JP2021535410A - 全自動化学発光分析装置に基づく血清ｔｋ１検出キット - Google Patents

Abstract

本発明はキット及びその用途を開示し、当該キットは既に固体担体に固定された又は固体担体への固定に適する第１ポリクローナル抗体と、マーカーで標識された第２ポリクローナル抗体とを含み、前記第１ポリクローナル抗体及び前記第２ポリクローナル抗体はいずれもニワトリ抗ヒトＩｇＹ−ＴＫ１ポリクローナル抗体であり、且つ、前記第１ポリクローナル抗体及び前記第２ポリクローナル抗体はいずれもチミジンキナーゼ１との特異的結合に適する。当該キットは検出感度が高く正確であり、操作しやすく、集団健康診断及び画像から検出できない小さな悪性腫瘍／前がん疾患スクリーニング、腫瘍リスク評価に適する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は２０１８年９月４日に提出された出願番号が２０１８１１０２６７９９．６である中国特許出願の優先権を主張し、その全体の内容は本明細書に組み込まれる。

本発明は生体検出の分野に関し、磁性微粒子免疫サンドイッチ法による全自動化学発光分析装置に基づくキットの開発及び健常者集団を対象とする健康診断とスクリーニングにおけるその使用の有効性に関する。

免疫磁性微粒子分離技術は抗原−抗体特異的結合に基づく免疫学的技術である。主に磁性微粒子の表面を標識した修飾基、例えば、アミノ基、カルボキシ基、トルエンスルホニル基、ストレプトアビジンなどの基によって標識抗体に共有又は非共有結合するものであり、全自動免疫化学発光分析装置で、特異的抗原と結合することにより、対応する抗原物質を分離させるために用いられる。

チミジンキナーゼ１は細胞質で発現されチミジン（ｄＴｄＲ）をチミジン一リン酸に変換させるキナーゼである。サルベージ経路によるｄＴｄＲのＤＮＡ合成への導入における唯一の経路の重要なキナーゼである。ＴＫ１の発現は細胞周期と密接に関連し、細胞周期におけるその調節はＤＮＡ複製で３−チミジン一リン酸の供給を保証する。これが腫瘍細胞の異常増殖時に必要なＤＮＡ合成を補う。ＴＫ１のレベルの昇降がＤＮＡの細胞周期のＳ期のＤＮＡ合成速度と密接に関係し、増殖期の腫瘍細胞でＴＫ１のレベルが細胞周期のＧ１期とＳ期の臨界点から上昇し、細胞がＧ１期の後期に入ると、ＴＫ１酵素のレベルがＳ期とＧ２期の臨界点まで徐々に大幅に上昇する。したがって、ＴＫ１酵素はＳ期特殊酵素と呼ばれることもある。健康診断で血清からチミジンキナーゼ１の含有量を検出することで近い将来に前がん疾患が悪性腫瘍に発展するハイリスク集団を特定できるだけでなく、臨床診療科で、悪性腫瘍患者の治療効果、予後及び再発リスクを監視するためにも利用できる。従来のチミジンキナーゼ１検出システムでは自動操作を行うことができず繰り返し測定で正確さが不十分で、検出結果の判断に支障をきたした。したがって、チミジンキナーゼ１検出キットの改善が必要である。

本発明の目的は全自動化学発光分析装置に使用でき、検出の正確さが高く、操作しやすく、大規模な集団に対するスクリーニングに適するキットを提供することである。

腫瘍疾患は異常な細胞増殖を特徴としている。一部の酵素及びタンパク質では細胞成長調節経路に関連する複数の遺伝子変異により正常な細胞調節がコントロールできず、悪性腫瘍の異常な増殖が発生する。新たな腫瘍増殖マーカーの研究開発及び検出技術の確立は腫瘍精密検出及び予防医学で重要な課題の１つである。１９５０年に、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）が発見され一般的には正確なタンパク質分子標的と見なされ、細胞の増殖速度を評価するために用いられる。ＴＫ１はピリミジンサルベージ経路の酵素で、チミジン（ｄＴＤＲ）を触媒してチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）に変換させる。哺乳類の細胞周期でＴＫ１はＤＮＡ合成の重要な酵素及びＳ期の特異的酵素と称される。ＴＫ１レベルはＤＮＡ合成速度と密接に関連し、腫瘍細胞の増殖にも密接に関係する。本発明者がヒトＴＫ１抗原を設計し、ニワトリ抗ヒトＴＫ１−ＩｇＹ抗体の調製に成功し、高感度免疫増強化学発光ドットブロット（ＥＣＬドットブロット）検出キット製品を開発し、血清中のＴＫ１濃度を測定した。当該検出システムは様々な腫瘍の治療効果の監視、がん患者の再発及び生存率、特に前がん疾患と悪性腫瘍の早期検出及び腫瘍進行リスクの予測に適し、腫瘍の動的発展リスクを予測するバイオマーカーとして好ましいことが判明した。３５３６５人の大規模な集団に対する健康診断の血清サンプルのメタ（Ｍｅｔａ）研究に基づいて、本発明者がＳＴＫ１ｐ（血清チミジンキナーゼ１タンパク質）＝２ｐｍｏｌ／Ｌを合理的な「リスク閾値」に設定し、健常者に対するスクリーニングで異常な細胞の増殖速度を効果的に評価した。６年以内の悪性腫瘍の新規発生率は中国腫瘍調査による新規発生率（０．２％〜０．３％）より３〜５倍高かった。ＳＴＫ１ｐ低リスク群（２ｐｍｏｌ／Ｌ以下）と比べ、ＳＴＫ１ｐ高リスク群では１１年以内で悪性腫瘍が新規発生するリスクが高かった（４４倍）。これまでに発表した合計１６万８６例の健康診断のメタ（Ｍｅｔａ）研究により、当該検出キットは前がん疾患、腫瘍関連疾患リスク及び潜在的な小さな早期悪性腫瘍などの早期腫瘍の発見に適することが一層判明した。しかしこの方法は半自動のままで、特に３μＬの血清スポッティングには高度な手作業で操作する必要があり、再現性が優れず（時には検出標準誤差が１５％を超える）、大規模な健常者を対象とするスクリーニングには適さない。

本発明の第１態様では、キットが提供される。本発明の実施例では、当該キットは、既に固体担体に固定された又は固体担体への固定に適する第１ポリクローナル抗体と、マーカーで標識された第２ポリクローナル抗体とを含む。前記第１ポリクローナル抗体及び前記第２ポリクローナル抗体はいずれもニワトリ抗ヒトＩｇＹ−チミジンキナーゼ１（ＩｇＹ−ＴＫ１）ポリクローナル抗体であり、且つ、前記第１ポリクローナル抗体及び前記第２ポリクローナル抗体はいずれもチミジンキナーゼ１との特異的結合に適する。

本発明の実施例のキットでは、本発明者が多くのチミジンキナーゼ１（ＴＫ１）抗体をスクリーニングしたところ、第１ポリクローナル抗体及び第２ポリクローナル抗体の２種のニワトリ抗ヒトＩｇＹ−ＴＫ１ポリクローナル抗体がＴＫ１の抗原エピトープの異なるマイクロドメインを同時に認識でき、つまり同じ由来の２種のポリクローナル抗体が抗原の異なる表面決定基と特異的に結合して、二重抗体サンドイッチ複合体を形成できる。複合体における発光マーカーで標識されたポリクローナル抗体に付与された発光標識の光強度を検出することによりサンプルにおけるＴＫ１抗原の濃度を判断する。本発明者が更なる研究を通じて、ニワトリ抗ヒトＩｇＹ−ＴＫ１は他の動物に由来するＩｇＹ−ＴＫ１より、血清中のＴＫ１との結合の感度及び特異性が優れることを発見した。

さらに、本発明の実施例のキットは検出感度が高く、特異性が強く、検出時間が短く、検出費用が安く、自動操作が可能で、普及しやすい。本発明の実施例では、本発明の実施例のキットによる検出結果は集団健康診断及びスクリーニングに効果的に利用して、腫瘍疾患に発展するリスクのある患者及び非腫瘍疾患患者を分けることができ、繰り返し検出で正確さが高い。

さらに、本発明の実施例のキットは全自動化学発光免疫分析装置と組み合わせて使用され、サンプル中のチミジンキナーゼ１を検出し、検出過程の全自動を実現し、手動操作による誤差を減らす。

なお、本願では、従来のマウスに由来するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体で二重抗体サンドイッチ複合体を形成させる代わりに、第１ポリクローナル抗体及び第２ポリクローナル抗体の２種のポリクローナル抗体で二重抗体サンドイッチ複合体を形成させる。現在、ますます多くの腫瘍疾患患者がマウスモノクローナル抗体による免疫治療を受けており、ヒト抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体（ＨＡＭＡ）が１つの干渉因子であり、しばしば抗体応答効果を引き起こす。腫瘍治療に関しては、特にマウスモノクローナル抗体で治療する場合に、さらにモノクローナル抗体のタイプの腫瘍関連マーカーで検出するため、ＨＡＭＡの体内発生率が上昇する。ニワトリ抗体検出方法による治療効果監視の利点はＨＡＭＡと反応しないことである。したがって、本発明の実施例のキットはニワトリ抗体による免疫測定を用いるため理論的には哺乳類抗体を使用するものより優れる。ＴＫ１−ＩｇＹポリクローナル抗体は単一抗体での検出よりも利点が多く、検出結果がより正確である。

なお、本発明の実施例の第１及び第２ポリクローナル抗体はニワトリ抗ヒトＩｇＹ抗体であり、ニワトリ抗ヒトＩｇＹ抗体を用いると、次の少なくとも１つの利点がある。
（１）ニワトリＩｇＹとヒトＩｇＧの間に分子遺伝学的差異がある。
（２）ニワトリＴＫ１とヒトＴＫ１に種間差異がある。
（３）従来のウサギ免疫で製造したポリクローナル抗体と比べ、ＩｇＹは内因性分子の均一性を有する（１つのタイプの抗体分子のＩｇＹしか生じない）。
（４）ＩｇＹ抗体がヒト補体系を活性化させないため、ヒト血清中の非特異的抗原結合部位の活性化を一部遮断する。
（５）リウマチ因子（ＲＦ）がＩｇＹ抗体と反応しない。ＲＦが多くの免疫測定で非特異的反応の主な要因であり、ＲＦが哺乳類抗体ＩｇＧのＦｃ部分と反応すると、患者及び健常者の血清が偽陽性を示すからである。

さらに、本発明の前記実施例に係るキットは次の付加的な技術特徴を備えてもよい。
本発明の実施例では、前記第１ポリクローナル抗体及び前記第２ポリクローナル抗体が認識する抗原エピトープは、
チミジンキナーゼ１の炭素末端の第３ペプチドセグメントであって、配列番号３（ＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ）に示す配列を備え、血清ＴＫ１形態の非常に重要な特異的エピトープである前記第３ペプチドセグメントを含み、
さらに、炭素末端の第１ペプチドセグメントであって、アクセス可能なエピトープであり、配列番号１（ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮ）に示す配列を備える前記第１ペプチドセグメント、
炭素末端の第２ペプチドセグメントであって、配列番号２（ＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ）に示す配列を備える前記第２ペプチドセグメント、
炭素末端の第４ペプチドセグメントであって、配列番号４（ＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ）に示す配列を備える前記第４ペプチドセグメント、
炭素末端の第５ペプチドセグメントであって、配列番号５（ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ）に示す配列を備える前記第５ペプチドセグメント、
チミジンキナーゼ１の前記ペプチドセグメントから選ばれた少なくとも２種を含む。

本発明の実施例では、前記第１ポリクローナル抗体及び前記第２ポリクローナル抗体は抗原でニワトリを免疫化させて得たもので、前記抗原はヒトチミジンキナーゼ１の炭素末端のポリペプチドである。本発明者が多くのチミジンキナーゼ１の異なるペプチドセグメントをスクリーニングしたところ、Ｃ末端に位置するチミジンキナーゼ１のペプチドセグメントで免疫化させて得た抗体はＴＫ１との結合で特異性が強く感度が高いことを発見し、且つ、当該抗体は血清中のＴＫ１と結合して、血清中のＴＫ１の検出を実現する。他のペプチドセグメントで免疫化させて得た抗体は殆どが血清ＴＫ１と結合しにくいため、血清中のＴＫ１を効果的に検出できない。しかも１５年にも及ぶ当該抗体の臨床実験及び１０万例超のサンプル分析から、当該抗体は血清ＴＫ１を効果的に認識し増殖リスクが高い集団を特定できるという結論に至った。

本発明の実施例では、前記抗原でニワトリを免疫化させて前記第１ポリクローナル抗体及び第２ポリクローナル抗体を得、前記抗原は配列番号６（ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ）に示す配列を備える。

さらに、当該抗原が認識できるエピトープは４つの特異的エピトープと、１つのアクセス可能なエピトープとを有し、４つの特異的エピトープと、１つのアクセス可能なエピトープはそれぞれ、
炭素末端の第１ペプチドセグメントであって、１つのアクセス可能なエピトープであり、配列番号１（ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮ）に示す配列を備える前記第１ペプチドセグメント、
炭素末端の第２ペプチドセグメントであって、配列番号２（ＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦ）に示す配列を備える前記第２ペプチドセグメント、
炭素末端の第３ペプチドセグメントであって、配列番号３（ＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ）に示す配列を備え、血清ＴＫ１形態の非常に重要な特異的エピトープである前記第３ペプチドセグメント、
炭素末端の第４ペプチドセグメントであって、配列番号４（ＮＣＰＶＰＧＫＰＧＥ）に示す配列を備える前記第４ペプチドセグメント、
炭素末端の第５ペプチドセグメントであって、配列番号５（ＰＶＰＧＫＰＧＥＡＶ）に示す配列を備える前記第５ペプチドセグメントである。

本発明者がＥＬＩＳＡ測定法を用いて、炭素末端の第１ペプチドセグメントを抗原として免疫化させて調製したＩｇＹ−ＴＫ１ポリクローナル抗体を検出した結果、これらのポリクローナル抗体が前記４つの特異的エピトープ及びアクセス可能な領域（ＧＱＰＡＧＰＤＮＫＥＮ１９５〜２０５）と免疫応答反応を行うが、異なる雌ニワトリに由来する抗体は４つの特異的エピトープ及びアクセス可能なエピトープに異なる免疫応答反応パーセンテージを示す。炭素末端の第３ペプチドセグメントのエピトープは主な免疫反応と最も強い免疫反応を示す。具体的には、ヒトチミジンキナーゼ１のＣ末端のポリペプチドを抗原として免疫化させた雌ニワトリではそれぞれの抗体の免疫応答反応に差があり、第１ポリクローナル抗体及び第２ポリクローナル抗体は同じ属の２匹のニワトリを免疫化させて得た抗体で、異なるエピトープの応答反応を認識するポリクローナル抗体であってもよく、当該キットのサンドイッチ法のペアリングを実現する。本発明の実施例では、前記第１ポリクローナル抗体及び前記第２ポリクローナル抗体が認識する抗原エピトープはいずれもチミジンキナーゼ１の前記第１〜第５ペプチドセグメントの少なくとも３〜４種から選ばれ、ただし炭素末端の第３ペプチドセグメントが必須である。

本発明の実施例では、標識認識物質と結合した基質発光触媒であって、前記標識認識物質が特異的に前記マーカーを認識する前記基質発光触媒と、発光基質であって、前記基質発光触媒の作用で光信号を発する前記発光基質とをさらに含む。このように、標識認識物質によって特異的にマーカーを認識することにより、特異的な信号増幅システムを形成させ、検出感度及び再現性が向上し、検出時間が短縮される。本発明の特定の実施例では、前記マーカーはビオチンであり、前記標識認識物質はストレプトアビジンである。このように、ビオチン−ストレプトアビジン高特異性信号増幅システムを用いると、検出感度及び再現性が明らかに向上し、反応時間は従来の検出方法の７時間から５０分に短縮される。

本発明の実施例では、当該発光基質はＡＰＳ−５である。

本発明の実施例では、当該基質発光触媒はアルカリホスファターゼであってもよく、標識認識物質と結合した基質発光触媒はアルカリホスファターゼによって標識されたストレプトアビジンであってもよく、基質発光触媒は西洋ワサビペルオキシダーゼであってもよく、標識認識物質と結合した基質発光触媒はアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼによって標識されたストレプトアビジンであってもよい。

本発明の実施例では、前記固体担体は磁性微粒子である。このように、ポリクローナル抗体を磁性微粒子に結合させることにより、免疫化学発光技術と全自動磁性微粒子免疫発光分析装置の組み合わせを実現し、均一相に近い反応系を提供し、且つ発光マーカー−標識認識物質という高特異性信号増幅システムを用いることにより、検出感度及び再現性が大幅に向上し、反応時間は従来の検出方法の７時間から５０分に短縮される。

本発明の実施例では、前記磁性微粒子の粒子径は２〜５μｍである。好ましくは、当該磁性微粒子の粒子径は３μｍである。このように、磁性微粒子の粒子径が適切であり、全自動化学発光免疫分析装置とより適合し、磁場が適合するとより効率的な分離を実現でき、また当該粒子径範囲の磁性微粒子の抗体に対する結合度が高いため、検出精度の向上に役立つ。

本発明の実施例では、磁性微粒子と結合した第１抗体の製造方法は次のとおりである。
１）充分に均一に混合させたトルエンスルホニル基磁性微粒子濃縮液を反応フラスコに入れ、当該反応フラスコを磁場に１５〜２０分間置き、全てのトルエンスルホニル基磁性微粒子が磁場によって吸着された後、上清を吸い取り、反応フラスコに２〜２０倍の体積の磁性微粒子活性化バッファーを加え、振盪して１０分間洗浄し、さらに反応フラスコを磁場に１５〜２０分間置き、上清を吸い取り、次にトルエンスルホニル基磁性微粒子を２回洗浄し、最後にトルエンスルホニル基磁性微粒子溶液を１〜２０ｍｇ／ｍＬに希釈し、使用に備えて均一に混合しておく。
２）結合反応としてトルエンスルホニル基磁性微粒子溶液：第１抗体＝１０００：１〜１０の質量比でステップ１）で調製したトルエンスルホニル基磁性微粒子溶液に第１抗体を加え、総体積の１／１０〜１／２の磁性微粒子触媒バッファーを加え、３７℃で均一に混合した状態を保持して１８時間反応させる。
３）ステップ２）で調製した磁性微粒子溶液に溶液の総体積の１／５０〜１／１０の１０％ＢＳＡを加え、３７℃で均一に混合した状態を保持して６時間反応させる。
４）反応フラスコを磁場に１５分間置き、トルエンスルホニル基磁性微粒子が磁場に吸着されると磁性微粒子洗浄液で３回洗浄し、次に１ｍｇ／ｍＬに定容し、２〜８℃で保存して、磁性微粒子と結合した第１抗体を得る。

当該磁性微粒子活性化バッファーの調製方法は５．１８〜７．３６ｇのホウ酸を９００ｍＬの脱イオン水に溶解し、ＮａＯＨでｐＨを８〜１０に調整し、１Ｌに定容した後、０．４５μｍメンブレンフィルターで濾過することであり、前記磁性微粒子触媒バッファーの調製方法は１００〜１５０ｇの硫酸アンモニウムを１Ｌの磁性微粒子活性化バッファーに溶解し、完全に溶解すると０．４５μｍメンブレンフィルターで濾過することであり、前記磁性微粒子洗浄液はｐＨ７．４のＴＢＳＴバッファーである。磁性微粒子と結合した第１抗体は第１抗体と結合した磁性微粒子試薬ともいう。

本発明の実施例では、校正物質、品質管理物質、抗体試薬、希釈液、洗浄液をさらに含む。

洗浄液はｐＨ７．４のＴＢＳＴバッファーである。
希釈液の調製方法は０．１ｇ〜１０ｇのブロッキング剤を１ＬのＴｒｉｓバッファーに溶解し、０．１ｍＬ〜５ｍＬの防腐剤を加え、完全に溶解すると０．２２μｍメンブレンフィルターで濾過して得ることである。

抗体試薬は抗体試薬バッファーで調製され、抗体試薬バッファーの調製方法は０．１ｇ〜１０ｇのブロッキング剤を１ＬのＴｒｉｓバッファーに溶解し、０．１ｍＬ〜５ｍＬの防腐剤を加え、完全に溶解すると０．２２μｍメンブレンフィルターで濾過して前記抗体試薬バッファーを得ることであり、次にビオチンと第２抗体を結合させて、ビオチンによって標識された第２抗体を得、試薬バッファーで、ビオチンによって標識された第２抗体を最終濃度０．０５μｇ／ｍＬ〜０．５μｇ／ｍＬに希釈する。当該抗体試薬はビオチンによって標識された第２抗体ともいう。

本発明の実施例では、校正物質及び品質管理物質はいずれもＴＫ１純品であり、校正物質は、標準曲線を決定して濃度を計算するために５つの濃度を含み、品質管理物質は２つの濃度を含み、品質管理物質で試薬の有効性を確認し、品質管理物質の結果が所定の範囲にあるかどうかを測定する。

本発明の実施例のキットを使用するために、当該キットを用いて血清中のチミジンキナーゼ１の含有量の一般的な測定方法として、
１）キットの試薬を順に付帯の全自動化学発光分析装置に入れるステップと、
２）全自動化学発光分析装置でそれぞれ１〜１０μＬの被験サンプル、１０〜１００μＬの希釈液、１０〜１００μＬの第１抗体と結合した磁性微粒子試薬、１０〜１００μＬの抗体試薬を吸い取って、この順に反応カップに加え、３７℃で１０分間反応させ、次に洗浄装置で磁気分離を行い、上清を捨てた後、洗浄液で複合体沈殿物を１〜６回洗浄するステップと、
３）反応カップにストレプトアビジンによって標識されたアルカリホスファターゼ試薬１０〜１００μＬを加え、３７℃で１０分間反応させ、次に洗浄装置で磁気分離を行い、上清を捨てた後、洗浄液で複合体沈殿物を１〜６回洗浄するステップと、
４）１０〜５００μＬの発光基質を、複合体沈殿物を入れた反応カップに加え、１〜５分間反応させ、ダークボックスに入れて発光値を読み取り、サンプルのチミジンキナーゼ１の含有量は発光値と正の相関関係であり、発光標準曲線からチミジンキナーゼ１の含有量を計算するステップとを含む、前記方法を提供する。

本発明の実施例のキットの技術的原理は次のとおりである。第１抗体と結合した磁性微粒子とビオチンによって標識された第２抗体が、サンプル、校正物質又は品質管理物質におけるチミジンキナーゼ１と結合してサンドイッチ複合体を形成できる。次に、アルカリホスファターゼによって標識されたストレプトアビジン試薬を加え、ストレプトアビジンがビオチンと特異的に結合して信号を増幅させる役割を果たし、外部磁場の作用で、免疫反応で形成させた複合体を結合されていない他の物質と分離し、複合体を洗浄した後、酵素触媒化学発光基質を加える。酵素の作用で基質が触媒によって分解され、不安定な励起状態の中間体が形成され、励起状態の中間体が基底状態に戻ると光子を放出し、発光反応を実現し、全自動化学発光免疫分析装置の光電子増倍管で光子強度を読み取りデジタル信号に変換する。検出範囲では、発光強度はサンプルのチミジンキナーゼ１の含有量と正比例し、改良４パラメータロジスティック方程式による当てはめでサンプルのチミジンキナーゼ１の濃度を計算できる。

本発明のキットでは、その検出特異性は比較分析で腫瘍細胞のＴＫ１陽性株及びＴＫ１陰性株におけるＴＫ１のレベルを測定することにより、本発明のキットによるＴＫ１検出の特異性を検証するものである。

本発明の第２態様では、チミジンキナーゼ１を検出するためのキットの用途が提供される。血清中のチミジンキナーゼ１を検出して細胞の異常増殖度を反映できるため、画像検査に先立って、健康診断を受ける者に早期の潜在的な異常細胞増殖を警告し、被験者に悪性腫瘍に発展するリスクを示す一方、小さな腫瘍の増殖速度を検出するためにも利用できる。

本発明の第３態様では、画像から検出できない小さな悪性腫瘍及び腫瘍リスク評価における前記キットの用途が提供される。つまり、当該キットは悪性腫瘍の早期発見及び腫瘍進行リスク予測の有効性を評価できる。言い換えれば、腫瘍の早期で、腫瘍の体積が小さいため画像から検出しにくいが、本発明の実施例のキットを用いて、チミジンキナーゼ１を検出及び分析し、他の医学的検査と組み合わせることにより、事前に腫瘍の発生を判断することができ、腫瘍のリスク評価にも利用できる。具体的には、当該キットを用いる検出方法は、前記実施形態の方法又はキットを用いて健康診断集団の被験者の生体サンプルから血清ＴＫ１物質のレベルを測定するステップと、次に前記血清サンプルにおける血清ＴＫ１物質のレベル又は事前に前記被験者において測定した血清ＴＫ１物質のレベルを比較するステップと、測定した血清ＴＫ１のレベルが上昇する場合、前記被験者における腫瘍関連疾患進行のリスクが大きくなることを提示するステップとを含む。

本発明の第４態様では、被験者の血清における細胞の異常な増殖の測定方法が提供され、当該方法は特に健康診断集団に適する。本発明の実施例では、当該方法は前記キットを用いて患者の血清におけるチミジンキナーゼ１の含有量を測定するステップと、前記血清チミジンキナーゼ１の含有量に基づいて前記患者（被験者）における細胞増殖が異常であるかどうかを評価するステップとを含む。

本発明の一実施例では、正常な細胞増殖又は腫瘍細胞増殖のレベルを測定し、且つ測定した血清ＴＫ１のレベルと比較することにより、被験者は正常な細胞増殖であるか、ベースラインを上回った細胞増殖であるかを決定する。

次の説明で本発明の付加的な態様及び利点の一部を示し、それが次の説明から明らかになり、あるいは本発明を実施して知られる。

本発明の上述した及び／又は付加的な態様及び利点は、次の図面を用いる実施例の説明から明らかで理解しやすいものになる。
図１は本発明の実施例に係る標準曲線図を示す。 図２は本発明の実施例に係る血清ＴＫ１濃度分布と人数％の検出結果図を示し、Ａはキット１、Ｂはキット２、Ｃはキット３である。 図３は本発明の実施例のキットでは、腫瘍細胞のＴＫ１陽性細胞株分解液の希釈濃度の高さとＴＫ１発現の多さに相関性があることを示す結果図である。 図４は本発明の実施例でヒトＳＴＫ１ｐ濃度と腫瘍増殖の相関性を示す模式図である。

次に本発明の実施例を詳細に説明し、図面に前記実施例の例を示し、各図で同じ又は類似する記号で同じもしくは類似するコンポーネント、又は機能が同じもしくは類似するコンポーネントを表す。次に、図面を参照して説明される実施例は例示的なもので、本発明を説明するために供し、本発明に限定を加えるものとは理解できない。

なお、用語「第１」、「第２」は説明のためにのみ使用され、相対的な重要性を示し又はそれを暗黙的に示すものでもなければ、対象となる技術的特徴の数量を暗黙的に示すものでもない。したがって、「第１」、「第２」で限定された特徴は１つ以上の対象特徴を明示的に含んでもよいし、暗黙的に含んでもよい。さらに、本発明の説明で、特に説明がない限り、「複数」とは２つ以上を意味する。

次に、具体的な実施例を参照して、本発明を説明する。なお、これらの実施例は説明に供するものに過ぎず、本発明に限定を加えるものとは理解できない。

次に実施例を用いて本発明の技術的解決手段を説明する。当業者が理解したように、次の実施例は本発明の説明に供するもので、本発明の範囲を限定するものとは見なされない。実施例で技術又は条件が具体的に示されない場合、本分野の文献に記載の技術、条件又は製品の取扱説明書に従って実施される。使用する試薬又は装置はメーカーが記載されないものは、いずれも市販品で通常のルートから入手できる。例えば、Ｓｉｇｍａ社から購入する。

（実施例１）
本発明の実施例のキットは校正物質と、品質管理物質と、ブロッキング剤と、第１抗体と結合した磁性微粒子試薬（磁性微粒子と結合した第１抗体ともいう）と、ビオチンによって標識された第２抗体（抗体試薬ともいう）とを含み、ストレプトアビジンによって標識されたアルカリホスファターゼ、発光基質、抗体試薬、希釈液、洗浄液の調製方法は以下のとおりである。
１．第１抗体と結合した磁性微粒子試薬
１）充分に均一に混合したトルエンスルホニル基磁性微粒子濃縮液を反応フラスコに入れ、当該反応フラスコを磁場に１５分間置き、全てのトルエンスルホニル基磁性微粒子が磁場によって吸着された後、上清を吸い取り、反応フラスコに１０倍の体積の磁性微粒子活性化バッファーを加え、振盪して１０分間洗浄し、さらに反応フラスコを磁場に１５１分間置き、上清を吸い取り、次にトルエンスルホニル基磁性微粒子を２回洗浄し、最後にトルエンスルホニル基磁性微粒子溶液を１０ｍｇ／ｍＬに希釈し、使用に備えて均一に混合しておいた。
２）結合反応としてトルエンスルホニル基磁性微粒子溶液：第１抗体＝１００：１の質量比でステップ１）で調製したトルエンスルホニル基磁性微粒子溶液に第１抗体を加え、総体積の１／１０の磁性微粒子触媒バッファーを加え、３７℃で均一に混合した状態を保持して１８時間反応させ、第１抗体とは配列番号６に示す配列を抗原としてニワトリを免疫化させて得たポリクローナル抗体であった。
３）ステップ２）で調製した磁性微粒子溶液に溶液の総体積の１／２０の１０％ＢＳＡを加え、３７℃で均一に混合した状態を保持して６時間反応させた。
４）反応フラスコを磁場に１５分間置き、トルエンスルホニル基磁性微粒子が磁場に吸着されると磁性微粒子洗浄液で３回洗浄し、次に１ｍｇ／ｍＬに定容し、４℃で保存して、磁性微粒子と結合した第１抗体を得た。

当該磁性微粒子活性化バッファーの調製方法は５．１８〜７．３６ｇのホウ酸を９００ｍＬの脱イオン水に溶解し、ＮａＯＨでｐＨを８〜１０に調整し、１Ｌに定容した後、０．４５μｍメンブレンフィルターで濾過することである。
磁性微粒子触媒バッファーの調製方法は１００〜１５０ｇの硫酸アンモニウムを１Ｌの磁性微粒子活性化バッファーに溶解し、完全に溶解すると０．４５μｍメンブレンフィルターで濾過することである。
磁性微粒子洗浄液はｐＨ７．４のＴＢＳＴバッファーであった。

２．ビオチンによって標識された第２抗体
ＰＢＳで２〜５ｍｇの第２抗体溶液を調製し、ＤＭＳＯでビオチンを５〜５０ｍＭの溶液に調製し、抗体溶液にビオチン溶液を加えて均一に混合し、２時間の氷浴又は室温で３０分間反応させて、ビオチンによって標識された第２抗体溶液を得た。
ビオチンによって標識された第２抗体溶液を０．２μｇ／ｍＬに希釈した。
第２抗体とは配列番号６に示す配列を抗原としてニワトリを免疫化させて得たポリクローナル抗体であった。
３．発光基質
ＡＰＳ−５（華信行から購入）
４．ブロッキング剤
脱脂粉乳
５．希釈液
０．１ｇ〜１０ｇのブロッキング剤を１ＬのＴｒｉｓバッファーに溶解し、０．１ｍＬ〜５ｍＬの防腐剤を加え、完全に溶解すると０．２２μｍメンブレンフィルターで濾過して得た。
６．洗浄液
ｐＨ７．４のＴＢＳＴバッファー（３０倍の濃縮液）
７．ストレプトアビジンによって標識されたアルカリホスファターゼ
ストレプトアビジンによって標識されたアルカリホスファターゼはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入されたストレプトアビジンによって標識されたアルカリホスファターゼを、希釈液で５００００倍に希釈したものであった。

（実施例２）
実施例１の血清ＴＫ１検出キットを評価し、方法は具体的に次のとおりである。
１．サンプル調製：
（１）基礎血清：１ｍＬの血清（濃度２．２ｐｍｏｌ／Ｌ）＋０．１ｍＬの蒸留水
（２）回収サンプル１：１ｍＬの血清＋０．１ｍＬのＴＫ１抗原溶液（濃度１１ｐｍｏｌ／Ｌ）
（３）回収サンプル２：１ｍＬの血清＋０．１ｍＬのＴＫ１抗原溶液（濃度８０ｐｍｏｌ／Ｌ）
（４）品質管理サンプル１：１ｍＬの標準品１＋５ｍＬの標準品希釈液（最終濃度２．２ｐｍｏｌ／Ｌ）
（５）品質管理サンプル２：１ｍＬの標準品１＋１ｍＬの標準品希釈液（最終濃度１０ｐｍｏｌ／Ｌ）

２．試験前処理：
１）精製水で洗浄液を３０倍希釈させた。
２）目視で沈殿物が認められないように、磁性微粒子試薬を充分に均一に混合させた。

３．試験方法：本キットは全自動化学発光分析装置によって自動的に行われてもよいし、手動操作で行われてもよい。
１）検出試験管に１０μＬの被験サンプル、６０μＬのサンプル希釈液、３０μＬの磁性微粒子試薬を加えて均一に混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。
２）磁場を付与し、検出試験管内の反応系における磁性微粒子を沈下させ、上清液を除去し、複数回洗浄した後、磁場を除去した。
３）ステップ２）で洗浄した反応系に１００μＬの抗体試薬を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。
４）磁場を付与し、検出試験管内の反応系における磁性微粒子を沈下させ、上清液を除去し、複数回洗浄した後、磁場を除去した。
５）ステップ４）で洗浄した反応系にストレプトアビジンによって標識されたアルカリホスファターゼ試薬１００μＬを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。
６）磁場を付与し、検出試験管内の反応系における磁性微粒子を沈下させ、上清液を除去し、複数回洗浄した後、磁場を除去した。
７）２００μＬの化学発光基質を加え、充分に均一に混合した後、室温で、遮光環境で２分間反応させ、相対発光強度（ＲＬＵ）を検出した。

４．標準曲線：
１）標準品調製：
３１ペプチド抗原凍結乾燥粉末（外部購入）を標準品希釈液（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰ０_４、１０ｍＭのＮａＨ_２Ｐ０_４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、５％グリセリン、ｐＨ７．４）に溶解して１ｍｇ／ｍＬの濃度にし、キット３で前記抗原溶液の濃度を測定及び確認し、測定後に濃度を２０ｐｍｏｌ／Ｌに調整した（標準品１）。引き続き標準品希釈液を使用して標準品１を３倍希釈して標準品２を得、標準品希釈液を使用して標準品２を３倍希釈して標準品３を得、標準品３を２倍希釈して標準品４を得、標準品希釈液を標準品５とし、このように得た標準品１〜５の理論上の濃度はそれぞれ２０ｐｍｏｌ／Ｌ、６．６ｐｍｏｌ／Ｌ、２．２ｐｍｏｌ／Ｌ、１．１ｐｍｏｌ／Ｌ、０ｐｍｏｌ／Ｌであった。
２）標準曲線の作成：
キット１で５つの標準品を測定して、発光値を得た。理論上の濃度と発光値を組み合わせて標準曲線を作成し、図１に示すように、Ｒ値は０．９９９であった。

５．回収率試験：
基礎血清、回収サンプル１及び回収サンプル２をそれぞれ本発明に記載の方法で３回繰り返し測定し、結果は以下のとおりである。

６．精度試験
品質管理サンプル１（２．２ｐｍｏｌ／Ｌ）及び品質管理サンプル２（１０ｐｍｏｌ／Ｌ）をそれぞれ本発明に記載の方法で２０回繰り返し測定し、結果は以下のとおりである。

試験結果が、本発明の実施例のキットは回収率及び精度が高いことを示す。

（実施例３）
本実施例で、３種のキットを用いて１４８例の健康診断血清からＴＫ１を検出し、当該３種のキットにはそれぞれ３種の異なる抗体及び方法が用いられ、具体的には以下のとおりである。
キット１：実施例１のキットで、全自動化学発光免疫分析装置と組み合わせて測定した。
キット２：当該キットのキット１との違いは、第２抗体として実施例１の３１ペプチドで免疫化させて得たＩｇＹポリクローナル抗体を有し、実施例１の３１ペプチドで免疫化させて得たマウスＩｇＧモノクローナル抗体を第１抗体とし、実施例１のキットの各試薬で調製して形成させたサンドイッチはＩｇＹ＋ＩｇＧであり、全自動化学発光免疫分析装置のキットと組み合わせて測定した。
キット３：ドットブロット増強化学発光（ＥＣＬ）免疫検出キット（華瑞同康生物技術有限公司から購入、商品名はチミジンキナーゼ１（ＴＫ１）細胞周期分析キット）
検出結果では、キット１とキット３の検出結果の一致率は７３％であり、キット２とキット３の検出結果の一致率は５４％であった。試験結果の詳細を図２に示し、キット１及びキット３による集団健康診断の個体の血清ＴＫ１濃度値の低い順の分布を、Ｅｘｃｅｌで製図して分析したところ、その特徴がこれまでに発表された一般的な集団健康診断スクリーニングの調査研究と同じであり、図３に示すようにキット１及びキット３の分布特徴は正規分布に近い分布で、メインピークが０．２〜０．３ｐｍｏｌ／Ｌであることであり、ＳＴＫ１ｐ濃度が０．６ｐｍｏｌ／Ｌから徐々に２ｐｍｏｌ／Ｌに上昇すると、連続的に低下する小さなエンドピークが認められ、集団健康診断の血清ＴＫ１濃度分布が正規分布に近い分布を示すのが特徴であるという事実は重要な発見であり、血清ＴＫ１ｐ濃度分布は自然の規律に従う分布であることを示し、その測定感度が０．１〜０．２ｐｍｏｌ／Ｌに達する。血清ＴＫ１濃度の分布を観察すると０．６ｐｍｏｌ／Ｌ〜２．０ｐｍｏｌ／Ｌ〜＞２．０ｐｍｏｌ／Ｌには連続的に上昇する小さなエンドピークが認められ、当該連続的に上昇する小さなエンドピークは当該区間の集団個体では前がん疾患／悪性腫瘍に発展するリスクが上昇する可能性があることを反映した。キット２では、血清ＴＫ１値の８３％が負の値であり、血清ＴＫ１値はメインピークが０．２〜０．３ｐｍｏｌ／Ｌで正規分布に近い分布を示さないという特徴は、感度が高くないことを示す。

（実施例４）
本実施例では、実施例３のキット１及びキット２を用いてＴＫ１陽性細胞株及び陰性細胞株の細胞分解液からＴＫ１を測定し、具体的には以下のとおりである。
ＴＫ１陽性細胞株（ヒト結腸腫瘍ＴＫ１^＋：ｈｔ２９）及びＴＫ１陰性細胞株（ヒト結腸腫瘍：１４３ｂ ＴＫ−、ＴＫ１遺伝子ノックアウト細胞）をそれぞれ培養し、細胞対数増殖期になり、濃度が１×１０^７／ｍＬになると、１ｍＬの細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去して１ｍＬの細胞分解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０）を加え、４℃で２０分間処理し、１５０００回転で１０分間遠心分離した後、上清を取り分けた。ＰＢＳで陰性細胞株分解液及び陽性細胞株分解液をそれぞれ希釈し、陰性細胞株分解液を１０倍希釈し、陽性細胞株分解液をそれぞれ１０倍、５０倍、１００倍希釈した後、キット１及びキット２でそれぞれ当該細胞分解液を測定した。

キット１の検出結果を図３に示す。ＴＫ１陽性細胞株分解液の希釈濃度の高さとＴＫ１発現の多さに相関性があるが、キット２の結果が異常で、ＴＫ１陽性細胞株分解液の希釈濃度の高さとＴＫ１発現の多さに相関性が認められなかった（図には示さない）。検出結果図による陽性細胞株のＴＫ１値のデータで、１つの対数増殖期の腫瘍細胞には約０．０２１ｐｇのＴＫ１タンパク質があると算出し、１つの腫瘍細胞の総タンパク質が２００ｐｇであることで計算すると、０．０１％であった（０．０２１ｐｇ／２００ｐｇ総タンパク質＝０．０１％）。したがって、増殖中の腫瘍細胞にＴＫ１の含有量が非常に低く、正確に検出するには高感度の検出システムが必要である。腫瘍細胞中のＴＫ１が血液に放出されると、人体の血液量が約５０００ｍＬであることで計算すると、増殖中の腫瘍細胞が５２００万個あれば、血清中のＴＫ１値を検出でき、従来のイメージングシステムでは１０億個の腫瘍細胞が必要であり、画像から検出できるのは直径が約１ｍｍに達する腫瘍である。

本発明のキット１の検出システムは高感度を有し、画像から検出できない小さな悪性腫瘍の場合、血清ＴＫ１値の上昇を検出すると、患者には細胞の異常な増殖のある前がん疾患／画像から検出できない小さな悪性腫瘍があることを予告する。図２及び図３に基づいて、ＳＴＫ１ｐの値と増殖腫瘍細胞数（増殖速度）及び時間との相関性の模式図の図４を作成した。図中、画像検出閾値線の下方は画像から検出できない又はアクセスできない前がん疾患もしくは小さな悪性腫瘍であり、画像検出閾値線の上方は画像から検出できる又はアクセスできる悪性腫瘍であり、本発明の実施例のキットはＳＴＫ１＞２ｐｍｏｌ／Ｌで、画像から検出できない小さな悪性腫瘍／細胞の異常な増殖のある前がん疾患を検出できる。図に示すように、血清ＴＫ１の発現は腫瘍増殖の早期及び中期で腫瘍細胞の増殖数と密接に関連し（腫瘍細胞が１０億個未満）、しかし多くの場合は、血清ＴＫ１の発現は腫瘍増殖の後期で低下し、これは腫瘍増殖の後期に腫瘍組織が増大し体積が大きく、画像から検出できるが、このような大きな腫瘍組織の中心に程度の差はあるが組織壊死が認められるため、増殖速度が低下し、ＳＴＫ１ｐ濃度レベルも低下したからである。さらに、本発明の実施例のキットを用いて、血清ＴＫ１の上昇値を検出すると画像から検出できない小さな潜在的な悪性腫瘍を早めに検出することができ、細胞の異常な増殖のある前がん疾患のリスク評価にも利用できる。

本明細書の説明で、用語「一実施例」、「いくつかの実施例」、「例」、「具体例」、「いくつかの例」などを含む記載は当該実施例又は例を用いて説明された特定の特徴、構造、材料又は特性が本発明の少なくとも１つの実施例又は例に含まれることを意味する。本明細書で、前記用語が出現する場合は必ずしも同じ実施例又は例が対象になるとは限らない。また、説明される特定の特徴、構造、材料又は特性が任意の１つ以上の実施例又は例で適切に組み合わされてもよい。

本発明の実施例を示しこれを説明したが、当業者が理解したように、本発明の原理及び趣旨を逸脱せず、これらの実施例に様々な変形、修正、置換を行うことができ、本発明の範囲は特許請求の範囲及び同等なものによって限定される。

Claims (11)

1. 既に固体担体に固定された又は固体担体への固定に適する第１ポリクローナル抗体と、
   マーカーで標識された第２ポリクローナル抗体とを含み、
   前記第１ポリクローナル抗体及び前記第２ポリクローナル抗体はいずれもニワトリ抗ヒトＩｇＹ−チミジンキナーゼ１ポリクローナル抗体であり、且つ、前記第１ポリクローナル抗体及び前記第２ポリクローナル抗体はいずれもチミジンキナーゼ１との特異的結合に適することを特徴とするキット。
2. 前記第１ポリクローナル抗体及び前記第２ポリクローナル抗体が認識する抗原エピトープは、
   炭素末端の第３ペプチドセグメントであって、配列番号３に示す配列を備える前記第３ペプチドセグメントを含み、
   炭素末端の第１ペプチドセグメントであって、配列番号１に示す配列を備える前記第１ペプチドセグメント、
   炭素末端の第２ペプチドセグメントであって、配列番号２に示す配列を備える前記第２ペプチドセグメント、
   炭素末端の第４ペプチドセグメントであって、配列番号４に示す配列を備える前記第４ペプチドセグメント、
   炭素末端の第５ペプチドセグメントであって、配列番号５に示す配列を備える前記第５ペプチドセグメントから選ばれた少なくとも２種の前記ペプチドセグメントを含むことを特徴とする請求項１に記載のキット。
3. 前記第１ポリクローナル抗体及び前記第２ポリクローナル抗体は抗原で異なるニワトリを免疫化させて得たもので、前記抗原はヒトチミジンキナーゼ１の炭素末端のポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のキット。
4. 前記抗原は配列番号６に示す配列を備えることを特徴とする請求項３に記載のキット。
5. 標識認識物質と結合した基質発光触媒であって、前記標識認識物質が特異的に前記マーカーを認識する前記基質発光触媒と、
   発光基質であって、前記基質発光触媒の作用で光信号を発する前記発光基質とをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のキット。
6. 前記マーカーはビオチンであり、前記標識認識物質はストレプトアビジンであることを特徴とする請求項５に記載のキット。
7. 前記固体担体は磁性微粒子であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
8. 校正物質、品質管理物質、抗体試薬、希釈液、洗浄液をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のキット。
9. チミジンキナーゼ１を検出するための請求項１〜８のいずれか１項に記載のキットの用途。
10. 画像から検出できない小さな悪性腫瘍及び腫瘍／前がん疾患のリスク評価における請求項１〜８のいずれか１項に記載のキットの用途。
11. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のキットを用いて患者の血清におけるチミジンキナーゼ１の含有量を測定するステップと、
    前記チミジンキナーゼ１の含有量に基づいて前記患者（被験者）における細胞増殖が異常であるかどうかを評価するステップとを含む被験者における細胞の異常な増殖の測定方法。

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