAG1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
산업동물인 소의 사육에서는 대부분이 새끼 생산을 통해 농가의 소득이 이루어지고 있는 실정이다. 한편, 소의 번식에서는 수태를 시키는 것도 중요하지만, 수정을 시킨 소의 임신여부를 조기에 진단하는 것 또한 비수태 동물을 조기에 별도 관리할 수 있어 공태 기간을 줄일 수 있으므로, 농가의 원가 절감이 가능하다. 현재, 소 임신진단의 대부분은 수의사 또는 인공 수정사에 의해 임신 30 내지 42일에 태막 촉진법에 의해 이루어지고 있다. 또한, 다른 방법으로는 우유 내의 프로게스테론을 방사성 면역법(radiommunoassay, RIA)을 이용하여 검사하는 방법이 있다. 이 방법에 의하면 프로게스테론은 임신의 정상적 진행과 유지에 필요한 스테로이드계 호르몬으로서, 프로게스테론의 혈청 역가가 임신 초기에 상승하므로, 상기 호르몬의 상승 정도를 우유 내에서 확인하는 방법이다. 그러나, 상기 방사성 면역분석법은 방사성 물질을 이용하여 위험성이 따를 뿐만 아니라, 복잡한 실험 장비를 사용해야 하며, 프로게스테론의 양은 소에 따라 다르기 때문에 기준이 불명확하여, 정확한 진단을 위해서는 최소한 2회 이상의 실험을 해야 하는 문제점이 있다. 따라서, 기존의 문제점을 해결함과 동시에, 보다 간편하고 신속하게 소의 임신을 초기에 정확하게 진단할 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요하다.
일 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다.
다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포(수탁번호 KCLRF-BP-00416)를 제공하는 것이다.
다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 소의 임신 진단용 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검체 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 bPAG1 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 소에서 임신을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 소의 임신성 혈장 단백질인 bPAG1에 특이적으로 결합하는 신규 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제작하고 상기 세포로부터 상기 항체를 다량으로 분리 정제하여 소의 임신 여부를 비교적 간단한 방법으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 내 용어, “소 임신-연관 글리코단백질1 (bovine Pregnancy-associated glycoprotein 1, bPAG1) 단백질"은 소의 임신성 혈장 단백질로서, 임신에 따라 출현 또는 증량하는 혈류 단백질을 총칭한다. 상기 bPAG1는 단백질의 천연 형태, 그 변이체, 및 이의 기능적 등가물을 포함한다. 상기 bPAG1는 천연 세포 또는 재조합 세포로부터 분리되거나, 인공적으로 합성될 수 있다.
본 명세서 내 용어, “항체”는 단일 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 상기 항체는 달리 언급이 없으면 당업계에서 알려진 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드에 의하여 형성된 항원 결합 특이적 부위를 포함하는 분자 또는 그 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항체는 혈장 세포(plasma cell) 또는 하이브리도마 세포에 의해 생산될 수 있다. 상기 항체는 단일클론항체(monoclonal antibody)일 수 있다. 구체적으로, 수탁번호 KCLRF-BP-00416인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다. 본 명세서 내 용어, “항원-항체 복합체”는 bPAG1 단백질과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 복합체는 시료 중의 bPAG1 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다. 상기 복합체는 예를 들어, 소의 뇨, 혈청 또는 혈장 등의 생물학적 시료 중 bPAG1을 검출하는데 사용될 수 있다.
일 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항체는 상기 항체가 소의 임신성 혈장 단백질인 bPAG1 단백질을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 항원-결합 단편을 포함할 수 있으며, 상기 항원-결합 단편은 F(ab')2, Fab, Fab, Fv 단편 등을 포함할 수 있다.
일 실시예에서 bPAG1 단백질에 대한 단일클론 항체와 특이적으로 결합하는 에피토프(epitope)를 분석한 결과, 항원의 농도 의존적으로 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 상기 항체는 동일한 항원 농도에서 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 비해 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대하여 특이적으로 결합하는 양이 현저하게 높았다. 따라서, 상기 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 에피토프 폴리펩티드에 결합하는 것일 수 있다. 또한, 상기 항체의 완전한 형태는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이술피드 결합으로 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 중쇄는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체 길이 중쇄 및 이의 단편 모두일 수 있다. 상기 경쇄는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체 길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미할 수 있다. 이때, 상기 중쇄는 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 입실론(ε)의 불변 영역을 포함하고, 경쇄는 카파(κ) 및 람다(λ) 타입의 불변 영역을 포함한다. 상기 항체는 예를 들면, 면역글로불린 M(IgM)일 수 있다.
다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포(수탁번호 KCLRF-BP-00416)를 제공한다. 상기 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 마우스의 비장세포를 확보하고, 이를 마우스 골수종 세포와 융합하여 배양한 후, 소의 임신성 혈장 단백질인 bPAG1에 특이적으로 결합하는 항체가 확인된 하이브리도마 세포만을 선택하였다. 이후, 상기 하이브리도마 세포를 한국세포유곽연구재단(Korean Cell Line Research Foundation, KCLRF)에 기탁하여 2017년 12월 22일 수탁번호 KCLRF-BP-00416를 부여 받았다.
상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 이를 시험관 내 또는 생체 내에서 다량으로 배양하는데 사용될 수 있다. 상기 하이브리도마 세포가 생산하는 항체는 정제하지 않고 사용할 수 있으나, 최선의 결과를 얻기 위하여 공지된 방법에 따라 고순도 예컨대, 95% 이상으로 정제하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 투석, 염 친전, 크로마토그래피 등의 정제방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다.
다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 소의 임신 진단용 조성물을 제공한다. 상기 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 조성물은 상기 항체에 대한 희석제, 버퍼, 안정화제 등과 같은 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 검출 시약을 포함할 수 있다.
다른 양상은 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 소의 임신 진단용 키트를 제공한다. 상기 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 구체적으로, 본 발명에 따른 소의 임신 진단용 키트에는 bPAG1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구 또는 시약이 포함될 수 있다. 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 에피토프 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 이때, 면역학적 분석에 사용되는 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함될 수 있다. 상기 표지 물질이 효소인 경우, 상기 키트는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지 시약 등을 포함할 수 있다.
상기 담체는 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카리드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검체 시료에 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 bPAG1 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 소의 임신을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 구체예에 따른 소의 임신을 진단하는 방법은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검체 시료에 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 시료는 소로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 임신 여부를 확인하고자 하는 소의 유즙, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨일 수 있다. 상기 접촉시키는 단계는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 시료를 액체 매질 중에서 인큐베이션 하는 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 시료 중 항원과 상기 항체가 항원-항체 결합을 하는데 적합한 온도, pH 및 교반 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 2 내지 37℃에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 pH 6 내지 8에서 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 소의 임신 진단 방법은 상기 항체 또는 항원-결합 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 검출하는 단계는 항원-항체 복합체를 직접 분리하여 그 존재를 확인하거나, 분리 또는 분리하지 않고 상기 복합체를 생화학, 면역화학 분석법 등의 방법을 수행하여 검출하는 것일 수 있다. 상기 분석 방법은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 항원-항체 복합체는 검출 가능한 표지(detectable lavel)로 표지되거나 검출 가능한 표지를 발생시킬 수 있는 물질로 표지될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지 또는 검출 가능한 표지를 발생시킬 수 있는 물질은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticla), 레독스 분자 및 방사선동위원소로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 효소는 예컨대, β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제, 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 형광물질은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있다. 상기 발광물질은 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 상기 미세입자는 콜로이드금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+ 또는 [MO(CN)8]4 - 등일 수 있다. 상기 방사선동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 또는 186Re 등일 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 소의 임신 여부에 따라 출현 또는 증량하는 혈장 단백질에 특이적으로 결합하여 항원-항체 복합체를 형성하며, 상기 항원-항체 복합체의 분석을 통하여 소의 임신 여부를 비교적 간단한 방법으로 진단할 수 있는 바, 소의 번식 효율을 높여 축산업에 유용하게 이용될 수 있다.
일 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체는 소의 임신성 혈장 단백질인 bPAG1에 특이적으로 결합하므로, 소와 같이 번식이 중요한 동물에 있어서 임신을 간단하게 진단할 수 있는바, 번식 효율을 높여 축산업에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 bPAG1 단백질의 분자적 정보를 나타낸 것이다.
도 2는 아이소타입 스크리닝 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 면역글로불린 M을 분리한 후, Bradford assay를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 3에서, 도 3a는 분리한 3B1 클론의 정량 그래프를 나타낸 것이고, 도 3b는 분리한 3B3 클론의 정량 그래프를 나타낸 것이고, 도 3c는 분리 정제한 항체의 멤브레인 상에서의 활성 정도를 나타낸 사진이다.
도 4는 bPAG1 단백질에 대한 단일클론 항체의 에피토프 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 소의 임신 진단 방법을 나타낸 모식도이다.
도 6은 간이 제조한 키트를 이용하여 소의 임신을 진단한 결과를 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[준비예]
항체 제조용 항원 펩티드는 bPAG1 단백질의 150~200번째 및 350~400번째 아미노산 서열 중 40개를 선정하였으며, 키홀-림펫 헤모사이아닌(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)의 유무에 따라 4 종류로 진행하였다. bPAG1 단백질 단편의 아미노산 서열은 서열번호 5 (PAG1_100) 및 서열번호 6 (PAG1_300)의 서열을 갖는다.
[실시예]
실시예 1. 항원을 이용한 면역 반응 유도
1-1. bPAG1_100
준비예의 항원(bPAG1_100) 100㎕과 동량의 컴플리트 애쥬번트(Complete adjuvant)를 이용하여 항원 유화액을 만든 후, 8 주령의 암컷 마우스(BALB/C) 피하에 투여하여 면역반응을 유도하였다. 1차 투여 후, 2주 간격으로 동일한 항원 100㎕과 동량의 인컴플리트 애쥬번트(Incomplete adjuvant)를 이용하여 상기 마우스의 피하에 투여하였다. 항원 투여 일정 등에 관한 사항은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
1-2. bPAG1_100-KLH
항원 bPAG1_100-KLH을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
1-3. bPAG1_300
항원 bPAG1_300을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
1-4. bPAG1_300-KLH
항원 bPAG1_300-KLH을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
차수 항원 농도(㎎/㎖) 투여량(㎍)
1차 실시예 1-1 0.5 75 + 컴플리트 애쥬번트 (v/v 1:1 혼합)
1차 실시예 1-2 0.3125 46.875
2차 실시예 1-1 0.5 75 + 인컴플리트 애쥬번트 (v/v 1:1 혼합)
2차 실시예 1-2 0.3125 46.875
1차 실시예 1-3 0.5 75 + 컴플리트 애쥬번트(v/v 1:1 혼합)
1차 실시예 1-4 0.3125 46.875
3차 실시예 1-1 0.5 75 + 컴플리트 애쥬번트(v/v 1:1 혼합)
3차 실시예 1-2 0.3125 46.875
2차 실시예 1-3 0.5 75 + 인컴플리트 애쥬번트(v/v 1:1 혼합)
2차 실시예 1-4 0.3125 46.875
3차 실시예 1-3 0.5 75 + 컴플리트 애쥬번트(v/v 1:1 혼합)
3차 실시예 1-4 0.3125 46.875
실시예 2. 항체의 역가 확인
2-1. bPAG1_100
상기 실시예 1-1의 항원 투여를 3회 진행한 후, 상기 마우스의 꼬리 정맥에서 혈청(serum)을 소량 채혈하여 ELISA test를 통해 혈청 내 다클론 항체의 역가를 확인하였다. 구체적으로, bPAG1_100 항원 2 ㎍/㎖을 well당 100㎕씩 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, 코팅하였다. 다음날 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 이용하여 실온에서 1시간 동안 반응(blocking)시켰다. 이후, 마우스 혈액에서 얻은 혈청을 사용하여 배율에 맞게 희석하여 웰에 100 ㎕를 분주한 후, 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트는 PBST를 사용하여 세척한 후 HRP가 컨쥬게이션(conjugation)되어 있는 Goat anti-mouse IgG-HRP를 1:2000 비율로 희석하여 웰에 100 ㎕를 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, PBST를 사용하여 세척하고, TMB 용액을 분주하여 15분간 반응 시킨 후 반응 정지액을 사용하여 반응을 종결하였다. 450/620 nm에서 흡광도 값을 측정하여 혈청 내 역가(titer)를 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 2 및 표 3에 나타냈다.
2-2. bPAG1_100-KLH
항원 bPAG1_100-KLH을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
2-3. bPAG1_300
항원 bPAG1_300을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
2-4. bPAG1_300-KLH
항원 bPAG1_300-KLH을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
PAG1-100 코팅
혈청 농도 대조군 NC1 NC2 NC3 실시예 2-1 실시예 2-2 실시예 2-3 실시예 2-4
x 100 A 0.203 0.087 0.145 0.111 2.393 2.483 0.195 0.151
x 200 B 0.084 0.037 0.062 0.045 2.176 2.265 0.087 0.069
x 400 C 0.03 0.014 0.025 0.018 2.018 1.916 0.035 0.029
x 800 D 0.013 0.009 0.011 0.01 1.547 1.518 0.015 0.013
x 1600 E 0.009 0.006 0.008 0.006 1.029 0.998 0.016 0.019
x 3200 F 0.006 0.006 0.006 0.007 0.562 0.554 0.014 0.002
x 6400 G 0.005 0.005 0.011 0.011 0.288 0.263 0.005 0.005
x 12800 H 0.005 0.005 0.005 0.005 0.134 0.127 0.005 0.005
PAG1-300 코팅
혈청 농도 대조군 NC1 NC2 NC3 실시예 2-1 실시예 2-2 실시예 2-3 실시예 2-4
x 100 A 0.15 0.075 0.125 0.082 0.159 0.012 2.558 2.583
x 200 B 0.059 0.027 0.048 0.033 0.073 0.048 2.317 2.34
x 400 C 0.021 0.012 0.018 0.015 0.03 0.019 2.114 2.164
x 800 D 0.01 0.007 0.009 0.008 0.013 0.01 1.828 1.921
x 1600 E 0.007 0.006 0.006 0.007 0.007 0.005 1.434 1.446
x 3200 F 0.005 0.005 0.006 0.005 0.006 0.006 0.869 0.887
x 6400 G 0.005 0.004 0.005 0.005 0.005 0.004 0.385 0.454
x 12800 H 0.005 0.004 0.005 0.005 0.005 0.005 0.224 0.246
그 결과, 표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, bPAG1의 항원성 분석을 통해 합성하여 얻어진 PAG1-100과 PAG1-300 펩타이드가 bPAG1 항체를 다량 생산하였음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. bPAG1 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조 및 단일클론 항체 분리
3-1. 하이브리도마 세포의 제조
상기 실시예 2의 항체 역가 확인 실험을 통해 확인된 마우스의 혈청 내 역가를 기준으로 높은 역가를 갖는 항체들이 생성되었음을 확인하고 상기 마우스의 림프구를 분리하여 세포 융합을 실시하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-1 내지 1-4에서 면역 반응이 유도된 마우스의 비장을 손상 없이 적출하여 DMEM (Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium) 배지로 세척하고, 림프구를 분리하여 60㎜ 디쉬(dish)에 DMEM 배지를 담아 단일 세포로 분리시켰다. 이후, RBC 용해 버퍼 (lysis buffer)를 사용하여 림프구에 섞여있는 적혈구를 제거한 후, DMEM 배지로 세척하고, 준비된 골수종 세포(Myeloma cell, SP2/0 Ag 14 - ATCC #CRL-1581)과 림프구를 세포 수 대비 1:5로 혼합하였다. 이후, 상기 혼합된 세포들에 PEG1500 1.7 ㎖를 첨가해 세포 융합을 유도하고, 96 웰 플레이트에 웰 당 200 ㎕씩 세포를 분주 한 뒤 CO2 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 세포 융합 2일 후, 각 웰 당 50%를 HAT 배지(hypoxanthine-aminopterinthymidine medium)로 교체하였고, 12일 후, 콜로니(colony)를 확인하여 bPAG1 단백질 펩티드(ELISA 확인용 항원)와의 반응 여부를 상기 실시예 2와 동일한 ELISA (Asb. 450 nm) 방식으로 진행하여 결정하였다. 상기 ELISA 결과 중, O.D 값을 기준으로 1.0 이상인 경우, 양성(positive)으로 선정하여 단일클론 항체를 생산하기 위한 모세포로 선정하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타냈다.
bPAG100 bPAG300
1A1 1B3 2A6 2C2 3A6 N 4A1
1.877 0.97 2.49 1.475 0.704 0.02 3.036
1A2 1B4 2B1 2C3 3B1 4A2
1.689 1.776 1.797 1.382 1.558 1.966
1A3 1B5 2B2 2C4 3B2 4A3
2.651 0.251 0.985 3.283 2.766 0.389
1A4 2A1 2B3 3A1 3B3 4A4
2.146 2.649 1.11 1.504 2.996 0.181
1A5 2A2 2B4 3A2 3B4 4A5
0.68 2.631 0.157 0.478 1.053 0.146
1A6 2A3 2B5 3A3 3B5 N
1.431 3.164 3.106 0.904 1.058 0.125
1B1 2A4 2B6 3A4 3B6
2.522 2.847 3.16 0.076 0.745
1B2 2A5 2C1 3A5 3C1
0.872 0.108 2.929 1.133 2.246
3-2. 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 선별
상기 실시예 3-1에서 제조한 융합세포군 중 bPAG1에만 특이적으로 반응하는 세포를 선별하고 항체의 생성여부를 확인하기 위하여, 효소 면역방법을 이용하여 스크리닝 하였다.
세포융합 후 12일째에 배지를 교환하고, 교환한 배지를 1차 항체로 사용하여 ELISA 시험을 수행하였다. ELISA 시험 후 해당 항원에 양성을 보이는 웰을 선택하여 24 웰로 옮겨 배양하였다. 24 웰에서 배양한 하이브리도마 세포주를 동일한 방법으로 다시 ELISA 시험을 수행하여 항체 역가를 확인함과 동시에 항체 생성 세포주를 2차 스크리닝 하였다. 24 웰에서 키운 융합세포의 흡광도(O.D값)를 ELISA로 확인하고, 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하여 6 웰 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA로 확인하여 3차 스크리닝을 수행하였다. 3차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 다시 75T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 ELISA로 흡광도를 확인하여 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하였다. 상기 과정을 거쳐 선정된 세포주를 하기 표 5에 나타냈다.
bPAG1_100 1A6, 2A6, 2B6, 2C4
bPAG1_100-KLH 3A6, 3B1, 3B3, 3B5
bPAG1_300 4A1, 4A3
표 5에 나타난 바와 같이, bPAG1-100을 결합부위로 하는 항체는 1A6, 2A6, 2B6, 2C4, 3A6, 3B1, 3B3, 및 3B5 세포주가 최종 선별되었으며 bPAG-300을 결합부위로 하는 항체는 4A1 및 4A3 세포주가 선별되었다. 그 중, 융합세포 3B1을 한국세포유곽연구재단(Korean Cell Line Research Foundation, KCLRF)에 2017년 12월 5일자로 기탁하였다(수탁번호: KCLRF-BP-00416).
실시예 4. bPAG1 단백질에 대한 단일클론항체의 생산 및 정제
상기 실시예 3-2에서 최종 선택한 융합세포로부터 bPAG1에 단백질에 대한 단일클론 항체를 대량 생산하기 위하여 6 주령 마우스(BALB/C)의 복강에 0.5 ㎖ 인컴플리트 애쥬번트를 투여하였다. 3일 후, 상기 실시예 3-1에서 선정된 하이브리도마 세포 중 O.D 값이 높은 것으로 확인된 각각의 세포를 마우스 1 마리당 100 ㎕(1x106 cell)씩 투여하였다. 6~10일 후, 상기 마우스의 복강에서 복수(ascite)를 채취하였다.
실시예 5. bPAG1 단백질에 대한 단일클론 항체의 분리
상기 실시예 3에서 선별한 융합세포들로부터 bPAG1에 특이적으로 결합하는 항체를 분리하기 위하여 투석 팩(Dialysis pack)에 주사기를 사용하여 복수를 넣어주었다. 이후, 2 mM PB 2L를 비커에 넣고, 마그네틱 바와 시료가 들어있는 투석 색을 넣어준 후, 4℃에서 3~4일 동안 투석하였다. 이때, 버퍼는 하루에 한번씩 교체해 주었다. 투석이 완료된 후 투석액 내에 존재한 액체를 수거하여 원심분리 후 상층액을 수거하여 단백질 정량을 하였으며 또한 멤브레인 상에서 항원-항체 반응을 확인하였다.
그 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 3B1 융합세포주의 경우, 복수 1 ㎖ 당 약 1.5 ㎎의 항체를 생산하였으며 3B3 융합세포주의 경우 복수 1 ㎖ 당 약 2 ㎎의 항체를 생산하였다. 상기 과정을 통해 분리된 항체의 멤브레인 상에서의 활성을 확인하기 위하여, 멤브레인에 임신한 소의 혈청을 소량 로딩하여 건조시킨 후 금 입자를 접합시킨 각 항체들을 전개 용액과 혼합하여 흘려 보냈다. 그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이, 2C4, 3B1, 3B3 및 4A1 항체에서 항원(bPAG1)과의 결합을 의미하는 선명한 스팟을 확인할 수 있었다.
실시예 6. bPAG1 단백질에 대한 단일클론 항체의 에피토프(epitope) 분석
항체 생산에 사용한 펩티드를 사용하여 에피토프 맵핑(epitope mapping)을 실시하였다. 맵핑에 사용된 펩티드는 기존 항원 생산에 사용되었던 PAG1 단백질의 100, 300 size의 일부만을 사용하였고, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 4종류로 진행하였다.
펩티드 1 ASSDLWVPSDFCTSPACSTH 서열번호 1
펩티드 2 CVRFRHLQSSTFRLTNKTFRI 서열번호 2
펩티드 3 GAIPRGSEHYVPCSEVNTLP 서열번호 3
펩티드 4 CSIVFTINGINYPVPGRAYIL 서열번호 4
구체적으로, 항원 bPAG1_100 및 bPAG1_300을 각각 100 ㎍/웰의 웰 당 25, 50, 100 및 200 ㎕씩 분주하여 코팅한 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 블로킹 버퍼를 이용하여 실온에서 1시간 동안 블로킹 한 후 정제된 샘플을 사용하여 웰에 100 ㎕ 분주하고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 반응이 완료된 플레이트를 PBST를 사용하여 세척하고, HRP가 컨쥬게이션 되어 있는 Goat anti-mouse IgM을 1:50000 비율로 희석하여 웰에 100㎕ 분주하고 1시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 PBST를 사용하여 세척하고 TMB 용액을 분주하여 15분간 반응시켰다. 이후, 반응 정지액을 사용하여 반응을 종결하고 450/620 nm에서 흡광도 값을 측정하여 샘플 내 역가를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 항원의 농도 의존적으로 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 펩티드 1의 경우, 동일한 항원 농도 대비 펩티드 2~4에 비해 항원과 특이적으로 결합하는 양이 현저한 것으로 보아, 본 발명에 따른 항체 에피토프의 아미노산 서열임을 알 수 있다.
실시예 7. 분리 정제한 항체를 이용한 소의 임신 진단
상기 실시예 3에서 선별한 항체를 이용하여 임신한 소의 혈액 내에 존재하는 것으로 알려져 있는 bPAG1을 검출하였다. 구체적으로, 상기 항체를 멤브레인에 분주하고 금 입자가 결합된 항원 결합 부위가 다른 항체를 이용하여 인공 수정 후 6주, 7주 및 8주된 소의 혈액을 채취하고 원심분리 하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청 0.05 ㎖을 간이 제조한 키트의 검체 적제부에 로딩하고 15분 경과한 후, 결과를 판정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 수정 6주 후부터 검사선에 띠가 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 항체를 이용한 소의 혈액 내 bPAG1의 존재를 확인함으로써 소의 임신을 진단할 수 있다.
Figure PCTKR2018013572-appb-I000001

Claims (9)

  1. 소 임신-연관 글리코단백질1 (bovine Pregnancy-associated glycoprotein 1, bPAG1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 에피토프(epitope) 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체의 중쇄는 면역글로불린 M(IgM)인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 수탁번호 KCLRF-BP-00416인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 것인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포(수탁번호 KCLRF-BP-00416).
  6. bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 소의 임신 진단을 위한 조성물.
  7. 청구항 6의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 소의 임신을 진단하기 위한 키트.
  8. 청구항 1의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검체 시료에 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 bPAG1 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 소의 임신을 진단하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 검출하는 방법은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 수행하는 것을 포함하는 것인 소의 임신을 진단하는 방법.
PCT/KR2018/013572 2017-11-15 2018-11-08 소-임신 연관 글리코단백질 1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 WO2019098603A2 (ko)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201880074377.8A CN111587252B (zh) 2017-11-15 2018-11-08 与牛妊娠相关糖蛋白1特异性结合的抗体及其用途
AU2018370072A AU2018370072B2 (en) 2017-11-15 2018-11-08 Antibody specifically binding to bovine pregnancy-associated glycoprotein 1 and use thereof
EP18878115.7A EP3712167A4 (en) 2017-11-15 2018-11-08 ANTIBODIES SPECIFICALLY BONDED TO BOVINE'S PREGNANCY ASSOCIATED GLYCOPROTEIN 1 AND USES THEREOF
CA3082923A CA3082923C (en) 2017-11-15 2018-11-08 Antibody specifically binding to bovine pregnancy-associated glycoprotein 1 and use thereof
JP2020545029A JP7013051B2 (ja) 2017-11-15 2018-11-08 牛妊娠関連グリコタンパク質１に特異的に結合する抗体及びその用途
US16/875,120 US11953504B2 (en) 2017-11-15 2020-05-15 Antibody specifically binding to bovine pregnancy-associated glycoprotein 1 and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20170152257 2017-11-15
KR10-2017-0152257 2017-11-15

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/875,120 Continuation US11953504B2 (en) 2017-11-15 2020-05-15 Antibody specifically binding to bovine pregnancy-associated glycoprotein 1 and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2019098603A2 true WO2019098603A2 (ko) 2019-05-23
WO2019098603A3 WO2019098603A3 (ko) 2019-07-11

Family

ID=66537807

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/013572 WO2019098603A2 (ko) 2017-11-15 2018-11-08 소-임신 연관 글리코단백질 1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11953504B2 (ko)
EP (1) EP3712167A4 (ko)
JP (1) JP7013051B2 (ko)
KR (1) KR102189893B1 (ko)
CN (1) CN111587252B (ko)
AU (1) AU2018370072B2 (ko)
CA (1) CA3082923C (ko)
WO (1) WO2019098603A2 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102189893B1 (ko) * 2017-11-15 2020-12-11 (주)에스엘에스바이오 bPAG1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
KR20230065047A (ko) * 2021-11-04 2023-05-11 주식회사 나노바이오라이프 소 임신 진단 항체와 이를 이용한 조기 임신 진단키트 개발
CN114672464A (zh) * 2022-03-31 2022-06-28 吴峰 一种分泌抗牛妊娠相关糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554256A (en) * 1983-07-21 1985-11-19 The Idaho Research Foundation, Inc. Antigen associated with early detection of mammalian pregnancy
US4755460A (en) * 1984-07-06 1988-07-05 The Regents Of The Univ. Of Minnesota Bovine antigen glycoprotein, related antibody, and use in detection of pregnancy in cattle
US4895804A (en) * 1984-07-06 1990-01-23 University Of Minnesota Bovine antigen glycoprotein, related antibody, and use in detection of pregnancy in cattle
EP2295978A3 (en) * 1998-03-20 2012-06-06 The Curators Of The University Of Missouri Early pregnancy diagnosis using PAGs(Pregnancy-associated Glycoproteins)
AU2002330102A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-14 Aspenbio, Inc. Bovine pregnancy test
CA2467904C (en) * 2001-11-20 2009-04-07 The Curators Of The University Of Missouri Compositions and methods for accurate early pregnancy diagnosis
SG2014010029A (en) * 2005-08-19 2014-08-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
WO2009076632A1 (en) * 2007-12-13 2009-06-18 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for early pregnancy diagnosis
WO2012088290A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Tri-variable domain binding proteins and uses thereof
KR20130000950A (ko) * 2011-06-24 2013-01-03 충남대학교산학협력단 Ｔ-형(타입) 칼슘 채널의 알파1ｇ 서브유닛의 소 임신 진단 마커로서의 용도
CN104987379B (zh) * 2015-07-08 2018-08-03 武汉市畜牧兽医科学研究所 一种奶牛早期妊娠阶段血清中的差异蛋白及其用途
CN105838679B (zh) * 2016-04-12 2019-10-08 北京纳百生物科技有限公司 牛妊娠相关糖蛋白pag特异性单克隆抗体细胞株及其应用
CN106831976B (zh) * 2017-03-30 2020-07-24 山西农业大学 奶牛pag1多肽、其多克隆抗体及应用
CN107219368B (zh) * 2017-06-06 2019-02-26 山西农业大学 奶牛pag1检测试纸条及其制备方法
KR102189893B1 (ko) * 2017-11-15 2020-12-11 (주)에스엘에스바이오 bPAG1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CN111587252A (zh) 2020-08-25
US20200326347A1 (en) 2020-10-15
CA3082923A1 (en) 2019-05-23
EP3712167A2 (en) 2020-09-23
KR20190055741A (ko) 2019-05-23
JP7013051B2 (ja) 2022-01-31
AU2018370072A1 (en) 2020-07-02
CN111587252B (zh) 2023-08-29
WO2019098603A3 (ko) 2019-07-11
AU2018370072B2 (en) 2022-09-08
EP3712167A4 (en) 2021-10-27
CA3082923C (en) 2023-06-27
KR102189893B1 (ko) 2020-12-11
US11953504B2 (en) 2024-04-09
JP2021503014A (ja) 2021-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4935343A (en) Monoclonal antibodies for interleukin-1β
Williams et al. Thymic B lymphocyte clones from patients with myasthenia gravis secrete monoclonal striational autoantibodies reacting with myosin, alpha actinin, or actin.
KR100257985B1 (ko) 항-글리코헤모글로빈단일클론항체및글리코헤모글로빈의측정방법
WO2019098603A2 (ko) 소-임신 연관 글리코단백질 1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2016080591A1 (ko) 중동호흡기증후군 코로나바이러스 뉴클레오캡시드를 인식하는 항체 및 그의 용도
EP3150634A1 (en) Anti-muc1 antibody or antigen-binding fragment of same, and use thereof
JPH04503600A (ja) 抗インターロイキン―１α及び―１βのモノクローナル抗体、その製法、ならびに前記抗体類の、インターロイキン―１α及び―１βの検出と治療への応用
WO2023036152A1 (zh) 一种SARS-Cov-2检测方法和试剂盒
US7575938B2 (en) Method for diagnosing liver diseases
WO2011046309A2 (en) A diagnostic marker for hepatocellular carcinoma comprising anti-fasn autoantibodies and a diagnostic composition for hepatocellular carcinoma comprising antigens thereof
US5187063A (en) Measuring non-dystrophin proteins and diagnosing muscular dystrophy
WO1986002364A1 (en) Monoclonal antibodies and their use
WO2012144784A2 (ko) 인간 간-카르복실에스터라제 １을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도
WO2019013394A1 (ko) En2 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물
WO2019013392A1 (ko) En2 단백질을 특이적으로 인식하는 특정 항원으로부터 얻어진 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물
DE68928106T2 (de) Nachweis, quantifizierung und klassifizierung von ras-proteinen in körperflüssigkeiten und geweben
GB2133543A (en) Monoclonal antibody specific to human melanoma
CA1273305A (en) Process and reagent for the determination of the follicle-stimulating hormone and monoclonal antibodies suitable therefor
WO1986002359A1 (en) Monoclonal antibodies and their use
KR100493932B1 (ko) 레지스틴에 대한 단클론 항체, 이의 제조 방법, 및 용도
KR940002521B1 (ko) 인체 프로릴 4-히드록시라아제의 정량 방법
WO2017126944A1 (ko) 아세틸화된 마우스 bubr1에 대한 신규한 특이 단일클론항체 및 그 제조방법
WO1986002363A1 (en) Monoclonal antibodies and their use
WO1986003498A1 (en) Monoclonal antibodies and their use
WO2024061058A1 (zh) 一种抗生物素抗体或其功能性片段及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3082923

Country of ref document: CA

Ref document number: 2020545029

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018878115

Country of ref document: EP

Effective date: 20200615

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018370072

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20181108

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18878115

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2