WO2017126944A1 - 아세틸화된 마우스 bubr1에 대한 신규한 특이 단일클론항체 및 그 제조방법 - Google Patents

아세틸화된 마우스 bubr1에 대한 신규한 특이 단일클론항체 및 그 제조방법 Download PDF

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monoclonal antibody
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snu
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이현숙
김현종
권미선
박인애
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서울대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a specific monoclonal antibody of rabbit immunity against acetylated mouse BubR1, and to a method for producing the same, more specifically, the specific monoclonal antibody and hybridoma cells producing the monoclonal antibody and using the same
  • the antibody may provide a measure of cell division checkpoint activity as a measure of the degree of acetylation of BubR1, detection of diseases based on cell division abnormalities, cancer diagnosis and anticancer drug screening methods, or cell division cycle control methods.
  • the chromosome separation time which is transferred to each daughter cell after genetic information is replicated, that is, the transition period from the middle to the late stage of cell division, is the peak of cell division, and the spindle assembly checkpoint ( Spindle Assembly Checkpoint (SAC) (Taylor SS, Scott MI, Holland AJ (2004) The spindle checkpoint: a quality control mechanism which ensures accurate chromosome segregation. Chromosome Res 12: 599-616].
  • SAC Spindle Assembly Checkpoint
  • APC / C Anaphase Promoting Complex
  • APC / C is a multiplex E3 ligase that destroys securin and cyclin B [Yu, ibid]. If SAC is not working properly, cells die or produce diploids, which are known to be important features of cancer cells [Kops GJ, Weaver BA, Cleveland DW (2005) On the road to cancer: aneuploidy and the mitotic checkpoint . Nat Rev Cancer 5: 773-785; Pihan G.A.
  • monoclonal antibodies are antibodies that recognize one epitope and thus have low cross-reactivity and, above all, semi-permanent production is possible for the purpose of identifying the presence of the epitope.
  • it since it has high specificity and high affinity, it is widely used not only for the detection of a specific protein in research but also as a therapeutic antibody (antibody medicine) and a diagnostic tool for cancer.
  • rabbit immune monoclonal antibodies are used as ideal monoclonal antibodies for research and diagnosis.
  • rabbit immune antibodies are generally reported to have higher affinity and higher specificity [Rossi, S et al., Am J Clin Pathol., 124 (2), 295-302 (2005); Rocha R et al., Pathol Res Pract , 204 (9), 655-662 (2008); Tao, GZ et al, Exp Cell Res 312, 411-422 (2006).
  • rabbits are known to produce antibodies against antigens with greater immunogenicity than mice and other animals [Raybould, TJ et al, Science 240 , 1788-1790 (1988): Feng, L et al, Am J Transl Res 3, 269-274 (2011)].
  • BubR1 acetylation acts as a molecular switch regulating cell division checkpoint activity, suggesting that BubR1 acetylation can be used as a cell division checkpoint specific indicator [Choi et al., EMBO Journal , 28 (14), 2077-2089 (2009)].
  • BubR1-K243R / + mice embryonic fibroblasts (MEFs) which inactivated the BubR1 acetylation site, proved to cause about 40% of their own cancers. The two most important cell divisions have been identified and published (Park et al., J. Cell Biol ., 202 (2), 295-309 (2013)).
  • Korean Patent Publication No. 10-2011-0019495 discloses a method for preparing a polyclonal antibody against BubR1 derived from human, Musmusculus, Gallus Gallus, and Genus Laebes. .
  • no method is disclosed or implied in any of the above documents for the preparation of rabbit immune monoclonal antibodies of acetylated mouse BubR1.
  • Another object of the present invention to provide a use of the monoclonal antibody.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing cancer.
  • the object of the present invention is to determine a target peptide antigen for acetylated mouse BubR1 and to produce polyclonal hybridoma cells; BubR1-specific polyclonal hybridoma mAcBubR1-SNU-20 cells (Korea Cell Line Bank, deposited using GST-tagged mouse BubR1 (1-514 amino acids) recombinant protein for polyclonal hybridoma cells prepared in the above step) No. KCLFR-BP-00390, deposited on Jan.
  • the present invention has the effect of providing a monoclonal antibody against acetylated mouse BubR1 of rabbit immunity which is superior in specificity and reactivity compared to a mouse monoclonal antibody, and a method of preparing the same, and using the monoclonal antibody against BubR1.
  • Cellular checkpoint activity is measured on the basis of the degree of acetylation, detection of diseases based on cell division abnormalities, cancer diagnosis and anticancer screening methods or cell division cycle control methods are provided.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a novel GST-tagged mouse BubR1 (1-514 amino acid) recombinant protein according to the present invention.
  • FIG. 2 specifically recognizes BubR1, wherein the 243th residue contains acetylated lysine residues to identify specificity for acetylated BubR1 of mouse acetylated BubR1 polyclonal hybridoma cell culture according to the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of Myc-tagged mouse BubR1 according to the present invention.
  • FIG. 4 is a monoclonal antibody mAcBubR1-SNU-20-4, mAcBubR1-SNU-20 that specifically binds to mouse acetyl BubR1 protein after transfecting a plasmid containing Myc-tagged mouse BubR1 to HeLa cells according to the present invention.
  • Figure 7 is a photograph showing the results of Western blots after immunoprecipitation experiments of mAcBubR1-SNU-20-9.
  • Figure 5 shows the results of Western blot after immunoprecipitation experiment of the monoclonal antibody mAcBubR1-SNU-20-7 specifically binding to mouse acetyl BubR1 protein using Mouse Embryonic Fibroblast (mouse embryonic fibroblast) according to the present invention It is a photograph.
  • the present invention discloses monoclonal antibodies against acetylated mouse BubR1 and methods for their preparation.
  • the term “antibody” refers to a molecule that specifically binds to an antigen, and includes dimers, trimers and multimers, antibodies, recombinant, processed and camelized antibodies. In addition, the antibodies may be in the form of functional fragments of antibody molecules as well as complete forms.
  • the term “monoclonal antibody” refers to an antibody molecule of a single molecular composition obtained from substantially the same antibody population, which monoclonal antibody exhibits single binding specificity and affinity for a particular epitope.
  • “Hybridoma cell line” is a hybrid cell line obtained by fusing tumor cells and normal cells having certain functions. The hybridoma cell line is used to produce monoclonal antibodies and the like by obtaining cells having both proliferative properties and living cell functions of tumor cells. It is a cell line.
  • composition may be provided as a cancer prevention and treatment composition for livestock such as cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, and nutrients as well as humans who may develop cancer.
  • prevention refers to any action in which the induction of cancer is inhibited or delayed by administration of a composition comprising the antibody of the present invention
  • treatment refers to improvement of the symptoms of cancer by administration of the antibody of the present invention. Means any action that could be or beneficially altered.
  • the antibody When used as a therapeutic antibody, the antibody may be directly coupled with an existing therapeutic agent or indirectly (eg, covalently) through a linker or the like to be introduced in vivo in the form of an antibody-therapeutic conjugate to be used for the prevention or treatment of cancer.
  • Therapeutic agents that may be used include chemotherapeutic agents, immunotherapeutics, cytokines, chemokines, antiviral agents, biologic agents, enzyme inhibitors and the like.
  • composition comprising an antibody includes a pharmaceutically acceptable carrier and may be formulated for human or veterinary use.
  • Pharmaceutical compositions for oral administration may be presented as discrete units such as capsules or tablets; Powder or granules; Syrups or suspending agents (in aqueous or non-aqueous liquids; edible blowing agents or whips; or emulsions).
  • Pharmaceutical compositions for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterile injectable solutions which may contain antioxidants, buffers, bacteriostats and solutes (which are substantially isotonic with the recipient's blood); And aqueous and non-aqueous sterile suspending agents which may include suspending agents and thickening agents.
  • Excipients that can be used in the injectable solvents include, for example, water, alcohols, polyols, glycerin and vegetable oils. Such compositions may be presented in unit-dose (single) or multi-dose (several) containers, eg sealed ampoules, and immediately prior to use, sterile liquid carriers, such as water for injection. Can be stored under freeze-drying conditions requiring only the addition of a. Immediate injection solutions and suspensions can be prepared from sterile powders, granules and tablets.
  • “Kits” of the present invention include not only the antibodies of the present invention but also tools, reagents, and the like that are generally used in the art used for immunological analysis.
  • tools / reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling materials capable of producing detectable signals, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like.
  • the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate and a reaction terminator capable of measuring enzyme activity.
  • detection of acetylation of BubR1 protein means qualitatively or quantitatively measuring the signal size of a detection label bound to an antigen-antibody conjugate to confirm the presence and amount of acetylated BubR1.
  • detection kits include not only the antibodies of the present invention but also tools, reagents, and the like that are commonly used in the art for immunological assays.
  • tools / reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling materials capable of producing detectable signals, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like.
  • the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate and a reaction terminator capable of measuring enzyme activity.
  • Antigen-antibody conjugate formation includes tissue immunostaining, radioimmunoassay (RIA), Enzyme-Linked Immunosorent Assay, Western Blotting, Immunprecipitation Assay, and immunodiffusion assay. assay, Complement Fixation Assay, FACS, protein chip, and the like, but are not limited thereto.
  • Labels that enable qualitative or quantitative measurement of antigen-antibody conjugates include, but are not limited to, enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, and radioisotopes.
  • Enzymes available as detection labels include ⁇ -glucuronidase, ⁇ -D-glucosidase, ⁇ -D-galactosidase, urease, peroxidase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, and glucose oxy Multidase, Hexokinase and GDPase, RNase, Glucose Oxidase and Luciferase, Phosphofructokinase, Phosphoenolpyruvate Carboxylase, Aspartate Aminotransferase, Phosphopyruvate Decarboxylase, ⁇ -La Tamases and the like, but is not limited thereto.
  • Fluorescent materials include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalate, fluorescamine, and the like.
  • Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.
  • Luminescent materials include, but are not limited to, acridinium ester, luciferin, luciferase, and the like.
  • Microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like.
  • Redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K4W (CN) 8, [Os (bpy) 3] 2+, [ RU (bpy) 3] 2+, [MO (CN) 8] 4-, and the like.
  • Radioisotopes include, but are not limited to, 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re, and the like.
  • cross-reactivity is a phenomenon in which a plurality of antigenic determinants exist in one antigenic substance and can react with other antigenic determinants similar in antibodies to a specific epitope.
  • a "labelled substance” is a substance labeled to detect a desired substance or phenomenon. Fluorescent substances, radioisotopes, ferritin, enzymes, and the like are used, but are not limited thereto. Markers can be detected by fluorescence microscopy, radiography, optical microscopy, enzyme reactions, and the like, but are not limited thereto.
  • Antibodies of the acetylated mouse BubR1 of the invention were prepared using the information and sequences in Table 1 below. In order to efficiently prepare antibodies, the sequences of the left and right were selected such that the lysine (K) residue was located in the middle, and the following antibody preparation target peptide appended SEQ ID NO: 1 was selected (Table 1).
  • the antibody-producing target peptide SEQ ID NO: 1 was injected into rabbits to produce cells that produce antibodies against the antigen, and antibody-producing cells (Lymphocyte, B cells) obtained from the rabbit's spleen were myeloma cells (myeloma, 240E-W2, Abcam®).
  • the fusion cells were obtained polyclonal hybridoma cells of multiple cell types or multiclones state with immune activity through ELISA experiment.
  • Acetyl-CoA After adding Acetyl-CoA to the GST-tagged mouse BubR1 (1-514 amino acid) recombinant protein, divided into two groups, one of the two groups added the GST-P / CAF HAT domain, and one group was excluded.
  • Polyclonal hybridoma cell cultures were added to the two groups in a blocking solution containing 5% skim milk powder at a ratio of 1: 3 and subjected to Western blotting after electrophoresis.
  • mAcBubR1-SNU-20 cells in the polyclonal hybridoma obtained in Example 1 showed polyclonal high as an antibody that specifically recognizes BubR1 containing the acetylated lysine residue at 243th residue. It was selected as bridoma cells (FIG. 2).
  • the polyclonal hybridoma cells produced according to this example were named mAcBubR1-SNU-20 and were deposited with the KCLFR-BP-00390 at the Korean Cell Line Bank (101, Jongno-gu, Jongno-gu, Seoul) under the Budapest Treaty. The deposit has been completed.
  • monochromatic hybridoma cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FBS (fetal bovine serum), 1% penicillin and streptomycin at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin and streptomycin at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • Each monoclonal antibody contained in the culture solution further recognizes acetylated mouse BubR1 using immunoprecipitation and Western blot experiments through each HeLa cell or mouse embryonic fibroblasts as shown in Examples 4 and 5 below. was selected and confirmed as a monoclonal antibody.
  • Hec cells transfected with Myc-tagged mouse BubR1 (FIG. 3) were treated with nocodazole (nocodazol, 200ng / ml), followed by synchronizing and gently culturing the cell culture medium to remove medium cells ( mitotic shake off).
  • nocodazole nocodazol, 200ng / ml
  • the monoclonal hybridoma cells produced according to this example were named mAcBubR1-SNU-20-4, mAcBubR1-SNU-20-7 and mAcBubR1-SNU-20-9 and the Budapest Treaty International Depositary Organization Korea Cell Line Bank ( Deposits KCLFR-BP-00391, KCLFR-BP-00392 and KCLFR-BP-00393 were completed on January 19, 2017 at 101 Daehak-ro, Jongno-gu, Seoul.
  • mouse embryonic fibroblasts were treated with nocodazole (nocodazole (400ng / ml)) and the medium cells were removed (mitotic shake off).
  • nocodazole nocodazole (400ng / ml)
  • the medium cells were removed (mitotic shake off).
  • Western blotting the acetylated mouse BubR1 monoclonal antibodies of Example 4 in a ratio of 1: 5 As a result, it was confirmed that mAcBubR1-SNU-20-7 was specifically bound to be used as a monoclonal antibody (Fig. 5).
  • the present invention has the effect of providing a monoclonal antibody against acetylated mouse BubR1 of rabbit immunity superior to specificity and reactivity compared to mouse monoclonal antibody, and a method of preparing the same.
  • Antibodies can be used to measure cell division checkpoint activity as a measure of the degree of acetylation of BubR1, to detect tumor diseases based on cell division abnormalities, to diagnose cancer and screen cancer drugs, or to control cell division cycles. Diagnosis and cancer prevention and treatment is a very useful invention in the industry.

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Abstract

본 발명은 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 토끼 면역성 단일클론항체 및 그 제조방법을 제공하고, 나아가 상기의 단일클론항체를 이용하여 BubR1에 대한 아세틸화도를 척도로 세포분열체크포인트 활성도 측정, 세포분열 이상을 근간으로 하는 종양 질환의 검출, 암 진단 및 항암제 스크리닝 방법 또는 세포분열 주기 조절 방법을 제공한다.

Description

아세틸화된 마우스 BUBR1에 대한 신규한 특이 단일클론항체 및 그 제조방법
본 발명은 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 토끼 면역성의 특이 단일클론항체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 특이 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포 및 이를 이용하여 상기 항체가 BubR1에 대한 아세틸화도를 척도로 세포분열체크포인트 활성도 측정, 세포분열 이상을 근간으로 하는 질환의 검출, 암 진단 및 항암제 스크리닝 방법 또는 세포분열 주기 조절 방법 등을 제공할 수 있다.
세포분열에 있어 가장 중요한 것은 모세포와 동일한 유전정보를 딸세포로 정확하게 전달하는데 있다. 특히 유전정보가 복제된 후 각각의 딸세포로 이동하는 염색체 분리시기, 즉 세포분열 중기에서 후기로 전환되는 시기는 세포분열의 정점을 이루며, 딸세포로의 완전한 유전체의 전달을 위해서는 방추체 조립 체크포인트(Spindle Assembly Checkpoint, SAC)의 정상적 작동을 필요로 한다 [Taylor SS, Scott MI, Holland AJ (2004) The spindle checkpoint: a quality control mechanism which ensures accurate chromosome segregation. Chromosome Res 12: 599-616]. 정상적인 경우 통상 세포분열은 30분 내에 종료하지만, 한 개의 염색체라도 정상적으로 방추사에 적절하게 부착되지 않는 경우 길게는 16시간까지 세포분열이 지연된다. 이를 조절하는 것이 SAC로, 활성화된 SAC는 세포분열 후기의 진행에 필요한 후기진행 복합체(Anaphase Promoting Complex, APC/C)를 억제한다 [Yu H (2002) Regulation of APC-Cdc20 by the spindle checkpoint. Curr Opin Cell Biol 14: 706-714]. APC/C는 다중복합체를 이루고 있는 E3 라이게이즈로 세큐린과 사이클린 B를 파괴한다 [Yu, ibid]. SAC가 제대로 작동하지 않는 경우 세포는 죽거나 이수배수체를 생성하게 되는데, 이수배수체는 암세포의 중요한 특징으로 알려져 있다 [Kops GJ, Weaver BA, Cleveland DW (2005) On the road to cancer: aneuploidy and the mitotic checkpoint. Nat Rev Cancer 5: 773-785; Pihan G.A. et al (1999) Cancer Biology 9: 289-302]. 또한 SAC가 잘못될 경우 진행이 빠르고 치료가 힘든 염색체 불안정성 암(Chromosomal Instability Cancer, CIN)이 생길 수 있다[Hannahan D et al, Cell 100:57-70 (2000); Li R et al. PNAS 97: 3236- 3241(2000)]. 암세포는 무제한으로 분열하기 때문에 세포분열을 조절하는 것이 암 치료의 지름길이며, 이를 위해서는 세포분열 체크포인트에서 여러 인자들의 상호작용 및 이들 간의 조절기전 그리고 이러한 체크포인트의 활성도를 체크할 수 있는 물질의 개발을 필요로 한다. 세포분열체크포인트인 SAC를 구성하는 인자 중 APC/C 에 직접 결합하여 APC/C를 억제하는데 중요한 것으로 알려진 인자가 BubR1이다 [Yu, ibid]. 그러나 이러한 BubR1 단백질의 정확한 APC/C 조절기작 및 이를 특이적으로 인식하는 항체에 대하여는 알려진 바가 없다.
더욱이 현재까지 마우스 아세틸 BubR1 단백질을 검출할 수 있는 항체는 전혀 알려진 바 없다. 체내 (in vivo) 실험이 가능한 동물로는 마우스 모델이 대표적이나 기존의 항체로는 마우스를 이용한 항암제 스크리닝과 같은 실험을 진행하는 것이 불가능하다. 따라서 마우스 아세틸 BubR1 단백질을 인지할 수 있는 항체 개발이 절실하다.
또한 단일클론항체는 하나의 에피토프를 인식하는 항체로서 이 때문에 교차반응성이 낮고, 무엇보다 그 에피토프의 존재를 동정하는 목적하에 반영구적인 생산이 가능하므로, 안정된 공급이 가능한 점이 큰 장점이라 할 수 있다. 또한 높은 특이성과 높은 친화성을 가지므로, 연구에 있어서 특정의 단백질을 검출하기 위한 목적 뿐만 아니라 암에 대해 치료용 항체 (항체의학) 및 진단의 도구로서도 넓게 이용되고 있다. 특히 토끼 면역성의 단일클론항체는 연구 및 진단을 위한 이상적인 단일클론항체로 이용되고 있다. 구체적으로, 토끼 면역성 항체는 일반적으로 더욱 높은 친화성 및 높은 특이성을 가진 것으로 보고되고 있다 [Rossi, S et al., Am J Clin Pathol., 124 (2), 295-302 (2005); Rocha R et al., Pathol Res Pract, 204 (9), 655-662 (2008); Tao, G. Z. et al, Exp Cell Res 312, 411-422 (2006)]. 특히, 토끼는 마우스 및 다른 동물보다 면역원성이 월등이 많은 항원에 대해서 항체를 생산하는 것으로 알려져있다 [Raybould, T J et al, Science 240, 1788-1790 (1988): Feng, L et al, Am J Transl Res 3, 269-274 (2011)].
본 발명자는 BubR1 아세틸화가 세포분열체크포인트 활성을 조절하는 분자적 스위치로 작용한다는 것을 규명하여, 세포분열체크포인트 특이적인 지표로서 BubR1 아세틸화를 사용할수 있음을 시사하였다 [Choi et al., EMBO Journal, 28 (14), 2077-2089 (2009)]. BubR1 acetylation site를 불활성화시킨 BubR1-K243R/+mice embryonic fibroblasts (MEFs)는 자체적으로 40% 정도의 암을 발생함을 증명하였으며, BubR1 아세틸화가 세포 분열기의 동원체-방추사 결합과 spindle assembly checkpoint의 유지 등 두가지의 가장 중요한 세포 분열기 기능을 조절한다는 것을 규명하고 발표하였다 [Park et al., J. Cell Biol., 202 (2), 295-309 (2013)].
본 발명 관련 선행기술로서 대한민국 공개특허 제 10-2011-0019495호는 인간, 머스 머스큘러스, 갈러스 갈러스, 제노퍼스 라에비스 유래의 BubR1에 대한 다클론항체를 제작하는 방법에 대하여 개시하고 있다. 그러나 아세틸화된 마우스 BubR1의 토끼 면역성 단일클론항체의 제조 방법에 대하여는 상기 어느 문헌에도 개시되거나 암시된 바 없다.
따라서 본 발명의 목적은 토끼면역성의 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 신규한 하이브리도마 세포주, 상기 세포주 유래의 토끼 면역성 단일클론항체 및 그 제조방법을 제공하는데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체의 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 진단용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 기타 목적은 명세서의 상세한 설명의 실시예의 범위 내에서 발견할 수 있다.
본 발명의 상기 목적은 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 타겟 펩타이드 항원을 결정하고 다클론 하이브리도마 세포를 제작하는 단계; 상기 단계에서 제작된 다클론 하이브리도마 세포들에 대하여 GST- tagged mouse BubR1 (1-514 아미노산) 재조합 단백질을 이용하여 BubR1 특이적 다클론 하이브리도마 mAcBubR1-SNU-20 세포 (한국세포주은행, 기탁번호 KCLFR-BP-00390, 2017.01.19자 기탁)를 선정하는 단계; 상기 단계에서 얻은 BubR1 특이적 다클론 하이브리도마 mAcBubR1-SNU-20 세포 중 단일클론 하이브리도마세포를 선정하고 배양한 후 및 배양액을 정제하는 단계; 상기 단계에서 얻은 정제된 배양액 내 포함된 단일클론항체 중 아세틸화된 마우스 BubR1에 특이성이 있는 단일클론항체를 확인하기 위하여 HeLa 세포의 면역침강 및 웨스턴블랏을 수행하여 단일클론 하이브리도마 세포 mAcBubR1-SNU-20-4 (한국세포주은행, 기탁번호 KCLFR-BP-00391, 2017.01.19자 기탁), 단일클론 하이브리도마 세포 mAcBubR1-SNU-20-7(한국세포주은행, 기탁번호 KCLFR-BP-00392, 2017.01.19자 기탁) 및 단일클론 하이브리도마 세포 mAcBubR1-SNU-20-9(한국세포주은행, 기탁번호 KCLFR-BP-00393, 2017.01.19자 기탁)의 배양액으로부터 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 단일클론항체를 수득하는 단계; 상기 단계에서 수득한 단일클론항체 중 endogenous 아세틸화된 마우스 BubR1에 특이성 있는 단일클론항체를 확인하기 위하여 마우스 배아섬유아세포(Mouse Embryonic Fibroblast)의 면역침강 및 웨스턴블랏을 수행하여 토끼면역 특이성이 있는 신규한 단일클론항체 mAcBubR1-SNU-20-7을 수득하는 단계를 통하여 이루어진다.
본 발명은 마우스 단일클론항체에 비해 특이성과 반응성이 뛰어난 토끼 면역성의 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 단일클론항체 및 그 제조방법을 제공하는 효과가 있을 뿐만 아니라, 상기 단일클론항체를 이용하여 BubR1에 대한 아세틸화도를 척도로 세포분열체크포인트 활성도 측정, 세포분열 이상을 근간으로 하는 질환의 검출, 암 진단 및 항암제 스크리닝 방법 또는 세포분열 주기 조절 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도1은 본 발명에 따른 신규한 GST-tagged mouse BubR1 (1-514 아미노산) 재조합 단백질의 모식도이다.
도2는 본 발명에 따른 마우스 아세틸화된 BubR1 다클론하이브리도마 세포 배양액의 아세틸화된 BubR1에 대한 특이성을 확인하기 위하여 243번째 잔기가 아세틸화된 라이신 잔기를 포함하는 BubR1을 특이적으로 인식하는 우수성을 보이는 웨스턴 블랏 (western blot)의 사진도이다.
도3은 본 발명에 따른 Myc-tagged mouse BubR1의 모식도이다.
도4는 본 발명에 따라 Myc-tagged mouse BubR1을 포함하는 플라스미드를 HeLa 세포에 트랜스팩션한 후 마우스 아세틸 BubR1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 mAcBubR1-SNU-20-4, mAcBubR1-SNU-20-7 및 mAcBubR1-SNU-20-9의 면역침강 실험 후 웨스턴블랏의 결과를 나타낸 사진도이다.
도5는 본 발명에 따라 Mouse Embryonic Fibroblast(마우스 배아섬유아세포)를 이용하여 마우스 아세틸 BubR1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 mAcBubR1-SNU-20-7의 면역침강 실험 후 웨스턴블랏의 결과를 나타낸 사진도이다.
본 발명은 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 단일클론항체 및 그 제조방법을 개시한다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과하며, 본 발명의 권리범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 상세한 설명을 생략하였다. 본 발명과 관련된 기술 또는 기법들은 [Rabbit monoclonal antibodies: generating a fusion partner to produce rabbit-rabbit hybridomas. (Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 92(20):9348-52.)], [Generation of rabbit monoclonal antibodies (Methods Mol Biol., 2014; 1131:71-9)] 및 [Generation of rabbit monoclonal antibodies (Methods Mol Biol., 2014; 1131:71-9)]에 기재된 바 in vitro 및 in vivo hybridoma 생산 및 항체수득 방법에 대하여 상세히 기술되어 있다.
본 발명에서 용어, "항체(antibody)" 란 항원과 특이적으로 결합하는 분자이며, 이량체, 삼량체 및 다량체, 항체, 재조합, 가공된 및 카멜화된(camelized) 항체를 포함한다. 또한, 항체는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편의 형태일 수 있다. 본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. “하이브리도마 세포주”는 종양 세포 및 어떠한 기능을 갖는 정상 세포를 융합하여 얻은 잡종 세포주로 종양 세포가 갖는 증식성과 생체 세포의 기능을 함께 갖고 있는 세포를 얻음으로써 단일클론항체 등의 생산에 이용되는 세포주이다.
본 발명에서 “조성물”이라 함은 암이 발생할 수 있는 인간 뿐 아니라 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양 등의 가축의 암 예방 및 치료 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어 "예방"이란 본 발명의 항체를 포함하는 조성물 투여에 의해 암의 유발이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 항체 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
치료용 항체로 사용될 경우, 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)되어 항체-치료제 결합체 형태로 생체내로 투입하여 암의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다. 사용될 수 있는 치료제는 화학치료제, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 항바이러스제, 생물작용제, 효소저해물질 등을 포함한다.
본 발명에서 “항체를 포함하는 조성물”이라 함은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 인체 또는 수의용으로 제형화 될 수 있다. 경구 투여용의 약제학적 조성물은 별개의 단위, 예를 들면, 캅셀제 또는 정제; 산제 또는 과립제; 시럽 또는 현탁제(수성 또는 비-수성 액상물 중; 식용 발포제 또는 휩(whip); 또는 에멀션)로 제조될 수 있다. 비경구 투여용의 약제학적 조성물에는 산화방지제, 완충제, 정균제(bacteriostat) 및 용질(수용자의 혈액과 실질적으로 등장성인)을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용제; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁제가 포함된다. 주사용 용제에 사용될 수 있는 부형제에는 예를 들어, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일이 포함된다. 이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰플이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가만을 요구하는 동결-건조 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.
본 발명의 “키트”에는 본 발명의 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, " BubR1 단백질의 아세틸화도 검출 "은 항원-항체 결합체와 결합한 검출 라벨(detection label)의 시그널 크기를 정성 또는 정량적으로 측정하여 아세틸화된 BubR1의 존재 여부와 양을 확인하는 것을 의미한다. 이러한 검출 키트에는 본 발명의 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
항원-항체 결합체 형성은 조직면역 염색, 방사능 면역분섭법(RIA), 효소면역 분석법(Enzyme-Linked Immunosorent Assay), 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip)등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
항원-항체 결합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시퍼라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈테히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,125I,131I,186Re 등이 있으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서의 “교차반응성”이란 하나의 항원물질에서도 복수의 다수인 항원결정기 가 존재하여 특정 항원결정기에 대한 항체에서도 유사한 다른 항원결정기와도 반응할 수 있는 현상이다. “표식물질”이란 목적하는 물질 또는 현상을 검지하기 위하여 표지하는 물질로, 형광물질, 방사성동위원소, 페리틴, 효소 등이 사용되며 이에 제한되지 않는다. 표식물질은 형광 현미경, 래디오오토그래피, 광학현미경 및 효소반응 등에 의하여 검출될 수 있고 이에 한정되지 않는다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다.
[실시예1] 본 발명 타겟 펩티드 항원의 결정 및 다클론 하이브리도마 세포의 제작
본 발명의 아세틸화된 마우스 BubR1의 항체는 하기의 표1의 정보와 서열을 이용하여 제조되었다. 효율적인 항체의 제조를 위하여 라이신(K) 잔기가 중간에 위치하도록 좌우의 서열을 선택하여 하기 항체 제작 타켓 펩타이드 별첨 서열번호 1을 선정하였다 (표1).
표 1
mouse BubR1 accession number Q9Z1S0
마우스 BubR1 243번째 라이신(K) 잔기 주변 서열 PISRVGGALKAPGQSR
항체 제작 타겟 펩타이드 서열번호 1 cGGAL(acK)APGQS
(C: Cysteine; G:Glycine; A:Alanine; L:Leucine; K:Lysine; A: Alanine ; P:Proline; G: Glycine; Q:Glutamine; S:Serine; K: 아세틸레이션 부위)
상기 항체 제작 타켓 펩타이드 서열번호 1을 토끼에 주사한 후 항원에 대한 항체를 생산하는 세포를 생성시키고, 토끼의 비장으로부터 얻은 항체생산세포 (Lymphocyte, B 세포)를 골수종세포 (myeloma, 240E-W2, Abcam®)와 융합시켰다. 상기 융합세포는 ELISA 실험을 통해 면역활성이 있는 multiple cell types 또는 multiclones 상태의 다클론 하이브리도마세포를 획득하였다.
[실시예2] 본 발명 GST- tagged mouse BubR1 (1-514 아미노산) 재조합 단백질의 제작 및 이를 이용한 BubR1 특이적 다클론 하이브리도마 mAcBubR1-SNU-20 세포의 선정
상기 실시예 1에서 수득한 다클론 하이브리도마세포들 중 in vitro acetylation 실험을 통하여 아세틸화된 마우스 BubR1만을 특이적으로 인식하는 다클론 하이브리도마세포를 선정하기 위하여, 도 1에 도시된 GST- tagged mouse BubR1 (1-514 아미노산) 재조합 단백질을 제작하였다.
상기 GST- tagged mouse BubR1 (1-514 아미노산) 재조합 단백질에 Acetyl-CoA를 첨가한 후 두 그룹으로 나누어, 두 그룹 중 한 그룹은 GST-P/CAF HAT domain을 더하고 한 그룹은 배제한 후, 모두 30°C에서 1시간 동안 반응시켜 각 ‘GST- tagged mouse BubR1 (1-514 아미노산) 재조합 단백질을 아세틸화한 그룹(AC)’과 ‘GST- tagged mouse BubR1 (1-514 아미노산) 재조합 단백질을 아세틸화하지 않은 그룹(NAC)’을 제조하였다. 상기 두 그룹에 다클론 하이브리도마세포 배양액을 1:3의 비율로 5% 탈지분유가 들어있는 블로킹 용액에 넣어 전기영동 후 웨스턴블랏을 실시하였다.
웨스턴블랏 실시 결과 실시예1에서 수득한 다클론 하이브리도마 중 mAcBubR1-SNU-20 세포가 243번째 잔기가 아세틸화된 라이신 잔기를 포함하는 BubR1을 특이적으로 인식하는 항체로서의 우수성을 보이는 다클론 하이브리도마 세포로서 선정되었다 (도 2).
본 실시예에 따라 생산된 다클론 하이브리도마 세포는 mAcBubR1-SNU-20이라 명명하고 부다페스트 조약상 국제기탁기관 한국세포주은행(서울특별시 종로구 대학로 101)에 기탁번호 KCLFR-BP-00390로 2017.01.19자 기탁 완료되었다.
[실시예 3] BubR1 특이적 다클론 하이브리도마 mAcBubR1-SNU-20 세포 중 단일클론 하이브리도마세포의 선정 및 배양액의 정제
상기 실시예2에서 선정된 다클론 하이브리도마 mAcBubR1-SNU-20세포 중 단일클론 하이브리도마세포(single line 또는 subclone)들을 추가 선정한 후,
추가 선정된 단일크론 하이브리도마세포들은 37℃, 5% CO2 조건하에서 10% FBS (fetal bovine serum), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 배양액에 포함된 각 단일클론항체들은 더 나아가 하기 실시예 4 및 실시예 5와 같이 각 HeLa 세포 또는 마우스 배아섬유아세포를 통한 면역침강과 웨스턴블랏 실험을 이용하여 아세틸화된 마우스 BubR1을 특이적으로 인식하는 단일클론항체로 선별 및 확인하였다.
[실시예 4] HeLa 세포의 면역침강 및 웨스턴블랏을 이용한 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 단일클론항체의 특이성 확인
Myc-tagged mouse BubR1 (도 3)이 트랜스팩션된 HeLa 세포에 대하여 노코다졸 (nocodazol, 200ng/ml)을 처리한 후, 싱크로나이즈(synchronize) 시키고 세포배양용기를 부드럽게 쳐서 중기의 세포를 떼어내었다 (mitotic shake off). 상기 중기의 세포를 수집하고 이로부터 수득한 세포추출물을 사용하여 항-9E10 항체로 면역침강 실험을 수행한 후, 실시예3의 아세틸화된 마우스 BubR1 단일클론항체를 1:5의 비율로 웨스턴블랏을 수행한 결과, 이들 중 mAcBubR1-SNU-20-4, mAcBubR1-SNU-20-7 및 mAcBubR1-SNU-20-9가 특이적으로 결합을 하여 단일클론항체로써 사용 가능함이 확인되었다 (도 4).
본 실시예에 따라 생산된 단일클론 하이브리도마 세포는 mAcBubR1-SNU-20-4, mAcBubR1-SNU-20-7 및 mAcBubR1-SNU-20-9이라 명명하고 부다페스트 조약상 국제기탁기관 한국세포주은행 (서울특별시 종로구 대학로 101)에 각각 기탁번호 KCLFR-BP-00391, KCLFR-BP-00392 및 KCLFR-BP-00393로 2017.01.19자 기탁 완료하였다.
[실시예 5] 마우스 배아섬유아세포(Mouse Embryonic Fibroblast)의 면역침강 및 웨스턴블랏을 이용한 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 단일클론항체의 특이성 확인
Endogenous mouse acetylated BubR1을 인식하는 항체를 확인하기 위하여 마우스 배아섬유아세포에 노코다졸 (nocodazole, 400ng/ml)을 처리한 후 중기의 세포를 떼어내었다 (mitotic shake off). 상기의 세포를 수집하고 이로부터 수득한 세포추출물을 사용하여 항-BubR1의 항체로 면역침강 실험을 수행한 후, 실시예 4의 아세틸화된 마우스 BubR1 단일클론항체들을 1:5의 비율로 웨스턴블랏을 수행한 결과, 이들 중 mAcBubR1-SNU-20-7이 특이적으로 결합을 하여 단일클론항체로써 사용 가능함이 확인되었다 (도 5).
이상 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 마우스 단일클론항체에 비해 특이성과 반응성이 뛰어난 토끼 면역성의 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 단일클론항체 및 그 제조방법을 제공하는 효과가 있으므로 상기의 단일클론항체를 이용하여 BubR1에 대한 아세틸화도를 척도로 세포분열체크포인트 활성도 측정, 세포분열 이상을 근간으로 하는 종양 질환의 검출, 암 진단 및 항암제 스크리닝 방법 또는 세포분열 주기 조절을 연구를 수행할 수 있어 암 진단 나아가 암 예방 및 치료 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> A Novel Specific Monoclonal Antibody for acetylated mouse BubR1
and preparation method of the same
<130> P5953
<150> KR 10-2016-0006851
<151> 2016-01-20
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1
<400> 1
Cys Gly Gly Ala Leu Lys Ala Pro Gly Gln Ser
1 5 10

Claims (14)

  1. 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 타겟 펩타이드 항원을 결정하고 다클론 하이브리도마 세포를 제작하는 단계; 상기 단계에서 제작된 다클론 하이브리도마 세포들에 대하여 GST-tagged mouse BubR1 (1-514 아미노산) 재조합 단백질을 이용하여 BubR1 특이적 다클론 하이브리도마 mAcBubR1-SNU-20 세포 (KCLFR-BP-00390)를 선정하는 단계; 상기 단계에서 선정된 BubR1 특이적 다클론 하이브리도마 mAcBubR1-SNU-20 세포 중 단일클론 하이브리도마세포를 선정하고 배양한 후 배양액을 정제하는 단계; 상기 단계에서 얻은 정제된 배양액 내 포함된 단일클론항체 중 아세틸화된 마우스 BubR1에 특이성이 있는 단일클론항체를 확인하기 위하여 HeLa 세포의 면역침강 및 웨스턴블랏을 수행하여 단일클론 하이브리도마 세포 mAcBubR1-SNU-20-4 (KCLFR-BP-00391), mAcBubR1-SNU-20-7 (KCLFR-BP-00392) 및 mAcBubR1-SNU-20-9 (KCLFR-BP-00393)의 배양액으로부터 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 단일클론항체를 수득하는 단계; 상기 단계에서 수득한 단일클론항체 중 endogenous 아세틸화된 마우스 BubR1에 특이성 있는 단일클론항체를 확인하기 위하여 마우스 배아섬유아세포(Mouse Embryonic Fibroblast)의 면역침강 및 웨스턴블랏을 수행하여 토끼 면역 특이성이 있는 신규한 단일클론항체 mAcBubR1-SNU-20-7을 수득하는 단계로 이루어지는 것이 특징인 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 단일클론항체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체 제조용 타켓 펩타이드 항원은 마우스 BubR1의 라이신 잔기가 아세틸화된 서열번호 1 (cGGAL(acK)APGQS)로 이루어진 중쇄가변영역을 포함하는 것이 특징인 단일클론항체의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항의 방법에 따라 제조된 토끼 면역성의 아세틸화된 마우스 BubR1에 대한 단일클론항체.
  4. 제3항에 있어서 상기 단일클론항체는 BubR1 특이적 다클론 하이브리도마세포주 mAcBubR1-SNU-20 (KCLFR-BP-00390) 유래의 항체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 단일클론항체는 토끼 면역성의 하이브리도마 세포주mAcBubR1-SNU 20-4 (KCLFR-BP-00391), mAcBubR1-SNU 20-7 (KCLFR-BP-00392), mAcBubR1-SNU 20-9 (KCLFR-BP-00393) 중 어느 하나 유래의 항체.
  6. 제5항의 단일클론항체는 아세틸화되지 않는 BubR1 단백질 및 상기 라이신 잔기가 알지닌으로 치환된 BubR1 단백질에 대하여 교차반응성을 나타내지 않는 항체.
  7. 제5항의 단일클론항체는 표식물질이 추가로 더 포함된 항체.
  8. 제5항의 단일클론항체를 포함하는 조성물.
  9. 제8항의 조성물은 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제8항의 조성물이 포함된 암 진단용 키트.
  11. 제5항의 단일클론항체를 이용하여 BubR1 단백질의 아세틸화도를 결정하는 단계를 포함하는 BubR1 단백질의 아세틸화도 검출 방법.
  12. 제5항의 단일클론항체를 포함하는, 시료에서 BubR1 단백질의 아세틸화도 검출용 키트.
  13. 제5항의 단일클론항체를 생산하는 다클론 하이브리도마 세포주 mAcBubR1-SNU-20 (KCLFR-BP-00390).
  14. 제5항의 단일클론항체를 생산하는 단일클론 하이브리도마 세포주 mAcBubR1-SNU 20-4 (KCLFR-BP-00391), mAcBubR1-SNU 20-7 (KCLFR-BP-00392), mAcBubR1-SNU 20-9 (KCLFR-BP-00393).
PCT/KR2017/000746 2016-01-20 2017-01-20 아세틸화된 마우스 bubr1에 대한 신규한 특이 단일클론항체 및 그 제조방법 WO2017126944A1 (ko)

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US20080102477A1 (en) * 2006-10-25 2008-05-01 Seoul National University Industry Foundation Method for screening an anticancer drug using acetylated BubR1
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