CN117825719A - 用于嗜酸性肉芽肿性多血管炎诊断的蛋白质组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1在制备嗜酸性肉芽肿性多血管炎检测试剂中的应用，还提供了一种嗜酸性肉芽肿性多血管炎检测试剂盒，通过检测生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1可以诊断嗜酸性肉芽肿性多血管炎。
Description
技术领域
本发明属于临床医学诊断工具领域，具体涉及SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1在制备嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)检测试剂中的应用，还涉及一种检测嗜酸性肉芽肿性多血管炎的试剂盒。
背景技术
嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)是一种可累及全身多个系统的、少见的自身免疫性疾病，主要表现为外周血及组织中嗜酸性粒细胞(EOS)增多、浸润及中小血管的坏死性肉芽肿性炎症，属于抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性系统性血管炎。本病几乎可以累及任何一个系统器官，临床表现缺乏特异性，多以哮喘及过敏性鼻炎等常见呼吸系统表现起病，无血管炎系统性表现的哮喘前驱期长，临床上难以辨识，且ANCA阳性率仅40％左右，对ANCA阴性者需要活检，但活检结果对诊断EGPA帮助并不大。因此，如何早期诊断EGPA，并将EGPA与其他嗜酸性粒细胞增多的疾病包括哮喘等区分开非常重要，因为他们的治疗方案及预后大不相同。且疾病反复复发活动导致了治疗的困难，给家庭和社会带来了沉重的经济负担，如不能早期识别疾病、正确评估活动性、及时采取治疗措施，将严重影响患者的预后。
目前，临床上常用伯明翰血管炎活动评分(BVAS)来评估EGPA的疾病活动性，但因其条目众多且主观性强，给临床医生带来了不便，极大限制了其临床应用。此外，一些传统血清学指标包括血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、IgE、以及新的生物标志物如嗜酸细胞活化趋化因子3(eotaxin-3)和骨膜蛋白(periostin)等也被用于评估疾病活动性，但是这些已报道的生物标志物的灵敏性与特异性存在局限性。因此，急需寻找可用于临床早期诊断、活动性评估和预测预后的新型生物标志物。
发明内容
本课题组通过蛋白质组学(DIA)及临床大样本验证成功筛选出EGPA患者外周血中高表达的蛋白质包括SERPINA3(丝氨酸蛋白酶抑制因子3)、FGA(纤维蛋白原Α)、AGP1(α1酸性糖蛋白1)、ITIH3(中间α-球蛋白抑制因子H3)和SAA1(血清淀粉样蛋白A1)，它们中两种以上的组合可作为EGPA诊断、评估的分子标志物或靶点，应用于EGPA的早期诊断、活动性评估，也可能作为治疗靶点而具有极大的应用前景。
基于该研究成果，本发明的第一个方面提供了蛋白质SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1在制备嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)检测试剂中的应用。
上述嗜酸性肉芽肿性多血管炎检测试剂可以包括用于检测生物样本中SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1含量的系统。
上述系统主要是指用于分别测定SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1含量所需的试剂和/或仪器。
优选地，上述系统还包括数据处理装置，用于确定生物样本中SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的含量，并将这些含量与健康个体样本中的平均水平(健康对照组)相比较来计算差值，进而确定是否符合嗜酸性肉芽肿性多血管炎标准。
在一种实施方式中，上述系统用于检测生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1蛋白质水平(含量)。
在另一种实施方式中，上述系统用于检测生物样本中SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的基因表达水平即mRNA水平。
可选地，上述基因表达水平是指mRNA水平。
上述应用中，当受测对象的生物样本中所述SERPINA3含量超过健康个体样本中平均含量80％以上、FGA含量超过健康个体样本中平均含量70％以上、AGP1含量超过健康个体样本中平均含量90％以上、ITIH3含量超过健康个体样本中平均含量30％以上、并且/或者SAA1含量超过健康个体样本中平均含量300％以上时，提示受测对象患有嗜酸性肉芽肿性多血管炎。
在一种实施方式中，当受测对象的血液样本中蛋白质SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的含量达到下述标准时，提示患有嗜酸性肉芽肿性多血管炎：SERPINA3为2973pg/ml以上，FGA为3025μg/ml以上，AGP1为251μg/ml以上，ITIH3为134μg/ml以上，SAA1为6.53μg/ml以上。
作为参考，健康个体血样中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的平均含量分别是：SERPINA3为1637.883pg/ml，FGA为1696.656μg/ml，AGP1为130.8208μg/ml，ITIH3为99.48μg/ml，SAA1为0.6385μg/ml。
为了提高诊断准确性，可以将五种蛋白质SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1中的两个以上、优选三个以上、更优选四个以上、例如五个组合起来，进行多因素综合评判。其中，上述三个以上可以是SERPINA3、FGA和AGP1三者的组合，或者是SERPINA3、FGA、AGP1和ITIH3四者的组合，或者是SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1五者的组合。
本发明的第二个方面提供了一种嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)检测试剂盒，可用于实施上述的应用，检测标靶是生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1或者它们的基因表达水平。
该EGPA检测试剂盒的检测方式可以是测定生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1蛋白质含量；或者是测定生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1基因表达水平。
优选地，EGPA检测试剂盒测定生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1蛋白质含量的方法是基于抗体-抗原亲和结合原理的测定方法，可以选自下组：放射免疫测定法(radioimmunoassay，RIA)，双抗体夹心法，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，磁微粒化学发光法，免疫层析，胶乳免疫比浊法，胶体金比色法，量子点荧光光度法(量子点发光法)，优选酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
EGPA检测试剂盒测定生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1基因表达水平的方法是通过PCR测定mRNA含量。
在一种实施方式中，所述EGPA检测试剂盒是基于抗体-抗原亲和结合原理来测定生物样本中的抗原SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1含量，包括：
(1)分别能够结合SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的抗体；以及
(2)分别由含有已知量SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的溶液组成的标准样。
这种情况下，试剂盒检测SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的方式可以为使用一种SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1抗体的胶乳免疫比浊法、或者化学发光法例如磁微粒化学发光法、或者采用放射性元素标记SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1抗体的放射免疫测定法(radioimmunoassay，RIA)。即，试剂盒可以为胶乳免疫比浊法试剂盒、化学发光法试剂盒、或者放射免疫测定法试剂盒。
在另一种实施方式中，所述EGPA检测试剂盒是测定SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1基因表达水平的试剂盒，包括：用于从生物样本中提取分离mRNA的mRNA提取分离系统；分别用于检测这些基因的PCR引物。
优选地，上述EGPA检测试剂盒还包含记载用于确定SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1表达量高/低分界标准的数学模型载体，当表达量高于所述分界标准时，提示患有嗜酸性肉芽肿性多血管炎。
当上述EGPA检测试剂盒是基于抗体-抗原亲和结合原理时，还可以进一步包括：(3)当SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1分别结合于(1)中限定的抗体时，能够分别结合于SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1的标记抗体，本文中也可以称为SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1第二抗体，该第二抗体上的标记物能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料，从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化，或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物，比如该标记物是酶(例如辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酯酶)；或者该第二抗体上的标记物就是能够被催化或者激活后显色或发光的化学发光化合物或者荧光染料，比如是吖啶酯。
即，该试剂盒包含两种不同的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1抗体(1)和抗体(3)，其中一种是分别用于捕获抗原SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的捕获抗体、也称“第一抗体”简称“一抗”，即上述(1)项中限定的抗体；另一种是分别用于检测被捕获抗原SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的检测抗体、也称“结合抗体”或“第二抗体”简称“二抗”，即上述(3)项中限定的抗体。这两种抗体先后与抗原SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1蛋白的不同抗原表位(抗原决定簇)相结合，先形成第一抗体-抗原SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1结合物，然后该第一抗体-抗原SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1结合物再与第二抗体相结合，产生第一抗体-抗原-第二抗体的“夹心”结构来实施“双抗体夹心法”检测抗原SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1蛋白。
这种情况下，上述嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)检测试剂盒为双抗体夹心法试剂盒，例如选自下组方式：A.酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒；B.磁微粒化学发光法试剂盒；C.免疫层析试纸条。
上述第一抗体和第二抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。例如上第一抗体是单克隆抗体而第二抗体是多克隆抗体。
可选地，上述SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1第一抗体可以是采用量子点或荧光微球进行标记的第一抗体，上述SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1第一抗体也可以采用胶体金进行标记。量子点(Quantum Dots)是由半导体材料如硒化镉CdSe组成的纳米颗粒，当量子点被一种普通光激发之后，可以释放出比普通荧光素强达数十倍的荧光，且有激发光谱宽、发射光谱窄的特点。发射光谱还可根据半导体材料的不同与纳米颗粒大小的不同而进行变动调节，且发射光的稳定性高，不会被淬灭。正是由于量子点荧光的这些优点，用量子点纳米颗粒标记的抗体，可比普通荧光素标记的抗体发光强度提升数百倍，从而使试剂的信号敏感度达到与化学发光的水平相当。
优选地，当上述试剂盒为ELISA试剂盒时，进一步包含：
(4)引发剂溶液，用于引发SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1第二抗体上的标记物与作为标记物反应对象的化学发光化合物或显色底物或者荧光染料之间的化学反应。
当上述试剂盒为ELISA试剂盒时，优选SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1第一抗体、或者用于固定SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1第一抗体的固相载体比如多孔板或者磁微粒上连接有化学发光化合物或荧光染料。借此，使得免疫测定方法更简单化，定量更准确。
优选地，上述任一种试剂盒中还包括使用说明书。
上述说明书可以写在瓶子、试管和类似物、板子上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频APP下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如CD、U盘、网盘等。
可选地，所述说明书还可以包括用于区分是否患有嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)的标准对照表，该标准对照表记载有区分嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)的血样中SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1浓度(即SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1血样水平)分界值。
优选地，上述生物样本可以选自下组：全血、血浆、血清、唾液、口腔黏膜、鼻咽分泌物、组织液、体液、尿液，例如是外周静脉血。
本发明首次发现五种蛋白SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1在嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)患者中高表达，有可能作为该病症的生物标志物，它们的特定组合能够显著提示该病症，因此SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的检测可用于EGPA的早期诊断和活动性评估，而且也有潜力用作治疗靶点。
附图说明
图1显示了利用数据非依赖采集(Data independent acquisition，DIA)技术筛选EGPA组和健康对照(HC)组中差异表达的蛋白质的统计截屏。
图2显示了EGPA患者、其他嗜酸性粒细胞增多疾病作为疾病对照(DC)组以及健康对照(HC)的外周血中五种蛋白质SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1含量的统计曲线。
图3显示了五种蛋白质SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1水平的ROC曲线以及四者或五者组合的ROC曲线。其中，a是EGPA组相对于HC组的五种蛋白质及五者组合的ROC曲线，b是EGPA组相对于DC组的四种蛋白质SERPINA3、FGA、AGP1和ITIH3及四者组合的ROC曲线。
图4显示了EGPA患者中活动组(active EGPA)和非活动组(inactive EGPA)中三种蛋白质SERPINA3、FGA和AGP1血浆水平统计曲线。
图5显示了活动性EGPA患者组(active EGPA，BVAS评分>0分)相对于非活动性EGPA患者组(inactive EGPA，BVAS评分＝0分)中三种蛋白质SERPINA3、FGA和AGP1及三者组合的ROC曲线。
具体实施方式
本课题组在通过蛋白质组学(DIA)及临床大样本来筛选可作为EGPA的蛋白质生物标志物时，发现有24个蛋白上调，11个蛋白下调。进一步将筛选的重点集中于这24个上调表达的蛋白质上。进而从这24个蛋白质中挑选出差异最显著的5个蛋白质，它们分别是SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1。
我们还通过ROC曲线分析对于它们各个单独的显著性、它们两种以上组合的显著性进行了考察。
受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)反映了灵敏度与特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。其中灵敏度代表真阳性率：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。特异度代表真阴性率：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度为100％。
ROC曲线显示，在EGPA诊断方面，SERPINA3的效能最高，AUC为0.905；FGA的AUC为0.831；AGP1的AUC为0.873；ITIH3的AUC为0.728；SAA1的AUC为0.787。进一步根据Logistic向前逐步回归方法，将上述5个蛋白质建立组合模型并构建ROC曲线，结果表明AUC为0.953。在EGPA的鉴别诊断方面(临床大样本验证，样本包括EGPA患者和其他嗜酸性粒细胞增多疾病患者(DC))，SERPINA3的AUC为0.872；FGA的AUC为0.734；AGP1的AUC为0.699；ITIH3的AUC为0.837；进一步根据Logistic向前逐步回归方法，将上述4个蛋白建立组合模型并构建ROC曲线，结果表明AUC为0.926。
进一步分析上述5个蛋白在不同疾病活动度下的表达水平，将32例患者分为活动组和非活动组，结果表明，活动组中SERPINA3、FGA和AGP1的表达水平显著高于非活动组。ROC曲线结果表明，FGA诊断效能最高，AUC为0.826；SERPINA3的AUC为0.816；AGP1的AUC为0.787。进一步根据Logistic向前逐步回归方法，将上述3个蛋白建立组合模型并构建ROC曲线，结果表明AUC为0.918。
医学领域公知，活动性EGPA定义为BVAS评分>0分，非活动性EGPA指BVAS评分＝0分。活动组中SERPINA3、FGA和AGP1表达水平高意味着SERPINA3、FGA和AGP1水平高于某个值时可能代表疾病活动。
根据上述统计，蛋白质组合SERPINA3、FGA和AGP1三者组合物，或者SERPINA3、FGA、AGP1和ITIH3四者组合物，或者SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1五者组合物能够准确反映EGPA，联合作为EGPA生物标志物，相比单一的蛋白标志物具有更高的可信度。其中，SERPINA3、FGA和AGP1组合物不仅能作为EGPA诊断的生物标志物，还能够作为区分活动性和非活动性EGPA的生物标志物。
由于SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1具有作为嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)生物标志物的用途，本领域技术人员显然理解可以开发出多种类型的试剂盒作为EGPA辅助诊断工具。按检测目标类型可以分为蛋白质检测试剂盒和核酸(DNA或者mRNA)检测试剂盒。
本领域普通技术人员容易理解，这5种检测标靶可以分别地在单独的试剂盒中检测，即一个试剂盒检测SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1中之一；也可以在一个试剂盒中同时检测两个以上标靶，即一个试剂盒中同时检测SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1中两种以上。
对于蛋白质检测试剂盒，例如可以开发的试剂盒形式包括但不限于：仅包含一种SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1抗体(单克隆抗体或者多克隆抗体，优选单克隆抗体)的胶乳免疫比浊法试剂盒、化学发光法试剂盒例如磁微粒化学发光法试剂盒、放射免疫测定法试剂盒；包含两种不同SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1抗体(单克隆抗体和/或多克隆抗体)的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、磁微粒化学发光法试剂盒、免疫层析试纸条，等。
SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1单克隆抗体和SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1多克隆抗体可以是商业渠道购买的商品抗体，也可以采用常规的技术手段制备得到，例如分别以SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1作为抗原制备。典型地，可以通过分别使用SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1蛋白免疫动物制备单克隆抗体，步骤包括：蛋白SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1作为免疫原与等体积的弗氏完全佐剂充分混合后，免疫动物比如小鼠，皮下多点注射；数周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫多次，之后取脾细胞与骨髓瘤细胞按常规方法用PEG介导进行融合，并用HAT条件培养基选择培养；融合后放入CO2培养箱中37℃培养9～11天后，孔内出现较大的细胞克隆；11天开始用间接ELISA进行筛选；对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养使筛选后的细胞大量分裂繁殖，之后扩增细胞、冻存、制备腹水；将小鼠用降植烷处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞，10天后收集腹水。用间接ELISA方法测定利用单克隆抗体的效价，得到抗体效价符合要求的单抗；硫酸铵沉淀后，再经Protein G亲和纯化，分离纯化得到单克隆抗体，抗体分装后冻干，低温保存。
同样，可以通过使用SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1蛋白免疫动物制备多克隆抗体，步骤包括：例如选用兔子作为免疫动物；基础免疫中，将SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1蛋白作为免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射；每隔4周加强免疫一次，抗原与不完全弗氏佐剂充分乳化后于背部多点皮下注射；末次加强免疫后第10天颈动脉放血，分离血清；用间接ELISA法测定制备的多克隆抗体的效价，得到抗体效价符合要求的多抗，颈动脉插管取血，分离血清；硫酸铵沉淀后，再经Protein G亲和纯化，分离纯化得到单克隆抗体，抗体分装后冻干，低温保存。
使用SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1单克隆抗体和SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1多克隆抗体检测生物样本中抗原SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1蛋白是基于免疫学技术。临床医学领域公知免疫学技术的检测手段有多种。概括来讲，生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1水平(含量)可使用选自下组的方法测定：蛋白质印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附试验(ELISA)；放射免疫试验(RIA)；夹心试验；荧光原位杂交(FISH)；免疫组织学染色；免疫荧光试验；质谱；荧光活化细胞分选(FACS)；免疫电泳试验。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分被可检测地标记或产生可检测信号。
在一些实施方式中，抗体试剂可以是被可检测地标记。在一些实施方式中，抗体试剂可以被附接至固体支持物(例如，结合至固体支持物)。在一些实施方式中，固体支持物可包含颗粒(包括但不限于琼脂糖或乳胶珠或颗粒或磁性颗粒)、珠、纳米颗粒、聚合物、基材、载玻片、盖玻片、平板、培养皿、孔、膜和/或光栅。固体支持物可以包括许多不同的材料，包括但不限于聚合物、塑料、树脂、多糖、基于硅或二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃和膜。
在一个实施方式中，如本文所述的试验、方法和/或系统可包括ELISA。在示例性实施方式中，第一抗体试剂可以被固定在固体支持物(通常是聚苯乙烯微量滴定板)上。固体支持物可以与从对象获得的样品接触，并且抗体试剂将结合(“捕获”)其特异性的抗原(SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1)。然后可以使固体支持物与第二标记的抗体试剂(例如，检测抗体试剂)接触。检测抗体试剂可以，例如，包含可检测的信号、共价连接至酶、或自身可以通过生物偶联被连接至酶的二抗检测。信号的存在表明固定在支持物上的第一抗体试剂和第二“检测”抗体试剂都结合至抗原，即信号的存在表明SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1分子的存在。在每个步骤之间，通常用温和的清洁剂溶液清洗板，以去除任何未特异性结合的蛋白质或抗体。在最后的洗涤步骤之后，通过添加酶底物使板显色以产生可见信号，该信号指示样品中SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1的含量。较旧的ELISA使用显色底物，但较新的试验使用具有更高灵敏度的荧光底物。还有其他不同形式的ELISA，这是本领域技术人员众所周知的。
在一个实施方式中，本文所述的试验、系统和方法可以包括横向流动免疫测定测试(LFIA)，也称为免疫层析试验，或条样测试，以测量或确定样品中SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1的水平。LFIA是一种简单的设备，旨在检测样品中SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1的存在(或不存在)。目前有许多LFIA测试用于医疗诊断或用于家庭测试、护理点测试或实验室使用。LFIA测试是免疫测定的一种形式，其中测试样品通过毛细管作用沿着固体基质流动。样品被施加到测试条上之后，它遇到与样品混合的有色抗体试剂，并且如果结合到样品的一部分，就会在基材上经过已经用第二抗体试剂预处理的线或区域。根据样品中存在的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1的水平，有色抗体试剂可能会结合至测试线或区域。LFIA本质上是免疫测定，适用于沿单轴操作以适应测试条格式或试纸格式。条样测试用途广泛，本领域技术人员可以轻松修改，以检测来自流体样品(例如尿液、血液、水样等)的大量抗原。条样测试也称为浸条测试(dip stick test)，名称来自将测试条“浸入”待测流体样品的字面动作。LFIA条样测试易于使用，需要最少的培训，并且可以很容易地作为护理点测试(POCT)诊断的组成部分在现场使用。LFIA测试可以作为竞争性或夹心试验进行操作。夹心LFIA类似于夹心ELISA。样品首先遇到用对靶标具有特异性的抗体试剂(例如，SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3或SAA1特异性抗体试剂)标记的有色颗粒。测试线还将包含抗体试剂(例如，SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1特异性抗体试剂)。测试线将在阳性样品中显示为有色条带。在一些实施方式中，横向流动免疫测定可以是双抗体夹心试验、竞争试验、定量试验或其变体。横向流动技术有许多变体。还可以应用多个捕获区域来创建多重测试。
典型的测试条由以下部分组成：(1)样品施加区域，包括吸收垫(即基质或材料)，测试样品施加在该吸收垫上；(2)偶联物或试剂垫-它包含一种或多种对靶标特异性的抗体试剂，其可偶联至有色颗粒(通常是胶体金颗粒或乳胶微球)；(3)包含反应膜的测试结果区-通常是抗体试剂固定于其上的疏水性硝化纤维素或醋酸纤维素膜，作为捕获区或测试线(也可能存在对照区，其包含对于偶联至颗粒或微球的抗体试剂特异性的抗体)；和(4)可选的芯吸或废液储器-另一个吸收垫，设计为通过毛细作用将样品吸过反应膜并收集它。条的组件通常固定至惰性背衬材料上，可以以简单的浸条形式或在塑料外壳内提供，带有样品端口和反应窗口，显示捕获区和对照区。虽然不是绝对必要的，但大多数测试都会包含第二行，其包含可以吸收游离的乳胶/金的抗体，以确认测试正确地进行。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种抗体试剂可包含可检测标记和/或包含产生可检测信号的能力(例如，通过催化将化合物转化为可检测产物的反应)。可检测标记可包括例如吸光染料、荧光染料或放射性标记。可检测标记、检测它们的方法和将它们纳入抗体试剂的方法是本领域众所周知的。
在一些实施方式中，可检测标记可包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学或化学手段(例如荧光、化学荧光或化学发光，或任何其他适当手段)检测的标记。本文所述方法中使用的可检测标记可以是一级标记(其中标记包含可直接检测的部分或产生可直接检测部分的部分)或二级标记(其中可检测标记结合另一部分以产生可检测信号，例如，如在使用二抗和三抗的免疫标记中很常见的)。可检测标记可以通过共价或非共价方式连接至抗体试剂。或者，可检测标记可以被连接，例如，通过直接标记经由配体-受体结合对排列实现结合至抗体试剂的分子或其他此类特异性识别分子。可检测标记可包括但不限于放射性同位素、生物发光化合物、生色团、抗体、化学发光化合物、荧光化合物、金属螯合物和酶。
在其他实施方式中，检测抗体用荧光化合物标记。当荧光标记的抗体暴露在适当波长的光下时，那么可以根据荧光检测到它的存在。在一些实施方式中，可检测标记可以是荧光染料分子或荧光团，包括但不限于荧光素、藻红蛋白、藻蓝蛋白、邻苯二醛、荧光胺、Cy3TM、Cy5TM、别藻蓝素、德克萨斯红、香槟叶绿素(peridenin chlorophyll)、花菁、串联偶联物，例如藻红蛋白-Cy5TM、绿色荧光蛋白、罗丹明、异硫氰酸荧光素(FITC)和OregonGreenTM、罗丹明及其衍生物(如德克萨斯红和四罗丹明异硫氰酸酯(TRITC))、生物素、藻红蛋白、AMCA、CyDyesTM、6-羧甲基荧光素(已知通常缩写为FAM和F)、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N’,N’-四甲基-6羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-所及-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)，和罗丹明110；花菁染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲亚胺染料，例如，Hoechst33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，如Cy3、Cy5等花菁染料；BODIPY染料和喹啉染料。
在一些实施方式中，放射免疫测定法(RIA)中可检测标记可以是放射性标记，包括但不限于3H、125I、35S、14C、32P和33P。
在一些实施方式中，可检测标记可以是酶，包括但不限于辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。酶标记可以产生例如化学发光信号、颜色信号或荧光信号。预期用于可检测地标记抗体试剂的酶包括但不限于：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
在一些实施方式中，可检测标记是化学发光标记，包括但不限于光泽精、鲁米诺、荧光素、异鲁米诺、吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
在一些实施方式中，可检测标记可以是光谱比色标记，包括但不限于胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯和乳胶)珠。
在一些实施方式中，抗体也可以用可检测标签标记，例如c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、HIS或生物素。也可以使用其他检测系统，例如生物素-链霉亲和素系统。在该系统中，与感兴趣的生物标志物具有免疫反应性(即特异性)的抗体被生物素化。使用链霉亲和素-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase)偶联物和显色底物确定结合至生物标志物的生物素化抗体的量。这种链霉亲和素-过氧化物酶检测试剂盒是可商购的。
抗体试剂也可以使用荧光发射金属如152Eu或镧系元素的其他金属进行可检测标记。这些金属可以被附接到抗体试剂上，使用例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)之类的金属螯合基团。
如本文所述的试验和方法可涉及确定对象是否具有相对于参考水平增加的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1水平。在一些实施方式中，SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的参考水平可以是未患有或未诊断为患有(嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA))的健康对象中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1水平。在一些实施方式中，参考水平可以是相似细胞类型、样品类型、样品处理的样品中的水平，和/或从与SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的数量有待确定的对象相似年龄、性别和其他人口统计学参数的对象中获得的水平。在一些实施方式中，测试样品和对照参考样品是相同类型的，即，从相同生物来源获得，并且包含相同的组合物，例如相同数量和类型的细胞和/或相同样品材料的类型。因此，在一些实施方式中，增加的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的水平可以随着人口统计因素例如年龄、性别、基因型、环境因素和个体病史的变化而变化。在一些实施方式中，参考水平可包括取自未表现出(嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA))的任何迹象或症状的对象的相同类型样品中SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的水平。在一些实施方式中，SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的参考水平可以是从对象获得的在先样品中SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的表达水平。这允许直接分析该个体的任何水平变化。
在一些实施方式中，如果SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的水平是参考水平的至少50％、例如至少1倍、至少1.5倍、至少2倍，至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或更高，则SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的水平可以是相对于参考水平增加的。在一些实施方式中，SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的表达水平可以相对于参考值被标准化。
如本文所用，术语“生物样本”、“样本”、“样品”或“测试样品”表示从生物体采集或分离的样品，例如来自对象的血样。示例性的生物样品包括但不限于：生物流体样品；血清；血浆；尿；唾液；和/或组织样品等。该术语还包括上述样品的混合物。术语“测试样品”还包括未处理或预处理(或预加工)的生物样品。在一些实施方式中，测试样品可包含来自对象的细胞。如本文所用，术语“生物流体”是指从生物来源获得的任何流体，包括但不限于血液、尿液和身体分泌物。
测试样品可以通过从对象取出样品获得，但也可以通过使用先前分离的样品(例如，在先前时间点分离并由同一人或另一人分离)来完成。此外，测试样品可以是新鲜采集的或先前采集的样品。
在一些实施方式中，测试样品可以是未处理的测试样品。如本文所用，短语“未处理的测试样品”是指除了稀释和/或悬浮在溶液中之外没有进行任何先前样品预处理的测试样品。用于处理测试样品的示例性方法包括但不限于离心、过滤、超声处理、均质化、加热、冷冻和解冻及其组合。在一些实施方式中，测试样品可以是冷冻的测试样品，例如冷冻组织。在采用本文所述的方法、试验和系统之前，可以将冷冻样品解冻。解冻后，冷冻样品可在经手本文所述的方法、试验和系统之前被离心。在一些实施方式中，测试样品是澄清的测试样品，例如，通过离心和收集包含澄清的测试样品的上清制备。在一些实施方式中，测试样品可以是预加工的测试样品，例如，由选自由离心、过滤、解冻、纯化及其任何组合的处理产生的上清或滤液。在一些实施方式中，测试样品可以用化学和/或生物试剂处理。在加工过程中，可以使用化学和/或生物试剂来保护和/或维持样品的稳定性，包括其中的生物分子(例如，核酸和蛋白质)。一种示例性试剂是蛋白酶抑制剂，其通常用于在加工过程中保护或维持蛋白质的稳定性。技术人员非常了解适用于如本文所述的测定SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1水平所需的生物样品的预加工的方法和过程。
在一些实施方式中，本文所述的方法、试验和系统还可包括从对象获得测试样品的步骤。在一些实施方式中，对象可以是人对象。
以下结合具体实施例及附图，对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例中，如果对于实验操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(10-40℃)。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指重量百分含量。
实施例1：EGPA差异蛋白质分子的筛选
收集2019年1月份至2023年6月份就诊于复旦大学附属中山医院风湿免疫科的EGPA患者(11例)和健康对照(10例)静脉血，分离外周血血浆，提取总蛋白，利用数据非依赖采集(Data independent acquisition，DIA)技术筛选出两组差异表达的蛋白质。
对DIA检测数据分析后，发现与健康对照组(HC)相比，EGPA组共有24个蛋白上调，11个蛋白下调，参见图1。其中五种蛋白SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的血清水平差异最显著，表达明显上调。
实施例2：扩大样本验证筛选出的差异表达蛋白质
1、样本收集
收集2019年1月份至2023年6月份就诊于复旦大学附属中山医院风湿免疫科，根据1990年ACR标准诊断为EGPA的患者共32例，排除其他自身免疫性疾病、肿瘤和感染的患者。同时收集24例其他嗜酸性粒细胞增多疾病作为疾病对照(disease control，DC)以及20例健康体检者作为健康对照(healthy control，HC)。用EDTA采血管采集患者和健康对照每人10ml静脉血。试验中标本采集已取得病人和对照的知情同意。
2、酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血浆蛋白质水平
采用ELISA在新收取的血浆样本中对SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1进行验证。实验原理：待测蛋白的抗体预埋于96孔板底部，标准品和样品加入后，其中的待测蛋白会与抗体结合。在去除未结合的基他底物后，加入待测蛋白的生物素共轭抗体。冲洗，加入抗生物素共扼辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体，通过冲洗去除未结合的HRP。加入显色剂，终止反应后，测量液体的吸光度。
2.1验证SERPINA3蛋白，体系包含：
包被有SERPINA3抗体的多孔板
SERPINA3纯品稀释5倍作为待测样品
生物素标记抗体
辣根过氧化物酶标记亲和素
生物素标记抗体稀释液
辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液
样本稀释液
洗涤液
底物溶液
终止液
其中
所述SERPINA3标准品浓度为75，150，300，600，1200pg/ml；
所述生物素标记抗体为生物素化的抗SERPINA3抗体；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；
所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.2，0.05％硫柳汞；
所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；
所述洗涤液：NaCl 9.0g，0.5％吐温20 5ml，加蒸馏水至1000ml；
所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；
所述终止液：2mol/L硫酸。
具体操作方法为：
1)取离体血浆样本，检测前在4℃环境下过夜后，2500rpm离心10min；
2)标准品制备：取1.5ml离心管5枚(S1-S5)，各加入150μl样本稀释液，吸取150μl标准品原液(浓度为2400pg/ml)到第一个离心管中(S5)，轻轻吹打混匀；从S5中吸取150μl到第二个EP管中(S4)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；
3)操作步骤：
a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2小时；
b)弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；
c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；
d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；
e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；
f)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；
g)每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟；
h)每孔加终止液50μl，终止反应；
i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；
4)数据处理：
使用CurveExpert(version 1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值，再乘以稀释倍数5，即为样品的实际浓度。
2.2验证FGA蛋白，体系包含：
包被有FGA抗体的多孔板
FGA纯品稀释200倍作为待测样品
生物素标记抗体
辣根过氧化物酶标记亲和素
生物素标记抗体稀释液
辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液
样本稀释液
洗涤液
底物溶液
终止液
其中
所述FGA标准品浓度为0，0.94，1.88，3.75，7.5，15，30，60μg/ml；
所述生物素标记抗体为生物素化的抗FGA抗体；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；
所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.2，0.05％硫柳汞；
所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；
所述洗涤液：NaCl 9.0g，0.5％吐温20 5ml，加蒸馏水至1000ml；
所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；
所述终止液：2mol/L硫酸。
具体操作方法为：
1)取离体血浆样本，检测前在4℃环境下过夜后，2500rpm离心10min；
2)标准品制备：标准品于6000rpm离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品，使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶，充分混匀得到标准品S7(60μg/ml)。取1.5ml离心管7枚(S0-S6)，各加入150μl样本稀释液，吸取150μl标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀；从S6中吸取150μl到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；S0为样本稀释液(0μg/ml)；
3)操作步骤：
a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2小时；
b)弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；
c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；
d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；
e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；
f)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；
g)每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟；
h)每孔加终止液50μl，终止反应；
i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；
4)数据处理：
使用CurveExpert(version 1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值，再乘以稀释倍数200，即为样品的实际浓度。
2.3验证AGP1蛋白，体系包含：
包被有AGP1抗体的多孔板
AGP1纯品稀释10000倍作为待测样品
生物素标记抗体
辣根过氧化物酶标记亲和素
生物素标记抗体稀释液
辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液
样本稀释液
洗涤液
底物溶液
终止液
其中
所述AGP1标准品浓度为0，1560，3120，6250，12500，25000，50000，100000pg/ml；
所述生物素标记抗体为生物素化的抗AGP1抗体；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；
所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.2，0.05％硫柳汞；
所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；
所述洗涤液：NaCl 9.0g，0.5％吐温20 5ml，加蒸馏水至1000ml；
所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；
所述终止液：2mol/L硫酸。
具体操作方法为：
1)取离体血浆样本，检测前在4℃环境下过夜后，2500rpm离心10min；
2)标准品制备：标准品于6000rpm离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品，使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶，充分混匀得到标准品S7(100ng/ml)。取1.5ml离心管7枚(S0-S6)，各加入300μl样本稀释液，吸取300μl标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀；从S6中吸取300μl到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；S0为样本稀释液(0ng/ml)；
3)操作步骤：
a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2小时；
b)弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；
c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；
d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加300μl，甩干；
e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；
f)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；
g)每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟；
h)每孔加终止液50μl，终止反应；
i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；
4)数据处理：
使用CurveExpert(version 1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值，再乘以稀释倍数10000，即为样品的实际浓度。
2.4验证ITIH3蛋白，体系包含：
包被有ITIH3抗体的多孔板
ITIH3纯品稀释100倍作为待测样品
生物素标记抗体
辣根过氧化物酶标记亲和素
生物素标记抗体稀释液
辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液
样本稀释液
洗涤液
底物溶液
终止液
其中
所述ITIH3标准品浓度为0，78，156，312，625，1250，2500，5000ng/ml；
所述生物素标记抗体为生物素化的抗ITIH3抗体；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；
所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.2 0.05％硫柳汞；
所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；
所述洗涤液：NaCl 9.0g，0.5％吐温20 5ml，加蒸馏水至1000ml；
所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；
所述终止液：2mol/L硫酸。
具体操作方法为：
1)取离体血浆样本，检测前在4℃环境下过夜后，2500rpm离心10min；
2)标准品制备：标准品于6000rpm离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品，使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶，充分混匀得到标准品S7(5000ng/ml)。取1.5ml离心管7枚(S0-S6)，各加入150μl样本稀释液，吸取150μl标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀；从S6中吸取150μl到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；S0为样本稀释液(0ng/ml)；
3)操作步骤：
a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2小时；
b)弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；
c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；
d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；
e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；
f)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；
g)每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟；
h)每孔加终止液50μl，终止反应；
i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；
4)数据处理：
使用CurveExpert(version 1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值，再乘以稀释倍数100，即为样品的实际浓度。
2.5验证SAA1蛋白，体系包含：
包被有SAA1抗体的多孔板
SAA1纯品稀释100倍作为待测样品
生物素标记抗体
辣根过氧化物酶标记亲和素
生物素标记抗体稀释液
辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液
样本稀释液
洗涤液
底物溶液
终止液
其中
所述SAA1标准品浓度为0,1560，3120，6250，12500，25000，50000，100000pg/ml；
所述生物素标记抗体为生物素化的抗SAA1抗体；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素；
所述生物素标记抗体稀释液为：0.05％叠氮钠，0.01M磷酸缓冲液pH7.2；
所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液：0.01M磷酸缓冲液pH7.2 0.05％硫柳汞；
所述样本稀释液为85％氯化钠、5％磷酸氢二钠、4％磷酸二氢钠、5％山羊血清，1％Proclin-300，pH值为6-7；
所述洗涤液：NaCl 9.0g，0.5％吐温20 5ml，加蒸馏水至1000ml；
所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺；
所述终止液：2mol/L硫酸。
具体操作方法为：
1)取离体血浆样本，检测前在4℃环境下过夜后，2500rpm离心10min；
2)标准品制备：标准品于6000rpm离心30s后，用样品稀释液1ml充分溶解标准品，使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶，充分混匀得到标准品S7(100ng/ml)。取1.5ml离心管7枚(S0-S6)，各加入300μl样本稀释液，吸取300μl标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀；从S6中吸取300μl到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀；以此类推进行标准品的倍比稀释；S0为样本稀释液(0ng/ml)；
3)操作步骤：
a)针对设置的标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2小时；
b)弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；
c)每孔加生物素标记抗体100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小时；
d)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板3次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；
e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新的板贴，37℃温育1小
时；
f)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，每孔加200μl，甩干；
g)每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟；
h)每孔加终止液50μl，终止反应；
i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值)；
4)数据处理：
使用CurveExpert(version 1.4)软件对OD值进行处理，使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后，将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值，再乘以稀释倍数100，即为样品的实际浓度。
五种蛋白的检测数据列于表1中。
表1、蛋白SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1血浆水平检测结果
3、结果与讨论
通过DIA检测，发现与HC相比，EGPA组共有24个蛋白上调，11个蛋白下调。其中上调表达的蛋白包括SAA1、C1QA、SERPINA1、IGHV1-69、IGKV1-27、IGKV3D-15、LBP、C9、AGP1、IGKV2D-28、HP、SERPINA3、MBL2、VWF、ITIH3、FGA、MAN1A1、TIMP1、IGL@、A2NUT2、B4E1I8、Q8NEJ1、Q6MZU6、Q6P5S3，下调表达的蛋白包括SERPINA5、B2R701、CLEC3B、A0A384MEF1、A8K1K1、F12、YWHAZ、ERFL、TAGLN、FERMT3、TUB1，如图1所示。
进一步挑选上调蛋白质中差异最显著的5个蛋白SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1在大样本中进行ELISA验证，发现EGPA患者外周血SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1均较健康对照组显著升高(图2中a-e)，与DIA结果一致，其中SERPINA3、FGA、AGP1和ITIH3在EGPA组较DC组亦显著升高(图2中a-d)。
ROC曲线结果显示，在EGPA诊断方面，SERPINA3的效能最高，AUC为0.905(95％CI：0.816,0.994)；FGA的AUC为0.831(95％CI：0.715,0.948)；AGP1的AUC为0.873(95％CI：0.777,0.970)；ITIH3的AUC为0.728(95％CI：0.588,0.868)；SAA1的AUC为0.787(95％CI：0.658,0.917)。进一步根据Logistic向前逐步回归方法，将上述5个差异蛋白建立组合模型并构建ROC曲线，结果表明AUC为0.953(95％CI：0.890,1.000)(图3中a)。
在EGPA的鉴别诊断方面，SERPINA3的效能最高，AUC为0.872(95％CI：0.775,0.970)；FGA的AUC为0.734(95％CI：0.605,0.864)；AGP1的AUC为0.699(95％CI：0.561,0.837)；ITIH3的AUC为0.837(95％CI：0.731,0.943)；进一步根据Logistic向前逐步回归方法，将上述4个差异蛋白建立组合模型并构建ROC曲线，结果表明AUC为0.926(95％CI：0.855,0.997)(图3中b)。
进一步分析上述5个差异蛋白在不同疾病活动度下的表达水平，参见图4。将上述32例患者分为活动组和非活动组，结果表明，活动组中SERPINA3、FGA和AGP1的表达水平显著高于非活动组。ROC曲线结果表明，FGA诊断效能最高，AUC为0.826(95％CI：0.660,1.000)；SERPINA3的AUC为0.816(95％CI：0.634，0.999)；AGP1的AUC为0.787(95％CI：0.614，0.961)；
进一步根据Logistic向前逐步回归方法，将上述3个差异蛋白建立组合模型并构建ROC曲线，结果表明AUC为0.918(95％CI：0.824,1.000)(图5)。
该结果表明，SERPINA3、FGA和AGP1组合物不仅能作为EGPA诊断的生物标志物，还能够作为区分活动性和非活动性EGPA的生物标志物。
上述实施例是为了便于本技术领域的普通技术人员理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易地对实施例做出修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.蛋白质SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1在制备嗜酸性肉芽肿性多血管炎检测试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嗜酸性肉芽肿性多血管炎检测试剂包括检测生物样本中SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1含量的系统。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述系统用于检测生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1蛋白质水平或者它们的基因表达水平即mRNA水平。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当受测对象的生物样本中所述SERPINA3含量超过健康个体样本中平均含量80％以上、FGA含量超过健康个体样本中平均含量70％以上、AGP1含量超过健康个体样本中平均含量90％以上、ITIH3含量超过健康个体样本中平均含量30％以上、并且/或者SAA1含量超过健康个体样本中平均含量300％以上时，提示受测对象患有嗜酸性肉芽肿性多血管炎。
5.一种嗜酸性肉芽肿性多血管炎检测试剂盒，用于实施如权利要求1所述的应用，其特征在于，检测标靶是生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1。
6.根据权利要求5所述的嗜酸性肉芽肿性多血管炎检测试剂盒，其特征在于，检测方式是测定生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1蛋白质含量；或者检测方式是测定生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1基因表达水平。
7.根据权利要求6所述的嗜酸性肉芽肿性多血管炎检测试剂盒，其特征在于，测定生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1蛋白质含量的方法是基于抗体-抗原亲和结合原理的测定方法，选自下组：放射免疫测定法，双抗体夹心法，酶联免疫吸附测定法，磁微粒化学发光法，免疫层析，胶乳免疫比浊法，胶体金比色法，量子点荧光光度法；
测定生物样本中的SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1基因表达水平的方法是通过PCR测定mRNA含量。
8.根据权利要求7所述的嗜酸性肉芽肿性多血管炎检测试剂盒，其特征在于，基于抗体-抗原亲和结合原理测定生物样本中的抗原SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1含量，包括：
(1)能够结合SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的抗体；以及
(2)由含有已知量SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的溶液组成的标准样。
9.根据权利要求8所述的嗜酸性肉芽肿性多血管炎检测试剂盒，其特征在于，还包括：(3)当SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1结合于(1)中限定的抗体时，能够结合于SERPINA3、FGA、AGP1、ITIH3和SAA1的标记抗体。
10.根据权利要求9所述的嗜酸性肉芽肿性多血管炎检测试剂盒，其特征在于，为双抗体夹心法试剂盒，选自下组方式：
A.酶联免疫吸附测定法试剂盒；
B.磁微粒化学发光法试剂盒；
C.免疫层析试纸条。
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