CN113150159A - 鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体用于识别大分子复合物的用途 - Google Patents

鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体用于识别大分子复合物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鸡抗人胸苷激酶1‑IgY多克隆抗体用于识别大分子复合物的用途，特别是识别人血清中TK1与蛋白质结合形成的大分子复合物的用途。通过利用鸡抗人胸苷激酶1‑IgY多克隆抗体，主要识别人血清中TK1与蛋白质结合形成的大分子复合物区域，其血清学检测试剂盒适用于筛查早期肿瘤风险进程和评估肿瘤患者预后的可信性。

Description

鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体用于识别大分子复合物的 用途
技术领域
本发明属于抗体及应用领域，特别涉及鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体用于识别大分子复合物的用途，特别是识别人血清中TK1与蛋白质结合形成的大分子复合物的用途。
背景技术
人胸苷激酶(ATP:thymidine-5’phosphotransferase)简称人TK1，是一种嘧啶补救途径的酶，其催化脱氧胸苷（dThd）转化为脱氧胸苷单磷酸（dTMP），是唯一一种将胸苷引入DNA 合成途径的酶，因此在DNA 合成中具极为关键的酶之一。人TK1酶在细胞周期的G1/G0期活性和浓度低，但在S/G2期升高。人TK1 在S 期晚期和G2期的活性和浓度水平在不同类型细胞可能有所差异，如恶性或非恶性生长细胞 (Sherley JL., Kelly TJ. 1988）。其表达水平主要受翻译后调控机制的影响，它在有丝分裂期的降解，受控于泛素蛋白酶体途径介导的蛋白降解途（Ke PY., Chang ZF.,2004）。
肿瘤细胞是逃逸了细胞凋亡调控规律而导致异常分裂增殖的细胞。肿瘤细胞（包括S和G2期的细胞）中的胸苷激酶1被释放至体液。因此，在细胞过度增生的情况下，血清TK1水平与肿瘤细胞增殖速度相关，并与肿瘤疾病的进程轻重程度，高水平TK1活性和浓度与肿瘤细胞增殖的高速度密切相关和肿瘤患者的生存和复发风险预后密切相关；但正常的细胞分裂是按照细胞凋亡调控规律进行，细胞内TK1在细胞分裂之前已经被降解，体内正常细胞增殖不会导致血清TK1水平的增加。（Skog S. 等, 2017）
在 1960 年初已提出检测血清TK活性方法是评估肿瘤细胞增殖度的唯一好的标志物（Clear J， 1967）。采用血清学检测TK1酶催化功能的活性方法是有效评估肿瘤患者的生存和复发风险预后，但一个建立血清学TK1浓度检测方法，真实的评估血清TK1水平与肿瘤细胞增殖速度相关的可信性，特别是用于体检筛查的真实早期肿瘤风险进程是一项艰难的研发工作。需要按照国际ROC分析曲线，达到下面积（AUC）达到 0.9 以上，误判率低的情况（Chen ZH. 等， 2011）。按照临床肿瘤预后评定 (REMARK，国际统一的指南) ，验证这华瑞同康的血清学TK1检测方法是有评估肿瘤患者生存和复发风险的可信性。
采用TK活性的方法已经使用于检测组织中细胞增殖度。检测肿瘤组织中细胞质的TK活性，已被报导作为一肿瘤细胞增殖度标记的好方法。从1692个乳腺癌患者乳腺癌组织分析TK活性检测显示，高TK1活性与短的生存率(Broet P. 等, 2000)。高TK1活性预示内分泌药物治疗患者预后差和短的生存率(Skog S. 等， 2017)。
由于检测TK活性的底物不是人TK1的专一性底物，与所有生物源如存在人体液中感染的细菌和病毒等共享同一底物，将可能导致血清中TK活性异常升高（Topolcan O. 等，2008），所以不适用于人群体检筛查。目前未有任何文献报告应用于人群体检筛查。
在肿瘤相关血清生物标记物中，TK1抗体检测血清中TK1的浓度是目前被认定的唯一评价肿瘤增殖速度的优选标志物。但是并非所有的TK1抗体都有适用于体检筛查中的早期筛查恶性肿瘤的风险的进程。
因此，在本领域中仍然需要一种具有上述的医学应用价值的特异抗体，才能对体检筛查中的早期恶性肿瘤风险进行评估。
发明内容
在一个方面，本申请提供了鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体用于识别大分子复合物的用途，其中所述大分子复合物是人血清中TK1与蛋白质结合形成的大分子复合物。通过识别人血清中TK1与蛋白质结合形成的大分子复合物，能够检测人血清TK1分子形式特征，筛查早期肿瘤风险进程，用于血清学检测试剂盒来评估肿瘤患者预后的可信性。
在一些实施方案中，所述多克隆抗体是由人胸苷激酶1 的C-端31肽制备的鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体，其中所述C-端31肽的氨基酸序列为195-225：GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ。
在一些实施方案中，所述大分子复合物中 90-75%的分子量分布在 730-300 KD，主峰为≈700 KD。
在一些实施方案中，所述多克隆抗体与人TK1 的C-端31肽中的构象性多表位1-5的协同反应，尤其是必须与表位4、2和5进行反应。人TK1的C-端31肽中 5个构象表位如下：
表位1：GEAVAARKLF，序列213-222
表位2：NCPVPGKPGE，序列205-214
表位3：PVPGKPGEAV，序列207-216
表位4：NCPVPGKPGEAV ，序列205-216
表位5: GQPAGPDKEN 序列，195-216。
在前述实施方案中，所述多克隆抗体与人TK1-31肽中的构象性多表位1-5发生协同反应，能够有意义地提升免疫反应亲和功效。与此相比，鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体与人TK1-31肽和的构象性表位1-5 无协同免疫反应。
在前述实施方案中，所述识别还包括使用鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体试剂，在同等抗体和抗原浓度条件下，与所述多克隆抗体比较，所述单克隆抗体试剂与表位4、2和5发生反应效率降低10倍。在另一些实施方案中，所述单克隆抗体试剂不能识别人血清中TK1与蛋白质结合形成的大分子复合物区域。在另一些实施方案中，所述单克隆抗体试剂适用于临床肿瘤免疫组织化学应用，但不适用于血清学临床肿瘤生存率预后评估和早期肿瘤风险筛查。
在另一些实施方案中，所述多克隆抗体适用于血清学检测试剂盒来评估肿瘤患者预后的可信性。
在另一方面，本申请提供了鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体用于制备识别人血清中TK1与蛋白质结合形成的大分子复合物的试剂盒的用途。在一些实施方案中，所述试剂盒为肿瘤患者生存率预后评估试剂盒，用于对肿瘤患者生存率进行预后评估。在另一实施方案中，所述试剂盒为血清学筛查早期肿瘤风险进程试剂盒，用于血清学筛查早期肿瘤风险进程。
在前述实施方案中，所述多克隆抗体是由人胸苷激酶1 的C-端31肽制备的鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体，其中所述C-端31肽的氨基酸序列为195-225：GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ。
在前述实施方案中，所述多克隆抗体主要识别人血清中TK1与蛋白质结合形成的大分子复合物区域： 90-75%的分子量分布在 730-300 KD，主峰为≈700 KD。
在前述实施方案中，所述多克隆抗体与人TK1 的C-端31肽中的构象性多表位1-5的协同反应，尤其是必须与表位4、2和5进行反应。人TK1的C-端31肽中 5个构象表位如下：
表位1：GEAVAARKLF，序列213-222
表位2：NCPVPGKPGE，序列205-214
表位3：PVPGKPGEAV，序列207-216
表位4：NCPVPGKPGEAV ，序列205-216
表位5: GQPAGPDKEN 序列，195-216。
在前述实施方案中，所述多克隆抗体与人TK1-31肽中的构象性多表位1-5发生协同反应，能够有意义地提升免疫反应亲和功效。与此相比，鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体与人TK1-31肽和的构象性表位1-5 无协同免疫反应。
在另一些实施方案中，所述试剂盒还包含鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体试剂，在同等抗体和抗原浓度条件下，与所述多克隆抗体比较，所述单克隆抗体试剂与表位4、2和5发生反应效率降低10倍。在另一些实施方案中，所述单克隆抗体试剂不能识别人血清中TK1与蛋白质结合形成的大分子复合物区域。在另一些实施方案中，所述单克隆抗体试剂适用于临床肿瘤免疫组织化学应用，但不适用于血清学临床肿瘤生存率预后评估和早期肿瘤风险筛查。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
1.在本申请中，通过利用鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体，能够检测人血清TK1分子形式特征，筛查早期肿瘤风险进程，用于血清学检测试剂盒来评估肿瘤患者预后的可信性。
2.所述多克隆抗体能够与人TK1-31肽中的构象性多表位1-5、尤其是表位4、2和5发生协同反应，从而有意义地提升免疫反应亲和功效。
附图说明
图1是采用蛋白质印迹方法和组织学免疫化学方法，分别鉴定和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体和鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体鉴定抗体的特异性。图1A示蛋白质印迹方法）分别鉴定两种鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（图1A-a和-b ）和鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体鉴定抗体（图1A-c）的特异性; 图1B示组织学免疫组化图。鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（057M）鉴定单抗的特异性（SSTK小鼠杂交细胞瘤株057M，保藏于中国典型培养物保存中心，保藏编号：CCTCC NO: C2019268，保藏日期：2019年11月28日，地点：武汉大学)；
图2A和2B是采用分子排阻色谱柱分析方法检测STK1浓度在大分子形式到小分形式区域（720-17 KD）中24个组分的分子形式分布的特征图，其中图2A为鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体的检测结果，图2B为鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体的检测结果；
图3是采用分子排阻色谱柱得到的组分1-5 利用SDS蛋白质电泳和考马斯蓝染色分析蛋白质复合物中所含蛋白质分子量分布情况的结果图；
图4是采用增强发光免疫点印迹法检测两种鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体在24个组分的STK1p的浓度分布特征的结果图；
图5A和5B是采用鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体分别检测血清TK1的浓度的结果图；
图6A-B分别是增强发光免疫点印迹（ECL）法和夹心ELISA测定方法分别检测血清TK1的浓度，比较两者符合率的图；
图7A是鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体检测肿瘤患者血清TK1浓度与健康人血清TK1浓度的结果图；图7B显示中国安群公司的人TK1-IgG 单克隆抗体试剂盒检测肿瘤患者血清TK1浓度与健康人血清TK1浓度的比较结果图；
图8是鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（SSTK 小鼠杂交细胞瘤株057M）采用组织学免疫化学方法，分别鉴定这两种TK1抗体的特异性（图8A：鸡抗人胸苷激酶1-IGY多克隆抗体和图8B：鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体）和验证这两种抗体对大肠癌肿瘤患者生存率预后评估效果的对比图（图8C：鸡抗人胸苷激酶1-IGY多克隆抗体和图8D：鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体）；
图9是鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体检测肿瘤患者的STK1浓度所得结果的对比图；和
图10是鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体分别检人TK1-C端31肽的5个表位功效的结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
图1是采用人TK1的C端31肽（序列号195-225）和与TK1酶活性相关的23肽（161-183）分别制备了两种的鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体，制备方法见我们发表的文献（HeQ. 等, 2004）。采用人TK1的C端31肽（序列号195-225）制备了鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体，制备方法见我们发表的文献 (Wu C. 等， 2003). 现采用蛋白质印迹方法和组织学免疫化学方法，分别鉴定这两种鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体和鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体的特异性。图1A示蛋白质印迹方法，分别鉴定了两种鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（图1A-a和-b ）和鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体鉴定抗体（图1A-c）的特异性;图1B示组织学免疫组化图，鉴定了鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（057M）鉴定单抗的特异性的结果图。
蛋白质印迹方法是采用淋巴肿瘤CEK1M T阳性细胞（C+）和CEM TK1阴性细胞（C-）的萃取液，进行天然胶蛋白质印染。从图1A-a, b 和 c可见，仅采用CEM TK1阳性细胞（C+）萃取液，呈现出一条明显的人TK1电泳带，但采用CEM TK1阴性细胞（C-）的萃取液，未呈现人TK1的电泳带。因此，图1A结果表明鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体和鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体鉴定抗体是与人TK1有特异性反应。
图1B 是乳腺癌检查和病理科鉴定的癌前病变和原位癌患者，采用用鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（克隆号057M）进行免疫组织化学鉴定照片的举例图，见图B。通过大人群女性常规乳腺癌检查和病理科鉴定，发现47例乳腺肿块患者为良性或癌前病变和60例患者原为癌。进一步地，采用活检或组织切片，用鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体进行免疫组织化学鉴定。免疫组化方法简述如下：石蜡包埋切片标本（厚4μm）经脱蜡水化，切片浸入标靶修复液（Dako, Copenhagen, Denmark），切片浸入3% H2O2溶液以灭活内源性酶；加试剂盒内的封闭剂封闭非特异性结合点；加入TK1单克隆抗体（合适浓度1mg/ml，用PBS 稀释800X），在室温下孵育2小时；用PBS溶液清洗切片；加EnVisiong复合物并在室温下孵育40分钟；二氨基联苯胺显色并用苏木精对载玻片进行复染色。显微镜下计数癌前病变和原位癌患者切片中的肿瘤细胞中的TK1的染色的标记指数（LI）。癌前病变和原位癌患者肿瘤细胞中TK1染色的标记指数分别为LI<5 和LI>50%，两者的显示有统计学显著性意义差别（p<0.0001）。
图2：使用高效液相色谱（FPLC）仪和分子排阻色谱柱（Superose 12， 1.0×30 cm，GE Healthcare）检测 STK1浓度在大分子形式到小分形式区域（720-17 KD）中的24组分的分子形式分布特征。检测方法上是按照Kalstrum AR 等描述的方法进行 [Kalstrum AR.等，1990]，并做了轻度修改。
具体操作步骤如下：配置样品缓冲液（0.01 M HEPES/KOH，0.15 M NH4Cl, 0.02%NaN3，pH 7.6），加入色谱柱中，过夜平衡Superose 12柱。取淋巴肿瘤患者术前血清并保存于-80度。利用高效液相色谱（FPLC）仪和分子排阻色谱柱分部收集，经ECL点印迹方法测得STK1的浓度为40pM（系肿瘤细胞高增殖度患者）。取200微升稀释到200 微升的样品缓冲液（1:1）。用样品缓冲液以0.4 毫升/分钟的流速洗脱。分部收集（0.4 毫升）24个组分，检测每个组分的TK1浓度。所用试剂为：标准蛋白（购于GE：α2-巨球蛋白（720 kDa）、β-淀粉酶（200kDa）、牛血清白蛋白（66 kDa）、卵清蛋白（45 kDa）、马肌球蛋白（17 kDa）。
进一步地，用天然胶蛋白印迹方法（Pan Z. 等, 2011），采用同一人TK1中的31肽免疫抗原制备的人鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体试剂盒和人鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（5#）试剂盒，分别检测采集自该患者的24个组分。结果发现，TK1-IgY多克隆抗体主要识别人血清中的TK1与蛋白质结合形成形成的大分子复合物区域：90-75% 分布在730-300 KD，主要峰为≈700 KD（见图2A），与2009年Kalstrum AR.等和2012年Sharif H. 等已公布哺乳动物血清TK1活性主要分布的这大分子复合物区域（≈700 KD）相同，因此可以断定其检测的TK1的浓度是真实的评估这患者的肿瘤细胞增殖活性功能。与此相比，人TK1-IgG 单克隆抗体主要识别血清TK1分子，分布在150-45 KD区域，主峰为≈66 KD（见图2B）。TK1在90-60 KD的四-二聚体TK1游离分子形式，与鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体比较，总浓度低至10%下。由于二聚体是一种具有高 Km 值（15μmol/L）和低催化效率形式的酶，但人TK1四聚体形式的酶却具有低Km 值（0.7μmol/L）和高催化效率，与二聚体相比，其催化磷酰基转移反应效率升高30 倍，游离的四聚体与二聚体是不稳定的，在不同条件下，是可以转换（Munch-Petersen B. 2009），所以，其水平的高低与评估这患者的肿瘤增殖活性功能没有密切相关性。
图3是对前述1-5 组分进行SDS蛋白质电泳和考马斯蓝染色的结果。结果表明，该大分子复合物（≈700 KD）中含有大小不同的蛋白质分子是与TK1蛋白质结合形成的分子复合物。
图4是人TK1的C端31肽（序列号195-225）和与TK1酶活性相关的23肽（161-183）分别制备的鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体。采用增强发光免疫点印迹法检测比较两种鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体在这24个组分的STK1p的浓度分布特征的结果图。增强发光免疫点印迹法检测方法简述如下：将前述24个组分分别点样至NC 膜（HybandTM-C，GE），将NC膜浸泡于含有 10% 脱脂奶粉的TBS 溶液中封闭30分钟，分别加入合适浓度的两种鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体反应2小时（37 oC），之后加入生物素标记的羊抗鼠二抗体，室温孵育4小时，再将膜与含有SA-HRP的TBS缓冲液孵育40分钟，加入底物 ECL使其发光，由CIS-Ⅱ成像系统进行读取（SSTK Ltd. China）OD值。
图4 结果显示，采用人TK1的C端31肽（序列号195-225）和与TK1酶活性相关的23肽（161-183）分别制备的不同鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体主要识别在血清中游离的TK1分子在90-60 KD的区域，其中31肽免疫的单克隆抗体比23肽免疫的单克隆抗体灵敏度高达三倍，进一步验证了图2中的结果。
图5A和5B是采用鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体分别用STK1-增强发光免疫点印迹法检测血清TK1的浓度的对比图。对已有医学信息的300例体检血清标本采用鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体分别检测血清TK1的浓度。血清TK1检测步骤简述如下：早晨采空腹血2ml于非肝素管中，室温放置2-3小时后4000r/min离心8-10分钟，取上清液，将3微升血清点至NC膜（HybandTM-C，GE）。校准品浓度为2.2pM、6.6pM和20pM，将NC膜浸泡于含有10%脱脂奶粉的TBS溶液中封闭30分钟，之后分别加入生物素标记的鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体或生物素标记的鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体，室温孵育 2小时，再将膜与含有SA-HRP的TBS缓冲液孵育40分钟，加入底物 ECL使其发光，由CIS-Ⅱ成像系统进行读取（SSTK Ltd.China）。基于已知浓度的TK1 标准的发光强度，计算血清TK1（STK1p）。所有实验均采用双盲法进行并重复两次，比较这两种方法检测血清TK1（STK1p）的个体之间的水平比较的符合率。图5示免疫增强发光点印迹方法结果指出，两者无符合率。对于图5A:TK1 pM 值和图5B:光吸收值（OD），分别为R2= 0.38，R2: 0.41），符合率低于75%。
图6A-B和7是增强发光免疫点印迹法和夹心ELISA测定方法分别检测血清TK1的浓度，比较两者的符合率的图。利用增强发光免疫点印迹法和夹心ELISA测定方法，将根据本申请的鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体与市购鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体进行对比，同时采用对已鉴定为肿瘤患者和健康人血清进行比较。具体而言，图6A和B分别是采用鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体（增强发光免疫点印迹法）和人TK1-IgG 单克隆抗体（瑞典Arocell ,ELISA夹心法）以血清标本13例进行比较的结果，R²=0.37, 表明两者无符合率。图7是采用鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体（STK1-增强发光免疫点印迹法）和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（中国安群公司,ELISA夹心法）检测10例血清标本，比较个体标本STK1之间的水平。图7A是鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体检测肿瘤患者血清TK1浓度与健康人血清TK1浓度，显示有意义的升高 (p=0.04)；图7B显示中国安群公司的人TK1-IgG单克隆抗体试剂盒检测肿瘤患者血清TK1浓度与健康人血清TK1浓度的比较结果，其表明两者无有意义的差别(p=0.089)。因此，两种抗体检测结果显示，符合率仅为R²= 0.5726，因此两者无符合率。
图8是鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（SSTK 小鼠杂交细胞瘤株057M）采用组织学免疫化学方法，分别鉴定TK1抗体的特异性（图8A 和B，方法同图1B中所述）和验证这两种抗体，分别对大肠癌肿瘤患者生存率预后评估效果的对比图（图8C和D）；在该组织学免疫化学鉴定评估中，患者是一结肠癌患者，病理分级鉴定为G2，临床分期为T2N1M0，TK1的染色验证了两种抗体都具有高度特异性（（图8A和B）。在该生存率预后评估效果的对比中，采用31肽制备的商用型试剂盒：鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（SSTK 小鼠杂交细胞瘤株057M）试剂盒比较分析人肿瘤患者生存率预后评估价值, 其中人肿瘤患者来源于随机选择的手术治疗前大肠癌肿瘤患者血清93例，已病理鉴定为大肠癌肿瘤患者，跟踪11年，血清标本保存于-20o以下。应用ROC统计学分析方法，设定本研究的手术前大肠癌肿瘤血清TK1的风险阈值为0.9pM,采用Kaplan–Meier统计学分析方法（SPSS version 25，IBM Corp., Armonk, NY,USA）进行分析。结果显示，仅鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体试剂盒对大肠癌患者生存率预后评估有统计学性意义差别（p=0.027），其中在STK1值低于0.9 pM时，生存率升高，预后好，STK1值高于0.9 pM时,生存率差，预后差。另外，采用鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（SSTK 小鼠杂交细胞瘤株057M）试剂盒对大肠癌患者生存率预后评估进行比较，结果表明无任何统计学性意义差别（p = 0.511）（图8C和D）。因此，鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（SSTK 小鼠杂交细胞瘤株057M）试剂盒评估人肿瘤患者的预后生存率没有价值。
图9是鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体检测肿瘤患者的STK1浓度所得结果的对比图。采用鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（SSTK 小鼠杂交细胞瘤株057M）试剂盒对随机选择已鉴定为大肠癌肿瘤患者收集手术治疗前患者血清93例进行相关性比较分析。图9 结果显示，鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体试剂盒检测出血清TK1值的平均值1.92±1.81pM (0.1-4.2pM)；鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（SSTK 小鼠杂交细胞瘤株057M）试剂盒检测出血清TK1值的平均值2.16±5.16 pM（0.02-46.2 pM）。两者符合率极低(r=0.0517)。将这两种试剂盒检测的STK1的个体之间的水平与乳腺和胃肠恶性肿瘤患者比较。采用鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（SSTK小鼠杂交细胞瘤株057M）试剂盒，所得STK1值波动在0.02-46.2 pM范围。据推测，出现这种大的波动的原因有＞10 %的血清TK1值异常高达 5 pM 以上，与患者的生存预后差没有相关性（见图8）。这观察结果表明，TK1单克隆抗体（SSTK 小鼠杂交细胞瘤株057M）虽然是临床肿瘤免疫组化的优选标志物，但不适用于血清学肿瘤患者预后评估，现在国内外已经有一系列TK1单克隆抗体，但没有提供采用血清学TK1检测方法，真实的评估人肿瘤患者的预后生存率和早期肿瘤筛查的有价值的文献。这表明好的TK1-抗体是必须识别在血清中的高分子量区域的TK1，根据本申请的TK1-IgY 多抗可以做到这一点，但现TK1-IgG单克隆抗体不能做到。
由上可见，好的TK1抗体必须识别在血清中的高分子量区域的TK1，其结果必须与临床肿瘤预后和体检早期肿瘤风险筛查的参数有好的相关性。否则，一种再稳定的TK1抗体，本身并无医学应用价值。
抗体识别抗原表位（性质、数目和空间构象）是决定免疫应答特异性的物质基础。本申请选择的这人TK1的C末端区域-TK1调控的细胞周期的关键序列暴露在TK1抗原分子表表面，属于一类依赖于TK1蛋白质空间构象而形成的五个功能构象表位。
人TK1的C端31肽（195-225序列 GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ）中 5个构象表位表位如下：
表位1：GEAVAARKLF，序列213-222
表位2：NCPVPGKPGE，序列205-214
表位3：PVPGKPGEAV ，序列207-216
表位4：NCPVPGKPGEAV ，序列205-216
表位5: GQPAGPDKEN，序列195-216
*其中功能构象表位4的氨基酸序列与2和 3 与重叠，为属于覆盖性表位(overlapping epitope).
图10是鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和IgG单克隆抗体分别采用人TK1C端31肽的5个表位功效的检测结果图。采用ELISA方法，分别用鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体与鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体，对人TK1C端31肽的5个表位功效进行比较测定。请注意，鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和IgG单克隆抗体检测人TK1C端31肽的5个不同表位功效是不相同的。通过选择鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体的最佳的抗体浓度为0.2μg/ml和最佳的抗原表位浓度为0.02μg/ml，发现鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体是主要与所有构象性表位1-5协同免疫反应，其中构象性表位4、2和5的高效协同反应，明显的提高了免疫反应亲和力，但TK1单克隆抗体与TK1-31肽的构象性表位1-5免疫反应比较弱（OD值≈0.09），无有意义的差别（图10A）。
进一步地，将TK1-31肽和每个表位浓度提高至10-25倍（0.2 μg/ml-0.5μg/ml），发现TK1单克隆抗体是主要与表位4的免疫反应提升15倍（OD值≈0.30-0.4），但每个升高表位的浓度为0.5μg/ml，没有意义的提升免疫反应灵敏度（未出示数据图）。2-3次重复所得的结果相同。与鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体比较，TK1单克隆抗体与五个表位免疫反应的灵敏度是有意义的低下（< 0.0001），表明IgY-TK1多克隆抗体与人TK1的31肽中的构象性表位1-5的协同反应必须有表位4、2和5表位参加，有意义的提升免疫反应亲和力，明显高于TK1单克隆抗体的应用功效（图10A）。但在将TK1-31肽浓度提高至10-25倍情况下，TK1单克隆抗体与总TK1-31 肽免疫反应的检测值是明显升高（图10B），但这将消耗TK1-31肽表位的使用量。
上述结果表明，鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体试剂盒检测血清TK1的值高低对肿瘤患者的生存率预后评估有临床应用重要价值，但鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（SSTK 小鼠杂交细胞瘤株057M）试剂盒检测血清TK1的值高低对肿瘤患者的预后生存率没有临床应用价值，这两种类型的抗体检测的血清TK1水平的符合性很低。据分析，出现这种情况的原因是，鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体，其检测的人血清TK1浓度的值的主峰位置与2009年和2012年已公布的人（哺乳动物）血清TK1活性主峰分布的这大分子复合物区域（主峰≈700 KD，分布范围730-300KD）相同，在这特定区域检测的人血清TK1浓度是真实的评估这患者的肿瘤增殖活性功能；而鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体主要识别人血清中TK1在主峰≈66 KD （分布范围为150-KD），主要是四-二聚体TK1游离分子形式，与鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体比较，检测总灵敏度低至30-10%下。文献指出 (Munch-PetersenB. 2006)，血清中游离的四聚体与二聚体是不稳定的，在不同条件下可以转换或降解，因此其水平的高低与评估这患者的肿瘤增殖活性功能没有密切相关性。这也就是为什么这鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体在国际30 多年和国内销售10多年来，没有研究文献公布对肿瘤患者的预后生存率的价值和应用于体检筛查早期肿瘤风险进程的价值。
TK1是一种评定肿瘤细胞增殖生物标志物，在评估临床肿瘤患者的预后和体检筛查早期肿瘤风险进程具有极大重要意义，但并非所有的TK1抗体都适用于临床肿瘤患者的预后和体检筛查早期肿瘤风险进程的评定。血清TK1是唯一评价肿瘤增殖速度的优选标志物应用于血清学中，人TK1在血清中，以多种形式存在，TK1与蛋白质结合大分子复合物的形式，游离4聚体，游离2聚体的形式，这取决不同抗体来源。
鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体的特征是适用作临床肿瘤监视效果评估，鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体能够好的识别TK1与蛋白质结合大分子复合物区域。对于本领域中制备的多种鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体，尽管其能够结合人细胞和组织中TK1，但是不能够良好地识别这TK1与蛋白质结合大分子复合物区域。
发明人还发现，单克隆抗体的特异性并非绝对。不同抗原表位可能具有相似的分子结构，导致同一单克隆抗体可能与不同抗原表位产生交叉反应。这也在一定程度上导致单克隆抗体的检测结果出现误差。
我们的研究说明，不同的鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体的结合性质的这种变化的原因在于，鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体仅识特异性别特定表位，并不显示识别对于大分子复合物区域人TK1中的有效功能，1) 哺乳动物源（鼠）制备的TK1单克隆抗体可能与鼠源不同蛋白质抗原表位产生交叉反应，很困难筛选一特异性的鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体；2）血清比组织中蛋白质比较，是含有更多的非特异性蛋白质类型。这些不同抗原表位可能具有相似的TK1分子表位结构，导致同一单克隆抗体可能与不同蛋白质抗原表位产生免疫交叉反应。这就是为什么采用同一血清标本国内外购买鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体与本申请的鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体之间没有符合性的原因。
总体而言，人TK1在存在ATP的情况下或在高浓度下作为四聚体存在，且在不存在ATP的情况下或在低浓度下作为二聚体存在。人细胞中的TK1和重组人TK1的四聚体形式具有高TK1活性，而二聚体形式具有较低TK1活性。
与此相比，具有人TK1酶催化功能的高活性与高浓度在血清中是以存在于大分子复合物区域，能够识别多克隆抗体，有充分免疫结合强度的特征如游离4聚体或包含此类2聚体，是具有低或甚至缺乏血清TK1活性。绝大多数B细胞表位为构象性（非线性）表位。构成B表位的氨基酸残基须形成严格的三维空间构型，人TK1多克隆抗体与相应人TK中的31 肽构象性（非线性）表位的亲和力明显高于单克隆抗体。
多克隆抗体是多种单克隆抗体的混合物。在一些实施方案中，本文采用的鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体和鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体可以参考本申请之前公开的文献制备：采用抗体基因技术制备的人TK1-IgY重组抗体 (1. 一种抗TK1原核重组单链抗体及制备方法；专利申请号：2018111029929.1；国际公布号：WO2020/048342A1); 2. 哺乳动物细胞重组抗人的鸡源的单克隆抗体及制备方法和应用:（中国发明专利申报号：2018110226810.9，国际公布号：WO2020/048341A1)。在选择特异性人TK1抗原表位制备多种抗体并将多种单克隆抗体进行混合时，其特异性和灵敏度与现在鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体的功能相同，并稳定性好，制备工艺简单。实现临床肿瘤预后和体检早期肿瘤风险筛查的评估。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体用于识别大分子复合物的用途，其中所述大分子复合物是人血清中TK1与蛋白质结合形成的大分子复合物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多克隆抗体是由人胸苷激酶1 的C-端31肽制备的鸡抗人胸苷激酶1-IgY多克隆抗体，其中所述C-端31肽的氨基酸序列为195-225：GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述大分子复合物中 90-75%的分子量分布在 730-300 KD， 主峰为≈700 KD。
4.根据权利要求2所述的用途，所述多克隆抗体与人胸苷激酶1的C-端31肽中的构象性多表位1-5发生协同反应，其中人胸苷激酶1的C-端31肽中 的5个构象表位如下：
表位1：GEAVAARKLF，序列213-222
表位2：NCPVPGKPGE，序列205-214
表位3：PVPGKPGEAV ，序列207-216
表位4：NCPVPGKPGEAV，序列205-216
表位5: GQPAGPDKEN，序列195-216。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述多克隆抗体必须与表位4、2和5发生反应。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述识别还包括使用鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体试剂，在同等抗体和抗原浓度条件下， 与所述多克隆抗体比较， 所述单克隆抗体试剂与表位4、2和5发生反应效率降低10倍。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体试剂不能识别人血清中TK1与蛋白质结合形成的大分子复合物区域。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体试剂适用于临床肿瘤免疫组织化学应用， 但不适用于血清学临床肿瘤生存率预后评估和早期肿瘤风险筛查。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024078017A1 (zh) * 2022-10-10 2024-04-18 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 鸡源抗人TK1重组IgY单链抗体和鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1414017A (zh) * 2002-09-13 2003-04-30 深圳市华瑞同康生物技术有限公司 抗细胞质胸苷激酶－IgY的制备及肿瘤诊断组合物
US20160311927A1 (en) * 2013-12-19 2016-10-27 Arocell Ab Monoclonal anti-tk1 antibodies
CN110873711A (zh) * 2018-09-04 2020-03-10 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 一种基于全自动化学发光分析仪的血清tk1检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1414017A (zh) * 2002-09-13 2003-04-30 深圳市华瑞同康生物技术有限公司 抗细胞质胸苷激酶－IgY的制备及肿瘤诊断组合物
US20160311927A1 (en) * 2013-12-19 2016-10-27 Arocell Ab Monoclonal anti-tk1 antibodies
CN110873711A (zh) * 2018-09-04 2020-03-10 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 一种基于全自动化学发光分析仪的血清tk1检测试剂盒
WO2020048340A1 (zh) * 2018-09-04 2020-03-12 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 一种基于全自动化学发光分析仪的血清tk1检测试剂盒

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024078017A1 (zh) * 2022-10-10 2024-04-18 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 鸡源抗人TK1重组IgY单链抗体和鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体及应用

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