WO2019022370A1 - 위암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 위암 진단 방법 - Google Patents

위암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 위암 진단 방법 Download PDF

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김용대
신용성
연은희
강경남
신호상
권오란
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Definitions

  • the present invention relates to a gastric cancer diagnostic composition and a gastric cancer diagnostic method using the composition.
  • Gastric cancer is the fourth most common cancer in the world, and the number of deaths is the second leading cause of cancer deaths.
  • the incidence of gastric cancer is high in East Asia, Eastern Europe and Latin America.
  • stomach cancer patients in Korea such as Korea and Japan.
  • daily intake of salt is more than twice that of Westerners.
  • Japan, Finland, and Iceland which have a habit of eating salted fish, it is known that the incidence of gastric cancer is high.
  • genetic causes as well as eating habits are becoming important causes of gastric cancer.
  • the incidence of gastric cancer in the first generation of gastric cancer patients was reported to be high.
  • the third cause is infection with Helicobacter pylori (Helicobacter Pylory).
  • cancer cells are thought to be caused by the generation of cells that are not proliferated or regulated by the modification of genes having the function of proliferating and regulating normal cells.
  • Early gastric cancer is classified as a condition in which cancer cells are localized within the gastric mucosa. The prognosis of patients found in early gastric cancer is relatively good. Early diagnosis and treatment of gastric cancer will contribute to lowering mortality from gastric cancer and lowering the cost of cancer treatment.
  • Stomach cancer has various symptoms ranging from no symptoms to severe pain.
  • the initial symptoms of common stomach cancer are absent or even milder, so most people feel that they have some dyspepsia or upper abdominal discomfort.
  • stomach cancer is mostly physical.
  • the gastrointestinal X-ray is double-contrast, compression, mucosal, and gastroscopy.
  • the gastrointestinal endoscope can be seen in the stomach directly through the eyes, so that not only small lesions that do not appear in the X-ray examination can be found, but also the biopsy can be performed directly at the suspicious site of the stomach cancer. have.
  • the best way to treat gastric cancer is surgical surgery aimed at cure.
  • the ablation should include as wide a range as possible, but the range of ablation should be determined considering the postoperative complications due to extensive ablation.
  • the range of ablation should be determined considering the postoperative complications due to extensive ablation.
  • resection not only the stomach but also the surrounding organs are included, so it is difficult to guarantee the prognosis of the patient.
  • stomach cancer is metastasized to other organs, radical surgery is not possible, and other treatment methods such as chemotherapy and radiotherapy are selected.
  • anticancer drugs on the market have been shown to be effective in relieving transient symptoms, There is only a temporary effect.
  • biomarker composition for diagnosing gastric cancer including neurotensin and cholestyocinin and a method for diagnosing gastric cancer using the same are disclosed in Korean Patent Registration No. 10-1438530, and 20 kinds of gastric cancer gene markers including CKS1B and SKB1 and A gastric cancer diagnostic kit is disclosed in Korean Patent Registration No. 10-0645979.
  • the selection of biomarkers that enable accurate identification of gastric cancer incidence and progression, and the development of agents that measure diagnostic markers are the biggest challenges in conquering gastric cancer.
  • the present inventors analyzed the expression pattern of proteins from gastric cancer patients and normal human serum while trying to select biomarkers for the diagnosis of stomach cancer.
  • the biomarkers of gastric cancer were identified as EGFR (epidermal growth factor receptor) TTR (transthyretin), ApoA1 (apolipoprotein A1), RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted), LRG1 (leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1) and D. Dimer proteins were selected.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • ApoA1 apolipoprotein A1
  • RANTES regulated on activation, normal T cell expressed and secreted
  • LRG1 leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1
  • Dimer proteins were selected.
  • the combination of the above protein markers is applied to the diagnosis and screening of gastric cancer, it is confirmed that the gastric cancer patient and the normal person can be distinguished with high accuracy, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides a gastric cancer diagnostic composition
  • a detection reagent which specifically binds to a biomarker composed of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer.
  • the present invention provides a gastric cancer diagnostic kit comprising the gastric cancer diagnostic composition.
  • the present invention also provides primers, probes and anti-sense nucleotides that specifically bind to a nucleic acid sequence of a gene encoding a biomarker consisting of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer, And a kit for diagnosing cancer of the stomach.
  • the present invention also provides a method for detecting a protein comprising the steps of: 1) measuring a protein expression amount composed of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer from a sample; And 2) comparing the amount of protein expressed in step 1) with the amount of protein expressed in normal individuals.
  • the present invention provides a method for detecting a protein comprising the steps of: 1) measuring the expression level of a gene encoding a protein consisting of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer from a sample; And 2) comparing the amount of gene expression in step 1) with the amount of gene expression in normal individuals.
  • the present invention also provides the use of a detection reagent which specifically binds to a biomarker composed of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer for use in the preparation of a gastric cancer diagnostic composition.
  • the present invention also provides the use of the gastric cancer diagnostic composition for use in the manufacture of a gastric cancer diagnostic kit.
  • composition for diagnosing gastric cancer of the present invention can be used for early diagnosis of gastric cancer and for improving the survival rate of patients with gastric cancer by easily detecting the expression amount of a specific protein in body fluids.
  • the present invention provides a gastric cancer diagnostic composition
  • a detection reagent that specifically binds to a biomarker composed of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer.
  • the EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D.Dimer proteins may be polypeptides of any sequence known in the art.
  • the polypeptide may be a mutant or fragment of an amino acid having a different sequence by deletion, insertion, substitution, or a combination of amino acid residues within a range that does not affect the function of the protein.
  • Amino acid exchanges in proteins or peptides that do not globally alter the activity of the molecule are known in the art. And may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, and the like in some cases.
  • the detection reagent may be any one or more selected from the group consisting of an antibody, an antibody fragment, an aptamer, and a D-peptide.
  • the antibody may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody or a recombinant antibody. Antibodies can be readily prepared using techniques well known in the art.
  • the antibody fragment may comprise a functional fragment of an antibody molecule.
  • the functional fragment of the antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and may be Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 , Fv and the like.
  • the aptamer is an oligonucleotide molecule having a binding activity to a predetermined target molecule, and may be RNA, DNA, modified oligonucleotide, or a mixture thereof, and may be in a linear or cyclic form.
  • Such monoclonal antibodies can be prepared using hybridoma methods, or phage antibody library techniques, which are well known in the art.
  • hybridoma cells that secrete monoclonal antibodies can be made by fusing immune cells and cancer cell lines isolated from immunologically appropriate host animals, such as mice injected with antigen protein. The cell fusion of these two groups is fused using a method known in the art such as polyethylene glycol, and the antibody producing cells are proliferated by a standard culture method. Subcloning is performed using a limiting dilution method to obtain a uniform cell population, and hybridoma cells capable of producing an antigen-specific antibody can be produced in vitro or in vivo.
  • the antibodies prepared by the above methods can be separated and purified by methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • the polyclonal antibody may be prepared by injecting an immunogen-causing biomarker protein or a fragment thereof into an external host according to methods well known in the art.
  • the external host may be a mammal such as a mouse, rat, sheep, or rabbit.
  • the immunogen When the immunogen is injected intra-muscularly, intraperitoneally or subcutaneously, it may be administered with an adjuvant to increase antigenicity. Thereafter, blood can be routinely taken from an external host to obtain serum showing improved titer and specificity for the antigen, and separating and purifying the antibody therefrom.
  • the detection reagent may be a conjugate labeled with a detection element such as a chromogenic enzyme, a fluorescent substance, a radioactive isotope or a colloid.
  • a detection element such as a chromogenic enzyme, a fluorescent substance, a radioactive isotope or a colloid.
  • the chromogenic enzyme may be a peroxidase, an alkaline phosphatase, or an acid phosphatase
  • the fluorescent substance may be a fluorescein carboxylic acid (FCA), a fluorescein isothiocyanate (FITC), a fluorescein thiourea (FTH) 2 ', 7'-dichlorofluorescein-5-yl, 2', 7'-dichlorofluorescein-6 Yl, tetramethylrhodamine-6-yl, 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bor- Diaza-s-indacene
  • the detection reagent may further comprise a ligand capable of specifically binding to the detection reagent.
  • the ligand may be a conjugate labeled with a detection element such as a chromogenic enzyme, a fluorescent substance, a radioactive isotope or colloid, and a ligand treated with streptavidin or avidin.
  • the diagnostic composition of the present invention may contain, in addition to the detection reagent as described above, distilled water or a buffer that stably maintains the structure thereof.
  • the present inventors analyzed the expression pattern of proteins from gastric cancer patients and normal human sera and selected EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D.Dimer proteins as biomarkers of gastric cancer using statistical techniques Respectively.
  • a classification model was created using a combination of the biomarkers, and it was confirmed that the classification model can distinguish between a gastric cancer patient and a normal person with high accuracy (Tables 3 to 6).
  • the present invention provides a gastric cancer diagnostic kit comprising the gastric cancer diagnostic composition of the present invention.
  • the gastric cancer diagnostic composition may have the above-described characteristics.
  • the gastric cancer diagnostic composition may comprise a detection reagent that specifically binds to a biomarker composed of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer.
  • the detection reagent may have the characteristics as described above.
  • the detection reagent may be any one selected from the group consisting of an antibody, an antibody fragment, an aptamer, and a D-peptide.
  • the detection reagent may be coupled to a solid substrate to facilitate subsequent steps such as washing or separation of the complex.
  • synthetic resin nitrocellulose, glass substrate, metal substrate, glass fiber, microsphere or micro bead may be used.
  • synthetic resin polyester, polyvinyl chloride, polystyrene, polypropylene, PVDF or nylon may be used.
  • the kit not only makes it possible to diagnose stomach cancer by a medical practitioner such as a doctor by discriminating whether a testee is a gastric cancer-risk group or not, and can monitor a patient's response to treatment and change therapy according to the result. It can also be used to identify compounds that modulate the expression of one or more markers in vivo or ex vivo in gastric cancer models such as mice and rats.
  • the gastric cancer diagnostic kit may be prepared by a conventional method known to those skilled in the art, and may further include a buffer, a stabilizer, an inactive protein, and the like.
  • the kit includes a fluorescence method in which a fluorescent substance is attached to a detector to detect the amount of a detection reagent, or a fluorescence method in which a radioactive isotope is attached to a detection body to perform high throughput screening , HTS) system, a surface plasmon resonance (SPR) method for measuring the surface plasmon resonance change in real time without a label of the detector, or a surface plasmon resonance imaging (SPRI) method for imaging and verifying the SPR system.
  • a fluorescence method in which a fluorescent substance is attached to a detector to detect the amount of a detection reagent
  • a fluorescence method in which a radioactive isotope is attached to a detection body to perform high throughput screening , HTS) system
  • a surface plasmon resonance (SPR) method for measuring the surface plasmon resonance change in real time without a label of the detector
  • SPRI surface plasmon resonance imaging
  • the present inventors analyzed the expression pattern of proteins from gastric cancer patients and normal human sera and selected EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D.Dimer proteins as biomarkers of gastric cancer using statistical techniques Respectively.
  • a classification model was created using a combination of the biomarkers, and it was confirmed that the classification model can distinguish between a gastric cancer patient and a normal person with high accuracy (Tables 3 to 6).
  • the present invention also provides primers, probes and anti-sense nucleotides that specifically bind to a nucleic acid sequence of a gene encoding a biomarker consisting of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer, And a kit for diagnosing cancer of the stomach.
  • the EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer proteins may have the above-described characteristics.
  • the primer may be any primer that is complementary to the gene encoding the biomarker found in the present invention and designed to amplify the same.
  • the term " probe &quot refers to a nucleic acid fragment corresponding to several hundreds to several hundreds of bases that can be specifically bound to DNA or RNA, and may be used to confirm the presence or absence of a specific DNA or RNA .
  • the probe may be prepared in the form of an oligonucleotide probe, a short-chain DNA probe, a double-stranded DNA probe, or an RNA probe.
  • the probe may be labeled with biotin, FITC, rhodamine, DIG (digoxigenin) have.
  • the antisense nucleotides may be double helix or single helix DNA, double helix or single helix RNA, DNA / RNA hybrids, DNA and RNA analogs and bases, sugar or backbone variants.
  • the gastric cancer diagnostic kit may have the above-described characteristics.
  • the present inventors analyzed the expression pattern of proteins from gastric cancer patients and normal human sera and selected EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D.Dimer proteins as biomarkers of gastric cancer using statistical techniques Respectively.
  • a classification model was created using a combination of the biomarkers, and it was confirmed that the classification model can distinguish between a gastric cancer patient and a normal person with high accuracy (Tables 3 to 6).
  • the present invention also provides a method for detecting a protein comprising the steps of: 1) measuring a protein expression amount composed of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer from a sample; And 2) comparing the amount of protein expressed in step 1) with the amount of protein expressed in normal individuals.
  • the sample of step 1) may include a biological sample capable of identifying a disease-specific polypeptide that can be distinguished from a normal state such as urine, blood, serum or plasma. Specifically, it may be blood, serum or plasma, which is a biological liquid sample. In one embodiment of the invention, the sample may be serum.
  • the sample can be pretreated using methods such as anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography, sequential extraction, centrifugation or gel electrophoresis.
  • the sample may be pretreated by centrifugation.
  • the expression level of the above step 1) can be measured by any one or more methods selected from the group consisting of Western blotting, enzyme-immunochemical detection (ELISA), immunohistochemical staining, immunoprecipitation and immunofluorescence.
  • ELISA enzyme-immunochemical detection
  • immunohistochemical staining immunoprecipitation and immunofluorescence.
  • the amount of expression of EGFR, TTR, ApoA1 and RANTES protein is decreased compared with that of the control, and the amount of expression of LRG1 and D.Dimer proteins can be increased as compared with the control.
  • the present inventors analyzed the expression pattern of proteins from gastric cancer patients and normal human sera and selected EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D.Dimer proteins as biomarkers of gastric cancer using statistical techniques Respectively.
  • a classification model was created using a combination of the biomarkers, and it was confirmed that the classification model can distinguish between a gastric cancer patient and a normal person with high accuracy (Tables 3 to 6).
  • the present invention provides a method for detecting a protein comprising the steps of: 1) measuring the expression level of a gene encoding a protein consisting of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer from a sample; And 2) comparing the amount of gene expression in step 1) with the amount of gene expression in normal individuals.
  • the sample of step 1) may include a biological sample capable of identifying a disease-specific nucleotide which can be distinguished from a normal state such as urine, blood, serum or plasma. Specifically, it may be blood, serum or plasma, which is a biological liquid sample. In one embodiment of the invention, the sample may be serum.
  • the expression level of the above step 1) can be measured by a reverse transcription polymerase chain reaction or a real-time PCR. At this time, the amount of expression of EGFR, TTR, ApoA1 and RANTES protein is decreased compared with that of the control, and the amount of expression of LRG1 and D.Dimer proteins can be increased as compared with the control.
  • the present inventors analyzed the expression pattern of proteins from gastric cancer patients and normal human sera and selected EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D.Dimer proteins as biomarkers of gastric cancer using statistical techniques Respectively.
  • a classification model was created using a combination of the biomarkers, and it was confirmed that the classification model can distinguish between a gastric cancer patient and a normal person with high accuracy (Tables 3 to 6).
  • the present invention also provides the use of a detection reagent which specifically binds to a biomarker composed of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer for use in the preparation of a gastric cancer diagnostic composition.
  • the gastric cancer diagnostic composition and detection reagent may have the above-described characteristics.
  • the gastric cancer diagnostic composition may comprise a detection reagent that specifically binds to a biomarker composed of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D. Dimer.
  • the present invention also provides the use of the gastric cancer diagnostic composition for use in the manufacture of a gastric cancer diagnostic kit.
  • the gastric cancer diagnostic kit may include a gastric cancer diagnostic composition having the characteristics as described above.
  • the gastric cancer diagnostic composition may comprise a detection reagent that specifically binds to a biomarker composed of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1, and D. Dimer.
  • the biomarker may have the above-described characteristics.
  • the primer is complementary to the gene encoding the biomarker according to the present invention and can be a primer capable of amplifying the same.
  • Serum was obtained from 458 normal men (277 men and 181 women) at the Seoul National University Hospital. The subjects were 80 men and 20 women (Male 66 , And 34 women). 5 ml of peripheral blood was collected from the normal or gastric cancer patients and placed in a Vacutainer SST II tube (Becton Dickinson) and left at room temperature. After 1 hour, the tube was centrifuged at 3000 g for 5 minutes, and the supernatant was taken to obtain serum. The obtained serum was stored at -80 ° C. until use.
  • 120 protein markers were selected from among tens of thousands of proteins in the human body. Two-dimensional electrophoresis and SELDI-TOF MS analysis were used to determine clinical significance, ease of analysis, , Cost, clinical condition, etc., 50 markers were selected from the 120 protein marker candidates. ApoA1, ApoA2, AFP, CEA, CA125, CA19-9, TTR, B2M, and CRP were selected as candidates for gastric cancer biomarkers. 18 proteins such as CYFRA21-1, VDBP, ApoA4, PAI-1, sVCAM-1, RANTES, EGFR, LRG1 and D.Dimer were selected. For statistical analysis thereof, Serum samples were used to quantify the 18 proteins.
  • RANTES protein was purchased from PeproTech
  • sVCAM-1, EGFR and LRG1 proteins were purchased from R & D Systems
  • PAI-1 was purchased from Calbiochem
  • VDBP was purchased from Biodesign. Respectively.
  • the ApoA1 and ApoA2 proteins were purchased from Sekisui, the TTR and CRP proteins from Siemens, CEA, CYFRA21-1, B2M, AFP, CA125, -9 protein was purchased from Roche.
  • Serum concentrations of EGFR and LRG1 proteins are determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which is a method of quantitatively measuring the intensity and amount of antigen-antibody reaction by measuring the enzyme activity by labeling the enzyme with an enzyme. , ELISA) method. Detection of EGFR and LRG1 proteins Antibodies were labeled with biotin and then used for ELISA.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Quantitation of EGFR and LRG1 proteins was performed by incubating each well of a 96-well microplate (Nalgene Nunc Inc., US) with a capture antibody (R & D systems, US) for human LRG- 100 [mu] L of antibody (R & D systems, US) was added and the plate was pre-treated at 4 DEG C overnight. The next day, the wells were washed three times with PBS containing 0.05% Tween 20. PBS solution containing 5% skim milk was added to the wells, and non-specific binding was blocked by stirring at room temperature for 2 hours.
  • the normal and gastric cancer patients obtained in Example 1 were added to each well, and reacted at room temperature for 1 hour And then washed three times.
  • the biotin-labeled detection antibody prepared in the above manner was treated at a concentration of 0.15 ⁇ g / ml in each well and allowed to react for another hour at room temperature.
  • Streptavidin-horseradish-peroxidase (Sigma-Aldrich, USA) was added at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml for 30 minutes at room temperature. After completion, it was washed five times.
  • TMB tetramethylbenzidine
  • KPL tetramethylbenzidine
  • Serum concentrations of RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 and VDBP proteins were measured by multiplex immunoassay using the xMAP technology platform (Luminex Corp. US).
  • the microspheres were bound to the capture antibody by the carbodiimide method and then used in immunoassay to minimize exposure of the microspheres to light throughout the process.
  • microsphere suspension of MagPlex (Luminex Corp.) was mixed with a vortex and then suspended in a sonicator instrument (Sonicor Instrument Corporation, US) for 20 seconds. 1 x 10 6 microspheres were transferred to a microtube and separated using a magnet. The solution was removed, washed with 100 ⁇ l of distilled water, and then resuspended in 80 ⁇ l of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.2) Respectively.
  • microspheres were washed twice with 250 [mu] l of 50 mM MES (pH 5.0) and resuspended in 100 [mu] l of 50 mM MES (pH 5.0).
  • 10 ⁇ g of anti-RANTES, anti-sVCAM-1, anti-ApoA4, anti-PAI-1 or anti-VDBP antibody and 50 mM of MES solution were added to the carboxyl-activated microspheres, 500 [mu] l, and then they were mixed at room temperature for 2 hours.
  • the antibody-bound microspheres were washed twice with 500 ⁇ l of PBS-TBN (PBS containing 1% BSA, 0.02% Tween 20 and 0.05% sodium azide) and counted with a hemocytometer.
  • the antibody-bound microspheres were suspended in 500 ⁇ l of PBS-TBN solution at a concentration of 1 ⁇ 10 6 and stored in a dark room at 2 to 8 ° C.
  • the RANTES and sVCAM-1 proteins were assayed simultaneously in a single well, and the ApoA4, PAI-1 and VDBP proteins were quantified as single assays measuring only one protein per well.
  • 20 ⁇ l of the serum of normal and gastric cancer patients obtained in Example 1 and 20 ⁇ l of the microsphere mixture prepared by the above-described method and bound to the capture antibody for RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 or VDBP protein were mixed 20 ⁇ l of the RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 or VDBP standard protein or the microsphere mixture containing the serum was added to each well of a 96-well microplate and reacted at room temperature for 1 hour .
  • ApoA1, ApoA2, and B2M proteins were measured by immunoblotting using Hitachi 7080 (Hitachi Medical Corp., Japan) according to the manufacturer's protocol. TTR and CRP proteins were measured by immunoblotting using the BN2 System (Siemens AG., Germany) according to the manufacturer's protocol.
  • CEA, CYFRA21-1, CA125, and CA19-9 proteins were purchased from cobas e601 (Hoffmann-La Roche AG, Switzerland) and D.Dimer proteins were purchased from Roche c501 (Hoffmann-La Roche AG. Switzerland) Protocol by electrochemiluminescence immunoassay.
  • the 18 markers (ApoA1, ApoA2, AFP, CEA, CA125, CA19-9, TTR, B2M, CRP, CYFRA21-1, VDBP, ApoA4, PAI-1, sVCAM-1, RANTES, EGFR, ) was confirmed by the t-test. Log 10 conversion was performed on the experimental value obtained in Example 2, and the value (measurement data) was used for statistical analysis. When the p-value was less than 0.1, the markers were judged to be significant.
  • a classification model was constructed using ApoA1, ApoA2, CEA, CA19-9, TTR, CRP, VDBP, RANTES, EGFR, LRG1, D.Dimer or PAI-1 markers determined as markers significant in Example 3, The contribution of the biomarker was measured in each classification model.
  • the classification model is constructed using a logistic regression model, which is expressed as Equation 1 below.
  • X 1 to X p are values obtained by normalizing the measurement data of each biomarker determined to be the markers significant in the third embodiment to an average of 0 and variance 1
  • ⁇ 0 to ⁇ p are unknown variables.
  • the unknown variables are calculated using the r-rist estimator (R Development Core Team (2007), R: A language and environment for statistical computing, R Foundation for Statistical Computing, Austria, ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org).
  • Example 1 samples of normal and gastric cancer patients obtained in Example 1 were randomly divided into 80% as training data and 20% as test data. On the other hand, twelve combinations were created with twelve markers determined to be significant markers in the third embodiment. Thereafter, a classification model was created in the same manner as in Example 4 for the combination using the training group, and the training group was predicted in the model. The above steps were repeated 1000 times to obtain 1000 AUC values, and the average of the AUC values was calculated to determine how well the model predicted the training group to measure the performance of various biomarker combinations.
  • the performance of the biomarker was confirmed by measuring the specificity, sensitivity and accuracy of a classification model made up of the combination of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1, and D.Dimer biomarkers having the greatest AUC value in Example 5 above.
  • the specificity was calculated by the following formula (2) as a ratio of normal persons determined to be normal.
  • Sensitivity was calculated by the following formula (3) as a ratio of cancer patients determined to be cancer, (accuracy) was calculated as the mean of sensitivity and specificity, with cancer-to-normal ratio.
  • the classification model made up of the combination of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 and D.Dimer biomarkers showed 90% specificity, 91.06% sensitivity, 90.20% accuracy and 0.1991 threshold (Table 5). It was confirmed that, if the threshold value is more than 0.1991, it can be diagnosed as a gastric cancer patient and if it is less than 0.1991, it can be diagnosed as a normal person.
  • a classification model made up of the combination of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1, and D.Dimer biomarkers generated in Example 5 was verified as follows.
  • Performance of a classification model made up of a combination of EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1, and D.Dimer biomarkers Threshold Specificity Sensitivity Accuracy 0.1991 91.00% 91.75% 91.37%

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Abstract

본 발명은 위암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 위암 진단 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 위암 진단용 조성물은 체액 내 특정 단백질의 발현량을 확인하여 간편하게 위암을 조기 진단함으로써, 위암의 조기 치료가 가능하게 하고, 위암 환자의 생존율을 향상시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

위암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 위암 진단 방법
본 발명은 위암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 위암 진단 방법에 관한 것이다.
위암은 전 세계적으로 4번째로 많이 발생하는 암이며 이로 인해 사망하는 환자의 수가 암에 의한 사망 원인 중 2번째로 높다. 위암의 발생율은 동아시아, 동유럽 및 라틴 아메리카 일부에서 높은 편이다. 특히 한국, 일본 등 아시아에 위암 환자가 많은데 이는 생활환경의 차이, 특히 식생활의 차이에서 오는 것으로 보고되었다. 한국인의 경우 하루 소금 섭취량이 서양인보다 두 배 가까이 많으며, 특히 소금에 절인 생선을 먹는 습관이 있는 한국, 일본, 핀란드, 아이슬란드 등에서 위암의 발생률이 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 위암의 발병원인으로 식습관만큼이나 유전적인 원인도 중요시되고 있다. 위암환자의 1세대 자손들에서 위암의 발생률이 높은 것으로 보고되었다. 세 번째 원인으로는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylory)의 감염 여부이다. 헬리코박터 파일로리의 감염과 위암의 인과관계가 결정적인 것이라고 판단하기는 어려우나, 한국인 중 소화기계 질환 및 위암 환자의 40 내지 60%에서 헬리코박터 파일로리가 검출됨으로써, 헬리코박터 파일로리 감염자가 상대적으로 위암에 걸릴 가능성이 높음을 알 수 있다. 따라서 헬리코박터 파일로리의 제거는 위염 및 위암 예방의 한 방법으로 대두되고 있다.
일반적으로 암세포는 정상세포를 증식 및 조절하는 기능을 가진 유전자가 변형되면서 이에 의해 증식 및 조절되지 않는 세포가 생겨남으로써 발생하는 것으로 보고 있다. 암세포가 위의 점막 내에 국한되어있는 상태를 조기 위암으로 분류하고 있는데, 조기 위암 상태에서 발견된 환자의 치료 예후는 비교적 좋다. 따라서 위암의 조기 진단 및 치료는 위암으로 인한 사망률을 낮추고, 암의 치료비용을 낮추는데 기여할 것이다.
위암은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 증상을 나타낸다. 일반적인 위암의 초기 증상은 없거나, 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도로 대부분의 사람들이 이를 간과한다.
현재까지 위암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이다. 위장 X-선 촬영으로서 이중조영법, 압박촬영법, 점막촬영법 등과 위내시경이 있다. 위내시경은 위 속을 직접 눈으로 들여다 볼 수 있어, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변도 발견할 수 있을 뿐 아니라 위암이 의심스러운 장소에서 직접 조직검사를 시행할 수도 있어, 위암의 진단률을 높이고 있다. 하지만, 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 고통을 감수해야 하는 단점이 있다.
위암의 치료를 위한 최선의 방법은 완치를 목표로 하는 외과적인 수술이다. 절제는 가능한 넓은 범위를 포함하도록 하는 것이 원칙이나 광범위한 절제로 인한 수술 후유증도 고려하여 그 절제 범위를 정한다. 절제시에는 위뿐만 아니라 주위 여러 장기도 포함하게 되므로 환자의 예후를 장담하기 어렵다. 또한, 위암이 다른 장기에 전이된 경우에는 근치수술이 불가능하여 화학요법, 방사선요법 등 다른 치료방법을 택하게 되는데, 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는데만 일시적인 효과가 있다.
상기의 문제점들을 극복하기 위해 위암의 조기진단을 위한 새로운 방법의 개발이 요구되면서 위암의 바이오마커를 찾는 연구가 진행되고 있다. 구체적으로, 뉴로텐신 및 콜레시스토키닌을 포함하는 위암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 위암 진단 방법이 대한민국 특허등록 제10-1438530호에 개시되어 있으며, CKS1B, SKB1을 포함하는 20종의 위암 유전자 마커 및 이를 이용한 위암 진단 키트가 대한민국 특허등록 제10-0645979호에 개시되어 있다. 위암 발병 여부 및 진행단계의 정확한 판별을 가능하게 하는 바이오마커의 선별 및 진단 마커를 측정하는 제제의 개발은 위암을 정복하는 가장 큰 과제이다.
이에, 본 발명자들은 위암의 진단을 위한 바이오마커를 선별하고자 노력하던 중, 위암 환자와 정상인 혈청으로부터 단백질의 발현 양상을 분석하고, 통계적 기법을 이용해 위암의 바이오마커로서 EGFR(epidermal growth factor receptor), TTR(transthyretin), ApoA1(apolipoprotein A1), RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted), LRG1(leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1) 및 D.Dimer 단백질을 선별하였다. 또한, 상기 단백질 마커들의 조합을 위암 진단 및 스크리닝에 적용하였을 때, 위암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 선별된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 위암 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 위암 진단용 조성물을 이용하여 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 위암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 위암 진단용 조성물을 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커를 암호화하는 유전자의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 시료로부터 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 단백질 발현량을 정상개체의 단백질 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 시료로부터 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 단백질을 암호화하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 유전자 발현량을 정상개체의 유전자 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 위암 진단용 조성물의 제조에 사용하기 위한 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 위암 진단용 키트의 제조에 사용하기 위한 상기 위암 진단용 조성물의 용도를 제공한다.
나아가, 본 발명은 위암 진단용 키트의 제조에 사용하기 위한 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커를 암호화하는 유전자의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용도를 제공한다.
본 발명의 위암 진단용 조성물은 체액 내 특정 단백질의 발현량을 확인하여 간편하게 위암을 조기 진단함으로써, 위암의 조기 치료가 가능하게 하고, 위암 환자의 생존율을 향상시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 위암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다.
상기 검출시약은 항체, 항체 단편, 앱타머 및 D-펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 항체는 단일클론항체, 다클론항체 또는 재조합항체일 수 있다. 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 항체 단편은 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등일 수 있다. 상기 앱타머는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 분자로 RNA, DNA, 수식(modified) 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.
상기 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같이 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터 분리된 면역 세포와 암 세포주를 융합하여 만들 수 있다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법을 이용하여 서브 클로닝을 실시하고, 균일한 세포 집단을 수득한 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양하여 제조할 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제될 수 있다.
상기 다클론 항체는 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 면역원인 바이오마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물일 수 있다. 상기 면역원이 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수득하고 이로부터 항체를 분리 및 정제하여 제조될 수 있다.
상기 검출시약은 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
상기 검출시약은 추가로 상기 검출시약에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지한 접합체 및 스트렙타비딘 또는 아비딘을 처리한 리간드일 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 검출시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 위암 환자와 정상인 혈청으로부터 단백질의 발현 양상을 분석하고, 통계적 기법을 이용해 위암의 바이오마커인 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 단백질을 선별하였다. 또한, 상기 바이오마커들의 조합을 이용하여 분류모델을 만들고, 상기 분류모델이 위암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 확인하였다(표 3 내지 6).
또한, 본 발명은 본 발명의 위암 진단용 조성물을 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다.
상기 위암 진단용 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 위암 진단용 조성물은 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함할 수 있다.
상기 검출시약은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 검출시약은 항체, 항체 단편, 앱타머 및 D-펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 검출시약은 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
상기 키트는 피검사자가 위암 위험군인지 아닌지를 구별하여 의사 등 진료 행위자가 위암을 진단하는 것을 가능하게 할 뿐 아니라, 치료에 대한 환자의 반응을 모니터하여 그 결과에 따라 치료를 변경할 수 있게 한다. 또한, 마우스 및 랫트 등의 위암 모델의 생체 내 또는 생체 외에서 하나 이상의 마커의 발현을 조절하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다.
상기 위암 진단용 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다.
상기 키트는 검출시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 위암 환자와 정상인 혈청으로부터 단백질의 발현 양상을 분석하고, 통계적 기법을 이용해 위암의 바이오마커인 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 단백질을 선별하였다. 또한, 상기 바이오마커들의 조합을 이용하여 분류모델을 만들고, 상기 분류모델이 위암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 확인하였다(표 3 내지 6).
또한, 본 발명은 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커를 암호화하는 유전자의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다.
상기 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 단백질은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 프라이머는 본 발명에서 탐색된 바이오마커를 암호화하는 유전자와 상보적이며, 이를 증폭할 수 있도록 설계된 프라이머라면 모두 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “프로브”는 DNA 또는 RNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 특정 DNA 또는 RNA의 존재 유무를 확인하는데 사용될 수 있다. 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 비오틴, FITC, 로다민, DIG(digoxigenin) 등으로 표지되거나 방사선 동위원소 등으로 표지될 수 있다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 것일 수 있다.
상기 위암 진단용 키트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 위암 환자와 정상인 혈청으로부터 단백질의 발현 양상을 분석하고, 통계적 기법을 이용해 위암의 바이오마커인 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 단백질을 선별하였다. 또한, 상기 바이오마커들의 조합을 이용하여 분류모델을 만들고, 상기 분류모델이 위암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 확인하였다(표 3 내지 6).
또한, 본 발명은 1) 시료로부터 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 단백질 발현량을 정상개체의 단백질 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 시료는 소변, 혈액, 혈청 또는 혈장 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 질환 특이적 폴리펩타이드를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함할 수 있다. 구체적으로는, 생물학적 액체 시료인 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 시료는 혈청일 수 있다.
시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 시료는 원심분리에 의해 전처리될 수 있다.
상기 단계 1)의 발현량은 웨스턴블랏, 효소-면역화학 검출법(ELISA), 면역조직화학 염색법, 면역침강 및 면역형광법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있다. 이때, EGFR, TTR, ApoA1 및 RANTES 단백질의 발현량은 대조군에 비해 감소하며, LRG1 및 D.Dimer 단백질의 발현량은 대조군에 비해 증가할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 위암 환자와 정상인 혈청으로부터 단백질의 발현 양상을 분석하고, 통계적 기법을 이용해 위암의 바이오마커인 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 단백질을 선별하였다. 또한, 상기 바이오마커들의 조합을 이용하여 분류모델을 만들고, 상기 분류모델이 위암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 확인하였다(표 3 내지 6).
또한, 본 발명은 1) 시료로부터 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 단백질을 암호화하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 유전자 발현량을 정상개체의 유전자 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 시료는 소변, 혈액, 혈청 또는 혈장 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 질환 특이적 뉴클레오티드를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함할 수 있다. 구체적으로는 생물학적 액체 시료인 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 시료는 혈청일 수 있다.
상기 단계 1)의 발현량은 역전사 중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 측정될 수 있다. 이때, EGFR, TTR, ApoA1 및 RANTES 단백질의 발현량은 대조군에 비해 감소하며, LRG1 및 D.Dimer 단백질의 발현량은 대조군에 비해 증가할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 위암 환자와 정상인 혈청으로부터 단백질의 발현 양상을 분석하고, 통계적 기법을 이용해 위암의 바이오마커인 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 단백질을 선별하였다. 또한, 상기 바이오마커들의 조합을 이용하여 분류모델을 만들고, 상기 분류모델이 위암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 확인하였다(표 3 내지 6).
또한, 본 발명은 위암 진단용 조성물의 제조에 사용하기 위한 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약의 용도를 제공한다.
상기 위암 진단용 조성물 및 검출시약은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 위암 진단용 조성물은 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 위암 진단용 키트의 제조에 사용하기 위한 상기 위암 진단용 조성물의 용도를 제공한다.
상기 위암 진단용 키트는 상술한 바와 같은 특징을 갖는 위암 진단용 조성물을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 위암 진단용 조성물은 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 위암 진단용 키트의 제조에 사용하기 위한 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커를 암호화하는 유전자의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용도를 제공한다.
상기 바이오마커는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 한편, 상기 프라이머는 본 발명에 따른 바이오마커를 암호화하는 유전자와 상보적이며, 이를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 혈청 수득
먼저, 서울대학교병원 가정의학과에서 정상인 458명(남자 277명, 여자 181명)을 대상으로 혈청을 수득하였으며, 계명대학교 바이오뱅크와 부산대학교 인체자원은행에서 각각 위암 환자 80명 및 20명(남자 66명, 여자 34명)을 대상으로 혈청을 수득하였다. 상기 정상인 또는 위암 환자로부터 말초혈액 5 ㎖을 채취하여 Vacutainer SST Ⅱ tube(Becton Dickinson)에 넣고, 이를 상온에서 방치하였다. 1시간 후, 상기 튜브를 3000 g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 취해 혈청을 얻었으며 수득된 혈청은 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 2. 단백질의 정량
위암 바이오마커 후보를 선정하기 위해 인체 내에 존재하는 수만개 이상의 단백질들 중에서 먼저 120개의 단백질 표지자 후보군을 선정하였고, 이차원 전기영동, SELDI-TOF MS 분석법 등을 통하여 임상적 의의, 분석의 편이성, 알고리즘의 정확도, 비용 및 임상 여건 등을 고려하여 상기 120개의 단백질 표지자 후보군으로부터 50여개의 표지자들을 선택하였다. 이후, 위암 환자 350여명, 정상인 400여명을 대상으로 결과 수치들의 통계 분석을 통해 유효성을 검증하여 최종적으로 위암 바이오마커 후보로서 ApoA1, ApoA2, AFP, CEA, CA125, CA19-9, TTR, B2M, CRP, CYFRA21-1, VDBP, ApoA4, PAI-1, sVCAM-1, RANTES, EGFR, LRG1 및 D.Dimer와 같은 18개의 단백질을 선별하였으며, 이의 통계학적 분석을 위해 하기와 같은 방법으로 실시예 1의 혈청 샘플을 이용해 상기 18개의 단백질을 정량하였다.
2-1. 항체, 키트 및 표준단백질
ApoA1, ApoA2, AFP, CEA, CA125, CA19-9, TTR, B2M, CRP, CYFRA21-1, VDBP, ApoA4, PAI-1, sVCAM-1, RANTES, EGFR, LRG1 및 D.Dimer의 단백질은 하기 표 1 및 2에 기재된 키트 혹은 항체를 이용하여 정량하였다. 표준 단백질의 경우, RANTES 단백질은 PeproTech사에서, sVCAM-1 ,EGFR 및 LRG1 단백질은 R&D Systems사에서, PAI-1은 Calbiochem사에서, VDBP는 Biodesign사에서 구입하여 사용하였으며, ApoA4는 자체 제작하여 사용하였다. 주시약 및 보정물질(calibrator)의 경우, ApoA1 및 ApoA2 단백질에 대한 것은 Sekisui사에서, TTR 및 CRP 단백질에 대한 것은 Siemens사에서, CEA, CYFRA21-1, B2M, AFP, CA125, D.Dimer 및 CA19-9 단백질에 대한 것은 Roche사에서 구입하여 사용하였다.
항체, 키트 및 표준단백질 구입처
바이오마커 표준물질 제조사 대응 항체 제조사 1 대응 항체 제조사 2
RANTES PeproTech &D Systems &D Systems
sVCAM-1 &D Systems &D Systems &D Systems
EGFR &D Systems &D Systems &D Systems
LRG1 &D Systems &D Systems &D Systems
ApoA4 자체제작 Abcam 자체제작
PAI-1 Calbiochem Innovative Research USBiological Life Sciences
VDBP Biodesign ThermoFisher ThermoFisher
항체, 키트 및 표준단백질 구입처
바이오마커 주시약 보정 물질(calibrator) 제조사
ApoA1 Apo A-1 Auto·N "Daiichi" Apo auto N Daiichi Sekisui
ApoA2 Apo A-2 Auto·N "Daiichi" Apo auto N Daiichi Sekisui
TTR N Antiserum to human PreAlbumin N Protein standard SL Siemens
CEA Elecsys CEA CEA CalSet Roche
CYFRA21-1 Elecsys CYFRA 21-1 CYFRA 21-1 CalSet Roche
B2M Tina-quant β2-microglobulin β2-Microglobulin Calibrator Roche
CA125 Elecsys CA 125 Ⅱ CA 125 Ⅱ CalSet Roche
CA19-9 Elecsys CA 19-9 CA 19-9 CalSet Roche
CRP CardioPhase hsCRP N Rheumatology standard SL Siemens
AFP Elecsys AFP AFP CalSetⅡ Roche
D.Dimer D-DI2 D-Dimer Gen.2 Calibrator set Roche
2-2. EGFR 및 LRG1 단백질의 정량
EGFR 및 LRG1 단백질의 혈청 내 농도는 항체가 항원에 효소를 표지해 효소의 활성을 측정하여 항원-항체 반응의 강도와 그 양을 정량적으로 측정하는 방법인 효소 결합 면역 흡착 분석(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 방법을 사용하여 측정하였다. EGFR 및 LRG1 단백질의 검출 항체는 바이오틴으로 표지한 후, ELISA에 이용하였다.
구체적으로, 먼저 EGFR 및 LRG1 검출 항체를 바이오틴화시키기 위해 400 ㎍의 항-인간-EGFR 항체(R&D systems, US) 또는 항-인간-LRG1 항체(R&D systems, US)를 800 ㎕의 PBS 용액에 넣은 후, 상기 용액의 몰 비율이 항체 대비 20배가 되도록 10 mM의 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Sulfosuccinimidyl-6-[biotin-amido]hexanoate, ThermoFisher Scientific, US) 용액을 넣어 주고 상온에서 30분간 반응시켰다. 바이오틴 표지가 완료되면 1 ℓ의 PBS 용액을 첨가하여 투석을 3회 반복한 뒤, 이를 -80℃에 보관하였다.
EGFR 및 LRG1 단백질의 정량은 96-웰 마이크로플레이트(Nalgene Nunc Inc., US)의 각 웰에 1 ㎍/㎖ 농도의 인간 LRG-1에 대한 포획 항체(R&D systems, US) 또는 인간 EGFR에 대한 포획 항체(R&D systems, US)를 100 ㎕씩 넣고 4℃에서 밤새 전처리하였다. 다음날 0.05% Tween 20을 함유한 PBS로 웰을 3회 세척한 후에 5% 탈지유가 포함된 PBS 용액을 웰에 넣고 실온에서 2시간 동안 교반하여 비특이적 결합을 차단하였다. 0.05% Tween 20을 함유한 PBS로 웰을 3회 세척한 후에 EGFR 및 LRG1 표준 단백질, 실시예 1에서 얻은 정상 및 위암 환자의 혈청을 각각 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후에 3회 세척하였다. 상기 방법으로 제조된 바이오틴이 표지된 검출 항체를 0.15 ㎍/㎖ 농도로 각 웰에 처리하고 실온에서 다시 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 3회 세척한 후, 0.5 ㎍/㎖ 농도의 스트랩타비딘-홀스래디쉬-과산화효소(streptavidin-horseradish-peroxidase, Sigma-Aldrich, US)를 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시키고 반응이 끝나면 5회 세척하였다. 발색 반응을 유도하기 위하여 TMB(tetramethylbenzidine, KPL, US)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였고, 15분 후 2 N 황산을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이후, 마이크로플레이트 리더기(Emax, Molecular Devices LLC., US)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Device)를 이용하여 5개 모수 커브 피팅(5-parametric-curve fitting)으로 분석하였다.
2-3. RANTES , sVCAM -1, ApoA4 , PAI -1 및 VDBP 단백질의 정량
RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 및 VDBP 단백질의 혈청 내 농도는 xMAP 기술 플랫폼(Luminex Corp. US)을 이용한 다중 면역분석법(multiplex immunoassay)으로 측정하였다. 미세구체(microspheres)는 카르보디이미드(carbodiimide) 방법으로 포획 항체를 결합시킨 후, 면역분석법에 이용하였으며 전체 과정에서 미세구체가 빛에 노출되는 것을 최소화하였다.
구체적으로, MagPlex(Luminex Corp.)의 미세구체 현탁액을 볼텍스(vortex)로 혼합한 후, 음파 용기(Sonicor Instrument Corporation, US)에서 20초 동안 현탁하였다. 1×106개의 미세구체를 마이크로튜브에 옮겨 자석을 이용하여 분리하고 용액을 제거하고, 100 ㎕의 증류수로 세척한 뒤, 이를 다시 80 ㎕의 0.1 M 인산나트륨 완충용액(pH 6.2)에 재현탁하였다. 이후, 50 mg/㎖의 N-하이드록시-설포숙시니마이드(N-hydroxy-sulfosuccinimide, ThermoFisher Scientific, US) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, ThermoFisher Scientific, US)를 각각 10 ㎕씩 차례로 넣은 후 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 이때 반응물을 10분 간격으로 섞어 주었다. 상기 미세구체를 250 ㎕의 50 mM MES(pH 5.0)로 2회 세척한 후, 100 ㎕의 50 mM MES(pH 5.0)에 재현탁하였다. 상기 방법으로 카복실기가 활성화된 미세구체에 10 ㎍의 항-RANTES, 항-sVCAM-1, 항-ApoA4, 항-PAI-1 또는 항-VDBP 항체, 및 50 mM의 MES 용액을 첨가하여 최종 부피가 500 ㎕가 되도록 한 후, 이를 실온에서 2시간 동안 섞어 주었다. 항체 결합 반응이 끝난 미세구체는 500 ㎕의 PBS-TBN(1% BSA, 0.02% Tween 20 및 0.05% 소듐 아자이드가 포함된 PBS)으로 2회 세척한 후, 혈구 계산기로 계수하였다. 항체가 결합된 미세구체는 500 ㎕의 PBS-TBN 용액에 1×106개 농도가 되도록 현탁하여 2 내지 8℃의 암실에서 보관하였다.
RANTES 및 sVCAM-1 단백질은 한 웰에서 동시에 측정하는 다중 검사법으로, ApoA4, PAI-1 및 VDBP 단백질은 한 웰에서 하나의 단백질만 측정하는 단일 검사법으로 정량하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 얻은 정상 및 위암 환자의 혈청 20 ㎕와 상기 방법으로 제조된 RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 또는 VDBP 단백질에 대한 포획 항체가 결합된 미세구체 혼합액 20 ㎕를 섞어준 후, 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 또는 VDBP 표준 단백질, 또는 상기 혈청이 포함된 미세구체 혼합액을 20 ㎕씩 넣고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 바이오틴이 표지된 검출 항체 20 ㎕와 스트렙타비딘-R-파이코에리쓰린(Streptavidin R-Phycoerythrin, Jackson ImmunoResearch) 20 ㎕를 순차적으로 넣고 각각 1시간 및 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 플레이트에 각 웰당 200 ㎕의 PBST(0.05% Tween 20가 포함된 PBS)용액 및 마이크로플레이트 세척제(HydroFlex™, TECAN, Switzerland)를 넣어 2회 세척한 다음 미세구체를 100 ㎕의 PBST(0.05% Tween 20가 포함된 PBS)용액에 재현탁하여 Luminex TM200으로 형광의 세기를 측정하였다. 혈청 샘플의 RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 및 VDBP 단백질 농도는 비드뷰 소프트웨어(Beadview Software, Upstate, US)를 이용하여 5개 모수 커브 피팅으로 분석하였다.
2-4. ApoA1 , ApoA2 , TTR , CEA , CYFRA21 -1, B2M , CA125, CA19-9, CRP , D.Dimer 및 AFP 단백질의 정량
ApoA1, ApoA2 및 B2M 단백질은 Hitachi 7080(Hitachi Medical Corp., Japan) 장비를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 면역비탁법으로 측정하였다. TTR 및 CRP 단백질은 BN2 System(Siemens AG., Germany) 장비를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 면역비탁법으로 측정하였다. CEA, CYFRA21-1, CA125, CA19-9 단백질은 cobas e601(Hoffmann-La Roche AG., Switzerland) 장비를, D.Dimer 단백질은 Roche c501(Hoffmann-La Roche AG., Switzerland) 장비를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 전기화학발광면역측정법으로 측정하였다.
실시예 3. 위암 바이오마커의 통계분석
상기 18개 마커(ApoA1, ApoA2, AFP, CEA, CA125, CA19-9, TTR, B2M, CRP, CYFRA21-1, VDBP, ApoA4, PAI-1, sVCAM-1, RANTES, EGFR, LRG1 및 D.Dimer)에 대한 위암 환자와 정상인 간의 발현량 차이의 유의성을 t-test를 통해 확인하였다. 상기 실시예 2에서 얻은 실험값에 log10 변환을 취해 그 값(측정데이터)을 통계분석에 사용하였다. t-test 결과 p-value가 0.1 이하이면 유의한 마커로 판정하였다.
마커의 유의성
t df P-value
ApoA1 -12.341 134.259 0.000
ApoA2 -9.774 122.542 0.000
AFP -1.207 122.213 0.230
CEA 2.428 125.119 0.017
CA125 -0.783 145.461 0.435
CA19-9 1.903 117.975 0.059
TTR -12.520 116.145 0.000
B2M 0.591 132.915 0.555
CRP 4.228 131.349 0.000
CYFRA21-1 0.270 134.860 0.788
VDBP -4.274 141.284 0.000
ApoA4 -0.465 101.463 0.643
PAI-1 -1.815 125.898 0.072
sVCAM-1 1.057 135.866 0.292
RANTES -6.234 122.791 0.000
EGFR -13.090 132.731 0.000
LRG1 9.952 119.311 0.000
D.Dimer 10.474 129.949 0.000
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, ApoA1, ApoA2, CEA, CA19-9, TTR, CRP, VDBP, RANTES, EGFR, LRG1, D.Dimer 및 PAI-1 마커가 위암 환자 및 정상인 간의 발현량 차이에 유의성이 있었다(표 3).
실시예 4. 바이오마커의 기여도 측정
상기 실시예 3에서 유의한 마커로 판정된 ApoA1, ApoA2, CEA, CA19-9, TTR, CRP, VDBP, RANTES, EGFR, LRG1, D.Dimer 또는 PAI-1 마커들을 사용하여 분류모델을 구축하고, 각각의 분류모델에서 바이오마커의 기여도를 측정하였다.
구체적으로, 상기 분류모델은 로지스틱 회귀분석(logistic regression) 모형을 사용하여 구축하였으며, 이는 하기 수학식 1과 같이 표현된다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2018006527-appb-I000001
상기 수학식 1에서 X1 내지 Xp는 실시예 3에서 유의한 마커로 판정된 각 바이오마커의 측정데이터를 평균 0, 분산 1로 표준화한 값이고, β0 내지 βp는 미지변수이다. 미지변수는 리지 추정(ridge estimator)을 사용하여 R 통계 패키지(R Development Core Team (2007), R: A language and environment for statistical computing. R Foundationfor Statistical Computing, Austria, ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org)를 통해 예측하였다. 리지 추정의 절대값이 클수록 해당 바이오마커의 로지스틱 회귀분석 모형에서의 기여도가 큰 것을 의미한다.
그 결과, EGFR> TTR > ApoA1 > RANTES > LRG1 > D.Dimer > ApoA2 > VDBP > PAI-1 > CEA > CRP > CA19-9 순으로 분류모델에서 기여도가 감소하였다.
실시예 5. 다양한 바이오마커 조합의 성능 측정
실시예 4에서 측정한 기여도를 이용해 기여도가 낮은 마커를 제거해가며, 실시예 3에서 유의한 마커로 판정된 다양한 바이오마커 조합의 성능을 측정하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 얻은 정상인과 위암 환자의 샘플을 무작위로 나눠 80%는 훈련 집단(training data)으로 20%는 평가 집단(test data)으로 하였다. 한편, 실시예 3에서 유의한 마커로 판정된 12개의 마커로 12가지의 조합을 작성하였다. 이후, 훈련 집단을 이용하여 상기 조합에 대해 실시예 4와 동일한 방법으로 분류 모델을 만들고, 상기 모델에 훈련 집단을 예측시켜보았다. 상기 단계를 1000번 반복하여 1000개의 AUC 값을 얻었고, 그 값의 평균을 계산하여 상기 모델이 훈련 집단을 얼마나 잘 예측했는지 판단하여 다양한 바이오마커 조합의 성능을 측정하였다.
다양한 바이오마커 조합의 성능
마커 조합 평균(AUC)
EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1, D.Dimer, ApoA2, VDBP, PAI-1, CEA, CRP, CA19-9 0.96068
EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1, D.Dimer, ApoA2, VDBP, PAI-1, CEA, CRP 0.96113
EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1, D.Dimer, ApoA2, VDBP, PAI-1, CEA 0.96128
EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1, D.Dimer, ApoA2, VDBP, PAI-1 0.96186
EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1, D.Dimer, ApoA2, VDBP 0.96075
EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1, D.Dimer, ApoA2 0.96184
EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1, D.Dimer 0.96548
EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 0.96268
EGFR, TTR, ApoA1, RANTES 0.95506
EGFR, TTR, ApoA1 0.94155
EGFR, TTR 0.92569
EGFR 0.86507
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 바이오마커 조합으로 만든 분류모델에서 AUC 값이 가장 큰 것을 확인하였고, 최종적으로 위암의 바이오마커로서 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer를 선별하였다(표 4).
실시예 6. EGFR , TTR , ApoA1 , RANTES , LRG1 및 D. Dimer 바이오마커 조합의 성능 측정
상기 실시예 5에서 AUC 값이 가장 컸던 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 바이오마커 조합으로 만든 분류모델의 특이도, 민감도 및 정확도를 측정함으로써, 바이오마커의 성능을 확인하였다. 특이도(specificity)는 정상인 사람을 정상으로 판정한 비율로, 하기 수학식 2와 같이 계산하였으며, 민감도(sensitivity)는 암환자를 암으로 판정한 비율로, 하기 수학식 3과 같이 계산하였고, 정확도(accuracy)는 암과 정상을 맞춘 비율로, 민감도와 특이도의 평균으로 계산하였다.
[수학식 2]
Figure PCTKR2018006527-appb-I000002
[수학식 3]
Figure PCTKR2018006527-appb-I000003
EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 바이오마커 조합의 성능
특이도(specificity) 민감도(sensitivity) 정확도(accuracy) 역치값(threshold)
90.00% 91.06% 90.20% 0.1991
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 바이오마커 조합으로 만든 분류모델은 90%의 특이도, 91.06%의 민감도, 90.20%의 정확도 및 0.1991의 역치값을 나타내었다(표 5). 이를 통해, 역치값이 0.1991 초과이면 위암환자로, 0.1991 미만이면 정상인으로 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. EGFR , TTR , ApoA1 , RANTES , LRG1 및 D. Dimer 바이오마커 조합으로 만든 분류모델의 검증
상기 실시예 5에서 생성한 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 바이오마커 조합으로 만든 분류모델을 하기와 같은 방법으로 검증하였다.
먼저, 서울대학교병원 가정의학과에서 정상인 100명을, 계명대학교 바이오뱅크와 부산대학교 인체자원은행에서 각각 위암 환자 17명 및 80명을 대상으로 한 것을 제외하고는 <실시예 1>과 동일한 방법으로 혈청을 수득하였다. <실시예 2>와 동일한 방법으로 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 단백질을 정량한 후, <실시예 6>과 동일한 방법으로 특이도, 민감도, 정확도 및 역치값을 측정하여 역치값이 0.1991일때 특이도, 민감도 및 정확도를 확인하였다.
EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 바이오마커 조합으로 만든 분류모델의 성능
역치값(threshold) 특이도(specificity) 민감도(sensitivity) 정확도(accuracy)
0.1991 91.00% 91.75% 91.37%
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이, EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 바이오마커 조합으로 만든 분류모델은 역치값이 0.1991일때 91.00%의 특이도, 91.75%의 민감도 및 91.37%의 정확도를 나타냄을 확인하였다(표 6). 이를 통해, EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer 바이오마커 조합으로 만든 분류모델은 위암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (13)

  1. EGFR(epidermal growth factor receptor), TTR(transthyretin), ApoA1(apolipoprotein A1), RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted), LRG1(leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1) 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 위암 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 검출시약이 항체, 항체 단편, 앱타머 및 D-펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 위암 진단용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 항체가 단일클론항체 또는 다클론항체인, 위암 진단용 조성물.
  4. 제 1항의 위암 진단용 조성물을 포함하는 위암 진단용 키트.
  5. EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커를 암호화하는 유전자의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 위암 진단용 키트.
  6. 1) 시료로부터 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 단백질 발현량을 정상개체의 단백질 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 단계 1)의 시료가 소변, 혈액, 혈청 또는 혈장인, 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 EGFR, TTR, ApoA1 및 RANTES 단백질의 발현량이 정상개체에 비해 감소하는, 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 LRG1 및 D.Dimer 단백질의 발현량이 정상개체에 비해 증가하는, 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
  10. 1) 시료로부터 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 단백질을 암호화하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 유전자 발현량을 정상개체의 유전자 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
  11. 위암 진단용 조성물의 제조에 사용하기 위한 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약의 용도.
  12. 위암 진단용 키트의 제조에 사용하기 위한 제 1항의 위암 진단용 조성물의 용도.
  13. 위암 진단용 키트의 제조에 사용하기 위한 EGFR, TTR, ApoA1, RANTES, LRG1 및 D.Dimer로 구성된 바이오마커를 암호화하는 유전자의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용도.
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