WO2016175406A1 - 쇼그렌증후군 특이적 항체반응 검사를 이용한 쇼그렌증후군 진단방법 - Google Patents

쇼그렌증후군 특이적 항체반응 검사를 이용한 쇼그렌증후군 진단방법 Download PDF

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Definitions

  • the present application is a technique related to the diagnosis of Sjögren's syndrome using Sjögren's syndrome specific antibody response test.
  • Sjogren's syndrome is mainly caused by dry mouth and dry eye syndrome.
  • the autoimmune response causes salivary and lacrimal insufficiency.
  • Current diagnostic criteria for Sjogren's syndrome include: 1) salivary gland scans for dry mouth and dry eye, Schirmer test, 2) presence of anti-Ro, anti-La autoantibodies, and 3) lymphocyte deposition in salivary glands by biopsy. .
  • US Pat. No. 8,765,378 relates to a method for diagnosing Sjögren's syndrome, which discloses a method for diagnosing Sjögren's syndrome by testing antibodies to SP-I, PSP, and CA6.
  • the present application aims to explain the etiology of Sjogren's syndrome and to provide markers and uses thereof that reflect the activity of the disease.
  • the present disclosure provides a method for detecting autoantibodies to aquaporin 5 included in a sample or a method for diagnosing Sjogren's syndrome, in order to provide information for diagnosing Sjogren's syndrome.
  • the method comprises providing an aquaporin 5 antigen; Contacting the antigen with a sample to form an antigen-antibody complex by the contacting; And detecting the antigen-antibody complex, wherein the antigen-antibody complex detection results in using Sjögren's syndrome-specific antibody response diagnosed as Sjögren's syndrome when the result of the antigen-antibody complex detection is positive compared to that of the control group.
  • the present disclosure also includes an aquaporin 5 antigen and a detection antibody, wherein the detection antibody specifically binds to human IgG or IgA, and comprises a chromophore; Enzymes including alkaline phosphatase, biotin, beta-galactosidase or peroxidase; Radioactive material; Or labeled with a substance comprising color particles including colloidal gold particles or color latex particles, and provides a kit for detecting or diagnosing Sjogren's syndrome.
  • the detection antibody specifically binds to human IgG or IgA, and comprises a chromophore
  • Enzymes including alkaline phosphatase, biotin, beta-galactosidase or peroxidase
  • Radioactive material Or labeled with a substance comprising color particles including colloidal gold particles or color latex particles, and provides a kit for detecting or diagnosing Sjogren's syndrome.
  • the present invention also provides a composition for detecting Sjogren's syndrome comprising aquaporin 5 protein or a fragment thereof or a cell expressing the protein.
  • kits or compositions according to the present invention include antigen-antibody complex detection, which includes, for example, FACS (Fluorescence-activated cell sorting), cell immunostaining methods, radial immunodiffusion, immunoelectrophoresis or reverse Immunoprecipitation analysis, including Rheu electrophoresis, radioimmunoassay (RIA) or Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting
  • cell immunostaining methods radial immunodiffusion
  • immunoelectrophoresis or reverse Immunoprecipitation analysis, including Rheu electrophoresis, radioimmunoassay (RIA) or Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • the antigen-antibody complex detection herein comprises the use of a detection antibody, said detection antibody specifically binding to human IgG or IgA, said detection antibody comprising a chromophore; Enzymes including alkaline phosphatase, biotin, beta-galactosidase or peroxidase; Radioactive material; Or a substance comprising color particles comprising colloidal gold particles or color latex particles.
  • compositions or kits according to the invention the antigen may be provided in the form of aquaporin 5 full length or fragment thereof or a cell expressing said protein.
  • the sample may be whole blood, serum, plasma, tear or saliva.
  • the present application discloses methods and kits for detecting or diagnosing Sjogren's syndrome using a specific antibody response of a specimen against aquaporin 5.
  • the method or kit according to the present application can accurately and quickly diagnose Sjögren's syndrome, which is difficult to diagnose by the existing methods, and it is important to explain the etiology of the disease and to evaluate the treatment effect after the treatment by reflecting the activity of the disease. can do.
  • 1 is a cDNA vector encoding aquaporin 5 (AQP5) protein of human in accordance with an embodiment of the present invention by transduction and expression in the MDCK cell line and then reacted with the serum of the control and the patient and labeled with fluorescent 2 After staining with the primary antibody, it was observed by scanning fluorescence microscope. Serum of healthy humans was used as a control, and anti-hIgG antibody was used as a control secondary antibody.
  • AQP5 aquaporin 5
  • the present application is based on the finding that aquaporin 5 autoantibodies are specifically produced in Sjogren's syndrome patients and can be used as a major diagnostic marker reflecting disease activity.
  • the present disclosure provides a method of providing an aquaporin 5 antigen to provide information for diagnosing Sjögren's syndrome; Contacting the antigen with a sample or biological sample, thereby forming an antigen-antibody complex; And detecting the antigen-antibody complex, wherein if the detection result of the antigen-antibody complex is positive, the diagnosis is Sjögren's syndrome.
  • a method for detecting an anti-aquaporin 5 autoantibody using Sjögren's syndrome-specific antibody response It is about.
  • the present application relates to a Sjögren's syndrome diagnostic composition comprising aquaporin 5.
  • compositions according to the invention can be used for the development of Sjögren's syndrome, the progression of the disease, the diagnosis or the prognosis of the disease.
  • Sjogren's syndrome is mainly caused by dry mouth and dry eye syndrome.
  • the autoimmune response causes salivary and lacrimal insufficiency.
  • Aquaporin 5 is a water channel protein that is expressed in acinar cells and duct cells of salivary glands and lacrimal glands, and provides a path through which water molecules pass through lipid membranes.
  • the methods, compositions or kits according to the invention can be usefully used for the diagnosis of Sjögren's syndrome.
  • diagnosis refers to determining the susceptibility of an object to a particular disease or condition, that is, a test subject, determining whether an object currently has a particular disease or condition, To determine the prognosis of a subject with a disease or condition (e.g., to determine the stage of progression or to determine the responsiveness of the disease to treatment) or to therametrics (e.g., to provide information about treatment efficacy) Monitoring the status of the system.
  • Detection herein includes quantitative and / or qualitative analysis, including the detection of presence, absence, and measurement of concentration. Such methods are known in the art and those skilled in the art can select appropriate methods for the practice of the present application. There will be.
  • the method, composition, or kit according to the present invention detects autoantibodies against aquaropine 5 present in a subject or sample, and aquaporin 5 antigens functioning as antigens are known, and synthetic isolation and purification via genetic recombination methods.
  • the antigen is a sequence derived from a mammal, especially a human, for example, but not limited to (GenBank Accession NO: NM_001651.3 (mRNA); NP_001642.1 (protein)), the full length or fragment thereof May be used, including functional equivalents thereof.
  • the aquaporin 5 antigen may be provided in the form of cells expressing it, in particular such cells may in one embodiment use cells which do not express all aquaporin including aquaporin 5.
  • the plasmid expressing aquaporin 5 can be transferred to the cells and expressed and used.
  • MDCK cells as described in the Examples herein can be used, but are not limited thereto.
  • Aquaporin 5 is a transmembrane protein present in cell membranes that is difficult to maintain its conformation or folding structure when present in aqueous solutions other than lipid membranes. Detection of antibodies can be difficult.
  • the extracellular domain of aquaporin 5 is used when used in soluble form.
  • the sample or biological sample according to the present application is a sample derived from a person suspected of Sjogren's syndrome, a person suffering from Sjögren's syndrome, or a person who is being treated after diagnosis of Sjogren's syndrome.
  • Such a sample is not particularly limited as long as it can detect aquaporin 5 autoantibodies, and refers to a substance or a mixture of substances including one or more detectable components, and includes cells, tissues, or body fluids, particularly human-derived organisms, for example, Saliva, body fluids such as tears, whole blood, plasma, and serum include, but are not limited to.
  • blood in particular serum, is used.
  • the antigen-antibody complex can be detected using various known methods.
  • the antigen-antibody complex can be detected by immunoprecipitation analysis, including radioimmunofusion, immunoelectrophoresis or reverse current electrophoresis, radioimmunoassay (RIA) or Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Detection in this manner is particularly advantageous when the antigen is provided as a soluble protein, in one embodiment the extracellular domain protein portion of aquaporin 5 may be provided as an antigen.
  • an ELISA method in particular a sandwich type ELISA, is used, in which case the detection antibody described below is also used.
  • cell-based assays such as FACS (Fluorescence-activated cell sorting) assays
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting
  • cell immunostaining methods using antibodies for example immunofluorescence as described in the Examples herein. Immunofluorescence cell staining can be used.
  • the intensity of the final signal of the sample is analyzed and compared with the signal of the sample of the normal control group, and if it is higher than this, it can be diagnosed with Sjogren's syndrome or the treatment progress can be judged.
  • the antigen is labeled with a labeling substance described below or a detection antibody or secondary antibody is used.
  • Detection antibodies that can be used in the methods according to the invention specifically bind to human IgG or IgA, which can be labeled with a substance that can be detected using visual or various image detection equipment.
  • the antigen or the detection antibody according to the present invention is a peroxidase such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, beta as a marker Beta-galactosidase, urease, catalase, asparginase, ribonuclease, malate dehydrogenase, star Staphylococcal nuclease, triose phospate isomerase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucoamylase, and acetylcholine es Detects color development or light by catalyzing chemical reactions in the presence of a specific substrate, such as acetylcholine esterase It can be labeled with an enzyme capable of liberating but is not limited thereto.
  • a peroxidase such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, beta as a marker Beta-galactosidase,
  • the antigen or the detection antibody according to the present invention is Viroluminescence, Chemiluminescence, Electroluminescence, Electrochemistry and the like to emit light of a wavelength different from the light irradiated by irradiation of light and Chromophores used in photoluminescence, for example, green fluorescent proteins as proteins;
  • Organic compounds include fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, and fluorecamine. Including but not limited to.
  • the antigen or detection antibody according to the invention can be labeled with various radioisotope materials.
  • the detection of the labeling substance may be performed by a scintillation counter, for example, in the case of a radioisotope.
  • the labeling substance is a fluorescent substance, spectroscopy, a phospho-imaging device, or a fluorometer may be used. It can be performed by the same method.
  • labeled with an enzyme it can be carried out by measuring the chromogenic product exhibited by the conversion of the chromogenic substrate by the enzyme in the presence of an appropriate substrate. It can also be detected as a color comparison of the chromogenic product exhibited by the enzymatic reaction through comparison with a suitable standard or control.
  • the antigen or detection antibody according to the invention is for example a chromophore; Enzymes including alkaline phosphatase, biotin, beta-galactosidase or peroxidase; Radioactive material; Or materials including nanoparticles such as colloidal gold particles or colored latex particles, but are not limited thereto.
  • the present application also includes a solid support and a detection antibody to which the aquaporin 5 antigen is adsorbed, which is used in the method according to the above application, wherein said detection antibody specifically binds to human IgG, and said antigen or detection antibody Is a chromophore; Enzymes including alkaline phosphatase, biotin, beta-galactosidase or peroxidase; Radioactive material; Or it provides a kit for detecting or diagnosing Sjogren's syndrome which is labeled with a substance comprising nanoparticles including colloidal gold particles or colored latex particles.
  • the antigen according to the present invention may be a microwell plate such as a 96 well microwell plate, beads or particles including colloidal gold particles or colored latex particles or cellulose, nitrocellulose, polyethersulfone, polyvinylidene, And may be attached to membranes such as fluoride, nylon, charged nylon, polytetrafluoroethylene and the like.
  • a method of attaching or coating a known method may be used, and for example, reference may be made to those described in the Examples herein.
  • the method or kit according to the present invention may be used in a sandwich immunoassay such as Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), Radio Immuno Assay (RIA) and the like.
  • ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
  • RIA Radio Immuno Assay
  • This method involves adding a sample to an antigen bound to a solid substrate, for example beads, membranes, slides or microwell plates made of glass, plastic (e.g. polystyrene), polysaccharides, nylon or nitrocellulose.
  • Labeling agents capable of direct or indirect detection for example labeled with a radioactive material such as 3 H or 125 I, fluorescent material, chemiluminescent material, hapten, biotin, digoxygenin, etc.
  • Immunoassay methods also include Enzyme Immunoassay, ET Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, JM ed., Humana Press, NJ, 1984 and the like.
  • ELISA kits are substrates used for detection and secondary detection antibodies labeled with the above-mentioned substances such as reagents capable of detecting bound antibodies, such as chromophores, enzymes (eg conjugated with antibodies), and the like. And the like may further be included.
  • the methods or kits according to the present disclosure can be used in the form of an array or chip comprising a microarray.
  • Antigens can be attached to the surface of a support such as free or nitrocellulose, and array fabrication techniques are described, for example, in Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93 (20): 10614-9; Schena et al., 1995, Science 270 (5235): 467-70; And U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 or 5,631,734. Fluorescence luminosity can be used with scanning confocal microscopy, for example Affymetrix, Inc. Or Agilent Technologies, Inc.
  • the method or kit according to the present application is used in the form of a dip stick rapid kit according to the assay.
  • a dipstick a technique widely used in the field of point of care treatment (POCT), in which the antigen according to the present invention is bound to a substrate such as nitrocellulose, and when contacted with a sample such as serum, for example, When one end is immersed in the serum sample, the sample is detected by moving the substrate by capillary action and developing a color when bound to the antibody in the substrate.
  • POCT point of care treatment
  • kits herein can also be used for lateral flow analysis depending on the assay.
  • a lateral flow assay is a method of quantitatively or qualitatively measuring a specific substance, such as a specific nucleic acid or protein, included in a sample, for example, a nitrocellulose membrane in which an antigen is bound to a specific position. Development medium) to transfer the analytes by chromatography to detect specific nucleic acids or proteins in the sample by antigen antibody reaction.
  • kits of the present disclosure may also include instructions on the use of the biomarkers according to the present disclosure.
  • it may further include a reagent for detecting an antibody or a bound antibody specific for the control.
  • MDCK cells after transfection transfer using the calcium phosphate method (Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells , Korea Cell Line Bank) them in MEM (Minimum Essential) medium containing G418 (Sigma) 5% CO 2 , 37 ° Cultured under the conditions, cells that specifically express aquaporin 5 were selected.
  • Serum was obtained from two groups of patients: 1) 10 primary SS patients enrolled at the University of Ulsan Hospital Rheumatology Clinic who were diagnosed as primary SS patients according to the 2002 American European Consensus Group (AECG) classification criteria; 2) 102 primary patients enrolled in the Sjogren's Syndrome Cohort Development and Theragnosis Development Project, diagnosed according to AECG and American College of Rheumatology (ACR). Serum was collected before the start of treatment.
  • AECG American European Consensus Group
  • MDCK-AQP5 cells prepared in Example 1 were incubated on the coverslip.
  • the MDCK-AQP5 cells were then stimulated with 400 ⁇ M cAMP (Sigma) for 24 hours to induce AQP5 to migrate from the cytoplasm to the cell membrane.
  • the cultured cells were then fixed with 4% paraformaldehyde for 0.5 hours, and sodium citrate buffer (10 mM Sodium citrate, 0.05% Tween-20, pH 6.0) was used for antigen retrieval. Added and heated at 105 degrees for 20 minutes.
  • Primary antibodies include 1: 100 diluted goat-derived AQP5-specific antibody (Santa Cruz, USA), and 1: 200 diluted patients (according to the American and European Rheumatology Association), salivary gland scan, Schimer's test, anti-Ro / anti-La autoantibodies, diagnosed by biopsy) or serum from normal controls were used together. As a total sample, 35 control serum and 100 patient serum were analyzed. Subsequently, the primary antibody which did not bind in the cells cultured with the primary antibody was washed three times with PBS.
  • donkey anti-goat IgG antibody (Santa Cruz) bound with Alexa Fluor 488 and anti-human IgG antibody (Sigma) bound with CF-594 were added and incubated at room temperature for 2 hours.
  • the secondary antibody was washed three times with distilled water. Cells were observed by scanning fluorescence microscope (Carl Zeiss, 400 times).
  • AQP5 specific antibody staining shows that AQP5 is mainly located in the cell membrane and expressed in some cytoplasms.
  • control serum did not stain MDCK-AQP5 cells, whereas the serum with anti-AQP5 autoantibodies in Sjogren's serum only stained MDCK cells expressing AQP5 and the staining signal overlapped well with the signal generated by the AQP5-specific antibody. Able to know.
  • Table 1 shows the detection frequency of anti-aquaporin 5 autoantibodies in the control group and Sjogren's syndrome patients, and the detection frequency is expressed as the number of cases (%).
  • the autoantibody AQP5 marker according to the present application was compared with the anti-Ro and anti-La IgG markers previously used as diagnostic markers of Sjogren's syndrome based on the saliva secretion of patients.
  • anti-AQP5 detection was performed as described in Example 3.
  • anti-Ro and anti-La IgG were detected using an ELISA kit (Abcam, USA). The results are shown in Table 2. As described herein, it was confirmed that the patients with anti-AQ5IgG or IgA had significantly lower non-irritant saliva secretion rate compared to patients without autoantibodies against AQ5.
  • anti-Ro and anti-La IgG which is used as a diagnostic marker for Sjogren, were known to be irrelevant to saliva secretion rate as previously known.
  • a is ANOVA
  • b Mann-Whitney U test
  • CI confidence interval
  • p value less than 0.05 was determined to be significant.

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Abstract

본원은 아쿠아포린 5에 대한 검체의 특이적 반응을 이용하여 쇼그렌증후군을 검출 또는 진단하는 방법 및 키트를 개시한다. 본원에 따른 방법 또는 키트는 기존의 방법으로는 진단이 어려운 쇼그렌증후군을 정확하고 신속하게 진단할 수 있다.

Description

쇼그렌증후군 특이적 항체반응 검사를 이용한 쇼그렌증후군 진단방법
본원은 쇼그렌증후군 특이적 항체반응 검사를 이용한 쇼그렌증후군의 진단과 관련된 기술이다.
쇼그렌증후군은 입마름증과 안구건조증을 주 증상으로 하는 질병으로 자가면역반응에 의해 침샘과 눈물샘의 기능저하가 발생한다. 현재 쇼그렌증후군의 진단기준은 1) 입마름증과 안구건조증 측정을 위한 침샘스캔, Schirmer test, 2) 항-Ro, 항-La 자가항체 유무 및 3) 조직 검사에 의한 침샘 내 림프구 침착을 포함한다.
미국특허 제8,765,378호는 쇼그렌증후군의 진단방법에 관한 것으로, SP-I, PSP, 및 CA6에 대한 항체의 검사를 통해 쇼그렌증후군을 진단하는 방법을 개시하고 있다.
그러나 이러한 진단기준 중 침샘과 눈물샘 기능저하의 원인을 설명하고 질병활성도와 연관된 진단지표가 없는 것이 실정이며, 기타 진단지표에 대한 생물학적 마커의 개발이 필요한 실정이다.
본원에서는 쇼그렌증후군의 병인을 설명하고 질병의 활성을 반영하는 마커 및 그 용도를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 쇼그렌증후군을 진단하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 검체에 포함된 아쿠아포린 5에 대한 자가항체를 검출하는 방법 또는 쇼그렌증후군 진단 방법을 제공한다.
일 구현 예에서 상기 방법은 아쿠아포린 5 항원을 제공하는 단계; 상기 항원을 검체와 접촉하는 단계로 상기 접촉에 의해 항원-항체 복합체가 형성되고; 그리고 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 항원-항체 복합체 검출결과가 대조군의 결과와 비교하여 양성인 경우 쇼그렌증후군으로 진단하는 쇼그렌증후군 특이적 항체 반응을 이용하는 것이다.
다른 양태에서 본원은 또한 아쿠아포린 5 항원 및 검출항체를 포함하며, 상기 검출 항체는 인간 IgG 또는 IgA에 특이적으로 결합하고, 발색단; 알칼라인 포스파타제, 바이오틴, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 포함하는 효소; 방사선물질; 또는 콜로이드성 금입자 또는 칼라 라텍스입자를 포함하는 칼라 입자를 포함하는 물질로 표지된 것인, 쇼그렌증후군 검출 또는 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 아쿠아포린 5 단백질 또는 그 단편 또는 상기 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 쇼그렌증후군 검출용 조성물을 제공한다.
본원에 따른 방법, 키트 또는 조성물은 항원-항체 복합체 검출을 포함하며, 이는 예를 들면 FACS ((Fluorescence-activated cell sorting), 세포면역염색방법, 방사상 면역확산 (Radial Immunodiffusion), 면역전기영동 또는 역전류 전기영동을 포함하는 면역침전분석, RIA (Radioimmunoassay) 또는 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)로 수행될 수 있다.
일 구현예에서 본원의 항원-항체 복합체 검출은 검출 항체의 사용을 포함하며, 상기 검출 항체는 인간 IgG 또는 IgA에 특이적으로 결합하며, 상기 검출 항체는 발색단; 알칼라인 포스파타제, 바이오틴, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 포함하는 효소; 방사선물질; 또는 콜로이드성 금입자 또는 칼라 라텍스입자를 포함하는 칼라 입자를 포함하는 물질로 표지된 것인, 방법.
본원에 따른 방법, 조성물 또는 키트에서 항원은 아쿠아포린 5 전장 또는 그 단편 또는 상기 단백질을 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다.
본원에 사용되는 검체는 전혈, 혈청, 혈장, 눈물 또는 타액일 수 있다.
본원은 아쿠아포린 5에 대한 검체의 특이적 항체 반응을 이용하여 쇼그렌증후군을 검출 또는 진단하는 방법 및 키트를 개시한다. 본원에 따른 방법 또는 키트는 기존의 방법으로는 진단이 어려운 쇼그렌증후군을 정확하고 신속하게 진단할 수 있음은 물론, 질병의 병인을 설명하고 질병의 활성을 반영하여 치료 후 치료효과를 평가하는데 중요한 기능을 할 수 있다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따라 사람의 아쿠아포린 5 (AQP5) 단백질을 코딩하는 cDNA 벡터를 MDCK 세포주에 전달이입하여 발현 시킨 후 대조군 및 환자의 혈청과 반응시킨 후 이를 형광물질로 표지된 2차 항체를 이용하여 염색한 후 주사형광현미경으로 관찰한 결과이다. 대조군으로는 건강한 사람의 혈청을 사용하였으며, 대조군 2차 항체로는 항-hIgG 항체를 사용하였다.
본원은 쇼그렌증후군 환자에서 아쿠아포린 5 자가항체가 특이적으로 생성되고, 질병활성을 반영하는 주요한 진단마커로 활용될 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
따라서 한 양태에서 본원은 쇼그렌증후군을 진단하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 아쿠아포린 5 항원을 제공하는 단계; 상기 항원을 검체 또는 생물학적 시료와 접촉하는 단계로 상기 접촉에 의해 항원-항체 복합체가 형성되고; 및 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 검출결과 항원-항체 복합체 검출결과가 양성인 경우 쇼그렌증후군으로 진단하는, 쇼그렌증후군 특이적 항체 반응을 이용한 항-아쿠아포린 5 자가항체의 검출방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서 본원은 아쿠아포린 5를 포함하는 쇼그렌증후군 진단용 조성물에 관한 것이다.
본원에 따른 방법 또는 조성물은 쇼그렌증후군의 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.
쇼그렌증후군은 입마름증과 안구건조증을 주 증상으로 하는 질병으로 자가면역반응에 의해 침샘과 눈물샘의 기능저하가 발생한다. 아쿠아포린 5는 침샘과 눈물샘의 선세포(acinar cell) 및 도관세포(duct cell)에 발현하는 물통로단백질로 물분자가 지질성분인 세포막을 통과하는 통로를 제공한다.
본원에 따른 방법, 조성물 또는 키트는 쇼그렌증후군의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 진행 단계 결정 또는 치료에 대한 질환의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 농도 측정을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본원에 따른 방법, 조성물 또는 키트는 대상체 또는 검체에 존재하는 아쿠아로핀 5에 대한 자가항체를 검출하는 것으로, 항원으로 기능하는 아쿠아포린 5 항원은 공지된 것으로, 유전자 재조합 방법을 통해 합성 분리 및 정제될 수 있으며 예를 들면 상기 항원은 포유류, 특히 인간 유래의 서열로 예를 들면 (GenBank Accession NO: NM_001651.3 (mRNA); NP_001642.1 (단백질)) 이로 한정하는 것은 아니며, 이의 전장 또는 단편이 사용될 수 있으며, 이의 기능적 동등체를 포함하는 것이다.
본원에 따른 일 구현예에서 특히 아쿠아포린 5 항원은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있으며, 특히 이러한 세포는 일 구현예에서 아쿠아포린 5를 포함 모든 아쿠아포린을 발현하지 않는 세포가 사용될 수 있다. 아쿠아포린 5를 발현하지 않는 세포의 경우 아쿠아포린 5를 발현하는 플라스미드를 해당 세포에 전달이입하여, 이를 발현시켜 사용할 수 있다. 예를 들면 본원 실시예에 기재된 것과 같은 MDCK 세포가 사용될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 아쿠아포린 5는 세포막에 존재하는 막관통단백질(transmembrane protein)로 지질막이 아닌 수용액에 존재할 때는 본래의 구조(conformation or folding structure)를 유지하기가 어려워 실제로 침샘이나 눈물샘에 발현하는 아쿠아포린 5에 결합하는 항체의 검출이 어려울 수 있다.
다른 구현예에서 가용성(soluble) 형태로 사용되는 경우에는 아쿠아포린 5의 세포외영역이 사용된다.
본원에 따른 검체 또는 생물학적 시료는 쇼그렌증후군이 의심되는 사람 또는 쇼그렌증후군에 걸린 사람 또는 쇼그렌증후근으로 진단 후 치료를 받고 있는 사람 유래의 검체이다.
이러한 검체는 아쿠아포린 5 자가항체를 검출 할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 타액, 눈물과 같은 체액, 전혈, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현 예에서는 혈액, 특히 혈청이 사용된다.
본원에 따른 방법에서 항원-항체 복합체는 공지된 다양한 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들면 항원-항체 복합체는 방사상 면역확산 (Radial Immunodiffusion), 면역전기영동 또는 역전류 전기영동을 포함하는 면역 침전분석 , RIA (Radioimmunoassay) 또는 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)로 검출될 수 있다. 이런 방식의 검출은 특히 항원이 가용성 단백질로 제공되는 경우에 유리하며, 일 구현예에서는 아쿠아포린 5의 세포외영역 단백질 부분이 항원으로 제공될 수 있다. 본원에 따른 일구현예에서는 ELISA 방법, 특히 샌드위치 방식의 ELISA가 사용되며, 이 경우 후술하는 검출항체가 또한 사용된다.
다른 구현예에서 항원이 세포의 형태로 제공되는 경우에는 세포기반 분석 방법 예를 들면 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 분석법, 항체를 이용한 세포면역염색방법 예를 들면 본원 실시예에 기재된 바와 같은 면역형광세포염색(immunofluorescence cell staining)이 사용될 수 있다.
항원-항체 복합체 검출 과정을 통해 검체의 최종적인 시그널의 세기를 분석하고 이를 정상 대조군의 시료의 시그널과 비교하여, 이 보다 높은 경우 쇼그렌증후군으로 진단하거나, 치료 경과에 대한 판단을 할 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서, 항원-항체 복합체의 검출을 위해, 항원이 후술하는 표지물질로 표지되거나 또는 검출항체 또는 2차 항체가 사용된다.
본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 검출 항체는 인간 IgG 또는 IgA에 특이적으로 결합하며, 상기 검출항체는 시각적 또는 다양한 이미지 검출 장비를 이용하여 검출할 수 있는 물질로 표지될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 항원 또는 검출항체는 표지물질로서 호스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase), 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 유레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 아스파르기나아제(asparginase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 말레이트 데하이드로지나아제(malate dehydrogenase), 스타필로코칼 뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 트리오스 포스페이트 이소머라아제(triose phospate isomerase), 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로지나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 그리고 아세틸콜린 에스터라아제(acetylcholine esterase)와 같이 특정 기질(substrate)의 존재하에서 화학반응을 촉매하여 검출가능한 발색반응 또는 광을 방출할 수 있는 효소로 표지될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 본원에 따른 항원 또는 검출항체는 광의 조사에 의해 조사된 광과 상이한 파장의 광을 방출하는 바이로루미네슨스, 케미루미네슨스, 일렉트로루미네슨스, 일렉트로케미루미네슨스 및 포토루미네슨스에 사용되는 발색단으로 예를 들면 단백질로서 그린형광단백질; 유기화합물로서 플루오르세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 파이코에리쓰린(phycoerythrin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin), 그리고 플루오르카민(fluorecamine)을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에서, 본원에 따른 항원 또는 검출항체는 다양한 방사선 동위원소 물질로 표지될 수 있다.
본원에서 표지물질의 검출은 예를 들어 방사선동위원소인 경우 신틸레이션 카운터(scintillation counter)에 의해 수행할 수 있으며, 예를 들어 표지물질이 형광물질인 경우, 스펙트로스코피, 포스포이미징 장치 또는 형광계측기 등과 같은 방법에 의해 수행할 수 있다. 효소로 표지된 경우, 적절한 기질의 존재하에서 효소에 의한 발색성 기질의 변환에 의해 나타나는 발색 산물을 계측을 함으로써 수행할 수 있다. 또한, 적당한 표준 혹은 대조군과의 비교를 통해 효소반응에 의해 나타나는 발색 산물의 색 비교로서 탐지할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 항원 또는 검출항체는 예를 들면 발색단; 알칼라인 포스파타제, 바이오틴, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 포함하는 효소; 방사선물질; 또는 콜로이드성 금입자 또는 착색 라텍스입자 등과 같은 나노입자를 포함하는 물질을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 또한 상기한 본원에 따른 방법에 사용되는, 아쿠아포린 5 항원이 흡착된 고상지지체 및 검출항체를 포함하며, 상기 검출 항체는 인간 IgG에 특이적으로 결합하고, 상기 항원 또는 검출 항체는 발색단; 알칼라인 포스파타제, 바이오틴, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 포함하는 효소; 방사선물질; 또는 콜로이드성 금입자 또는 착색 라텍스입자를 포함하는 나노입자를 포함하는 물질로 표지되는 것인 쇼그렌증후군 검출 또는 진단용 키트를 제공한다.
본원에 따른 키트에 포함되는 구성 중 상술한 바와 중복되는 것은 위의 기재를 참고할 수 있다.
본원에 따른 키트에서 본원에 따른 항원은 96웰 마이크로웰플레이트와 같은 마이크로웰플레이트, 콜로이드성 금입자 또는 착색 라텍스 입자를 포함하는 비드 또는 입자 또는 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리딘, 플루오라이드, 나일론, 하전나일론 및 폴리테트라플루오로에틸렌 등과 같은 멤브레인에 부착될 수 있다. 부착 또는 코팅하는 방법은 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 것을 참고할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법 또는 키트는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석방식으로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 멤브레인, 슬라이드 또는 마이크로웰플레이트에 결합된 항원에 검체를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 상술한 바와 같은 3H 또는 125I와 같은 방사성 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다. 또한 면역분석 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 등과 같은 상술한 물질로 표지된 2차 검출항체 및 검출에 사용되는 기질 등을 추가로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 따른 방법 또는 키트는 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 사용될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 지지체의 표면에 항원이 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.
또한 본원에 따른 방법 또는 키트는 분석양태에 따라 딥스틱 래피드(dip stick rapid kit) 형태로 사용된다. 딥스틱의 경우, POCT (Point of Care Treatment) 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 항원이 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 혈청과 같은 시료와 접촉시 예를 들면 딥스틱의 일 말단을 혈청시료에 담그면, 시료가 모세관 현상에 의해 기질을 이동하여, 기질 중의 항체와 결합시 발색하는 방식으로, 검출하는 것이다.
또한 본원의 키트는 분석양태에 따라 측방유동분석에 사용될 수 있다. 측방유동 분석(lateral flow assay)은 검체에 포함된 특정 물질, 예를 들면 특정 핵산 또는 단백질을 정량 또는 정성적으로 측정하는 방법으로, 예를 들면 항원이 특정 위치에 결합되어 있는 나이트로셀룰로스 멤브레인(전개용 매질)을 이용하여 크로마토그래피 방법으로 분석물을 이동시켜 항원 항체 반응을 통해 시료 중의 특정 핵산 또는 단백질을 검출하는 방법이다.
또한 본원의 키트는 본원에 따른 바이오 마커의 사용법에 관한 안내서를 포함할 수 있다. 또한 대조군에 특이적인 항체 또는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약 등을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 아쿠아포린 5 (AQP5)를 과발현하는 MDCK 세포주 (MDCK-AQP5) 제조
AQP5를 코딩하는 cDNA (GenBank No: NM_001651)를 수득한 후 (서울대학교 치의학대학원 박경표 교수), 이를 pcDNA3.1 벡터 (Invitrogen, USA)에 클로닝하여 pcDNA3.1-AQP5 플라즈미드를 수득하였다.
이어 이를 MDCK 세포 (Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells, 한국세포주은행)에 칼슘포스페이트 방법을 이용하여 전달이입 한 후 이를 G418(Sigma)을 함유하는 MEM (Minimum Essential) 배지에서 5% CO2, 37도의 조건에서 배양하여 아쿠아포린 5를 특이적으로 발현하는 세포를 선별하였다.
실시예 2 환자 혈청 시료 수득
본 연구는 헬싱키선언에 부합하는 것으로 서울대학교병원 의학연구윤리심의위원회, 서울대학교치과병원 의학연구윤리심의위원회 및 서울성모병원 의학연구윤리심의위원회의 승인을 받았다. 혈청은 두 그룹의 환자로부터 수득하였다.:1) 울대학교 병원 류마티스 클리닉에 등록을 한 10명의 일차 SS 환자로 이들은 2002년 미국유럽 컨센서스 그룹 (AECG) 분류기준에 따라 일차 SS 환자로 진단되었으며,; 2) 대한민국 쇼그렌 증후군 코호트 구축과 테라그노시스 개발사업에 등록한 환자로 AECG 및 ACR (American College of Rheumatology)에 기준에 따라 진단된 102 명의 일차 환자. 혈청은 치료 시작 전에 수집하였다. 나아가 비자극 및 자극타액분비 왁스 검 (GC America Inc. USA)을 이용한 스피팅 및 저작 자극법에 따라 측정하였다 (Navazesh M et al., J Dent Res.1982;61:1158-62). 모든 환자는 21세부터 80세의 여성 (mean age 52.5±10.7 년)이다. 대조군 혈청은 SS 증상을 전혀 나타내지 않는 건강한 여성환자의 시료를 사용하였다. 고혈압이외에 전신 질환을 갖는 환자는 제외하였다. 모든 환자로부터 고지된 동의를 받았다.
실시예 3 본원에 따른 마커의 검출을 위한 면역형광염색
실시예 1에서 준비한 MDCK-AQP5 세포를 커버슬립 위에 배양하였다. 이어 상기 MDCK-AQP5 세포를 400 μM cAMP (Sigma)로 24시간 자극하여 AQP5가 세포질에서 세포막으로 이동하도록 유도하였다.
이어 배양한 세포를 4% 파라포름알데하이드로 0.5 시간 동안 고정하고, 상기 고정된 세포에서 항원복구 (antigen retrieval)를 위해 소디움사이트레이트 완충액 (10 mM Sodium citrate, 0.05% Tween-20, pH 6.0)를 첨가해 105도에서 20분간 가열하였다.
이어 상기 세포에 일차항체를 첨가해 밤새 4도에서 배양하였다. 일차항체로는 1:100으로 희석한 염소 유래 AQP5-특이 항체 (Santa Cruz, USA), 그리고 1:200으로 희석한 환자 (미국 및 유럽 류마티스 학회 기준에 따라 침샘스캔, Schimer's test, anti-Ro/anti-La 자가항체, 조직검사를 통해 진단) 또는 정상 대조군의 혈청을 함께 사용하였다. 총 검체로 대조군 혈청 35개와 환자 혈청 100개를 분석하였다. 이어 일차항체와 배양한 세포에서 결합하지 않은 일차항체를 PBS로 3회 세척하였다. 이어 2차항체로 Alexa Fluor 488이 결합된 donkey anti-goat IgG 항체 (Santa Cruz)와 CF-594가 결합된 anti-인간 IgG 항체 (Sigma)를 첨가해 상온에서 두 시간 배양한 후 결합하지 않은 2차항체를 증류수로 3회 세척하였다. 세포는 주사형광현미경(Carl Zeiss, 400배)으로 관찰하였다.
결과는 도 1에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 AQP5 특이 항체 염색결과 AQP5가 주로 세포막에 위치해 있고 일부 세포질에도 발현되어 있는 것을 잘 보여준다. 또한 대조군 혈청은 MDCK-AQP5 세포를 염색하지 못하는 반면 쇼그렌환자 혈청 중 항-AQP5 자가항체가 존재하는 혈청은 AQP5를 발현하는 MDCK 세포만 염색하며 염색 시그날이 AQP5-특이 항체에 의한 시그날과 잘 겹치는 것을 알 수 있다.
또한 대조군 혈청 35개와 환자 혈청 100개를 검색했을 때 기준점 설정에 따라 다음 표 1과 같은 검출 결과를 얻었다. 표 1은 대조군과 쇼그렌증후군 환자에서 항-아쿠아포린5 자가항체 검출빈도이고, 검출빈도는 증례수 (%)로 표시하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2015011741-appb-I000001
실시예 4 AQP5 마커의 기존 anti-Ro 및 anti-La IgG 마커대비 쇼그렌 증후군과의 연관성에 대한 판단
본원에 따른 자가 항체 AQP5 마커를 기존에 쇼그렌 증후군 진단마커로 사용되는 anti-Ro 및 anti-La IgG 마커와 환자의 타액분비 여부를 기준으로 비교하였다.
anti-AQP5 검출은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행되었다. anti-Ro 및 anti-La IgG 은 ELISA 키트 (Abcam, USA)를 사용하여 검출하였다. 결과는 표 2에 기재되어 있다. 이에 기재된 바와 같이 항-AQ5IgG 또는 IgA 가 있는 환자의 경우, AQ5에 대한 자가 항체가 없는 환자와 비교하여 비자극성 타액분비율이 유의하게 낮음을 확인하였다. 반면 기존 쇼그렌 진단 마커로 사용되는 anti-Ro, anti-La IgG의 경우 기존에 알려진 바와 같이 타액 분비율과 무관한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본원에 따른 AQP5에 대한 자가 항체가 쇼그렌 증후군 환자에서 분비 기능장애에 관여할 가능성이 높으며, 질병 활성을 반영하는 마커로서 유용함을 나타내는 것이다.
[표 2]
Figure PCTKR2015011741-appb-I000002
표 2에서 a는 ANOVA, b는 Mann-Whitney U test로 분석한 결과이고, CI는 신뢰구간이고, 0.05 보다 작은 p값을 유의한 것으로 판단하였다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (11)

  1. 쇼그렌증후군을 진단하기 위한 정보를 제공하기 위하여,
    아쿠아포린 5 항원을 제공하는 단계;
    상기 항원을 검체와 접촉하는 단계로 상기 접촉에 의해 항원-항체 복합체가 형성되고; 그리고
    상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하며,
    상기 항원-항체 복합체 검출결과가 대조군의 결과와 비교하여 양성인 경우 쇼그렌증후군으로 진단하는, 쇼그렌증후군 특이적 항체 반응을 이용한 항-아쿠아포린 5 자가항체의 검출방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 검체는 전혈, 혈청, 혈장, 눈물 또는 타액인, 방법.
  3. 제 1 항에서 있어서, 상기 항원은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되는 것인, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체 검출은 FACS ((Fluorescence-activated cell sorting), 세포면역염색방법, 방사상 면역확산 (Radial Immunodiffusion), 면역전기영동 또는 역전류 전기영동을 포함하는 면역침전분석, RIA (Radioimmunoassay) 또는 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)로 수행되는 것인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원-항체 복합체 검출은 검출 항체의 사용을 포함하며, 상기 검출 항체는 인간 IgG 또는 IgA에 특이적으로 결합하며, 상기 검출 항체는 발색단; 알칼라인 포스파타제, 바이오틴, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 포함하는 효소; 방사선물질; 또는 콜로이드성 금입자 또는 칼라 라텍스입자를 포함하는 칼라 입자를 포함하는 물질로 표지된 것인, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 FACS, 세포면역염색, 딥스틱, ELISA 또는 측방유동분석방법으로 수행되는 것인, 방법.
  7. 아쿠아포린 5 항원 및 검출항체를 포함하며,
    상기 검출 항체는 인간 IgG 또는 IgA에 특이적으로 결합하고, 발색단; 알칼라인 포스파타제, 바이오틴, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 포함하는 효소; 방사선물질; 또는 콜로이드성 금입자 또는 칼라 라텍스입자를 포함하는 칼라 입자를 포함하는 물질로 표지된 것인, 쇼그렌증후군 검출 또는 진단용 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 아쿠아포린 5 항원은 고상지지체에 결합된 것인, 키트.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 고상지지체는 마이크로플레이트, 마이크로어레이, 칩, 유리, 비드 또는 입자, 또는 멤브레인인, 키트.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 항원은 세포의 형태로 제공되는 것인, 키트.
  11. 아쿠아포린 5 단백질 또는 그 단편 또는 상기 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 쇼그렌증후군 검출용 조성물.
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