JPH04326062A - ＩｇＡ測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は被検液中のＩｇＡを定量
するためのＩｇＡ測定用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ＩｇＡ
腎症は、１９６８年フランスの病理学者ベルジェー（Ｊ
．Ｂｅｒｇｅｒ）によって初めて報告された糸球体疾患
で、わが国の原発性慢性糸球体腎炎のなかの３０〜４０
％を占めている。その特徴は、蛍光抗体法や酵素抗体法
的検索による腎糸球体メサンギウム領域，ときに係蹄壁
にかけてのＩｇＡの顆粒状沈着であり、しばしばＩｇＧ
，ＩｇＭ，Ｃ３の沈着を伴っている。こうした所見は、
ＩｇＡ腎症の他にＨｅｎｏｃｈ−Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ
　紫斑病性腎炎，ＳＬＥ，肝硬変症，肺疾患，グルテン
過敏性腸症，菌状息肉腫症，ＩｇＡ骨髄腫以外の単クロ
ーン性ＩｇＡ血症などがあり、最近これらを一括して“
ＩｇＡ腎症症候群”として扱う傾向にある。しかし、ベ
ルジェーの提唱したＩｇＡ腎症（いわゆるベルジェー病
）は、原発性慢性糸球体腎炎の一つとして確立されてお
り、これらの二次性疾患とは区別される。

【０００３】ジャッカリン（Ｊａｃａｌｉｎ）　はパラ
ミツ（ｊａｃｋｆｒｕｉｔ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ　ｈ
ｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ））の種子から抽出されたレ
クチンであり、Ｒｏｑｕｅ−Ｂａｒｒｅｉｒａら（Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３４：１７４０〜１７４３（１９
８５））　によりＩｇＡと特異的に結合する性質が見出
されている。Ａｎｄｒｅら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ　４：１１５〜１１９（１９９０））はジャッカリ
ンの本性質に着目し、このものを用いてＩｇＡのＥＬＩ
ＳＡ　測定系を作製し、ＩｇＡ腎症患者血清中ＩｇＡ量
を測定した。彼らは、ＩｇＡ腎症患者群では血清ＩｇＡ
量が健常人対照に比べ有意に低値を示す、すなわち、ジ
ャッカリンへの結合能の低下を認め、これをＩｇＡ腎症
患者のＩｇＡの異常なグリコシレーション（ｇｌｙｃｏ
−ｓｙｌａｔｉｏｎ）の結果であると推論している。

【０００４】富野によれば、ＩｇＡ腎症の診断は簡便法
がなく腎生検で行っているのが現状であり、患者に与え
る苦痛は多大であるので本症の血清診断法が登場すれば
有意義であるとの考えから、ジャッカリンでの測定系は
この目的に合致するものである。また、本法は最近増加
傾向にある糖尿病性腎症でも血清ＩｇＡの高値と蛋白の
グリケーションが亢進していることからその診断にも使
える可能性がある、としている。

【０００５】その他、ＩｇＡ−フィブロネクチン複合体
を定量してＩｇＡ腎症病を診断する方法（特表平２−５
０３７１４）などが知られている。

【０００６】本発明は上記事情を考慮してなされ、Ｉｇ
Ａ測定用の試薬をキット化することにより、その測定を
迅速に行うことができる試薬キットを提供することを目
的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段及びその作用】上記目的達
成のため本発明者が鋭意研究を行った結果、ＩｇＡの定
量測定に使用する各試薬を分離し、測定時にこれらを順
次、用いることによりＩｇＡを高感度、高精度且つ迅速
に測定できることを見出して本発明を完成した。

【０００８】すなわち本発明は、固定化ジャッカリンと
、酵素標識抗ＩｇＡ抗体，標準ＩｇＡ，酵素活性測定用
基質，および、緩衝液よりなるＩｇＡ測定用試薬（以下
ＥＩＡ試薬という）であり、いわゆるサンドイッチ法に
より、ＩｇＡを測定するものである。

【０００９】本発明に係るＥＩＡ試薬は各試薬をキット
化しておくことが便宜であるので、以下キット化された
ものを例として説明する。本発明をキット化した場合、
次のような試薬にて構成される。 （１）　固定化ジャッカリン （２）　酵素標識抗ＩｇＡ抗体 （３）　活性測定用基質 （４）　反応停止剤 （５）　検量線作成用標準品 （６）　緩衝液

【００１０】以下、これらの試薬を説明する。 （１）　固定化ジャッカリン， 固定化ジャッカリンは一次抗体として用いられるジャッ
カリンを不溶性担体に固定化したものである。まず不溶
性担体としてはビーズ，マイクロプレートあるいは繊維
などが挙げられるが、好適にはマイクロプレートが用い
られる。特に、ポリスチレン，ポリエチレン，ポリプロ
ピレンなどの透明な合成樹脂を材質とする酵素免疫測定
法用マイクロタイトレーションプレートなどが適用でき
る。ジャッカリンは公知の方法により調製される。固定
化方法としては、ジャッカリンが波長２８０ｎｍでの吸
光度が０．００１〜０．０５の蛋白濃度になるように混
和調製した後、当該溶液の適量を容器に入れ、例えば０
〜３７℃にて１〜２４時間静置後、希釈液を除去する。 洗浄液の適量を用いて、好ましくは１〜５回洗浄する。 洗浄液としては、蒸留水，生理食塩液，およびこれらに
０．０１〜１．０％アルブミンやＴｗｅｅｎ−２０を添
加溶解した溶液が使用できる。

【００１１】（２）　酵素標識ＩｇＡ抗体酵素標識抗Ｉ
ｇＡ抗体は抗ＩｇＡ抗体に酵素を標識したものである。 標識用酵素はＥＩＡ試薬で通常、用いられるものを利用
できる。具体的には表１左欄で開示した酵素を用いる。

【表１】 ＡＢＴＳ：２，２’−アジノ−ビス−３−エチルベンズ
チアゾリン−６−スルホン酸 ＡＤＰＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニ
シジン ＡＬＰＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリンＭ
ＡＯＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンこのような
抗ＩｇＡ抗体は公知の方法により調製される。標識方法
としては、既知の方法、例えばＮ−サクシンイミジル３
−（２′−ピリジルジチオ）プロピオネートを用いる方
法，グルタルアルデヒドを用いる方法，Ｎ，Ｎ′−Ｏ−
フェニレンジマレイミドを用いる方法などにて標識する
ことによって作製することができる。

【００１２】（３）　活性測定用基質 酵素活性測定用基質は、当然のことながら、用いる標識
用酵素の種類によって異なるが、当該酵素に適した基質
の粉末，錠剤または溶液である。具体的には表１中欄に
示した。

【００１３】（４）　反応停止剤 反応停止剤も用いる標識用酵素の種類により異なる。当
該酵素に適した反応停止剤として、公知のものが用いら
れる。

【００１４】（５）　検量線作成用標準品本発明で用い
られる標準品は後述する検量線を作成するために用いら
れるものであり、溶液あるいは凍結乾燥品よりなるもの
である。標準品は緩衝液または蒸留水に溶解して使用さ
れ、この際、測定する物質のレベルに合わせて４〜６濃
度段階まで小分けして検量線の作成に使用される。

【００１５】（６）　緩衝液 本発明キット用として使用される緩衝液は、抗原−抗体
反応用のものと、標識用酵素の酵素活性測定用のもので
ある。抗原−抗体反応用緩衝液は、特にｐＨが６〜９，
塩濃度が０．０１〜０．５Ｍ程度のものが好ましく、具
体的には、例えば０．１Ｍリン酸塩緩衝化生理食塩液ｐ
Ｈ７．０のものがあげられる。また、１〜２０％ウマ血
清，０．１〜０．５％ウシ血清アルブミンなどを添加し
ておくことが、抗原抗体反応を良好に行うために好まし
い。一方酵素活性測定用緩衝液は、標識用酵素の種類に
より異なるため、その標識用酵素に応じて作製する。本
発明試薬を使用するＩｇＡの測定方法は次の通りである
。

【００１６】（ｉ）　ジャッカリンの固定化ジャッカリ
ンの固定化から行う場合は、前記（１）　の固定化ジャ
ッカリンの調製において記載された固定化法に準じて行
う。通常は既に固定化したものをキットに組込む。

【００１７】（ｉｉ）被検液の添加 固定化ジャッカリンに被検液（例えば、血漿，尿，Ｉｇ
Ａ含有溶液）を添加してインキュベーション（１０〜３
７℃，０．５〜５時間程度）を行う。かくして、固定化
ジャッカリンとＩｇＡとが結合体を形成する。しかる後
に液相を除去・洗浄する。

【００１８】（ｉｉｉ）　酵素標識抗体の添加当該反応
系にさらに酵素標識抗ＩｇＡ抗体を添加してインキュベ
ーション（１０〜３７℃，０．５〜５時間程度）を行う
。かくして、固定化ジャッカリン−抗原と酵素標識抗体
とが抗原抗体反応によって新たな結合体を形成する。し
かる後に液相を除去・洗浄する。過剰（未反応）の酵素
標識抗体は液相を除去・洗浄することにより容易に除去
される。

【００１９】（ｉｖ）基質の添加 当該反応系に基質を添加して反応（１０〜３０℃，１０
〜６０分間程度）を行う。かくして、結合体中の酵素と
基質が酵素反応により生成物を形成する。

【００２０】（Ｖ）　測定 形成された生成物を目視・分光光度計または蛍光光度計
を用いて測定する。このとき、被検液中のＩｇＡの量が
多ければ多い程、酵素標識抗体の結合量が多くなるので
酵素活性は上昇する。一方、上記被検液の代わりに種々
の濃度の標準ＩｇＡを用いて標準検量線を作成し、これ
と被検液の酵素活性値を対比して被検液中のＩｇＡの量
を定量する。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
発明はこの実施例に限定されるものではない。

【００２２】供試材料 （１）　ジャッカリン：ベクター社（Ｖｅｃｔｏｒ　社
），Ｌｏｔ．８０９１５（２）　ＩｇＡ類　　　　：Ｉ
ｇＡ　はプロトゲンＡＧ（１ｍｇ／Ｖｉａｌ，Ｌｏｔ．
Ｐ９０４０８）、及び　ＧＣＣ（５ｍｇ／Ｖｉａｌ，ｌ
ｏｔ．ＫＵ８１５ＨＳ）、ＩｇＡ１はプロトゲンＡＧ（
０．５ｍｇ／Ｖｉａｌ，Ｌｏｔ．Ｐ００２１４）　、Ｉ
ｇＡ２はプロトゲンＡＧ（０．５ｍｇ／Ｖｉａｌ，Ｌｏ
ｔ．Ｐ００１０９）　をそれぞれ用いた。 （３）　ＰＯＤ　標識抗体： （ａ）　タゴ社（ＴＡＧＯ　社），Ｃａｔ．＃４５０１
，Ｌｏｔ．１２０１〈ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｉｓｏｌａｔ
−ｅｄ　ｇｏａｔ　Ｆ（ａｂ′）２　ａｎｔｉ−（ｈｕ
ｍａｎ　ＩｇＡ　　α　ｃｈａｉｎ）−ＰＤＯ　ｃｏｎ
ｊｕ−ｇａｔｅ〉 （ｂ）　バインディングサイト社（Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓ
ｉｔｅ　社），Ｃａｔ．＃ＰＰ０８８，Ｌｏｔ．Ｇ１３
６０　〈ｇｏａｔ　ＩｇＧ　ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　Ｉ
ｇＡ１−ＰＯＤ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ〉 （ｃ）　バインディングサイト社（Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓ
ｉｔｅ　社），Ｃａｔ．＃ＰＰ０８７，Ｌｏｔ．Ｇ１３
６３　〈ｇｏａｔ　ＩｇＧ　ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　Ｉ
ｇＡ２−ＰＯＤ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ〉 （４）　抗ヒトＩｇＡ　抗進：タゴ社（ＴＡＧＯ　社）
，Ｃａｔ．＃４１０１，Ｌｏｔ．２５０５ （５）　ビオチン化ジャッカリン：ベクター社（Ｖｅｃ
ｔｏｒ　社），Ｃａｔ．＃Ｂ−１１５５，Ｌｏｔ．７０
６２９（５ｍｇ／Ｖｉａｌ）（６）　アビジン−ＰＯＤ
：　ベクター社（Ｖｅｃｔｏｒ　社），Ｃａｔ．＃Ａ−
２００４，Ｌｏｔ．８０４０５ （７）　ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）　：半井テ
スク（８）　ＮＯＲ−パルチゲン　ＩｇＡ：ヘキスト社
，Ｌｏｔ．１７Ｈ００１（９）　標準人血清：ヘキスト
社，Ｌｏｔ．３５６ａ　１／７６，ＩｇＡ（２．５ｍｇ
／ｍｌ），ＮＯＲ−パルチゲンＩｇＡ　のスタンダード
に用いた。 （１０）ヒト血清：健常人血清，１１例を用いた。 （１１）ジャッカリン固定プレートの調製ジャッカリン
（２０　μｇ／ｍｌ．０．１Ｍ　炭酸緩衝液，ｐＨ９．
６），１００μｌ　をマイクロプレート（ＮＵＮＣ　社
，Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌｅ　Ｆ１６−Ｈ）の各ウェル
に分注し、冷所に一晩静置を行ってウェルに固定した。 ０．５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ　（洗浄液）で洗浄の後、
各ウェルにゼラチン−ＢＳＡ−ＰＢＳ，３００μｌ　を
加え冷所に静置してブロッキングを行った（このものを
固定プレートと称す）。使用前に各ウェルを洗浄液にて
洗浄を行い測定に供した。ここでＰＢＳは等張リン酸緩
衝液の略称であり、ＢＳＡはウシ血清アルブミンの略称
である。 （１２）抗ヒトＩｇＡ固定プレートの調製抗ヒトＩｇＡ
（２０　μｇ／ｍｌ．０．１Ｍ　炭酸緩衝液，ｐＨ９．
６），１００μｌ　を用い、上記（１１）と同様の処理
を行って固定プレートを調製した。

【００２３】測定方法 （１）　ジャッカリン固定プレートを用いるＥＬＩＳＡ
洗浄後のウェルにＩｇＡ（検量線用）またはヒト血清（
１００倍希釈），１００μｌを添加して室温，１時間イ
ンキュベーションを行った（一次反応）。洗浄液で５〜
６回洗浄の後、ＰＯＤ　標識抗ＩｇＡ抗体液１００μｌ
を加えて室温，１時間のインキュベーションを行った（
二次反応）。洗浄液で５〜６回洗浄の後、基質液（Ｈ２
Ｏ２−ＯＰＤ　加クエン酸リン酸緩衝液，ｐＨ５．０）
１００　μｌ　を加えて室温，０．５時間インキュベー
ションした（酵素反応）。 ２．０Ｎ硫酸１００μｌを加えて反応停止の後、各ウェ
ルの吸光度（主波長：４９２ｎｍ，副波長：６９０ｎｍ
）を測定し、検量線からヒト血清中のＩｇＡを定量した
。なお、測定時に用いたヒト血清の希釈用緩衝液は０．
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ，ｐＨ７．５　である。 （２）　抗ヒトＩｇＡ抗体固定プレートを用いるＥＬＩ
ＳＡ洗浄後のウェルにＩｇＡ（検量線用）を添加して室
温，１時間インキュベーションを行った（一次反応）。 洗浄液で５〜６回洗浄の後、ビオチン化ジャッカリン（
Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ−ｊａｃａｌｉｎ）液１００
μｌを加えて室温，１時間のインキュベーションを行っ
た（二次反応）。洗浄液で５〜６回洗浄の後、アビジン
−ＰＯＤ液１００μｌを加え室温，１時間のインキュベ
ーション（三次反応）、引き続き上記（１）　と同様に
して吸光度を測定した。 （３）　ＮＯＲ−パルチゲンを用いるヒト血清中のＩｇ
Ａの定量標準人血清（ヘキスト社）の原液、２倍及び４
倍希釈液の３点を検量線用のスタンダードとして用い、
次の方法で測定を行った。ＮＯＲ　パルチゲンＩｇＡ　
（ヘキスト社）の抗原孔に標準ヒト血清（ヘキスト社）
の原液，２倍希釈液，４倍希釈液と被験ヒト血清の原液
を５μｌずつ添加した。室温にて４８時間以上水平状態
で静置後、形成された沈降輪の直径を測定した。上記標
準血清（３濃度）のＩｇＡ濃度（ｍｇ／１００ｍｌ）を
パルチゲン用グラフ用紙（ヘキスト２乗グラフ）の横軸
に、それに対応する沈降輪の直径（ｍｍ）を縦軸にそれ
ぞれ目盛り、この３点を結ぶ検量線を作成した。この検
量線から被験血清の沈降輪に対応するＩｇＡ濃度を求め
た。

【００２４】上記測定により以下の結果を得た。 （１）　ジャッカリン固定プレートでのＥＬＩＳＡＩｇ
Ａ及びＩｇＡサブクラス（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）との反
応性及び測定の至適条件（測定範囲や標識抗体の使用時
濃度）につき検討し、図１乃至図４の結果を得た。 図１，図２，および図３はそれぞれＩｇＡ（プロトゲン
ＡＧ），ＩｇＡ１（プロトゲンＡＧ），およびＩｇＡ２
（プロトゲンＡＧ）のジャッカリン固定プレートでの反
応性を示す。ここで各図において、ａは１０，０００倍
希釈濃度，ｂは２０，０００倍希釈濃度，ｃは４０，０
００倍希釈濃度，およびｄは８０，０００希釈濃度を示
す。また、図４はＩｇＡサブクラスのジャッカリン固定
プレートでの反応性を示し、ａはＩｇＡ，ｂはＩｇＡ１
，およびｃはＩｇＡ２の各４０，０００倍希釈濃度にお
ける反応性を示す。ＩｇＡ及びＩｇＡ２については用量
依存性的に吸光度の増加を認めるが、ＩｇＡ１の場合、
吸光度増加の程度はＩｇＡ２に比較して低かった。 各ＩｇＡとも標識抗体（ＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＡ，Ｆ（
ａｂ′）２，　タゴ社）　濃度に依存して吸光度は増加
するが非特異ブランク値（抗原０μｇ／ｍｌでの吸光度
）も濃度依存的に増加するので、標識抗体使用時の濃度
は４０，０００倍希釈程度が適当である。また、吸光度
曲線（検量線）は上に凸の双曲線状を示しＩｇＡ高値領
域での定量性に欠けるので（結果は示さず）、測定範囲
は０〜１０（２０）μｇ／ｍｌ程度が適当である。

【００２５】（２）　ジャッカリン固定プレートでのヒ
ト血清ＩｇＡ　の定量とマンシーニ法での定量値間の関
係ジャッカリン固定プレートでの定量に際し、検量線用
スタンダードに用いるＩｇＡの濃度を予めマンシーニ法
（ＮＯＲ−　パルチゲンＩｇＡ／ヘキスト社）　で評定
した。両測定法で得られた結果を表２に示す。

【表２】 　　表２に示す通り、概してＥＬＩＳＡ　測定値の方が
低値を与える傾向にあった。両測定法で求められた測定
値間の関係から求められた全例（１１例）での相関は相
関係数（Ｒ）＝０．８９２　と良好な値であり、この結
果はジャッカリン固定プレートでのＥＬＩＳＡ　でヒト
血清ＩｇＡの定量が可能であることを示すものである。

【００２６】これ以外に、抗ヒトＩｇＡ抗体固定プレー
トとビオチン化ジャッカリンおよびアビジン−ＰＯＤを
用いるＥＬＩＳＡ　を検討したが、ＩｇＡ低値でプロゾ
ーンが認められるので本法は使用不可と判断した。

【００２７】

【発明の効果】かくして本発明試薬を用いることにより
、被検液（血漿，尿，培養液，その他のＩｇＡ含有溶液
）中のＩｇＡの量を正確かつ迅速に測定することができ
る。また同時に多くの検体を測定することが可能である
。本発明の試薬は、臨床の場において患者の診断や経過
観察の為に用いることができる。

【００２８】また、この他にもＩｇＡの検索などの試験
研究の場において、さらに、生産量や比活性の測定など
の製造部門においても利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＩｇＡ（プロトゲンＡＧ）のジャッカリン固定
プレートでの反応性を示す、吸光度−ＩｇＡ濃度関係図
である。

【図２】ＩｇＡ１（プロトゲンＡＧ）のジャッカリン固
定プレートでの反応性を示す、吸光度−ＩｇＡ１濃度関
係図である。

【図３】ＩｇＡ２（プロトゲンＡＧ）のジャッカリン固
定プレートでの反応性を示す、吸光度−ＩｇＡ２濃度関
係図である。

【図４】ＩｇＡサブクラスのジャッカリン固定プレート
での反応性を示す、吸光度−ＩｇＡサブクラス濃度関係
図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　固定化ジャッカリン，酵素標識抗Ｉｇ
   Ａ抗体，標準ＩｇＡ，酵素活性測定用基質および緩衝液
   からなるＩｇＡ測定用試薬。