KR102491238B1

KR102491238B1 - 혈관신생 조절 인자들을 포함하는 바이오마커를 이용한 혈관신생 연관 질환 진단용 조성물, 혈관신생 연관 질환 진단을 위한 정보제공방법 및 혈관신생 연관 질환 치료용 물질의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102491238B1
Application number: KR1020220018644A
Authority: KR
Inventors: 장완진
Original assignee: 줄리아 연구소 주식회사
Priority date: 2022-02-14
Filing date: 2022-02-14
Publication date: 2023-01-26
Also published as: WO2023153687A1; KR20230122535A

Abstract

본 발명은 혈관신생 조절 인자들을 포함하는 바이오마커를 이용한 혈관신생 연관 질환의 진단용 조성물, 혈관신생 연관 질환을 진단하기 위한 정보제공방법 및 혈관신생 연관 질환의 치료용 물질을 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하며, 상기 바이오마커는 명세서에 상세하게 기술된다.

Description

혈관신생 조절 인자들을 포함하는 바이오마커를 이용한 혈관신생 연관 질환 진단용 조성물, 혈관신생 연관 질환 진단을 위한 정보제공방법 및 혈관신생 연관 질환 치료용 물질의 스크리닝 방법 {COMPOSITION FOR DIAGNOSING ANGIOGENESIS-RELATED DISEASES USING BIOMARKERS COMPRISING ANGIOGENESIS REGULATORS, METHOD FOR PROVIDING INFORMATION FOR DIAGNOSING ANGIOGENESIS-RELATED DISEASES, AND SCREENING METHOD FOR SUBSTANCES FOR TREATMENT OF ANGIOGENESIS-RELATED DISEASES}

본 발명은 혈관신생 조절 인자들을 포함하는 바이오마커를 이용한 혈관신생 연관 질환의 진단용 조성물, 혈관신생 연관 질환을 진단하기 위한 정보제공방법 및 혈관신생 연관 질환의 치료용 물질을 스크리닝할 수 있는 방법에 관한 것이다.

신생혈관은 배아 발달, 조직 복구 및 분자 수송을 위한 종양을 포함하여 새로운 혈관 싹트기의 다단계 과정이다. 혈관 네트워크는 모든 장기와 조직을 관통하여 이용 가능한 영양소, 신호 이온 및 산소를 순환시킨다. 혈관 골격의 발달은 배아 발생의 가장 초기 반응 중 하나이다. 초기 배아 발달 동안 중배엽 세포는 혈관모세포로 분리되고 조혈 세포의 활동과 내피 세포의 활동으로 혈관을 생성한다. 추가 분리 기간 동안 혈관아세포 (hemangioblast)는 혈관모세포(angioblast)를 생성하고 이 축적이 혈액섬의 배열을 가져온다. 혈액과 혈액섬의 조합은 내피 세포에 의해 형성된 미세 혈관으로 구성된 필수 혈관 신경총을 발생시킨다. 예를 들어, 미숙아 망막병증(ROP)은 조산 망막에서 비정상적인 혈관 성장이 발생하는 것과 같은 혈관 신생의 초기 반응을 이해하는 중요한 단계이다.

신생혈관의 조직 작용은 많은 촉진 성분의 균등화에 의존한다. 혈관의 전제를 형성하는 내피 세포의 증식과 이동을 관리하는 주요 신호 반응은 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)와 그 수용체이다. VEGF 의존 신호 네트워크는 혈관 발달의 초기 단계의 기본반응이다.

혈액장벽은 조밀연접으로 연결된 모세혈관내피세포와 성상세포 말단발돌기, 혈관주위세포, 혈관주위신경세포를 포함한 혈관주위요소로 구성된다. 내피 세포는 특수 밀착 접합으로 인해 혈액 장벽에 매우 선택적인 투과성을 부여한다.

제어되지 않은 혈관신생은 암, 염증, 당뇨병 및 노화 관련 황반변성 및 당뇨병성 망막병증을 포함하는 신경변성을 포함한 병태생리학적 상태를 결정한다. 암종 세포에서 VEGF의 조절은 항암제로서 널리 연구되었다. 그러나 분자 수준에서 혈관 신생 미세 환경에 대한 분자 정보는 알려지지 않았다.

본 발명자는 혈관 형성을 촉진하거나 억제하기 위해 미세 환경에서 혈관 신생 분자를 분석함으로써 특정 지질 분자가 혈관 형성 과정을 시작한다는 것을 확인하였다. 본 발명자는 특정 지질의 조성과 화학량론이 혈관신생 반응을 조절할 수 있는지 여부를 확인하고, 혈관 형성을 촉진하거나 억제하기 위해 혈관 신생 미세 환경을 특정 지방산이 결정함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

국내등록특허공보 제10-1486548호

이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 혈관신생을 조절하는 인자들을 규명하여 노인황반변성(AMD), 당뇨병성 망막병증(DR)과 같은 혈관신생 연관 질환들을 효과적으로 진단할 수 있는 조성물 및 방법을 제공하고, 혈관신생 연관 질환들의 치료용 물질을 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 일 실시예에 따라 혈관신생(angiogenesis) 연관 질환 진단용 조성물을 제공한다.

혈관신생 연관 질환 진단용 조성물은 혈관신생 연관 질환과 관련된 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는데, 상기 바이오마커는 하기 표 1과 같은 바이오마커 중 하나 이상을 포함한다.

구분	종류	검출 영역
제1 바이오마커	올레산 (oleic acid)	혈관 영역
	에폭시올레산 (epoxyoleic acid)
	리놀레산 (linoleic acid)
	리놀렌산 (linolenic acid)
	팔미트산 (palmitic acid)
	스테아르산 (stearic acid)
	니트로올레산 (nitro oleic acid)
	니트로옥타데센산 (nitro octadecenoic acid)
	콜레스테롤 (cholesterol)
	7-케토콜레스테롤 (7-ketocholesterol)
	리소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidyl ethanolamine, LPE)
	리소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC)
	도코사헥사에노일리소포스파티딜콜린 (LPC-DHA)
제2 바이오마커	도코사헥사엔산 (Docosahexaenoic acid, DHA)	비혈관 영역
제2 바이오마커	에이코사펜타엔산 (Eicosapentaenoic acid, EPA)	비혈관 영역

혈관신생 연관 질환이란 혈관신생(angiogenesis)에 의해 유발되거나 진행 또는 악화되는 등 혈관신생에 직간접적인 영향을 받는 것으로 공지된 질환을 의미한다(Seminars in Nephrology, Vol 27, No 2, March 2007, pp 161-171 ; Clin Sci (Lond). 2017 Aug 1; 131(15): 1763-1780. 등). 예를 들어 노인황반변성(AMD), 당뇨병성 망막병증(DR), 미숙아 망막병증(ROP), 암(cancer), 관절염(arthritis), 건선(psoriasis), 비만(obesity), 천식(asthma), 치매(Alzheimer's disease) 및 미생물 감염성 질환(microbial infectious disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 관절염은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)일 수 있다.

바이오마커의 수준을 측정하는 것은 바이오마커의 함량이나 농도 등 그 존재량을 측정하는 것일 수도 있고, 바이오마커를 직접 발현하거나 바이오마커의 증가에 관여하는 유전자의 mRNA나 단백질의 발현 수준을 측정하는 것일 수도 있다. 바이오마커의 증가에 관여하는 유전자란 해당 유전자의 발현을 통해 생성된 단백질 등의 물질이 해당 바이오마커를 존재량을 증가시키는 경우를 의미할 수 있다.

상기 표 1과 같은 바이오마커의 수준을 측정하는 제제로서, 상기 바이오마커와 관련된 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정할 경우에는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 및 안티센스 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 통상의 기술자는 상기 서열을 바탕으로 이들의 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 디자인할 수 있다.

상기 프로브란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합함으로써 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미하며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

mRNA 발현 수준을 측정하는 방법으로 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또는, 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 및 압타머(aptamer) 중 하나 이상을 포함할 수도 있다.

상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다.

상기 다른 과제를 해결하기 위해 본 발명은 일 실시예에 따라 혈관신생 연관 질환 진단용 키트를 제공한다. 혈관신생 연관 질환 진단용 키트는 상술한 바와 같은 혈관신생 연관 질환 진단용 조성물을 포함한다. 혈관신생 연관 질환 진단용 키트는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.

또한, 상기 키트는 질량분석에 이용될 수 있다. 이 경우, 상기 단백질의 특정 아미노산 잔기는 미리스토일화(myristoylation), 이소프레닐화, 프레닐화, 글리피칸화(glypiation), 리포일화(lipoylation), 아실화, 알킬화, 메틸화, 탈메틸화, 아미드화, 유비퀴틴화, 인산화, 탈아미드화, 글리코실화, 산화, 또는 아세틸화 등과 같은 변형을 가질 수 있다.

혈관신생 연관 질환 진단용 키트는 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 혈관신생 연관 질환 진단용 키트는 예를 들어, 동결 건조 형태의 항체와 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위해 본 발명은 일 실시예에 따라 혈관신생 연관 질환 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다. 혈관신생 연관 질환 진단을 위한 정보제공 방법은 (a) 대상(subject)의 생물학적 시료에서 혈관신생 연관 질환과 관련된 바이오마커의 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 측정된 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 수준이 상기 대조군 시료에 비해 증가하면 혈관신생 연관 질환의 유병 가능성이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함한다. 혈관신생 연관 질환과 관련된 바이오마커란 상기 표 1의 바이오마커 중 하나 이상이다.

구체적으로, 상기 표 1의 바이오마커들은 혈관신생 연관 질환을 갖는 세포 또는 환자에서 mRNA(또는 단백질) 발현 수준이나 존재량이 정상 대조군에 비해 증가한(또는 더 많은) 특징을 갖는다. 따라서, 바이오마커들의 수준이 상기 대조군 시료에 비해 증가하면(또는 더 많으면) 대상이 혈관신생 연관 질환의 유병 가능성이 있는 것으로 진단할 수 있다. 즉, 대상이 혈관신생 연관 질환을 갖고 있을 가능성이 높거나 발병할 가능성이 높은 것으로 진단(또는 판단, 판정)할 수 있다.

또한, 상기 생물학적 시료가 대상의 혈관 영역에서 유래된 경우 상기 제1 바이오마커의 수준을 비교하고, 상기 생물학적 시료가 대상의 비혈관 영역에서 유래된 경우 상기 제2 바이오마커의 수준을 비교함으로써, 보다 정확한 진단이 가능할 수 있다.

혈관 영역이란 대상의 혈관을 포함하는 조직으로서, 혈관 영역에서 유래된 생물학적 시료란 예를 들어, 혈액, 혈장 및/또는 혈관 조직(혈관 내피, 혈관 중피, 혈관 외피 등)을 포함하는 시료일 수 있다. 보다 구체적으로, 혈관 영역에서 유래된 생물학적 시료란 진단하고자 하는 질환과 관련 있는 조직 내의 혈관 영역에서 유래된 것일 수 있는데, 예를 들어 AMD, DR 또는 ROP를 진단하고자 할 경우에는 망막, 황반, 망막신경, 망막색소상피 등에서 채취한 혈액, 혈장 및/또는 혈관 조직일 수 있다.

비혈관 영역이란 대상의 혈관을 포함하지 않는 조직으로서, 비혈관 영역에서 유래된 생물학적 시료란 혈관 외 세포들의 조직을 포함하는 시료일 수 있다. 보다 구체적으로, 비혈관 영역에서 유래된 생물학적 시료란 진단하고자 하는 질환과 관련 있는 조직의 혈관 외 조직일 수 있는데, 예를 들어 AMD, DR 또는 ROP를 진단하고자 할 경우에는 망막, 황반, 망막신경, 망막색소상피 등에서 채취한 혈관 외 영역의 조직일 수 있다.

보다 구체적인 예시로서, 폐암 또는 유방암의 경우 혈관신생 관련 바이오마커의 증감은 종양조직샘플과 정상조직샘플을 비교하여 분석할 수 있다. 망막혈관의 경우 전체 망막 세포를 채취하여 혈관신생 관련 바이오마커를 분석할 수 있다. 당뇨병의 경우 갈색지방조직 또는 백색지방조직의 아디포스(adipose) 조직을 분리하여 분석할 수 있다. 혈관신생 정도는 현미경으로 측정하여 단위 면적당 결관 개수 또는 길이의 총합으로 나타낼 수 있다.

한편, 올레산과 DHA는 정상인 대상에 존재하는 농도가 10-50 μM이고, 혈관신생 기능을 나타내는 경우에는 100 μM 이상으로 존재할 수 있다. 따라서, 올레산(혈관 영역) 또는 DHA(비혈관 영역)의 측정된 농도가 50 μM 이하, 바람직하게는 10-50 μM일 경우 혈관신생 연관 질환의 유병 가능성이 낮은 것으로 진단할 수 있고, 100 μM 이상일 경우 혈관신생 연관 질환의 유병 가능성이 있는 것으로 진단할 수 있다.

또한, 올레산과 콜레스테롤이 혈관신생 기능을 나타내는 경우 혈관 영역과 비혈관 영역에서의 몰농도 비율(혈관 영역:비혈관 영역)은 각각 4.5-6.5:1 및 3.5-5.5:1로 존재하는 것으로 확인되기 때문에, 올레산이 혈관 영역 및 비혈관 영역에서의 질량농도(또는 몰농도)가 4.5-6.5:1(바람직하게는 약 5.5:1)이거나 콜레스테롤이 3.5-5.5:1(바람직하게는 약 4.2:1)일 경우 혈관신생 연관 질환의 유병 가능성이 있는 것으로 진단할 수 있다.

즉, 하기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나 이상을 만족하는 경우 혈관신생 연관 질환의 유병 가능성이 있는 것으로 진단할 수 있고, 많은 경우를 만족할수록 유병 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다.

(1) 혈관 영역에서 측정된 올레산 농도가 100 μM 이상일 경우

(2) 비혈관 영역에서 측정된 DHA 농도가 100 μM 이상일 경우

(3) 혈관 영역 및 비혈관 영역에서 측정된 올레산 질량농도(또는 몰농도) 비율이 4.5-6.5:1일 경우

(4) 혈관 영역 및 비혈관 영역에서 측정된 콜레스테롤 질량농도(또는 몰농도) 비율이 3.5-5.5:1일 경우

몇몇 실시예에서, 본 발명의 혈관신생 연관 질환 진단을 위한 정보제공 방법은 상기 (a) 단계가 대상의 혈관 영역에서 유래된 생물학적 시료에서 제1 바이오마커 중 하나 이상의 수준을 측정하고 비혈관 영역에서 유래된 생물학적 시료에서 제2 바이오마커 중 하나 이상의 수준을 측정하는 단계일 수 있다. 이와 같이 각각 다른 영역에서 혈관신생 연관 질환의 지표로 존재하는 제1 및 제2 바이오마커를 함께 측정 및 비교함으로써, 혈관신생 연관 질환의 진단에 대한 정확도를 보다 높일 수 있다. 이 경우, 제1 및 제2 바이오마커 중 하나만 증가한 경우보다 모두 증가한 경우의 유병 가능성이 더 높은 것으로 진단할 수 있다.

상기 바이오마커의 수준 측정 및 비교는 상술한 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 바이오마커의 수준은 GC-MS (Gas chromatography-mass spectrometry) 분석, LC-MS (Liquid chromatography-mass spectrometry) 분석, 콜레스테롤 옥시데이스(oxidase) 분석 및 리피드 패널(lipid panel) 분석으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용해서 측정할 수 있다. 특히, 콜레스테롤 옥시데이스 분석의 경우 콜레스테롤 옥시데이스가 혈액 콜레스테롤과 반응하면 570 nm의 색을 나타내거나 538/587 nm의 형광을 나타내기 때문에 콜레스테롤을 정확하게 분석할 수 있고, 리피드 패널을 사용하면 총 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스터, LDL, HDL 등을 정량분석할 수 있다.

또한, (a) 내지 (c) 단계의 분석은 진단의 정확도를 향상시키기 위해 통계적 방법 또는 알고리즘을 사용하여 분석할 수 있으며, 선형 또는 비선형 회귀 분석방법, 선행 또는 비선형 분류(classification) 분석방법, 로지스틱 회귀 분석 방법(logistic regression), 분산분석(Analysis of Variance; ANOVA), 신경망 분석방법, 유전적 분석방법, 서포트 벡터 머신 분석방법, 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법, 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘 또는 커널 주성분(Kernel principal component) 분석방법, 마르코프 블랭킷(Markov Blanket) 분석방법, 회귀 특성 소거(recursive feature elimination) 또는 엔트로피-기본 회귀 특성 소거 분석방법 및 전방 플로팅 서치(floating search) 또는 후방 플로팅 서치(floating search) 분석방법으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 분석방법을 사용할 수 있다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 다른 실시예에 따라 (d) 상기 (a) 단계에서 수준을 측정한 바이오마커를 감소시킬 수 있는 치료용 제제(therapeutic agent)를 투여하는 단계를 더 포함하는 혈관신생 연관 질환의 치료방법을 제공한다. 즉, (a) 내지 (c) 단계를 통해 특정 바이오마커가 증가하여 해당 질환의 유병 가능성이 있는 것으로 판단될 경우, 해당 바이오마커를 직간접적으로 저해하는 등으로 작용할 수 있는 치료용 제제를 투여함으로써 대상을 치료할 수 있다.

상기 치료용 제제는 약학적 조성물(pharmaceutical composition)의 형태로 투여될 수 있는데, 치료용 제제는 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 주사제 등의 제형으로 제조되어 정맥주사 등으로 투여될 수 있다.

본 발명의 혈관신생 연관 질환의 치료방법은 (e) 상기 (d) 단계의 약제학적 제제 투여 후 상기 바이오마커의 수준을 다시 측정하는 단계를 더 포함할 수도 있다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위해 본 발명은 일 실시예에 따라 혈관신생 연관 질환 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 혈관신생 연관 질환 치료용 물질의 스크리닝 방법은 (a) 실험 모델의 혈관 영역 또는 비혈관 영역에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 처리된 영역에서 상술한 바이오마커 중 하나 이상의 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 측정된 수준을 대조군 모델과 비교하여 바이오마커가 감소하였는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바이오마커는 정상 대조군 대비 증가하는 물질이므로, 특정 후보물질을 처리하여 바이오마커가 감소하였다면 해당 후보물질을 혈관신생 연관 질환 치료 가능성이 있는 물질로 판단하고 전임상, 임상 등 다음 단계의 실험을 수행하는데 활용할 수 있다.

혈관 영역 또는 비혈관 영역에 후보물질을 처리하는 단계는 in vitro, in vivo, ex vitro, ex vivo 및 in silico 중 하나 이상의 방식으로 수행될 수 있고, 혈관 영역 또는 비혈관 영역은 동물 모델 또는 동물이나 인간으로부터 분리되거나 유래된 세포 또는 조직일 수 있다.

기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명의 실시예들에 따르면, 혈관신생 연관 질환과 관련된 특정 바이오마커들을 이용함으로써 AMD, 당뇨병성 망막병증과 같은 혈관신생 연관 질환들을 효과적으로 진단할 수 있고, 혈관신생 연관 질환의 치료용 물질을 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 실시예들에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.

도 1은 본 발명의 실험예에 따라 혈관신생 분석 매크로 소프트웨어를 이용하여 제작된 이미지이다.
도 2는 본 발명의 실험예에 따라 혈관 형태에 대한 혈관신생을 분석한 것을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실험예에 따라 혈관 형태를 양적 분석한 것을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실험예에 따라 혈관신생 분석을 사용하여 총 메쉬 면적을 정량 분석한 것을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예에 따라 extremities, nodes 및 junction의 미가공 데이터를 나타낸 것이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, '및/또는'은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 또, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. '-' 또는 '내지'를 사용하여 나타낸 수치 범위는 다른 언급이 없는 한 그 앞과 뒤에 기재된 값을 각각 하한과 상한으로서 포함하는 수치 범위를 나타낸다. '약' 또는 '대략'은 그 뒤에 기재된 값 또는 수치 범위의 20% 이내의 값 또는 수치 범위를 의미한다.

또한, 본 발명의 실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

그리고 본 발명의 실시예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시예에 대한 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.

본 명세서에서, '예방'이란 증상 또는 질환은 아직 없으나, 이러한 증상 또는 질환에 걸릴 수 있는 개체에서 증상 또는 질환의 발생을 억제하거나 지연시키는 것을 의미한다.

본 명세서에서, '치료'란 개체에서 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, 예를 들어 (a) 증상 또는 질환의 발전(악화)의 억제, (b) 증상 또는 질환의 경감 또는 개선, 또는 (c) 증상 또는 질환의 제거를 의미한다.

본 명세서에서, '개체' 또는 '대상'이란 본 발명을 이용하여 특정 질병 또는 질환을 진단, 예방 또는 치료하려는 세포, 조직, 동물 또는 인간을 의미한다.

본 명세서에서, '진단'이란 본 발명의 조성물 또는 키트를 이용하여 특정 질병 또는 질환의 발병 여부 또는 발병 위험성을 판단하는 행위는 물론 병리 상태의 특징을 확인하는 등 상기 질병 또는 질환과 관련된 정보를 제공할 수 있는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서, '유병 가능성'이란 특정 질병 또는 질환이 발병하였을 가능성과 발병할 가능성을 모두 포함하는 의미이다.

본 명세서에서, '생물학적 시료'란 대상의 혈액, 혈장, 혈청, 세포, 조직, 체액, 타액, 뇨, 안방수, 전방수 등을 의미한다.

본 명세서에서, '유래'란 특정 대상 또는 특정 부위에서 분리되는 것뿐만 아니라 대상 또는 부위 그 자체를 의미할 수도 있다.

본 명세서에서, '바이오마커'란 특정 질병 또는 질환을 가진 개체에서 정상 대조군(특정 질병 또는 질환이 없는 개체)에 비하여 유전자 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소 양상을 보이는 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

본 명세서에서, '대조군'이란 특정 질병 또는 질환이 없거나 유발되지 않은 정상 세포 또는 환자 등을 의미한다.

본 명세서에서, '수준'이란 바이오마커를 포함한 특정 인자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 의미할 수도 있고, 특정 인자의 존재량을 측정 또는 분석하여 확인할 수 있는 함량, 농도 등도 의미할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예들을 제조예와 실험예를 통해 상세하게 설명하나, 본 발명의 효과가 하기 실험예에 의해 제한되지 아니함은 자명하다.

실험예 1: 융모요막을 이용한 혈관신생인자 분석 (1)

실험 방법

ARVO (미국 시력 및 안과 연구 협회) 성명과 생체 내 연구를 위한 미 국립보건원 가이드를 준수하였다. 조류 배아는 공중 보건 서비스(PHS) 정책에 따라 살아있는 동물로 간주되지 않는다. 임신 12일 이하의 닭 배아를 사용하는 경우 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 동물 사용 프로토콜 신청이 필요하지 않다. ED13 및 더 어린 배아를 -20 ℃ 냉동고 또는 < 4 ℃에서 4시간 동안 보관되어 저체온에 의해 안락사되었다. 배아 사망은 참수, 막 파괴 또는 침용으로 확인되었다. ED13 내지 ED17 사이의 병아리 배아는 경추 탈구로 안락사되었다.

융모요막 분석(CAM)을 사용하여 질량 분석을 포함한 대사체학을 사용하여 혈관 형태와 신생혈관 분자를 조사하였다. 연속 회전하는 인큐베이터에서 62-72% 습도 및 37.5 ℃에서 10일 동안 병아리 배아를 매일(ED1-ED10) 배양하고 페트리 접시에서 수확하여 분석하였다.

각 샘플(1g)을 혈관 영역, 혈관 시작 영역, 비혈관 영역 및 병아리 배아의 알부민에서 수집하고 메탄올(2 mL), 물/인산염 완충 식염수(4 mL)를 포함한 클로로포름(8 mL) 유기 용매를 사용하여 추출하였다. 용액을 균질해질 때까지 혼합하였다. 샘플을 원심분리 (5분 동안 3,500 x g) 하고 하층 용액을 수집하고 실온(27±3 ℃)에서 건조될 때까지 증발시켰다. 생화학적 분석을 위해 보존된 시료를 헥산에 먼저 용해시킨 후 사용하였다. 혈관 영역에서 수집한 샘플은 혈관을 포함하는 조직(tissue)샘플 1 cm x 1 cm x 0.5 cm(또는 1 g)이며, 비혈관 영역에서 수집한 샘플은 조직샘플 1 cm x 1 cm x 0.5 cm(또는 1 g)였다.

GC-MS (Gas chromatography-mass spectrometry) 분석은 질량 분석기(Agilent 5975C)에 자동 시료 주입기(Agilent 7683B)가 장착된 Agilent 가스 크로마토그래피(Agilent 7890A)를 사용하여 수행되었다.

최고 온도를 325 ℃로 설정하고 초기 온도를 60 ℃로 설정한 상태에서 지질 샘플은 총 실행 시간을 35분으로 하여 분석하였다. 21분 동안 280 ℃까지 10 ℃/min으로 1분 동안 실행하도록 프로그래밍하였다. 모세관 컬럼(DB-5MS 30 m x 0.322 mm x 0.25 μm)을 사용하여 자동 시료 주입기는 1:1의 분할 비율을 사용하여 시료를 주입구에 주입하였다. 순수한 헬륨 가스(99.99%)는 5.154 psi 압력에서 1.1 ml/min의 유속으로 운반 가스로 사용되었다. National Institute Standard and Technology (NIST 2014 및 NIST 2011) 데이터베이스는 샘플의 질량 스펙트럼 해석을 제공한다. 데이터베이스의 알려진 화합물은 대사체 샘플에서 생성된 질량 스펙트럼의 알려지지 않은 분자와 비교되었다.

혈관 형태는 ImageJ 소프트웨어에 연결된 혈관신생 분석 매크로를 포함하는 생물정보학 도구에 의해 21개의 혈관신생 매개변수를 사용하여 정량적으로 분석되었다(fr/ImageJ/Angiogenesis-Analyzer-for-ImageJ). 도 1 및 도 5와 같은 이미지를 16비트 및 HUVEC 위상차/형광 이미지로 변환하여 혈관 형태 분석을 수행하였다. 다음과 같은 AutoTube(https://github.com/autotubularity/autotube), AngioTool(http://angiotool.nci.nih.gov), REAVER(https://github.com/bacorliss/public_REAVER), VESSGEN 2D(https://software.nasa.gov/software/ARC-17621-1) 및 Vessel Analysis(https://imagej.net/Vessel_Analysis)에서 비교하였다. 혈관 길이, 사지 및 가지의 변화는 3개의 이웃으로 식별된 마디로 분석된 반면, 가지는 2개의 접합부와 가지로 구분된 세그먼트로 분석되었다. 마스터 분기점은 분기 내에서만 관련된 교차로 마스터 세그먼트로 구분되었다. 마스터 트리는 메시를 구분하는 마스터 접합과 연결된 마스터 세그먼트로 구성되었다. 두 개의 가까운 마스터 접합은 기본 단편과 함께 고유한 마스터 접합으로 결합될 수 있으며 모든 혈관 형태 분석에서 관찰되었다.

두 그룹 비교는 2-tailed t-test, ANOVA를 활용한 반면 Tukey/Dunnet 테스트는 Stat View 소프트웨어를 사용한 다중 비교에 사용되었다. 많은 양의 생물학적 샘플(n=85)을 사용한 3개의 기술적으로 독립적인 실험의 평균으로 표시된 값으로 나타내었고 P < 0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.

실험 결과

노른자 부위의 지질은 병아리 배아의 주요 에너지이자 영양소의 탄소 공급원이다. 병아리 융모요막을 사용한 생화학적 분석은 잔여 난황이 완전히 흡수될 때까지 혈관 형성이 혈액에서 시간 의존적 방식으로 난황 영역을 감싸도록 증가했음을 보여주었다. 혈관 가지(nodes), 접합부(junctions) 및 사지(extremities)가 혈관 형성 영역의 최전선에서 풍부하였다. 알부민 영역에서도 신생혈관이 발생하였다.

지질 이중층의 소수성 꼬리는 병아리가 성장함에 따라 점차적으로 삼켜지는 더 많은 가지를 형성하도록 확장되었다. 알부민 영역(계란 흰자위)에는 90%가 물이 포함되어 있다. 나머지 10%는 필요한 보호를 위해 배아에 영양을 공급하는 단백질, 비타민, 지방산 및 미네랄이 풍부하다. 신생혈관 분석 소프트웨어는 혈관 형성 영역 내부의 혈액의 수성 영역에서 더 많은 가지와 세그먼트가 생성되었음을 나타낸다. 혈관 형성에 대한 시간 의존적 분석은 올레산, 콜레스테롤 및 리놀레산을 포함한 백색 지질 복합체가 혈관 형성을 혈관 신생 반응 가이드로 이끄는 것으로 나타났다. 신생혈관 형태 분석을 통해 혈관이 백색 지질 복합 영역을 따라 생성됨을 확인하였다. 혈관 형성은 혈액, 알부민, 산소 및 카로티노이드의 미세 환경을 기반으로 구별되었다. 지질 조성 및 화학량론은 비혈관 면적(X), 혈관 면적(Y) 및 알부민(Z)을 기반으로 추가 분석되었다.

지질 조성이 신생 혈관 미세 환경을 결정할 수 있다는 것을 혈관 및 비혈관 영역의 소수성 분자를 정량적으로 분석하여 확인하였다. 혈관, 비혈관 및 알부민 영역의 특정 분자를 이해하기 위해 병아리 배아에서 GCMS에 의한 대사체학 접근법을 사용하여 지질 구성 및 단편을 측정하였다. 지질 단편은 전하에 대한 질량(Y-축) 및 상대 존재비(X-축)로 분석되었다. 영역별 이온은 빨간색(비혈관), 검은색(혈관) 및 노란색(알부멘)으로 결정되어 각 영역에 혈관신생 촉진 또는 항혈관신생 분자가 존재함을 나타내었다.

GCMS 분석의 상대적 존재비 데이터는 혈관 면적이 더 높은 농도의 올레산(혈관 면적에서 올레산 = 1.7 g/egg: 비혈관 면적에서 300-330 mg = 44% : 8%), 리놀레산을 가지고 있음을 보여주었다. 콜레스테롤(200mg:50mg = 혈관 면적:비혈관 면적 = 33.4%:8%), 니트로올레산, 팔미트산, 스테아르산, LPC, LPE, 7-케토콜레스테롤 및 LPC-DHA가 높은 농도로 존재하였다. GCMS 분석을 통해 비혈관 영영에서는 DHA 및 EPA가 풍부함을 확인하였다.

질량분석기 분석은 증가된 수준의 도코사헥사엔산(DHA, 분자 단편 = 74.1, 185.2, 328, 354)과 에이코사펜타엔산(EPA, 분자 이온 = 302.1)이 배아 1일째의 비혈관 영역에서 (ED 1, 체류 시간=17.403분) 증가함을 확인하였다. 분자이온은 니트로올레산, 리놀렌산, 리놀레산, 라우르산, 리놀레산, 팔미트산, 올레산, 리소포스파티딜콜린(LPC, 탄소:이중 결합 = 18:4), 스테아르산, 콜레스테롤, 니트로올레산을 포함한 지방으로 확인되었다. 리소포스파티딜에탄올아민(LPE, 18:3) 및 아라키돈산(20:4, 분자 이온 = 304.4)은 배아 첫날에 혈관 영역에 풍부하였다 (ED 1, 체류 시간=25.242분).

혈관생성 영역에서는 올레산(97.2), 리놀레산(85.3), 팔미트산/스테아르산(227.3), 콜레스테롤(281.1, 368.4), 니트로옥타데센산(327.1), LPE(20:3, 분자 이온 = 503.3)의 이온 조각이 높은 농도로 나타났다. 배아 5일째에 혈관 영역에서(ED 5, 체류 시간=10.245분). 올레산(이온 조각 = 111, 165, 207, 264), 리놀렌산(135), 팔미트산(239), 니트로올레산(297), 콜레스테롤(387), 7-케토콜레스테롤(401), 도코사헥사에노일리소포스파티딜콜린(414)는 혈관 영역의 주요 지질 성분으로 확인되었다 (ED 5, 체류 시간=13.857분).

상기 결과를 통해 에리트로포이에틴 및 지질을 포함한 혈관신생 및 항혈관신생 분자는 혈관의 개시를 제어하는 천연 혈관신생 결정자임을 확인하였다. 질량 분석 및 데이터베이스 검색을 포함한 대사체학 접근법은 올레산, 콜레스테롤 및 리놀레산을 혈관 발달을 제어하는 혈관신생 개시제로 확인하였다.

상기 결과를 정리하면, 혈관신생 관련 질환에서 아래 표 2와 같은 올레산, 리놀레산 등의 제1 바이오마커는 혈관 영역에서 증가하고, DHA, EPA와 같은 제2 바이오마커는 비혈관 영역에서 증가함을 알 수 있다.

또한, 올레산과 DHA는 각각 혈관 영역 및 비혈관 영역에서 정상일 경우 10-50 μM로 측정되었고, 혈관신생 기능을 나타낸 경우에는 100 μM 이상으로 측정되었다. 올레산과 콜레스테롤이 혈관신생 기능을 나타낸 경우 혈관 영역과 비혈관 영역에서의 질량농도(또는 몰농도) 비율(혈관 영역:비혈관 영역)은 각각 약 5.5:1 및 4.2:1로 측정되었다. 더 높은 농도의 지방산은 탄소-탄소 결합, 막 및 양친매성 세제의 에너지 및 빌딩 블록으로 사용되어 수성 혈액층의 소수성 환경을 구성하였다. 신생혈관분석을 통해 7-케토콜레스테롤이 잠재적인 혈관 신생 분자로 간주된다. 7-케토콜레스테롤은 생체 내에서 VEGF의 강력한 유도제라고 보고되었다. 도코사헥사엔산(DHA)은 22개의 탄소와 6개의 이중 결합(22:6)을 갖는 오메가-3 다중불포화 지방산이다. DHA는 우리 몸에서 가장 불포화된 고도로 불포화된 구조로 인해 특히 관심을 끌며 대부분 세포막을 형성하는 인지질의 sn-2 위치에 집중되어 세포 구조에 큰 유동성을 제공한다.

DHA는 지단백질과 알부민을 포함하는 특정 단백질에 결합한다. 지단백질은 트리아실글리세롤, 인지질 또는 콜레스테릴 에스테르 내에서 에스테르화될 때 DHA를 수송할 수 있다. 알부민은 에스테르화되지 않은 형태로 DHA에 결합하거나 리소포스파티딜콜린(DHA-LPC) 내에서 에스테르화될 수 있다.

DHA 또는 DHA-LPC는 내피 세포로 들어가기 전에 리파아제에 의해 지단백질에서 가수분해될 수 있다. 일반적으로 LPC가 에스테르화되지 않거나 에스테르화된 PUFA는 내피 세포에 도달할 때 알부민에서 분리된다. 혈액 장벽 내에서 DHA의 주요 진입으로 간주되는 한 가지 경로는 내피 세포막을 통한 비에스테르화 DHA의 수동 확산이다.

에스테르화되지 않은 DHA의 내피 세포로의 촉진된 수송은 FAT/CD36(지방산 트랜스로카제/분화 클러스터 36)을 포함할 수 있다. 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)에서 FAT/CD36은 현저한 단층을 가로지르는 지방산의 수송에 있는 역할을 한다. 뇌 인지질로의 DHA 이동과 같은 PUFA는 CD36-/- 마우스에서 발견되지 않았다. LPC에서 에스테르화된 DHA와 관련하여 최근 연구에서는 BBB 내피에서 발현되는 단백질인 Mfsd2a(주요 촉진제 슈퍼패밀리 도메인 함유 단백질 2A)의 중요한 역할을 입증하였다. DHA 지방산이 LPC로 에스테르화되는 경우에만 Mfsd2a가 DHA의 주요 수송체임을 확인하였다.

Mfsd2a 녹아웃 마우스는 뇌에서 DHA 수준이 현저히 감소했고 DHA-LPC 흡수 수준이 현저히 감소했다. Mfsd2a는 또한 망막으로의 DHA-LPC 수송에 중요한 것으로 나타났다. 내피 세포에서 신경 세포로의 비에스테르화 DHA의 수동 확산은 DHA가 뇌로 들어가는 잠재적인 경로로도 간주된다. DHA-LPC는 10-50 microM 농도에서 HUVEC 관 형성을 촉진했지만 더 높은 농도(100 microM)에서는 관 형성을 억제했으며, 실험예를 통해 DHA와 EPA의 항혈관신생 역할을 확인하였다. 우리는 또한 콜레스테롤, 올레산, 팔미트산 DHA-LPC를 포함한 지질이 농도에 따라 혈관 신생 및 항혈관 신생이 될 수 있음을 보여주는 비혈관 영역뿐만 아니라 수성 혈관 영역에서 이러한 인지질 및 기타 지방산의 존재를 관찰하였다. DHA-LPC가 혈관 신생 인자로서 혈관 영역에서 불용성 지질 복합체를 가용화하는 쯔비터이온성 세제로 작용하는 것으로 분석된다.

DHA는 망막과 뇌에 고농축되어 있지만, de novo in situ로 합성되지 않고 환경에서 얻어야 한다. 난황은 탄소 저장소이자 에너지원으로 존재한다. DHA; LPC에서 DHA-LPC 전환으로의 용해도 변화는 이를 혈관 영역으로 수송하는 역할을 수행한다. DHA는 소수성 비혈관 영역에 국한된 반면 DHA-LPC는 콜린 구조의 zwitterionic 특성으로 인해 수성 혈관 영역에 더 풍부하였다. 혈관 영역과 비혈관 영역이 DHA-LPC와 DHA의 상호 전환에 의해 DHA 농도를 제어하는 것으로 확인하였다.

DHA 수치는 알츠하이머 및 파킨슨병을 포함한 세포자멸사 신경 장애에서 감소한다. DHA의 전구체인 알파-리놀렌산(ALA, 18:3 ω-3)은 신체에서 합성되지 않는다.

이와 같이, 상기 실험예에서는 혈관 신생 반응의 미세 환경을 이해하기 위해 병아리 배아의 혈관 영역, 비혈관 영역 및 알부민에서 소수성 분자를 정량분석하였다. GCMS 분석, 데이터베이스 검색 및 정량적 에세이는 니트로올레산, 팔미트산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에폭시올레산, 리소포스파티딜콜린(LPC, 18:4), 콜레스테롤, 7-케토콜레스테롤 및 도코사헥사에노일리소포스파티딜콜린을 포함하는 특정 지질을 입증하였다. DHA-LPC는 혈관 영역에 존재하는 반면 DHA와 EPA는 비혈관 환경에서 높은 농도로 존재하였다. 대사체학 도구를 사용하여 지질 조성 및 농도가 혈관신생 미세환경을 결정할 수 있음을 알 수 있으며, 이는 연령 관련 황반변성(AMD) 및 당뇨병성 망막병증(DR)을 포함한 병리학적 혈관신생을 진단하고 치료하기 위한 물질로 사용될 수 있다.

실험예 2: 융모요막을 이용한 혈관신생인자 분석 (2)

실험 방법

조류배아의 융모요막 분석모델(CAM)을 사용하여 질량 분석을 포함한 전체 대사체를 사용하여 혈관 형태와 혈관신생 분자를 조사하였다. 화이트 레그혼 (White Leghorn) 닭의 수정란은 Veterinary Research Institute Jos Nigera/Local farm USA/Korea에서 구입하여 37.5 ℃에서 1-21일 동안 연속 회전하는 실험실 인큐베이터에서 습도 62-72%로 유지하여 배양하였다. 병아리 배아를 매일(ED1-ED21) 배양하고 페트리 접시에서 분석하였다.

지질 첨가 실험을 위해 용량 의존적 효과와 시간 의존적 혈관 성장을 모두 조사하였다. 인산염 완충 식염수(PBS)/디메틸 설폭사이드(DMSO) 중 콜레스테롤(55, 110 mg) 또는 올레산(45, 200 mg)을 마이크로주사기(200 microL, Hamilton Company, Bonaduz, 스위스) 집게로 만든 구멍(0.2 mm 직경)을 통해 주입하였다. 용매 독성은 음성 대조군에 의해 검증되었다(용매만 주입). 지질 첨가 후, 병아리 배아를 3M 투명 스카치 테이프로 밀봉하고 1-4일 동안 추가 인큐베이션한 후 수확 및 대사체 분석을 수행하였다.

병아리 배아에서 지질 추출은 병아리 배아의 혈관 부위, 혈관생성 시작 부위 및 비혈관 부위에서 각 시료 1 g을 채취하고 유기용매(메탄올 2 ml, 물 또는 인산완충식염수 4 ml, 클로로포름 8 ml)를 사용하여 추출하였다. 용액이 균질해질 때까지 와류를 사용하여 추출물을 혼합하였다. 혼합물 샘플은 원심분리하였다(5분 동안 3500 x g). 하층을 바이알에 수집하고 실온(27±3 ℃)에서 질소가스를 사용하여 증발 건조시키고, 이어서 샘플을 헥산에 용해시키고 생화학적 분석에 사용하였다.

가스크로마토그래피에 의한 질량 분석은 질량 분석기(Agilent 5975C)를 사용하였고 자동 시료 주입기(Agilent 7683B)가 장착된 Agilent 가스 크로마토그래피(Agilent 7890A)를 사용하여 수행되었다. 시료(2 μl)는 자동 시료 주입기에 의해 1:1의 분할 비율을 사용하여 주입구에 주입되었다. 온도 제한이 325 ℃인 모세관 컬럼(DB-5MS 30 m x 0.322 mm x 0.25 μm)을 사용하고 온도 프로그래밍을 60 ℃에서 280 ℃까지 10 ℃/min씩 계속 승온시켰다. 시료는 21분 동안 컬럼을 통과하였으며 총 35분동안 분석되었다. 순도 99.99%의 헬륨 가스를 5.154 psi의 압력에서 1.1 ml/min의 유속으로 운반 가스로 사용했다. 마지막으로 미국국립표준기술원(NIST 2014, NIST 2011) 데이터베이스의 질량 스펙트럼 해석을 통해 시료의 분자구조를 확인하였다.

질량 스펙트럼의 새로운 분자는 가스 크로마토그래피 질량분석기의 데이터베이스에 저장된 알려진 화합물과 비교하였다. NIST 데이터베이스에 의해 확인된 지질분자의 재확인을 위해 대사체 데이터베이스 (http://www.hmdb.ca/spectra/ms/search)를 수동으로 검색하여 질량 대 전하 비율, 단편화 패턴 및 상대적 존재비에 따라 지질을 확인했다.

혈관 형태는 이미지제이 (ImageJ) 소프트웨어에 연결된 혈관신생 분석 매크로 소프트웨어를 포함하는 생물정보학 도구에 의해 21개의 혈관신생 매개변수를 사용하여 정량적으로 분석하였다. 각 이미지는 16비트 이미지로 변환되었고 휴백(HUVEC) 위상차와 편광(Fluorescent) 이미지는 혈관 형태를 나타내도록 분석되었습니다. 다음과 같은 바이오인포매틱스 소프트웨어로 비교하여 정량분석하였다: AutoTube(https://github.com/autotubularity/autotube), AngioTool(http://angiotool.nci.nih.gov), REAVER(https://github.com/bacorliss/public_REAVER), VESSGEN 2D(https: //software.nasa.gov/software/ARC-17621-1) 및 혈관 분석(https://imagej.net/Vessel_Analysis). 신생 혈관 분석은 혈관 길이, 가지 및 사지를 포함한 혈관 형태의 변화를 보여주었다. 3개의 이웃으로 식별된 노드, 작은 가지, 두 개의 접합부와 가지로 구분된 마디와 분기점은 분기 내에서만 관련되며 마스터 분기점은 마스터 세그먼트를 구분한다. 마스터 트리는 마스터 접합 구분과 관련된 마스터 세그먼트로 구성된다.

실험 결과

혈관 영역에서 GCMS 분석을 통한 피크 확인 결과, 올레산, 리놀레산 및 콜레스테롤이 주요 혈관신생 지표 분자임을 보여주었다.

병아리 배아에 콜레스테롤과 올레산을 추가하여 기능 획득 접근법을 사용하여 잠재적인 혈관신생 분자를 조사한 경우, 음성 대조군(용매만)과 비교하여 용량 의존적 방식으로 콜레스테롤+(55 mg) 및 콜레스테롤++(110 mg)의 주사에 의해 혈관 형성이 가속화되는 것이 관찰되었다. 콜레스테롤 첨가 후 시간 의존적 혈관 성장을 확인하였으나, 콜레스테롤 주입 후 1일차는 콜레스테롤 주입 4일차에 비해 혈관 성장의 급격한 변화를 보여 초기 시점에서 콜레스테롤이 혈관 신생에 미치는 영향이 유의함을 나타낸다(p<0.001).

정량적 분석은 콜레스테롤++(110 mg)이 대조군에 비해 더 긴 혈관과 더 많은 가지를 생성할 뿐만 아니라 더 적은 콜레스테롤+(55 mg) 첨가에서도 혈관생성을 조절하는 것으로 나타났다(p 0.001). GCMS 분석은 초기 혈관 성장에 소수성 미세 환경이 필요할 수 있음을 보여주었다.

상기 실험예의 결과는 올레산, 콜레스테롤 및 리놀레산이 혈관 미세 환경을 제어하는 촉진 및 억제 신호의 적절한 균형을 위한 잠재적인 분자 결정자 및 신생혈관의 개시자로 작용할 수 있음을 나타낸다. 천연 혈관신생 인자는 당뇨망막증 및 황반변성를 비롯한 조절되지 않는 혈관신생 질환의 치료를 위한 표적이 될 수 있다.

이상에서 본 발명의 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성 요소는 변형하여 실시할 수 있다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

삭제
삭제
(a) 대상(subject)의 생물학적 시료에서 혈관신생 연관 질환과 관련된 바이오마커의 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 측정된 수준이 상기 대조군 시료에 비해 증가하면 혈관신생 연관 질환의 유병 가능성이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함하되,
상기 바이오마커는
올레산 (oleic acid), 에폭시올레산 (epoxyoleic acid), 리놀레산 (linoleic acid), 리놀렌산 (linolenic acid), 팔미트산 (palmitic acid), 스테아르산 (stearic acid), 니트로올레산 (nitro oleic acid), 니트로옥타데센산 (nitro octadecenoic acid), 콜레스테롤 (cholesterol), 7-케토콜레스테롤 (7-ketocholesterol), 리소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidyl ethanolamine, LPE), 리소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 및 도코사헥사에노일리소포스파티딜콜린 (LPC-DHA)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 제1 바이오마커; 또는
도코사헥사엔산 (Docosahexaenoic acid, DHA) 및 에이코사펜타엔산 (Eicosapentaenoic acid, EPA)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 제2 바이오마커이고,
상기 혈관신생 연관 질환은 노인황반변성(AMD), 당뇨병성 망막병증(DR) 및 미숙아 망막병증(ROP)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하며,
상기 생물학적 시료가 대상의 혈관 영역에서 유래된 경우 상기 제1 바이오마커의 수준을 비교하고, 상기 생물학적 시료가 대상의 비혈관 영역에서 유래된 경우 상기 제2 바이오마커의 수준을 비교하는
혈관신생 연관 질환 진단을 위한 정보제공 방법.
삭제
청구항 3에 있어서,
하기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나 이상을 만족하는 경우 혈관신생 연관 질환의 유병 가능성이 있는 것으로 진단하는
(1) 상기 혈관 영역에서 측정된 올레산 농도가 100 μM 이상일 경우
(2) 상기 비혈관 영역에서 측정된 DHA 농도가 100 μM 이상일 경우
(3) 상기 혈관 영역 및 비혈관 영역에서 측정된 올레산 질량농도 비율이 4.5-6.5:1일 경우
(4) 상기 혈관 영역 및 비혈관 영역에서 측정된 콜레스테롤 질량농도 비율이 3.5-5.5:1일 경우
혈관신생 연관 질환 진단을 위한 정보제공 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 바이오마커의 수준을 측정하는 단계는 GC-MS (Gas chromatography-mass spectrometry) 분석, LC-MS (Liquid chromatography-mass spectrometry) 분석, 콜레스테롤 옥시데이스(oxidase) 분석 및 리피드 패널(lipid panel) 분석으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용하는 단계인
혈관신생 연관 질환 진단을 위한 정보제공 방법.
(a) 실험 모델의 혈관 영역 또는 비혈관 영역에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 처리된 영역에서 바이오마커의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 측정된 수준을 대조군 모델과 비교하여 상기 바이오마커가 감소하였는지 여부를 확인하는 단계를 포함하되,
상기 처리된 영역이 혈관 영역일 경우 상기 수준을 측정하는 바이오마커는 올레산 (oleic acid), 에폭시올레산 (epoxyoleic acid), 리놀레산 (linoleic acid), 리놀렌산 (linolenic acid), 팔미트산 (palmitic acid), 스테아르산 (stearic acid), 니트로올레산 (nitro oleic acid), 니트로옥타데센산 (nitro octadecenoic acid), 콜레스테롤 (cholesterol), 7-케토콜레스테롤 (7-ketocholesterol), 리소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidyl ethanolamine, LPE), 리소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 및 도코사헥사에노일리소포스파티딜콜린 (LPC-DHA)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고,
상기 처리된 영역이 비혈관 영역일 경우 상기 수준을 측정하는 바이오마커는 도코사헥사엔산 (Docosahexaenoic acid, DHA) 및 에이코사펜타엔산 (Eicosapentaenoic acid, EPA)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인
노인황반변성(AMD), 당뇨병성 망막병증(DR) 및 미숙아 망막병증(ROP)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 혈관신생 연관 질환 치료용 물질의 스크리닝 방법.