JPH04326062A - IgA測定用試薬 - Google Patents

IgA測定用試薬

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JPH04326062A
JPH04326062A JP12535091A JP12535091A JPH04326062A JP H04326062 A JPH04326062 A JP H04326062A JP 12535091 A JP12535091 A JP 12535091A JP 12535091 A JP12535091 A JP 12535091A JP H04326062 A JPH04326062 A JP H04326062A
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JP
Japan
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iga
enzyme
reagent
jackalin
solution
Prior art date
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Pending
Application number
JP12535091A
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English (en)
Inventor
Yasuhiko Tomino
富 野  康 日 己
Takashi Kobayashi
小 林  隆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Original Assignee
Green Cross Corp Japan
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Publication date
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は被検液中のIgAを定量
するためのIgA測定用試薬に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】IgA
腎症は、1968年フランスの病理学者ベルジェー(J
.Berger)によって初めて報告された糸球体疾患
で、わが国の原発性慢性糸球体腎炎のなかの30〜40
%を占めている。その特徴は、蛍光抗体法や酵素抗体法
的検索による腎糸球体メサンギウム領域,ときに係蹄壁
にかけてのIgAの顆粒状沈着であり、しばしばIgG
,IgM,C3の沈着を伴っている。こうした所見は、
IgA腎症の他にHenoch−Schoenlein
 紫斑病性腎炎,SLE,肝硬変症,肺疾患,グルテン
過敏性腸症,菌状息肉腫症,IgA骨髄腫以外の単クロ
ーン性IgA血症などがあり、最近これらを一括して“
IgA腎症症候群”として扱う傾向にある。しかし、ベ
ルジェーの提唱したIgA腎症(いわゆるベルジェー病
)は、原発性慢性糸球体腎炎の一つとして確立されてお
り、これらの二次性疾患とは区別される。
【0003】ジャッカリン(Jacalin) はパラ
ミツ(jackfruit(Artocarpus h
eterophyllus))の種子から抽出されたレ
クチンであり、Roque−Barreiraら(J.
Immunol.,134:1740〜1743(19
85)) によりIgAと特異的に結合する性質が見出
されている。Andreら(Journal of C
linical Laboratory Analys
is 4:115〜119(1990))はジャッカリ
ンの本性質に着目し、このものを用いてIgAのELI
SA 測定系を作製し、IgA腎症患者血清中IgA量
を測定した。彼らは、IgA腎症患者群では血清IgA
量が健常人対照に比べ有意に低値を示す、すなわち、ジ
ャッカリンへの結合能の低下を認め、これをIgA腎症
患者のIgAの異常なグリコシレーション(glyco
−sylation)の結果であると推論している。
【0004】富野によれば、IgA腎症の診断は簡便法
がなく腎生検で行っているのが現状であり、患者に与え
る苦痛は多大であるので本症の血清診断法が登場すれば
有意義であるとの考えから、ジャッカリンでの測定系は
この目的に合致するものである。また、本法は最近増加
傾向にある糖尿病性腎症でも血清IgAの高値と蛋白の
グリケーションが亢進していることからその診断にも使
える可能性がある、としている。
【0005】その他、IgA−フィブロネクチン複合体
を定量してIgA腎症病を診断する方法(特表平2−5
03714)などが知られている。
【0006】本発明は上記事情を考慮してなされ、Ig
A測定用の試薬をキット化することにより、その測定を
迅速に行うことができる試薬キットを提供することを目
的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段及びその作用】上記目的達
成のため本発明者が鋭意研究を行った結果、IgAの定
量測定に使用する各試薬を分離し、測定時にこれらを順
次、用いることによりIgAを高感度、高精度且つ迅速
に測定できることを見出して本発明を完成した。
【0008】すなわち本発明は、固定化ジャッカリンと
、酵素標識抗IgA抗体,標準IgA,酵素活性測定用
基質,および、緩衝液よりなるIgA測定用試薬(以下
EIA試薬という)であり、いわゆるサンドイッチ法に
より、IgAを測定するものである。
【0009】本発明に係るEIA試薬は各試薬をキット
化しておくことが便宜であるので、以下キット化された
ものを例として説明する。本発明をキット化した場合、
次のような試薬にて構成される。 (1) 固定化ジャッカリン (2) 酵素標識抗IgA抗体 (3) 活性測定用基質 (4) 反応停止剤 (5) 検量線作成用標準品 (6) 緩衝液
【0010】以下、これらの試薬を説明する。 (1) 固定化ジャッカリン, 固定化ジャッカリンは一次抗体として用いられるジャッ
カリンを不溶性担体に固定化したものである。まず不溶
性担体としてはビーズ,マイクロプレートあるいは繊維
などが挙げられるが、好適にはマイクロプレートが用い
られる。特に、ポリスチレン,ポリエチレン,ポリプロ
ピレンなどの透明な合成樹脂を材質とする酵素免疫測定
法用マイクロタイトレーションプレートなどが適用でき
る。ジャッカリンは公知の方法により調製される。固定
化方法としては、ジャッカリンが波長280nmでの吸
光度が0.001〜0.05の蛋白濃度になるように混
和調製した後、当該溶液の適量を容器に入れ、例えば0
〜37℃にて1〜24時間静置後、希釈液を除去する。 洗浄液の適量を用いて、好ましくは1〜5回洗浄する。 洗浄液としては、蒸留水,生理食塩液,およびこれらに
0.01〜1.0%アルブミンやTween−20を添
加溶解した溶液が使用できる。
【0011】(2) 酵素標識IgA抗体酵素標識抗I
gA抗体は抗IgA抗体に酵素を標識したものである。 標識用酵素はEIA試薬で通常、用いられるものを利用
できる。具体的には表1左欄で開示した酵素を用いる。
【表1】 ABTS:2,2’−アジノ−ビス−3−エチルベンズ
チアゾリン−6−スルホン酸 ADPS:N−エチル−N−スルホプロピル−m−アニ
シジン ALPS:N−エチル−N−スルホプロピルアニリンM
AOS:N−エチル−N−(2−ハイドロキシ−3−ス
ルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリンこのような
抗IgA抗体は公知の方法により調製される。標識方法
としては、既知の方法、例えばN−サクシンイミジル3
−(2′−ピリジルジチオ)プロピオネートを用いる方
法,グルタルアルデヒドを用いる方法,N,N′−O−
フェニレンジマレイミドを用いる方法などにて標識する
ことによって作製することができる。
【0012】(3) 活性測定用基質 酵素活性測定用基質は、当然のことながら、用いる標識
用酵素の種類によって異なるが、当該酵素に適した基質
の粉末,錠剤または溶液である。具体的には表1中欄に
示した。
【0013】(4) 反応停止剤 反応停止剤も用いる標識用酵素の種類により異なる。当
該酵素に適した反応停止剤として、公知のものが用いら
れる。
【0014】(5) 検量線作成用標準品本発明で用い
られる標準品は後述する検量線を作成するために用いら
れるものであり、溶液あるいは凍結乾燥品よりなるもの
である。標準品は緩衝液または蒸留水に溶解して使用さ
れ、この際、測定する物質のレベルに合わせて4〜6濃
度段階まで小分けして検量線の作成に使用される。
【0015】(6) 緩衝液 本発明キット用として使用される緩衝液は、抗原−抗体
反応用のものと、標識用酵素の酵素活性測定用のもので
ある。抗原−抗体反応用緩衝液は、特にpHが6〜9,
塩濃度が0.01〜0.5M程度のものが好ましく、具
体的には、例えば0.1Mリン酸塩緩衝化生理食塩液p
H7.0のものがあげられる。また、1〜20%ウマ血
清,0.1〜0.5%ウシ血清アルブミンなどを添加し
ておくことが、抗原抗体反応を良好に行うために好まし
い。一方酵素活性測定用緩衝液は、標識用酵素の種類に
より異なるため、その標識用酵素に応じて作製する。本
発明試薬を使用するIgAの測定方法は次の通りである
【0016】(i) ジャッカリンの固定化ジャッカリ
ンの固定化から行う場合は、前記(1) の固定化ジャ
ッカリンの調製において記載された固定化法に準じて行
う。通常は既に固定化したものをキットに組込む。
【0017】(ii)被検液の添加 固定化ジャッカリンに被検液(例えば、血漿,尿,Ig
A含有溶液)を添加してインキュベーション(10〜3
7℃,0.5〜5時間程度)を行う。かくして、固定化
ジャッカリンとIgAとが結合体を形成する。しかる後
に液相を除去・洗浄する。
【0018】(iii) 酵素標識抗体の添加当該反応
系にさらに酵素標識抗IgA抗体を添加してインキュベ
ーション(10〜37℃,0.5〜5時間程度)を行う
。かくして、固定化ジャッカリン−抗原と酵素標識抗体
とが抗原抗体反応によって新たな結合体を形成する。し
かる後に液相を除去・洗浄する。過剰(未反応)の酵素
標識抗体は液相を除去・洗浄することにより容易に除去
される。
【0019】(iv)基質の添加 当該反応系に基質を添加して反応(10〜30℃,10
〜60分間程度)を行う。かくして、結合体中の酵素と
基質が酵素反応により生成物を形成する。
【0020】(V) 測定 形成された生成物を目視・分光光度計または蛍光光度計
を用いて測定する。このとき、被検液中のIgAの量が
多ければ多い程、酵素標識抗体の結合量が多くなるので
酵素活性は上昇する。一方、上記被検液の代わりに種々
の濃度の標準IgAを用いて標準検量線を作成し、これ
と被検液の酵素活性値を対比して被検液中のIgAの量
を定量する。
【0021】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
発明はこの実施例に限定されるものではない。
【0022】供試材料 (1) ジャッカリン:ベクター社(Vector 社
),Lot.80915(2) IgA類    :I
gA はプロトゲンAG(1mg/Vial,Lot.
P90408)、及び GCC(5mg/Vial,l
ot.KU815HS)、IgA1はプロトゲンAG(
0.5mg/Vial,Lot.P00214) 、I
gA2はプロトゲンAG(0.5mg/Vial,Lo
t.P00109) をそれぞれ用いた。 (3) POD 標識抗体: (a) タゴ社(TAGO 社),Cat.#4501
,Lot.1201〈affinity isolat
−ed goat F(ab′)2 anti−(hu
man IgA  α chain)−PDO con
ju−gate〉 (b) バインディングサイト社(Binding S
ite 社),Cat.#PP088,Lot.G13
60 〈goat IgG anti−human I
gA1−POD conjugate〉 (c) バインディングサイト社(Binding S
ite 社),Cat.#PP087,Lot.G13
63 〈goat IgG anti−human I
gA2−POD conjugate〉 (4) 抗ヒトIgA 抗進:タゴ社(TAGO 社)
,Cat.#4101,Lot.2505 (5) ビオチン化ジャッカリン:ベクター社(Vec
tor 社),Cat.#B−1155,Lot.70
629(5mg/Vial)(6) アビジン−POD
: ベクター社(Vector 社),Cat.#A−
2004,Lot.80405 (7) o−フェニレンジアミン(OPD) :半井テ
スク(8) NOR−パルチゲン IgA:ヘキスト社
,Lot.17H001(9) 標準人血清:ヘキスト
社,Lot.356a 1/76,IgA(2.5mg
/ml),NOR−パルチゲンIgA のスタンダード
に用いた。 (10)ヒト血清:健常人血清,11例を用いた。 (11)ジャッカリン固定プレートの調製ジャッカリン
(20 μg/ml.0.1M 炭酸緩衝液,pH9.
6),100μl をマイクロプレート(NUNC 社
,Immunomodule F16−H)の各ウェル
に分注し、冷所に一晩静置を行ってウェルに固定した。 0.5%Tween−PBS (洗浄液)で洗浄の後、
各ウェルにゼラチン−BSA−PBS,300μl を
加え冷所に静置してブロッキングを行った(このものを
固定プレートと称す)。使用前に各ウェルを洗浄液にて
洗浄を行い測定に供した。ここでPBSは等張リン酸緩
衝液の略称であり、BSAはウシ血清アルブミンの略称
である。 (12)抗ヒトIgA固定プレートの調製抗ヒトIgA
(20 μg/ml.0.1M 炭酸緩衝液,pH9.
6),100μl を用い、上記(11)と同様の処理
を行って固定プレートを調製した。
【0023】測定方法 (1) ジャッカリン固定プレートを用いるELISA
洗浄後のウェルにIgA(検量線用)またはヒト血清(
100倍希釈),100μlを添加して室温,1時間イ
ンキュベーションを行った(一次反応)。洗浄液で5〜
6回洗浄の後、POD 標識抗IgA抗体液100μl
を加えて室温,1時間のインキュベーションを行った(
二次反応)。洗浄液で5〜6回洗浄の後、基質液(H2
O2−OPD 加クエン酸リン酸緩衝液,pH5.0)
100 μl を加えて室温,0.5時間インキュベー
ションした(酵素反応)。 2.0N硫酸100μlを加えて反応停止の後、各ウェ
ルの吸光度(主波長:492nm,副波長:690nm
)を測定し、検量線からヒト血清中のIgAを定量した
。なお、測定時に用いたヒト血清の希釈用緩衝液は0.
1%BSA−PBS,pH7.5 である。 (2) 抗ヒトIgA抗体固定プレートを用いるELI
SA洗浄後のウェルにIgA(検量線用)を添加して室
温,1時間インキュベーションを行った(一次反応)。 洗浄液で5〜6回洗浄の後、ビオチン化ジャッカリン(
Biotinylated−jacalin)液100
μlを加えて室温,1時間のインキュベーションを行っ
た(二次反応)。洗浄液で5〜6回洗浄の後、アビジン
−POD液100μlを加え室温,1時間のインキュベ
ーション(三次反応)、引き続き上記(1) と同様に
して吸光度を測定した。 (3) NOR−パルチゲンを用いるヒト血清中のIg
Aの定量標準人血清(ヘキスト社)の原液、2倍及び4
倍希釈液の3点を検量線用のスタンダードとして用い、
次の方法で測定を行った。NOR パルチゲンIgA 
(ヘキスト社)の抗原孔に標準ヒト血清(ヘキスト社)
の原液,2倍希釈液,4倍希釈液と被験ヒト血清の原液
を5μlずつ添加した。室温にて48時間以上水平状態
で静置後、形成された沈降輪の直径を測定した。上記標
準血清(3濃度)のIgA濃度(mg/100ml)を
パルチゲン用グラフ用紙(ヘキスト2乗グラフ)の横軸
に、それに対応する沈降輪の直径(mm)を縦軸にそれ
ぞれ目盛り、この3点を結ぶ検量線を作成した。この検
量線から被験血清の沈降輪に対応するIgA濃度を求め
た。
【0024】上記測定により以下の結果を得た。 (1) ジャッカリン固定プレートでのELISAIg
A及びIgAサブクラス(IgA1,IgA2)との反
応性及び測定の至適条件(測定範囲や標識抗体の使用時
濃度)につき検討し、図1乃至図4の結果を得た。 図1,図2,および図3はそれぞれIgA(プロトゲン
AG),IgA1(プロトゲンAG),およびIgA2
(プロトゲンAG)のジャッカリン固定プレートでの反
応性を示す。ここで各図において、aは10,000倍
希釈濃度,bは20,000倍希釈濃度,cは40,0
00倍希釈濃度,およびdは80,000希釈濃度を示
す。また、図4はIgAサブクラスのジャッカリン固定
プレートでの反応性を示し、aはIgA,bはIgA1
,およびcはIgA2の各40,000倍希釈濃度にお
ける反応性を示す。IgA及びIgA2については用量
依存性的に吸光度の増加を認めるが、IgA1の場合、
吸光度増加の程度はIgA2に比較して低かった。 各IgAとも標識抗体(POD標識抗ヒトIgA,F(
ab′)2, タゴ社) 濃度に依存して吸光度は増加
するが非特異ブランク値(抗原0μg/mlでの吸光度
)も濃度依存的に増加するので、標識抗体使用時の濃度
は40,000倍希釈程度が適当である。また、吸光度
曲線(検量線)は上に凸の双曲線状を示しIgA高値領
域での定量性に欠けるので(結果は示さず)、測定範囲
は0〜10(20)μg/ml程度が適当である。
【0025】(2) ジャッカリン固定プレートでのヒ
ト血清IgA の定量とマンシーニ法での定量値間の関
係ジャッカリン固定プレートでの定量に際し、検量線用
スタンダードに用いるIgAの濃度を予めマンシーニ法
(NOR− パルチゲンIgA/ヘキスト社) で評定
した。両測定法で得られた結果を表2に示す。
【表2】   表2に示す通り、概してELISA 測定値の方が
低値を与える傾向にあった。両測定法で求められた測定
値間の関係から求められた全例(11例)での相関は相
関係数(R)=0.892 と良好な値であり、この結
果はジャッカリン固定プレートでのELISA でヒト
血清IgAの定量が可能であることを示すものである。
【0026】これ以外に、抗ヒトIgA抗体固定プレー
トとビオチン化ジャッカリンおよびアビジン−PODを
用いるELISA を検討したが、IgA低値でプロゾ
ーンが認められるので本法は使用不可と判断した。
【0027】
【発明の効果】かくして本発明試薬を用いることにより
、被検液(血漿,尿,培養液,その他のIgA含有溶液
)中のIgAの量を正確かつ迅速に測定することができ
る。また同時に多くの検体を測定することが可能である
。本発明の試薬は、臨床の場において患者の診断や経過
観察の為に用いることができる。
【0028】また、この他にもIgAの検索などの試験
研究の場において、さらに、生産量や比活性の測定など
の製造部門においても利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】IgA(プロトゲンAG)のジャッカリン固定
プレートでの反応性を示す、吸光度−IgA濃度関係図
である。
【図2】IgA1(プロトゲンAG)のジャッカリン固
定プレートでの反応性を示す、吸光度−IgA1濃度関
係図である。
【図3】IgA2(プロトゲンAG)のジャッカリン固
定プレートでの反応性を示す、吸光度−IgA2濃度関
係図である。
【図4】IgAサブクラスのジャッカリン固定プレート
での反応性を示す、吸光度−IgAサブクラス濃度関係
図である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】  固定化ジャッカリン,酵素標識抗Ig
    A抗体,標準IgA,酵素活性測定用基質および緩衝液
    からなるIgA測定用試薬。
JP12535091A 1991-04-25 1991-04-25 IgA測定用試薬 Pending JPH04326062A (ja)

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