WO2014157926A1 - 나이관련 황반변성 진단용 마커 및 이를 이용한 나이관련 황반변성 진단 방법 - Google Patents

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이지은
김혜정
우세준
안지윤
박규형
서의진
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서울대학교병원 (분사무소)
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Definitions

  • the present invention relates to a marker for diagnosing age-related macular degeneration and a method for diagnosing age-related macular degeneration using the same.
  • Age-related Macular Degeneration is a disease caused by various changes in the macula of the retina with age. It is the leading cause of blindness in the population over 60 years in the West, and the frequency of occurrence is expected to increase as the elderly population in Korea increases.
  • the macula refers to the central area of nerve tissue called the retina, which is responsible for central vision due to the concentration of important cells in response to light stimulation.
  • Macular degeneration is a disease that causes degeneration of the macular degeneration.
  • AMD is a degenerative disease that affects the retina, retinal pigment epithelium (RPE), Bruch's membrane and choroid.
  • AMD comes in two forms: non-exudative (dry) and exudative (wet). Nonexudative forms, which account for the majority of age-related macular degeneration, are those in which the retina develops lesions such as drusen or retinal pigment epithelium. It usually does not cause severe vision loss but can develop in wet form.
  • the exudative form is the development of choroidal neovascularization under the retina. The neovascularization causes exudation, bleeding, etc. in the macula, affecting central vision, and may cause blindness within 2 months to 3 years after development. Macular degeneration of the exudative form is very rapid and often results in rapid deterioration of vision within a few weeks.
  • Age-related macular degeneration is usually very important because early vision can't be restored once vision has started. Early detection is possible through regular eye examinations. If age-related macular degeneration is suspected by ophthalmologic examination including fundus examination, ophthalmologic examination such as fluorescein angiography can be performed to diagnose. Non-surgical treatments include laser photocoagulation, photodynamic therapy (PDT), pneumococcal therapy, and drug therapy (eg, VEGF inhibitor injection). There is a booze.
  • PDT photodynamic therapy
  • pneumococcal therapy eg, VEGF inhibitor injection
  • Vinculin is a protein that plays a role in the interaction between cells in relation to cell adhesion and migration. It is known that when vinculin decreases, the cells loosen between cells and cancer cells spread well (Seimiya M et al.). , Hepatology 48: 519-530, 2008). However, there have been no reports of changes in the expression level of vinculin protein in the blood, which is related to AMD.
  • One aspect provides a biomarker for diagnosing age-related macular degeneration comprising vinculin protein.
  • Another aspect provides an age-related macular degeneration diagnostic kit comprising an antibody that specifically binds to the protein or fragment of the protein.
  • Another aspect provides a method of diagnosing age-related macular degeneration or screening for a therapeutic substance, comprising measuring the expression level of the protein.
  • the vinculin protein may be, for example, having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the vinculin protein is a cell membrane-skeletal protein in mammalian cells having a molecular weight of about 123 kD, having a sequence having about 20 to 30% identity with ⁇ -catenin and its function is similar to each other.
  • the protein can be detected in plasma, it can be used to diagnose age-related macular degeneration in a simple manner.
  • the vinculin protein has a relatively increased expression level in blood, plasma, or serum of individuals with age-related macular degeneration compared to normal individuals. Therefore, age-related macular degeneration can be diagnosed by collecting blood, plasma or serum from normal individuals and individuals suspected of age-related macular degeneration and comparing the expression levels of the vinculin protein.
  • the subject may be a human or mammal except human.
  • Another aspect provides an age-related macular degeneration diagnostic kit comprising an antibody that specifically binds a vinculin protein or fragment of the protein.
  • the vinculin protein may be, for example, having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Fragments of the protein can be, for example, immunogenic fragments.
  • the immunogenic fragment refers to a fragment of a protein that has one or more epitopes that can be recognized by antibodies to the protein.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody may be a monoclonal antibody.
  • polyclonal antibodies can be prepared according to methods known to those skilled in the art. For example, it can be prepared by injecting the protein or fragment of the protein into an external host. As an external host, mammals such as mice, rats, sheep and rabbits can be used. When the protein or fragment thereof is injected by intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection methods, it may be administered with an adjuvant to increase antigenicity. Thereafter, blood may be collected periodically from an external host to collect serum showing enhanced titers and specificity for the antigen or to separate and purify the antibody therefrom.
  • an external host mammals such as mice, rats, sheep and rabbits can be used.
  • the protein or fragment thereof When the protein or fragment thereof is injected by intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection methods, it may be administered with an adjuvant to increase antigenicity. Thereafter, blood may be collected periodically from an external host to collect serum showing enhanced titers and specificity for the antigen or to separate and purify the antibody therefrom.
  • Such monoclonal antibodies can be prepared according to methods known to those skilled in the art. For example, it may be prepared by a technique for generating immortalized cell lines by fusion.
  • a method for preparing a monoclonal antibody may be purified by immunizing an appropriate amount of Balb / C mice, or by synthesizing polypeptide fragments of the protein with bovine serum albumin to immunize mice.
  • the isolated antigen-producing lymphocytes are fused with myeloma in humans or mice to produce immortalized hybridomas, and the ELISA method is used to select and propagate only hybridoma cells that produce the desired monoclonal antibody, followed by culture. It may be to separate and purify the monoclonal antibody from.
  • the monoclonal antibody may be an antibody against a commercially available vinculin protein.
  • the age-related macular degeneration diagnostic kit can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • the kit may include, for example, an antibody in freeze-dried form, a buffer, a stabilizer, an inactive protein, and the like.
  • the antibody can be labeled by radionuclides, fluorescors, enzymes, and the like.
  • the kit can be used, for example, for immunoassays.
  • Immunoassay can be performed according to various immunoassays or immunostaining protocols developed in the prior art.
  • the immunoassay or immunostaining format may include radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), capture-ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, flow cytometry, immunofluorescence staining. , Immunoaffinity tablets, or combinations thereof.
  • Another aspect includes measuring the expression level of vinculin protein in a biological sample obtained from an individual; And comparing the measured expression level of the protein with the vinculin protein expression level in a control sample.
  • the subject may be a subject suspected of age-related macular degeneration.
  • the subject may be a human or mammal except human.
  • the expression level of the vinculin protein can be measured by an antibody that specifically binds to the vinculin protein or fragment of the protein.
  • the expression level can be measured through the immunoassay or immunostaining method described above.
  • the expression level may be determined indirectly by measuring the mRNA amount of the gene encoding the vinculin protein.
  • the measurement of the mRNA amount can be, for example, RT-PCR, competitive RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNase protection assay, Northern blot, DNA chip It can be performed by.
  • the vinculin protein may be, for example, having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the fragment of the protein and the antibody are as described above.
  • the biological sample may be selected from the group consisting of blood, plasma, serum, eye cells, eye tissues, eye and water extracted from the eye.
  • the sample may be blood, plasma or serum isolated from a subject suspected of age-related macular degeneration.
  • antibodies labeled with radioisotopes eg, C14, I125, P32 and S35
  • radioisotopes eg, C14, I125, P32 and S35
  • the method comprises the steps of: (i) coating a blood sample of a normal individual and a subject suspected of age-related macular degeneration on the surface of the solid substrate; (ii) inducing an antigen-antibody response by contacting said blood sample with an antibody that specifically binds said protein or fragment of said protein as a primary antibody; (iii) reacting the resultant of step (ii) with the secondary antibody to which the enzyme is bound; And (iv) detecting the activity of the enzyme.
  • the solid substrate can be, for example, a hydrocarbon polymer, glass, metal, gel, or microtiter plate.
  • the hydrocarbon polymer can be, for example, polystyrene or polypropylene.
  • the enzyme bound to the secondary antibody may be an enzyme catalyzing a color reaction, fluorescence, luminescence, or infrared reaction.
  • the enzyme may be alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase, luciferase, or cytochrome P450.
  • alkaline phosphatase is used as the enzyme, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate or ECF ( Color reaction substrates such as enhanced chemifluorescence may be used.
  • the method uses a capture-ELISA method, the method comprises the steps of: (i) coating a surface of a solid substrate with an antibody that specifically binds the protein or fragment of the protein as a capturing antibody; (ii) contacting the capture antibody with a blood sample of an individual suspected of age-related macular degeneration to induce an antigen-antibody response; (iii) reacting the resultant of step (ii) with a detecting antibody having a label which generates a signal and which specifically reacts with the protein; And (iv) detecting a signal generated from the label.
  • the detection antibody may comprise a label which generates a detectable signal.
  • labels may include chemicals (eg biotin), enzymes (alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome P450), radioactive substances (eg C14, I125, P32 and S35), a fluorescent material (eg, fluorescein), a luminescent material, a chemiluminescent, a fluorescence resonance energy transfer (FRET), or a combination thereof.
  • chemicals eg biotin
  • enzymes alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome P450
  • radioactive substances eg C14, I125, P32 and S35
  • a fluorescent material eg, fluorescein
  • a luminescent material e.g, chemiluminescent
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • Measurement of the final enzyme activity or signal in the ELISA method and the capture-ELISA method can be carried out according to various methods known in the art.
  • the detection of these signals allows the protein to be analyzed qualitatively or quantitatively.
  • biotin when used as a label, streptavidin can be used to detect a signal, and when luciferase is used as a label, luciferin can be used to detect a signal.
  • the method can detect the protein by immobilizing an antibody that specifically binds to the protein or fragment of the protein on a microchip, and then reacted with a biological sample isolated from an individual suspected of age-related macular degeneration.
  • Microchips and automated microarray systems can detect the protein by immobilizing an antibody that specifically binds to the protein or fragment of the protein on a microchip, and then reacted with a biological sample isolated from an individual suspected of age-related macular degeneration.
  • An increase in vinculin protein expression level in a biological sample obtained from a subject relative to vinculin protein expression level in a control sample may be indicative of age-related macular degeneration of the subject.
  • individuals with increased vinculin protein expression levels compared to the control can be diagnosed as having age-related macular degeneration. For example, in an immunoassay of a sample of a subject suspected of age-related macular degeneration, if the signal for vinculin protein is stronger than that of a normal subject, it may be diagnosed as age-related macular degeneration.
  • Another aspect includes contacting a test substance with a cell comprising vinculin protein; And by measuring the expression level of the vinculin protein in the cells in contact, it provides a screening method for treating the age-related macular degeneration comprising the step of determining whether the expression is inhibited.
  • the cells comprising the vinculin protein may be, for example, retinal pigment epithelial cells.
  • test substance refers to an unknown substance used in screening to test whether the expression level of vinculin protein is affected.
  • the test substance may include, for example, chemical, nucleotide, antisense-RNA, small interference RNA (siRNA) or natural extract. Measurement of the vinculin protein or expression level of the protein is as described above. When the expression of the vinculin protein is inhibited in the cells to which the test substance is contacted, the test substance may be determined as a therapeutic agent for age-related macular degeneration.
  • a marker associated with age-related macular degeneration a diagnostic kit including a substance capable of detecting the same, and a diagnostic method using the same are new immunological diagnostic tools using plasma of a patient, and have excellent sensitivity and biopsy. It can be used for the early diagnosis of age-related macular degeneration because it can be easily analyzed in plasma without using it.
  • Figure 1 shows the number of proteins obtained after profiling with a tandem mass spectrometer peptides from plasma protein samples of 20 normal and 20 exudative age-related macular degeneration patients.
  • 2A-2D show mass spectrometry spectra corresponding to peptide fragments derived from vinculin protein.
  • FIG 3 shows the anti-vinculin antibody after electrophoresis of the plasma protein samples of the non-patient control (HC), early non-exudative AMD group (Early AMD, Early) and exudative AMD patient group (Exudative AMD, Late), respectively The result of performing the immunoblotting is shown.
  • 4A and 4B show the results of statistical processing of vinculin concentrations measured by immunoblotting of FIG. 3.
  • 4C shows the measured vinculin concentration in a receiver operating characteristic (ROC) graph.
  • ROC receiver operating characteristic
  • FIG. 6A and 6B show the results of statistical processing of vinculin concentrations measured by immunoblotting of FIG. 5.
  • FIG. 6C shows the measured vinculin concentration in a recipient-engineered characteristic (ROC) graph.
  • Plasma samples 40 ⁇ l of plasma samples were collected from 20 exudative AMD patients and 20 non-patients, respectively. Each plasma sample was subjected to immunoaffinity chromatography using a multiple affinity removal system (Agilent) column. A protein fraction that did not bind to the column was collected by tracking UV absorbance at 280 nm. The fraction is mostly free of albumin, immunoglobulin A, immunoglobulin G, transferrin, trypsin inhibitor and heptoglybin, which are six proteins that make up the majority of plasma proteins. The fractions were concentrated to prepare plasma protein samples containing only proteins having a size of at least 3 kDa.
  • the same amount was taken from 20 plasma protein samples of the patient group obtained in Example 1-1 and mixed, and the same amount was taken from 20 plasma protein samples of the non-patient group and mixed.
  • the protein amount of the mixed sample and the non-patient mixed sample of the patient group was adjusted to 500 mg, and then fractionated according to molecular weight using a gel-eluted liquid fractionation entrapment electrophoresis (GELFrEE 8100 fractionation system) system (Tran JC & Doucette AA ( 2008)
  • Gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis an electrophoretic method for broad molecular weight range proteome separation.Analytical chemistry 80 (5): 1568-1573).
  • Dithiothreitol was added to each plasma protein fraction obtained in Example 1-2 to react at 30C for 30 minutes to reduce disulfide bonds. Thereafter, iodoacetamide (IAA) was added to 40 mM for alkylation, and reacted for 1 hour at room temperature under dark conditions, and diluted 10-fold with 50 mM NH 4 HCO 3 . The sequencing level of trypsin (Promega) was added so that the mass ratio of protein and trypsin was 40: 1, followed by reaction at 37 ° C. for 16 hours. Trifluoroacetic acid (TFA) solution was added to 0.4% to acidify to pH 2.0 or below and digested into peptide fragments. To identify more proteins, subdivide each fraction containing peptide fragments into 14 fractions by isoelectric point via OFFGEL fractionator (Agilent), remove salts with C18 SPE cartridge (Waters), and dry in vacuo. I was.
  • the dried peptide fragments prepared in Examples 1-3 were dissolved in 10 ⁇ l of 0.4% acetic acid solution and aliquoted in 1 ⁇ l and mounted on a high performance liquid chromatography (HPLC) device coupled with LTQ Obitrap mass spectrometer (Thermo Scientific). Injection into a reversed-phase MAGIC C18aq column (12 cm ⁇ 75 ⁇ m, Eksigent MDLC system). The column was equilibrated with 95% Buffer A (0.1% formic acid solution in water) and 5% Buffer B (0.1% formic acid solution in acetonitrile) before use, and adapted to concentration gradient conditions before analyzing the sample. Several concentration gradients were used to make it work. Each peptide sample was eluted with 10-30% Buffer B with a gradual concentration gradient at a constant rate for 80 minutes.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the mass spectrometer was used to scan the entire mass range corresponding to 300-2000 m / z.
  • the spectrum having the highest sixth sensitivity was simultaneously identified, and the mother ions were collected to obtain the spectrum of daughter ions.
  • the options were isolation width 1.5 m / z, normalized collision energy 25%, and dynamic exclusion duration 180 seconds.
  • the mother ions that did not match the state of charge were removed. Data was obtained using Xcalibur software v2.0.7.
  • MS / MS spectra were collected using SEQUEST (TurboSequest version 27, revision 12) using the Human International Protein Index database (IPI, versions 3.44, European Bioinformatics Institute, http: //www.ebi) with 72,065 protein entries as well as contaminants. .ac.uk / IPI).
  • IPI Human International Protein Index database
  • MS / MS was 0.5 Da
  • MS tolerance was 15 ppm.
  • Fixed manification assigns 45.9877 Da to cysteine residues and +15.9949 Da due to the oxidation of methionine by variable modification.
  • Trans-Proteomic Pipeline (TPP, version 4.0, http://www.proteomecenter.org) was used for peptide identification and quantitative analysis.
  • the Sequest search results were derived by entering the pepXML module with trypsin restriction and the 'monoisotopic masses' option.
  • Peptide-Prophet has a probability of 0.05 or more and Protein-Prophet has a probability of 0.9 or more.
  • Figure 1 shows the number of proteins obtained after profiling with a tandem mass spectrometer peptides from plasma protein samples of 20 normal and 20 exudative age-related macular degeneration patients. 8832 unique peptides were identified from 320 proteins. Spectral counting method was used to compare the protein of the patient group and the non-patient group, and the protein having a three-fold difference in expression in the plasma of the patient group compared to the non-patient group was classified as an exudative age-related macular degeneration patient-specific protein. g-values were calculated to determine whether the difference in protein amount was statistically significant.
  • 2A-2D show mass spectrometry spectra corresponding to peptide fragments derived from vinculin protein.
  • Vinculin protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 could be identified from the amino acid sequence of each peptide fragment.
  • Plasma samples were collected from 22 non-exudative early AMD patients, 58 exudative AMD patients, and 40 non-patients, respectively.
  • Each plasma sample was subjected to immunoaffinity chromatography using a MARS column.
  • a protein fraction that did not bind to the column was collected by tracking UV absorbance at 280 nm.
  • the fraction is mostly free of albumin, immunoglobulin A, immunoglobulin G, transferrin, trypsin inhibitor and heptoglybin, which are six proteins that make up the majority of plasma proteins.
  • the fractions were concentrated to prepare plasma protein samples containing only proteins having a size of at least 3 kDa.
  • Example 2-1 After mixing the plasma protein samples of Example 2-1 with PBS, each diluted 40-fold, 10 ⁇ l and 1M Tris-HCL (pH 6.8) buffer containing 2% SDS, 15% SDS polyacrylamide gel was prepared. Electrophoresis was performed. Plasma proteins isolated by electrophoresis were transferred to PVDF membrane at 90 V, 250 mA in a buffer containing 50 mM Tris-HCl, 130 mM glycine, 0.05% SDS and 12.5% methanol, and the transferred membrane 0.02% sodium azide was added and reacted for 1 hour in Tris-buffered saline with Tween 20 (TBST) buffer containing 5% skim milk powder.
  • Tween 20 Tween 20
  • the PVDF membrane and the antibody to vinculin were reacted at 4 ° C. for 16 hours and then washed three times with TBST, and mouse IgG binding to anti-vinculin's mouse immunoglobulin. Reaction with HRP (1: 5000, GE Healthcare) at 25 ° C. for 1 hour, followed by three further washes with TBST. Subsequently, the PVDF membrane was reacted with ECLplus (enhanced chemiluminescence, Amersham Bioscience), and then subjected to X-ray film for 3 to 5 minutes to determine the respective protein concentrations.
  • ECLplus enhanced chemiluminescence, Amersham Bioscience
  • FIGS. 4A and 4B show the results of immunoblotting with anti-vinculin antibodies after electrophoresis of plasma protein samples of non-patient control group (HC), non-exudative early AMD patient group (Early) and exudative AMD patient group (Late), respectively. Indicates. The concentrations of antigens shown in the immunoblotting results were quantified and graphically shown in FIGS. 4A and 4B. As a result, it was confirmed that vinculin increased about 3.4-fold in the plasma of age-related macular degeneration compared to the plasma of the non-patient control group.
  • 4A and 4B show the results of statistical processing of vinculin concentrations measured by immunoblotting of FIG. 3.
  • 4C shows the measured concentration of vinculin in a recipient-engineered characteristic (ROC) graph.
  • the ROC graph is a graph of all susceptibility / specificity pairs obtained by continuously changing judgment thresholds over the full range of observed data, mainly indicating the accuracy of the test (Zweig et al., Clin. Chem. 39: 561-577). , 1993).
  • Vinculin's AUC area under the ROC curve
  • FIG. 6A and 6B show the results of statistical processing of vinculin concentrations measured by immunoblotting of FIG. 5.
  • FIG. 6C shows the measured vinculin concentration in a recipient-engineered characteristic (ROC) graph. Vinculin's AUC was 0.838 (SE 0.0421), indicating that the assay was sensitive and accurate.

Abstract

본 발명은 빈쿨린 단백질을 포함하는, 나이관련 황반변성 진단용 바이오 마커 및 상기 마커를 이용하는, 나이관련 황반변성 진단용 키트, 진단 방법 및 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 상기 나이관련 황반변성 진단용 키트 및 진단 방법은, 환자의 혈장을 이용하는 새로운 면역학적 진단 도구로서, 민감도가 우수할 뿐만 아니라 생검을 이용하지 않고 혈장을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 나이관련 황반변성의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

나이관련 황반변성 진단용 마커 및 이를 이용한 나이관련 황반변성 진단 방법
본 발명은 나이관련 황반변성 진단용 마커 및 이를 이용하여 나이관련 황반변성을 진단하는 방법에 관한 것이다.
나이관련 황반변성 (Age-related Macular Degeneration, AMD)이란 나이가 들면서 망막의 황반부에 여러 가지 변화가 동반되어 생기는 질병이다. 서구에서는 60세 이상의 인구에서 실명의 가장 주된 원인이며, 우리나라에서도 앞으로 노인 인구가 증가함에 따라서 그 발생 빈도는 더욱 증가하리라 예상된다. 황반이란, 망막이라고 하는 신경 조직의 중심 부위를 말하는데, 빛 자극에 반응하는 중요한 세포가 밀집되어 있어서 중심 시력을 담당한다. 이 황반부에 변성이 일어나 시력 장애를 일으키는 질환을 황반변성이라 한다. AMD는 퇴행성 질병으로 이는 망막, 망막색소상피층(RPE), Bruch's membrane, 맥락막에 영향을 끼친다.
AMD는 비삼출성(건성)과 삼출성(습성)의 두 가지 형태가 있다. 나이관련 황반변성의 대부분을 차지하는 비삼출성 형태는 망막에 드루젠이나 망막색소상피의 위축과 같은 병변이 생긴 경우를 말한다. 이는 보통 심한 시력상실을 유발하지는 않지만 습성 형태로 발전할 수 있다. 삼출성 형태는 망막 밑에 맥락막 신생혈관이 자라는 경우이다. 이러한 신생혈관은 황반부에 삼출물, 출혈 등을 일으켜서 중심시력에 영향을 주며, 발생 후 2개월 내지 3년 사이에 실명을 초래하기도 한다. 삼출성 형태의 황반변성은 진행속도가 매우 빨라서 수 주 안에 시력이 급속히 나빠지는 경우가 많다. 나이관련 황반변성은 일반적으로 일단 시력장애가 시작되면 이전의 시력을 회복할 수 없는 경우가 많으므로 조기 발견이 매우 중요하다. 조기 발견은 정기적인 안과검진을 통해서 가능하다. 안저검사를 포함한 안과적 검진으로 나이관련 황반변성이 의심되면, 형광안저혈관조영술 등의 안과 정밀검사들을 시행하여 진단할 수 있다. 비외과적 치료에는 레이저광응고술(photocoagulation), 광역학요법(photodynamic therapy, PDT), 경동공온열치료법, 약물치료법(예를 들면, VEGF inhibitor 주입) 등이 있으며, 외과적인 수술법으로는 황반하수술, 황반변위술이 있다.
빈쿨린은 세포의 부착과 이동에 관련되어 세포사이의 상호작용을 해주는 역할을 하는 단백질로, 빈쿨린이 감소하면 세포와 세포사이가 느슨해져 암세포가 다른 곳으로 잘 전이되는 것으로 알려져 있다(Seimiya M et al., Hepatology 48:519-530, 2008). 그러나, 이제까지 AMD와 관련된, 혈액에서 빈쿨린 단백질의 발현량 변화에 대한 연구는 보고된 바 없다.
일 양상은 빈쿨린 단백질을 포함하는 나이관련 황반변성 진단용 바이오 마커를 제공한다.
다른 양상은 상기 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 나이관련 황반변성 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 나이관련 황반변성을 진단하는 방법 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
일 양상은 빈쿨린(vinculin) 단백질을 포함하는, 나이관련 황반변성 진단용 바이오 마커를 제공한다. 상기 빈쿨린 단백질은 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 빈쿨린 단백질은 약 123 kD의 분자량을 갖는, 포유류 세포 내 세포막-골격계 단백질로, α-catenin과 약 20 내지 30%의 동일성을 갖는 서열을 가지며 그 기능 또한 서로 유사하다. 또한, 상기 단백질은 혈장에서 검출이 가능하기 때문에 간편한 방법으로 나이관련 황반변성을 진단하는데 활용될 수 있다.
상기 빈쿨린 단백질은 정상 개체에 비하여 나이관련 황반변성이 발병된 개체의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 그의 발현 수준이 상대적으로 증가된다. 따라서, 정상 개체와 나이관련 황반변성이 의심되는 개체의 혈액, 혈장 또는 혈청을 채취하여 상기 빈쿨린 단백질의 발현 수준을 비교함으로써, 나이관련 황반변성을 진단할 수 있다. 상기 개체는 사람 또는 사람을 제외한 포유동물일 수 있다.
다른 양상은 빈쿨린 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 나이관련 황반변성 진단용 키트를 제공한다. 상기 빈쿨린 단백질은 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 단백질의 단편은 예를 들어, 면역원성 단편일 수 있다. 상기 면역원성 단편은 상기 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단백질의 단편을 의미한다. 상기 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 단일클론 항체일 수 있다.
상기 다중클론 항체는 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질 또는 상기 단백질의 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주로는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 사용할 수 있다. 상기 단백질 또는 상기 단백질의 단편이 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주입되는 경우, 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제할 수 있다.
상기 단일클론 항체는 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 융합에 의한 불멸화된 세포주(immortalized cell line) 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체의 제조 방법은 예를 들면, 상기 단백질을 정제하여 적당량을 Balb/C 마우스에 면역화를 시키거나, 상기 단백질의 폴리펩티드 단편을 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨 다음, 마우스에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 마이엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성시키고, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식시킨 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리, 정제하는 것일 수 있다. 또한, 상기 단일클론 항체는 상업적으로 이용가능한 빈쿨린 단백질에 대한 항체일 수 있다.
상기 나이관련 황반변성 진단용 키트는 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 키트는 예를 들면, 동결 건조 형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.
상기 키트는 예를 들어, 면역분석(immunoassay)에 사용될 수 있다. 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색, 면역친화성 정제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에서 빈쿨린 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 측정된 상기 단백질의 발현 수준을 대조군 시료에서의 빈쿨린 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에서 나이관련 황반변성을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 나이관련 황반변성이 의심되는 개체일 수 있다. 상기 개체는 사람 또는 사람을 제외한 포유동물일 수 있다.
상기 빈쿨린 단백질의 발현 수준은 빈쿨린 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 측정될 수 있다. 상기 발현 수준은 전술한 면역분석 또는 면역염색 방법을 통해 측정될 수 있다. 또한, 상기 발현 수준은 상기 빈쿨린 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 양을 측정함으로써 간접적으로 결정될 수도 있다. 상기 mRNA 양의 측정은 예를 들면, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 정량적 RT-PCR(qualitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블롯, DNA 칩에 의해 수행될 수 있다.
상기 빈쿨린 단백질은 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 단백질의 단편 및 상기 항체에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 안구 세포, 안구 조직, 안구로부터 추출한 안방수와 전방수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 시료는 나이관련 황반변성이 의심되는 개체로부터 분리된 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있다.
상기 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예를 들어, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 항체가 상기 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다.
상기 방법이 ELISA 방법을 이용하는 경우, (i) 정상인 개체와 나이관련 황반변성이 의심되는 개체의 혈액 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차항체로서의 상기 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 혈액 시료를 접촉시켜 항원-항체 반응을 유도시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 고체 기질은 예를 들면, 탄화수소 폴리머, 유리, 금속, 겔, 또는 마이크로타이터 플레이트일 수 있다. 상기 탄화수소 폴리머는 예를 들면, 폴리스틸렌 또는 폴리프로필렌일 수 있다.
상기 이차항체에 결합되는 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, 또는 사이토크롬 P450일 수 있다. 상기 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 또는 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용될 수 있다. 상기 효소로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우, 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
상기 방법이 캡처-ELISA 방법을 이용하는 경우, 상기 방법은 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 상기 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 나이관련 황반변성이 의심되는 개체의 혈액 시료를 접촉시켜 항원-항체 반응을 유도하는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있고, 상기 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 표지로부터 발생하는 시그널을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 화학물질(예를 들어, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예를 들어, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent), FRET(fluorescence resonance energy transfer), 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출을 통해 상기 단백질을 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 표지로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙트아비딘을 이용하여 시그널을 검출하고, 표지로서 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린을 이용하여 시그널을 검출할 수 있다.
또한, 상기 방법은 상기 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 마이크로칩 상에 고정시킨 후, 나이관련 황반변성이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 반응시켜 상기 단백질을 검출할 수 있는 마이크로칩 및 자동화된 마이크로어레이 시스템(microarray system)의 형태로 실시될 수 있다.
대조군 시료에서의 빈쿨린 단백질 발현 수준 대비 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에서의 빈쿨린 단백질 발현 수준의 증가는 상기 개체의 나이관련 황반변성을 나타내는 것일 수 있다. 따라서, 대조군 대비 증가된 빈쿨린 단백질 발현 수준을 갖는 개체는 나이관련 황반변성을 갖는 것으로 진단될 수 있다. 예를 들어, 나이관련 황반변성이 의심되는 개체의 시료에 대한 면역분석에서 빈쿨린 단백질에 대한 시그널이 정상 개체의 시료보다 강하게 나오는 경우, 나이관련 황반변성으로 진단될 수 있다.
다른 양상은 빈쿨린 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 접촉시킨 상기 세포에서 빈쿨린 단백질의 발현 수준을 측정하여, 발현이 억제되는지를 확인하는 단계를 포함하는, 나이관련 황반변성 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 빈쿨린 단백질을 포함하는 세포는 예를 들면, 망막 색소 상피 세포일 수 있다. 상기 스크리닝 방법에서 용어 “시험물질”은 빈쿨린 단백질의 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 예를 들면, 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 또는 천연물 추출물을 포함할 수 있다. 상기 빈쿨린 단백질 또는 상기 단백질의 발현 수준의 측정에 대해서는 전술한 바와 같다. 시험물질이 접촉된 세포에서 빈쿨린 단백질의 발현이 억제되는 경우, 상기 시험물질은 나이관련 황반변성의 치료용 물질로 판정될 수 있다.
일 양상에 따른, 나이관련 황반변성과 관련된 마커, 이를 검출할 수 있는 물질을 포함한 진단용 키트, 및 이를 이용하는 진단방법은, 환자의 혈장을 이용하는 새로운 면역학적 진단 도구로서, 민감도가 우수할 뿐만 아니라 생검을 이용하지 않고 혈장을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 나이관련 황반변성의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 정상인 20명과 삼출성 나이관련 황반변성 환자 20명의 혈장 단백질 시료로부터 얻은 펩티드를 탠덤 질량 분석기를 이용해 프로파일링 한 후, 얻은 단백질의 개수를 벤다이어그램으로 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2d는 빈쿨린 단백질로부터 유래한 펩티드 절편에 해당하는 질량분석 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 비환자 대조군(healthy control, HC), 비삼출성 초기 AMD 환자군(Early AMD, Early) 및 삼출성 AMD 환자군(Exudative AMD, Late)의 혈장 단백질 시료를 각각 전기영동한 후, 항-빈쿨린 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 도 3의 면역블롯팅에 의해 측정된 빈쿨린 농도를 통계처리한 결과를 나타낸다. 도 4c는 측정된 빈쿨린 농도를 수용자-조작 특성(receiver operating characteristic, ROC) 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 새로운 비환자 대조군(HC) 60개, 비삼출성 초기 AMD 환자군(Early) 10개 및 삼출성 AMD 환자군(Late) 43개의 혈장 단백질 시료를 각각 전기영동한 후, 항-빈쿨린 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 도 5의 면역블롯팅에 의해 측정된 빈쿨린 농도를 통계처리한 결과를 나타낸다. 도 6c는 측정된 빈쿨린 농도를 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 나이관련 황반변성 환자의 혈장 단백질 중 빈쿨린의 동정
1-1. 나이관련 황반변성(AMD) 환자의 혈장 단백질 시료 준비
삼출성 AMD 환자 20명 및 비환자 20명으로부터 각각 혈장 시료를 40 ㎕씩 수집하였다. 각 혈장 시료에 대해 MARS(multiple affinity removal system, Agilent) 컬럼을 사용한 면역친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 자외선 흡광도 280 ㎚로 추적하여 상기 컬럼에 결합하지 않은 단백질 분획을 수집하였다. 상기 분획은 혈장 단백질의 대부분을 차지하는 6종의 단백질인 알부민, 면역글로불린 A, 면역글로불린 G, 트랜스페린, 트립신 저해제 및 헵토글리빈이 대부분 제거된 것이다. 상기 분획을 농축하여 3 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질만을 포함하는 혈장 단백질 시료를 준비하였다.
1-2. 혈장 단백질의 분획물 수득
실시예 1-1에서 얻은 환자군의 혈장 단백질 시료 20개에서 각각 동일한 양을 취하여 혼합하고, 비환자군의 혈장 단백질 시료 20개에서 각각 동일한 양을 취하여 혼합하였다. 상기 환자군의 혼합 시료 및 비환자군 혼합 시료의 단백질 양을 각각 500 mg로 맞춘 후, gel-eluted liquid fractionation entrapment electrophoresis(GELFrEE 8100 fractionation system) 시스템을 이용하여 분자량에 따라 분획하였다(Tran JC & Doucette AA(2008) Gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis: an electrophoretic method for broad molecular weight range proteome separation. Analytical chemistry 80(5):1568-1573). 1 cm, 12%T의 stacking 젤과 3 cm, 4%T stacking 젤로 이루어진 젤 컬럼으로 240 V에서 2시간 동안 전기영동하였다. 염료가 젤 컬럼을 통과하여 용출되는 시간을 '0' 분획으로 하고 이 시간부터 5분 분획, 15분 분획, 30분 분획, 50분 분획 및 120분 분획을 얻도록 설정하였다. 그 결과, 분자량에 따라 분리된 환자군 및 비환자군의 혈장 단백질 분획을 얻었다(환자군: 5분획, 비환자군: 5분획).
1-3. 펩티드 절편화 및 분획물 수득
실시예 1-2에서 얻은 각 혈장 단백질 분획에 10 mM이 되도록 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)을 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시켜 이황화 결합을 환원시켰다. 그 후, 알킬화를 위해 40 mM이 되도록 아이오도아세트아미드(iodoacetamide, IAA)를 가하여 암조건의 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 50 mM NH4HCO3로 10배 희석하였다. 시퀀싱이 가능한 수준의 트립신(Promega)을 단백질과 트립신의 질량 비율이 40:1이 되도록 첨가한 후, 37℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 0.4%가 되도록 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 가하여 pH 2.0 이하로 산성화시키고 펩티드 절편으로 분해하였다. 더 많은 단백질을 동정하기 위하여, 펩티드 절편을 포함하는 각 분획에 대해 OFFGEL fractionator(Agilent)를 통해 등전점에 따라 14개의 분획으로 다시 나누고, C18 SPE 카트리지(Waters)로 염을 제거한 후, 진공상태로 건조시켰다.
1-4. 액체 크로마토그래피와 탠덤 질량 분석
실시예 1-3에서 제조된 건조된 펩티드 절편을 0.4% 아세트산 용액 10 ㎕에 녹여 1 ㎕씩 분주하고, LTQ Obitrap 질량분석기(Thermo Scientific)와 결합되어 있는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 장치에 장착된 역상(reversed-phase) MAGIC C18aq 컬럼(12 ㎝ × 75 ㎛, Eksigent MDLC system)에 주입하였다. 상기 컬럼은 사용하기 전에 95% 완충용액 A(물에 용해한 0.1% 포름산 용액) 및 5% 완충용액 B(아세토니트릴에 용해한 0.1% 포름산 용액)으로 평형화시켰고, 시료를 분석하기 전 농도 구배 조건에 적응시키기 위해 여러 번 농도 구배 과정을 거쳤다. 각 펩티드 시료를 80분 동안 일정한 속도로 점진적 농도 구배가 일어나는 10 내지 30% 완충용액 B로 용출하였다.
상기 질량분석기를 이용하여 300 내지 2000 m/z에 해당하는 전체 질량 범위를 스캔하였다. 미리 조사된 어미 이온(parent ion)의 전체 스캔이 수행될 때 동시에 상위 6위의 감도를 가지는 스펙트럼을 파악하고 해당 어미 이온을 포집하여 딸 이온(daughter ion)의 스펙트럼을 얻었다. 이 때, 옵션은 어미 이온의 isolation width 1.5 m/z, normalized collision energy 25%, dynamic exclusion duration 180초였다. 데이터에 근거한 수득이 진행되는 동안 전하상태가 매치되지 않는 어미 이온은 제거되었다. 데이터는 Xcalibur software v2.0.7를 사용하여 얻었다.
1-5. 데이터 분석 및 빈쿨린 단백질의 동정
상기 MS/MS 스펙트럼을 SEQUEST(TurboSequest version 27, revision 12)를 사용하여 오염물질뿐만 아니라 72,065개의 단백질 엔트리를 가지는 Human International Protein Index database(IPI, versions 3.44, European Bioinformatics Institute, http://www.ebi.ac.uk/IPI)에 대하여 검색하였다. 이 때, 옵션은 no enzyme, MS/MS의 mass tolerance는 0.5 Da, mass tolerance는 15 ppm으로 하였다. 고정된 수식화(fixed manification)로는 시스테인 잔기에 45.9877 Da과 변동가능한 수식화(variable modification)로 메티오닌의 산화로 인한 +15.9949 Da을 지정해 주었다.
펩티드 동정과 정량 분석을 위해 Trans-Proteomic Pipeline(TPP, version 4.0, http://www.proteomecenter.org)을 이용하였다. 트립신 제한과 'monoisotopic masses' 옵션을 가한 pepXML 모듈을 입력하여 Sequest 검색 결과를 도출하였다. Peptide-Prophet은 probability가 0.05 이상인 것, Protein-Prophet은 probability가 0.9 이상인 것을 최종 데이터로 선택하였다.
도 1은 정상인 20명과 삼출성 나이관련 황반변성 환자 20명의 혈장 단백질 시료로부터 얻은 펩티드를 탠덤 질량 분석기를 이용해 프로파일링 한 후, 얻은 단백질의 개수를 벤다이어그램으로 나타낸 것이다. 320개 단백질로부터 8832개의 유니크 펩티드를 동정하였다. 스펙트럼 카운트(spectral counting) 방식으로 환자군과 비환자군의 단백질을 비교하였고, 비환자군에 비해 환자군의 혈장에서 3배 이상의 발현량 차이를 보이는 단백질을 삼출성 나이관련 황반변성 환자 특이적인 단백질로 분류하였다. g-value를 계산하여 단백질 양의 차이가 통계적으로 유의미한지 검사하였다.
상기와 같이 동정된 펩티드를 분석한 결과, 삼출성 나이관련 황반변성 환자 특이적인 단백질 군에 포함되는 빈쿨린 단백질을 동정할 수 있었다. 도 2a 내지 도 2d는 빈쿨린 단백질로부터 유래한 펩티드 절편에 해당하는 질량분석 스펙트럼을 나타낸다. 각 펩티드 절편의 아미노산 서열로부터 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 빈쿨린 단백질을 동정할 수 있었다.
실시예 2. 면역블롯팅을 이용한 나이관련 황반변성 환자 혈장에서 빈쿨린의 검출
2-1. 나이관련 황반변성 환자의 혈장 단백질 시료 준비
비삼출성 초기 AMD 환자 22명, 삼출성 AMD 환자 58명, 및 비환자 40명으로부터 각각 혈장 시료를 40 ㎕씩 수집하였다. 각 혈장 시료에 대해 MARS 컬럼을 사용한 면역친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 자외선 흡광도 280 ㎚로 추적하여 상기 컬럼에 결합하지 않은 단백질 분획을 수집하였다. 상기 분획은 혈장 단백질의 대부분을 차지하는 6종의 단백질인 알부민, 면역글로불린 A, 면역글로불린 G, 트랜스페린, 트립신 저해제 및 헵토글리빈이 대부분 제거된 것이다. 상기 분획을 농축하여 3 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질만을 포함하는 혈장 단백질 시료를 준비하였다.
2-2. 면역블롯팅을 이용한 혈장 내 빈쿨린의 검출
실시예 2-1의 혈장 단백질 시료를 각각 PBS로 40배 희석하여 얻은 10 ㎕와 2% SDS가 포함된 1M Tris-HCL(pH 6.8) 완충용액을 혼합한 후, 15% SDS 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동에 의해 분리된 혈장 단백질을 50 mM Tris-HCl, 130 mM 글리신, 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올이 포함된 완충용액 내에서 90 V, 250 mA의 조건에서 PVDF 멤브레인으로 전이시키고, 전이된 멤브레인을 0.02% 소듐 아자이드를 첨가하고 5% 탈지분유가 함유된 TBST(Tris-buffered saline with Tween 20) 완충용액에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, PVDF 멤브레인과 빈쿨린에 대한 항체(ab18058, 1:100, Abcam)를 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, TBST로 3회 세척하였고, 항-빈쿨린의 마우스 면역글로불린과 결합하는 마우스 IgG-HRP(1:5000, GE Healthcare)로 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 다시 TBST로 3회 세척하였다. 이어서, 상기 PVDF 멤브레인을 ECLplus(enhanced chemiluminescence, Amersham Bioscience)와 반응시킨 후, X-ray 필름에 3 내지 5분 동안 감광시켜 각각의 단백질 농도를 측정하였다.
도 3은 비환자 대조군(HC), 비삼출성 초기 AMD 환자군(Early) 및 삼출성 AMD 환자군(Late)의 혈장 단백질 시료를 각각 전기영동한 후, 항-빈쿨린 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과를 나타낸다. 면역블롯팅 결과에서 나타난 항원의 농도를 수치화하여 도 4a 및 도 4b에 그래프로 나타내었다. 그 결과, 빈쿨린은 비환자 대조군의 혈장에 비하여 나이관련 황반변성 환자의 혈장에서 약 3.4배 증가함을 확인할 수 있었다.
도 4a 및 도 4b는 도 3의 면역블롯팅에 의해 측정된 빈쿨린 농도를 통계처리한 결과를 나타낸다. 도 4c는 측정된 빈쿨린의 농도를 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 나타낸 것이다. ROC 그래프는 관찰된 데이터의 전 범위에 걸친 판정 역치를 연속적으로 변화시켜 수득되는 모든 감수성/특이성 쌍의 그래프로, 주로 시험의 정확도를 나타낸다(Zweig et al., Clin. Chem. 39: 561-577, 1993). 빈쿨린의 AUC(area under the ROC curve)는 0.895(SE 0.0312)로 상기 분석이 민감성과 정확성을 갖추고 있음을 알 수 있었다.
도 5는 새로운 비환자 대조군(HC) 60개, 비삼출성 초기 AMD 환자군(Early) 10개 및 삼출성 AMD 환자군(Late) 43개의 혈장 단백질 시료를 각각 전기영동한 후, 항-빈쿨린 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 도 5의 면역블롯팅에 의해 측정된 빈쿨린 농도를 통계처리한 결과를 나타낸다. 도 6c는 측정된 빈쿨린 농도를 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 나타낸 것이다. 빈쿨린의 AUC는 0.838(SE 0.0421)로 상기 분석이 민감성과 정확성을 갖추고 있음을 알 수 있었다.
상기 결과로부터, 혈장 내 빈쿨린을 선택적으로 인식하는 항체를 사용함으로써, 비환자 대조군과 비교하여 상대적으로 증가한 빈쿨린 단백질의 농도를 나타내는 피시험자를 나이관련 황반변성 환자로 진단할 수 있음을 확인하였다.

Claims (13)

  1. 빈쿨린(vinculin) 단백질을 포함하는, 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD) 진단용 바이오 마커.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 빈쿨린 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 마커.
  3. 빈쿨린 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 나이관련 황반변성 진단용 키트.
  4. 청구항 3에 있어서 상기 빈쿨린 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 키트.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체인 것인 키트.
  6. 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에서 빈쿨린 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    측정된 상기 단백질의 발현 수준을 대조군 시료에서의 빈쿨린 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에서 나이관련 황반변성을 진단하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 빈쿨린 단백질의 발현 수준은 빈쿨린 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 측정되는 것인 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 빈쿨린 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 안구 세포, 안구 조직, 안방수 및 전방수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체인 것인 방법.
  11. 청구항 6에 있어서, 대조군 시료에서의 빈쿨린 단백질 발현 수준 대비 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에서의 빈쿨린 단백질 발현 수준의 증가는 상기 개체의 나이관련 황반변성을 나타내는 것인 방법.
  12. 빈쿨린 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
    접촉시킨 상기 세포에서 빈쿨린 단백질의 발현 수준을 측정하여, 발현이 억제되는지를 확인하는 단계를 포함하는, 나이관련 황반변성 치료용 물질의 스크리닝 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 빈쿨린 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
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