JPH07218509A - ヒト株化癌細胞と反応する血中癌特異抗体の測定法 - Google Patents

ヒト株化癌細胞と反応する血中癌特異抗体の測定法

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JPH07218509A
JPH07218509A JP2896994A JP2896994A JPH07218509A JP H07218509 A JPH07218509 A JP H07218509A JP 2896994 A JP2896994 A JP 2896994A JP 2896994 A JP2896994 A JP 2896994A JP H07218509 A JPH07218509 A JP H07218509A
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cancer
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human
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cancer cell
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Hisao Yamanishi
久男 山西
Hidetoshi Kanda
秀俊 神田
Makoto Hashimoto
真 橋本
Keiko Watanabe
恵子 渡辺
Manabu Yoshino
学 吉野
Kazusa Asai
千紗 浅井
Tsugunobu Noutomi
継宣 納富
Masanori Sakanishi
昌則 坂西
Takayuki Minekawa
貴之 峰川
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Eiken Chemical Co Ltd
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Eiken Chemical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【目的】本発明は、多数検体の処理が可能で、客観性が
ある結果が得られ、癌に特異的で検出感度が高く、癌発
生の初期段階の早期癌が検出可能な癌の診断に有用な免
疫学的測定法を提供することである。 【構成】本発明はヒト株化癌細胞と反応し、癌患者の血
中に存在する癌特異抗体を測定する免疫学的測定法に関
し、詳しくは、標識した2次抗体または標識したイムノ
グロブリン親和性物質を用いる、ヒト株化癌細胞と反応
し、癌患者の血中に存在する癌特異抗体を測定する免疫
学的測定法に関する。従来の腫瘍マーカー測定法(抗原
測定法)とは相違した観点から担癌状態の情報を提供す
る。特に膵癌の診断に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト株化癌細胞と反応
する血中癌特異抗体の測定法に関する。つまり、ヒト株
化癌細胞と反応し、癌患者の血中に存在する癌特異抗体
をインビトロで検出する免疫学的測定法に関する。
【0002】担癌患者の血中に存在するヒト株化癌細胞
に対する抗体を検出することによって、従来、腫瘍マー
カー測定法として診断に利用されていた抗原測定法とは
相違した観点から担癌状態の情報を提供するものであ
る。
【0003】
【従来の技術】従来、癌のインビトロ診断は、主として
血中の腫瘍マーカー(癌関連抗原)を測定することによ
りなされており、腫瘍マーカーとしてはアルファフェト
プロテイン(AFP)や癌胎児性抗原(CEA)等が知
られている。これら腫瘍マーカーは、通常、腫瘍の増大
とともにその血中濃度が増加する。従って、従来の抗原
測定法による腫瘍マーカー(抗原)の検出では、血中に
ある程度の抗原量が蓄積されていなければ、測定が可能
とはならず、抗原が蓄積するためには癌の進行が必要で
あった。それゆえ、癌発生の初期段階、早期の癌の検出
にはこれら腫瘍マーカーの測定では不十分な点がみられ
た。
【0004】一方、体内での抗体産生反応は抗原が少量
のときでも起こり、抗体が産生され、産生された抗体は
生体内で増幅される。この増幅された抗体を測定できれ
ば早期に担癌の状況把握ができると考えられている。こ
のような試みはCEAに対する自己抗体について行われ
ている(特開平4−249770号)。しかし、CEA
は胎児性抗原であるため、CEA自己抗体の陽性率は健
常者で2%、良性疾患で12%と、癌に特異的ではなく
(Tumor Marker Today, 3, 8, 1993)、また癌患者にお
けるCEA自己抗体の陽性率もあまり高くなく、実用的
とは言い難い。
【0005】最近、白石らはブルーム症候群の患者から
形質転換して得られた細胞に対する癌患者の抗体を検出
する方法を報告している(Cancer Res., 53, 3427-343
2,1993)。しかし、この検出方法はブルーム症候群の患
者血液から分離し、特殊な処理を施した細胞を必要と
し、しかも被検血清と反応後、蛍光顕微鏡下で染色細胞
を数えるので、多数検体の処理に向かず、客観性に乏し
い欠点がある。
【0006】また癌の種類によっては適当なマーカーが
知られていないものもある。例えば膵癌ではCEAやC
A19−9等が腫瘍マーカーとして用いられているが、
それらは臓器特異性が小さく、有効な膵癌マーカーは未
だ知られていない。さらに膵臓自身も腹腔内の深部に位
置するためX線等による画像診断も困難を伴う。現在の
ところ、黄疸、腹痛や上腹部の不定愁訴を膵癌を疑うき
っかけとし、超音波画像診断による形態学的検査が膵癌
発見には優れているとされているが、やはり早期癌や小
膵癌の発見は困難である(臨床科学25(5)、537
−544、1989)。それゆえ膵癌に特異的な診断法
の開発も望まれていた。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はこのよ
うな従来技術の問題点を解決することにある。具体的に
は、多数検体の処理が可能で、客観性がある結果が得ら
れ、癌に特異的で検出感度が高く、早期癌が検出可能な
癌の診断に有用な免疫学的測定法を提供することであ
る。
【0008】
【課題を解決するための手段】このような現状に鑑み、
本発明者らは鋭意研究した結果、インビトロでヒト株化
癌細胞と結合する癌患者の血中に存在する癌特異抗体の
測定法を見いだし、この知見に基づき本発明を完成させ
た。
【0009】(1)すなわち本発明はヒト株化癌細胞と
反応し、癌患者の血中に存在する癌特異抗体を測定する
免疫学的測定法に関し、詳しくは、標識した2次抗体ま
たは標識したイムノグロブリン親和性物質を用いる、ヒ
ト株化癌細胞と反応し、癌患者の血中に存在する癌特異
抗体を測定する免疫学的測定法に関する。
【0010】(2)ここでヒト株化癌細胞としてはヒト
膵癌細胞株が本発明には好ましく、特に、ATCC CRL 142
0号として A.YUNIS氏により寄託されているヒト膵癌細
胞株、MIA−PaCa−2が好ましい。
【0011】(3)測定には標識した2次抗体または標
識したイムノグロブリン親和性物質を用いる。2次抗体
は抗ヒトIgG抗体または抗ヒトIgM抗体のどちらを
使用してもよく、またその抗体がポリクロナール抗体で
あるかモノクロナール抗体であるかを問わない。イムノ
グロブリン親和性物質としてはプロティンAまたはプロ
ティンGが本発明には好ましい。
【0012】(4)2次抗体またはイムノグロブリン親
和性物質に付する標識としては通常の免疫学的測定法で
用いられる標識物質が使用できる。例えば放射性物質(
125I、32P、3H等)、酵素(ペルオキシダーゼ(POD)、
ベータガラクトシダーゼ(βGAL)、アルカリフォスファ
ターゼ(AlP)、グルコースオキシダーゼ(GOD)等)、蛍光
物質(フルオレセン等)、発光物質(ルミノール、ルシ
フェリン等)、その他常用の標識物質が用いられる。
【0013】本発明の免疫学的測定法としては、ラジオ
イムノアッセイ(RIA)、エンザイムイムノアッセイ
(EIA)、蛍光イムノアッセイ(FIA)、発光イム
ノアッセイ(LIA)等の既存の高感度イムノアッセイ
法が用いられ、標識物質により、適宜選択される。ま
た、測定方法も競合法、サンドイッチ法、第2抗体法、
沈殿法と方法を問わない。更に、蛍光標識を用いた時
は、セルソーター(FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORT
ER)により反応した細胞数の計数も可能である。
【0014】また、本発明において、上記(1)〜
(4)を組み合わせて、ヒト株化癌細胞と反応し、癌患
者の血中に存在する癌特異抗体を測定する免疫学的測定
試薬も提供可能である。例えば、ヒト株化癌細胞を含む
抗原試薬、標識した2次抗体または標識したイムノグロ
ブリン親和性物質を含む標識試薬を主要構成試薬とし、
洗浄剤、陽性(陰性)標準等のその他の試薬を組み合せ
て試薬キットとすることも可能である。
【0015】上記標識試薬において、2次抗体またイム
ノグロブリン親和性物質の標識を放射性物質とすれば、
当該試薬キットはRIA法のキットとなり、標識物質を
酵素とすれば当該キットはEIA法のキットとなる。上
記抗原試薬において、ヒト株化癌細胞はそのまま用いて
も良いし、マイクロプレートやポリスチレンビーズ等の
固相に固定化して用いても良い。競合法・沈殿法・サン
ドイッチ法等の測定方法により適宜選択する。
【0016】具体的には、RIA法ではヒト株化癌細胞
をそのまま用いた(またはポリスチレンビーズ等に固定
化した)抗原試薬、抗ヒトIgG抗体等のイムノグロブ
リン親和性物質を125I等で標識した標識試薬、細胞に
対する抗体を含む(陽性)標準試薬、洗浄剤等からなる
測定キットが提供できる。EIA法ではヒト株化癌細胞
をそのまま用いた(またはポリスチレンビーズ等に固定
化した)抗原試薬、抗ヒトIgG抗体等のイムノグロブ
リン親和性物質をPODやAlP等の酵素で標識した標
識試薬、細胞に対する抗体を含む(陽性)標準試薬、洗
浄剤、酵素基質剤、反応停止剤等からなる測定キットが
提供できる。セルソーターを用いる場合はヒト株化癌細
胞をそのまま用いた抗原試薬、抗ヒトIgG抗体等のイ
ムノグロブリン親和性物質を蛍光物質で標識した標識試
薬、洗浄剤等からなる測定キットが提供できる。試薬キ
ットの形態は上記のように測定方法や測定設備等によ
り、適宜変更可能である。
【0017】
【作用】本発明の原理は、生きたヒト株化癌細胞と、患
者検体中の抗体とをインビトロで反応させ、ヒト株化癌
細胞に結合した患者検体中のヒト株化癌細胞に対する抗
体を、これと特異的に反応する標識2次抗体もしくは標
識イムノグロブリン親和性物質で検出する。標識抗体の
量はラジオイムノアッセイでは放射活性で、エンザイム
イムノアッセイでは酵素活性で、蛍光イムノアッセイで
は蛍光強度で、発光イムノアッセイは発光強度で検出さ
れるので、客観性のある結果が得られる。患者検体中の
抗体は増幅されているので早期癌でも検出可能である。
また、実施例で示すが、従来、診断が困難であった膵癌
の患者で健常人と明確に分けられる点は本発明の意義が
大きい。またヒト株化癌細胞の種類を選ぶことにより、
臓器特異性が高まり、癌の原発部位も推定できる可能性
も考えられる。
【0018】
【実施例】以下に本発明の実施例について述べるが、こ
れは本発明を詳細に説明する目的とするものであり、実
施例のみに限定されるものではない。また本実施例で使
用したヒト株化癌細胞はATCCより分与された物であ
る。使用した試薬は市販の特級品もしくは同等品を使用
した。
【0019】実施例1 膵癌患者血清中のヒト株化膵
癌細胞に対する抗体の測定 膵癌患者15例、健常人6例を用いて検討した。ヒト株
化膵癌細胞(MIA−PaCa−2)を50%牛胎児血
清(FCS)・りん酸緩衝液(pH7.3、0.1M
NaCl)で1x105個/100μlになるように調
製し、同上の緩衝液で10倍希釈した検体50μlを加
え、4℃、1時間反応する。その後、2.5%FCS・
りん酸緩衝液1mlを加え、遠心(1500rpm,5
分、4℃)する。この操作をさらに2回繰り返して洗浄
した。125I標識抗ヒトIgG抗体をFCSで希釈し2
00,000cpm/200μlに調製したものを加
え、4℃、1時間反応し、遠心、洗浄した。沈澱の放射
活性を測定した。その結果、図1に示すように健常人検
体に比較して、膵癌患者検体では膵癌細胞に対する抗体
濃度が有意に高いことが明かであった。
【0020】
【発明の効果】担癌患者の血中に存在するヒト株化癌細
胞に対する抗体を測定することにより、従来の腫瘍マー
カー測定法として診断に利用されていた抗原測定法とは
相違した観点から担癌状態の情報を提供できる。つま
り、腫瘍の増大や抗原量の蓄積によらず、癌を発生の初
期段階、早期癌において高感度に検出できる。また、多
数検体の処理が可能で、客観性のある結果が得られる。
さらに、診断が困難であった膵癌患者と健常人が容易に
分けられる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 膵癌患者血清中のヒト株化膵癌細胞に対する
抗体の測定結果
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 渡辺 恵子 栃木県大田原市下石上1381−3 栄研化学 株式会社免疫化学研究所内 (72)発明者 吉野 学 栃木県大田原市下石上1381−3 栄研化学 株式会社免疫化学研究所内 (72)発明者 浅井 千紗 栃木県大田原市下石上1381−3 栄研化学 株式会社免疫化学研究所内 (72)発明者 納富 継宣 栃木県大田原市下石上1381−3 栄研化学 株式会社免疫化学研究所内 (72)発明者 坂西 昌則 栃木県大田原市下石上1381−3 栄研化学 株式会社免疫化学研究所内 (72)発明者 峰川 貴之 栃木県大田原市下石上1381−3 栄研化学 株式会社免疫化学研究所内

Claims (11)

    【整理番号】 P290 【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ヒト株化癌細胞と反応し、癌患者の血中
    に存在する癌特異抗体を測定する免疫学的測定法
  2. 【請求項2】 ヒト株化癌細胞がヒト膵癌細胞株である
    請求項1に記載の方法
  3. 【請求項3】 ヒト膵癌細胞株がMIA−PaCa−2
    である請求項2に記載の方法
  4. 【請求項4】 標識した2次抗体または標識したイムノ
    グロブリン親和性物質を用いる、ヒト株化癌細胞と反応
    し、癌患者の血中に存在する癌特異抗体を測定する請求
    項1〜3に記載の免疫学的測定法
  5. 【請求項5】 2次抗体が抗ヒトIgG抗体または抗ヒ
    トIgM抗体である請求項4に記載の方法
  6. 【請求項6】 抗ヒトIgG抗体または抗ヒトIgM抗
    体がポリクロナール抗体である請求項5に記載の方法
  7. 【請求項7】 抗ヒトIgG抗体または抗ヒトIgM抗
    体がモノクロナール抗体である請求項5に記載の方法
  8. 【請求項8】 イムノグロブリン親和性物質がプロティ
    ンAまたはプロティンGである請求項4に記載の方法
  9. 【請求項9】 2次抗体またはイムノグロブリン親和性
    物質の標識が放射性物質、酵素、蛍光物質または発光物
    質である請求項4〜8に記載の方法
  10. 【請求項10】 ヒト株化癌細胞と反応し、癌患者の血
    中に存在する癌特異抗体を測定する免疫学的測定試薬
  11. 【請求項11】 ヒト株化癌細胞としてヒト膵癌細胞株
    を含む試薬と、標識した2次抗体または標識したイムノ
    グロブリン親和性物質を含む試薬とを主要な構成試薬と
    する請求項10記載のヒト株化癌細胞と反応し、癌患者
    の血中に存在する癌特異抗体を測定する免疫学的測定試
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2003517579A (ja) * 1998-11-05 2003-05-27 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 癌の血清マーカーとしてのs100タンパク質および自己抗体

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003517579A (ja) * 1998-11-05 2003-05-27 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 癌の血清マーカーとしてのs100タンパク質および自己抗体
JP4820003B2 (ja) * 1998-11-05 2011-11-24 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 癌の血清マーカーとしてのs100タンパク質および自己抗体

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