CN106117353A - 一种念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

一种念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体及其制备方法 Download PDF

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CN106117353A
CN106117353A CN201610496205.2A CN201610496205A CN106117353A CN 106117353 A CN106117353 A CN 106117353A CN 201610496205 A CN201610496205 A CN 201610496205A CN 106117353 A CN106117353 A CN 106117353A
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candida mannan
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mannan
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彭洁
李宁
粟艳
周泽奇
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Abstract

本发明提供一种针对念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体，按如下步骤制得，用灭活的念珠菌菌体作为免疫原免疫动物，经分离纯化后得到初步纯化的多克隆抗体；将念珠菌甘露聚糖Mn抗原交联于亲和层析基质，得到念珠菌甘露聚糖Mn免疫亲和层析柱；将初步纯化的多克隆抗体经免疫亲和层析柱纯化后，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体。用本发明方法制备得到的多克隆抗体效价高、纯度高的特点，在医疗和科研领域应用前景广阔。

Description

一种念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及抗体及其制备方法，特别涉及用于针对念珠菌甘露聚糖(Mannan，Mn)抗原的一种多克隆抗体及其制备方法。
背景技术
白色念珠菌是一种条件致病念珠菌，人体在正常情况下不会受到白色念珠菌的感染，只有机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调时，可能感染白色念珠菌，引起深部感染，甚至全身散播性感染。
近年来由于人口老龄化，免疫抑制剂及广谱抗生素的大量应用，艾滋病、恶性肿瘤发病率的增加，器官、骨髓移植及介入治疗的广泛开展，临床上侵袭性念珠菌感染的发病率呈逐年上升趋势。由于缺乏有效的诊断方法，侵袭性念珠菌感染后易造成漏诊、误诊而延误治疗，因此，发展早期、快速且特异的侵袭性念珠菌感染诊断学方法成为临床上迫切需要解决的问题。
目前临床对于侵袭性念珠菌感染常规的诊断方法主要包括以下几种：
(1)组织病理学诊断方法
在组织切片中找到病原念珠菌是确诊的“金标准”，有念珠菌侵袭和相应的炎症反应与组织损害或组织标本念珠菌培养阳性即可确定念珠菌感染的诊断。但组织病理学检查取材需要侵入性操作，重症患者难以耐受，可行性差。其敏感性受到取材的影响，一次切片未必能够找到念珠菌成分，且侵袭性念珠菌感染可引起各种各样的组织反应，给诊断带来较大困难。
(2)直接镜检和培养
直接镜检是念珠菌学检查最经典的方法，具有简便、快速、实用的优点，可以在显微镜下直接观察念珠菌形态。但直接镜检阳性率较低，阴性结果不能排除诊断，且同一菌属内的多种念珠菌镜下形态相似，对于菌种鉴定没特别的帮助。而培养检查需要结合菌落特征、生化试验等进行详细观察，培养过程耗时长，有时需要数周时间重复多次接种才能得出正确结果，且敏感性和阳性率较低，同时对操作人员的技术经验要求高，不利于早期诊断。
(3)影像学检查
动态影像学检查对提示诊断具有重要作用，胸部CT扫描，特别是高分辨率CT的临床应用对早期诊断价值较高。但影像学检测特异性较差，接合菌、镰孢菌、放线菌、奴卡菌、金黄色葡萄球菌等血管侵袭性感染在影像学上可能与侵袭性真菌相似，所以影像学检查通常只能作为辅助诊断手段。
甘露聚糖(mannan)是白色念珠菌细胞壁的主要抗原成分。对于白色念珠菌感染的诊断，除了传统的培养方法，测定血清中白色念珠菌甘露聚糖抗原，逐渐成为白色念珠菌早期诊断的简单、快捷的方法。
免疫检测技术是利用抗原抗体间能特异性结合反应，通过检测标记在反应物上的标记物，对抗原或抗体实现定性或定量检测的方法。根据标记物质的不同，分为酶联免疫分析技术(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay,ELISA)、免疫荧光检测技术、化学发光免疫分析技术、免疫微球技术、免疫胶体金技术等。其中ELISA技术具有操作简单，灵敏度高，检测时间短的特点，在临床检测和科学研究中被广泛使用。
而测定抗原作为白色念珠菌感染诊断方法的关键，便是得到针对白色念珠菌甘露聚糖抗原的抗体。所以，迫切需要一种方法能够制备针对白色念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种稳定、高效、特异性高的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体及其制备方法。
为实现上述目的，本发明一方面提供一种念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体，按以下步骤制得：
(1)用灭活的念珠菌菌体作为免疫原免疫动物，经分离纯化后得到初步纯化的多克隆抗体；
(2)将念珠菌甘露聚糖Mn抗原交联于亲和层析基质，得到念珠菌甘露聚糖Mn免疫亲和层析柱；
(3)步骤(1)得到的初步纯化的多克隆抗体经步骤(2)得到的免疫亲和层析柱纯化后，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体。
优选的，所述步骤(1)中，将灭活的念珠菌菌体进行破碎，用破碎后的念珠菌菌体作为免疫原；更优选的，可采用反复冻融法、超声破碎法、高速离心法、高速组织捣碎法和渗透压差法中的一种或几种进行破碎；更优选的，采用反复冻融法和/或超声破碎法进行破碎。
优选的，所述步骤(1)中，动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴中的一种或多种。
念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体采用间接法ELISA检测，效价不低于1:1×105。
优选的，所述步骤(1)中，免疫采用皮下注射法、脾内注射法、静脉注射法、腹腔注射法中的一种；所述的免疫的免疫剂量依照动物的种类确定，优选为10-1000μg/只/次。
优选的，为获得较好的免疫效果，所述步骤(1)中，每隔5-9天(优选6-8天，更优选为7天)测定免疫后动物的血清效价；免疫次数优选为3-5次，例如4次。
优选的，所述步骤(1)中，分离纯化的方法包括饱和硫酸铵盐析法、辛酸沉淀法、DEAE离子交换层析法、羟基磷灰石层析法、凝胶层析法等。优选的，采用饱和硫酸铵盐析法进行分离纯化。
在本发明一个具体的实施方式中，所述步骤(1)具体包括：用反复冻融法和超声破碎法将灭活的念珠菌菌体进行破碎，用破碎后的念珠菌菌体免疫动物；测定免疫后动物的血清效价，从免疫后的动物体内取血；用饱和硫酸铵盐析法进行纯化，得到初步纯化的多克隆抗体。
优选的，所述步骤(2)中，所述亲和层析基质选自蛋白A微珠、蛋白G微珠、活性微珠；更优选为蛋白G微珠。
优选的，所述步骤(2)中，所述念珠菌甘露聚糖Mn抗原与亲和层析基质的比例为：每1mL亲和层析基质结合1-4mg念珠菌甘露聚糖Mn抗原。
优选的，所述步骤(2)中，采用双功能结合剂将念珠菌甘露聚糖Mn抗原交联于亲和层析基质，所述双双功能结合剂选自二甲基庚二酸酯、羰基二咪唑、溴化氰、羟基丁二酰亚胺、乙酰基碘，优选二甲基庚二酸酯。
在本发明一个具体的实施方式中，所述步骤(2)具体包括如下步骤：
将念珠菌甘露聚糖Mn抗原溶于碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液中，并与亲和层析基质混合成匀浆，其中，每1mL蛋白A微珠结合1-4mg念珠菌甘露聚糖Mn抗原；
用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液洗涤得到的匀浆，并离心，得到抗原与亲和层析基质的混合物，其中，硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5，用量为5-15倍亲和层析基质体积；
用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液重悬得到的抗原与亲和层析基质的混合物，向得到的混悬液中加入二甲基庚二酸酯，室温孵育20-40min，并混匀，液固分离，得到亲和层析基质-抗原交联复合物，其中，硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5，用量为5-15倍亲和层析基质体积，二甲基庚二酸酯在混悬液中的终浓度为10-30mmol/L；
用0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液洗涤得到的亲和层析基质-抗原交联复合物；
将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物重悬于0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液中，室温孵育1.5-2.5h，混匀；
将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物填充入层析柱中，制得念珠菌甘露聚糖Mn免疫亲和层析柱。
优选的，所述步骤(3)具体包括如下步骤：
用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；
将步骤(1)初步纯化的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体上样；
用10-25倍柱床体积的结合缓冲液洗柱；
用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；
采用分段洗脱法，连续以0.4-0.8倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱，分别收集洗脱组分，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体。
在本发明一个具体实施方式中，所述结合缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种，优选为PBS缓冲液；所述预洗脱缓冲液为碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液；所述洗脱缓冲液选自0.1M甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为3.0。
在本发明一个具体的实施方式中，检测各洗脱组分中的多克隆抗体含量，将浓度高的多克隆抗体洗脱组分合并。此外，可用10-25倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱，使所述免疫亲和层析柱再生，当加入0.01％硫柳汞时，免疫亲和层析柱可长期保存于4℃的环境中。
本发明还提供了一种念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)用灭活的念珠菌菌体作为免疫原免疫动物，经分离纯化后得到初步纯化的多克隆抗体；
(2)将念珠菌甘露聚糖Mn抗原交联于亲和层析基质，得到念珠菌甘露聚糖Mn免疫亲和层析柱；
(3)步骤(1)得到的初步纯化的多克隆抗体经步骤(2)得到的免疫亲和层析柱纯化后，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体。
优选的，所述步骤(1)中，将灭活的念珠菌菌体进行破碎，用破碎后的念珠菌菌体作为免疫原；更优选的，可采用反复冻融法、超声破碎法、高速离心法、高速组织捣碎法和渗透压差法中的一种或几种进行破碎；更优选的，采用反复冻融法和/或超声破碎法进行破碎。
优选的，所述步骤(1)中，动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴中的一种或多种。
优选的，所述步骤(1)中，免疫采用皮下注射法、脾内注射法、静脉注射法、腹腔注射法中的一种；所述的免疫的免疫剂量依照动物的种类确定，优选为10-1000μg/只/次。
优选的，为获得较好的免疫效果，所述步骤(1)中，每隔5-9天(优选6-8天，更优选为7天)测定免疫后动物的血清效价；免疫次数优选为3-5次，例如5次。
优选的，所述步骤(1)中，分离纯化的方法包括饱和硫酸铵盐析法、辛酸沉淀法、DEAE离子交换层析法、羟基磷灰石层析法、凝胶层析法等。优选的，采用饱和硫酸铵盐析法进行分离纯化。
在本发明一个具体的实施方式中，所述步骤(1)具体包括：用反复冻融法和超声破碎法将灭活的念珠菌菌体进行破碎，用破碎后的念珠菌菌体免疫动物；测定免疫后动物的血清效价，从免疫后的动物体内取血；用饱和硫酸铵盐析法进行纯化，得到初步纯化的多克隆抗体。
优选的，所述步骤(2)中，所述亲和层析基质选自蛋白A微珠、蛋白G微珠、活性微珠；更优选为蛋白G微珠。
优选的，所述步骤(2)中，所述念珠菌甘露聚糖Mn抗原与亲和层析基质的比例为：每1mL亲和层析基质结合1-4mg念珠菌甘露聚糖Mn抗原。
优选的，所述步骤(2)中，采用双功能结合剂将念珠菌甘露聚糖Mn抗原交联于亲和层析基质，所述双双功能结合剂选自二甲基庚二酸酯、羰基二咪唑、溴化氰、羟基丁二酰亚胺、乙酰基碘，优选二甲基庚二酸酯。
在本发明一个具体的实施方式中，所述步骤(2)具体包括如下步骤：
将念珠菌甘露聚糖Mn抗原溶于碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液中，并与亲和层析基质混合成匀浆，其中，每1mL亲和层析基质结合1-4mg念珠菌甘露聚糖Mn抗原；
用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液洗涤得到的匀浆，并离心，得到抗原与亲和层析基质的混合物，其中，硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5，用量为5-15倍亲和层析基质体积；
用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液重悬得到的抗原与亲和层析基质的混合物，向得到的混悬液中加入二甲基庚二酸酯，室温孵育20-40min，并混匀，液固分离，得到亲和层析基质-抗原交联复合物，其中，硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5，用量为5-15倍亲和层析基质体积，二甲基庚二酸酯在混悬液中的终浓度为10-30mmol/L；
用0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液洗涤得到的亲和层析基质-抗原交联复合物；
将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物重悬于0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液中，室温孵育1.5-2.5h，混匀；
将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物填充入层析柱中，制得念珠菌甘露聚糖Mn免疫亲和层析柱。
优选的，所述步骤(3)具体包括如下步骤：
用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；
将步骤(1)初步纯化的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体上样；
用10-25倍柱床体积的结合缓冲液洗柱；
用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；
采用分段洗脱法，连续以0.4-0.8倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱，分别收集洗脱组分，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体。
在本发明一个具体实施方式中，所述结合缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种，优选为PBS缓冲液；所述预洗脱缓冲液为碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液；所述洗脱缓冲液选自0.1M甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为3.0。
在本发明一个具体的实施方式中，检测各洗脱组分中的多克隆抗体含量，将浓度高的多克隆抗体洗脱组分合并。此外，可用10-25倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱，使所述免疫亲和层析柱再生，当加入0.01％硫柳汞时，免疫亲和层析柱可长期保存于4℃的环境中。
本发明还一方面提供一种用于检测念珠菌的试剂盒，所述试剂盒包括如本发明所述的念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗体或者如本发明所述的制备方法制备得到的念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗体。
优选的，所述试剂盒还包括稀释剂，所述稀释剂选自生理盐水、磷酸盐缓冲液，PBS缓冲液，Tris-HCl缓冲液，硼酸盐缓冲液，琥珀酸盐缓冲液，或柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
优选的，所述试剂盒还可包括一种或多种药学上可接受的药物载体和/或赋形剂，其在使用时通常可冻干保存。
优选的，所述试剂盒还可包括酶标试剂，显色剂，终止液，洗涤液等。
本发明采用念珠菌灭活菌体作为免疫原产生多克隆抗体，并采用念珠菌甘露聚糖Mn抗原对多克隆抗体进行特异性纯化，本发明得到的多克隆抗体为国内首例使用免疫亲和层析提纯的念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗体，填补了国内空白。实验证明，用本发明所述方法制得的多克隆抗体具有效价高，特异性好的特点，且多克隆抗体性质稳定，有很强的应用前景。
附图说明
图1显示了兔IgG型多克隆抗体的SDS-PAGE检测的结果。
图2显示了兔IgG型多克隆抗体的效价测定的结果。
具体实施方式
本发明中所述念珠菌是一种条件致病念珠菌，人体在正常情况下不会受到念珠菌的感染，只有机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调时，可能感染白色念珠菌，引起深部感染，甚至全身散播性感染。
本发明中所述“念珠菌甘露聚糖抗原”，“念珠菌甘露聚糖Mn抗原”，“甘露聚糖Mn抗原”，“Mn抗原”可依照上下文语义互换使用。
本发明中所述“念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体”、“抗甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体”和“多克隆抗体”可依照上下文语义互换使用。
本发明所使用的念珠菌甘露聚糖Mn抗原由丹娜(天津)生物科技有限公司提供。
实施例1：初步纯化的念珠菌甘露聚糖Mn抗原(以下简称GXM抗原)的多克隆抗体的制备
一、用反复冻融法和超声破碎法将灭活后念珠菌进行破碎。
具体方法为：
(1)液体培养基中加入甲醛溶液，使甲醛终浓度为3.7％，于4℃放置24h灭活孢子。
(2)灭活后的念珠菌菌体4℃4000rpm离心10min，去上清。
3)用预冷的生理盐水重悬孢子后反复洗涤6-10次，充分去除甲醛溶液。
(3)加入液氮用灭菌的研钵研磨破碎3-5次，加水，冰浴下使用探头式超声破碎30min。
(4)进行BCA蛋白定量和苯酚硫酸法糖定量。
二、免疫动物
(1)将破碎的灭活的念珠菌菌体与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.01-1mg。免疫前3天取耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫1次，方法与第1次相同。
(2)免疫过程中，免疫后每隔几天采血测效价1次，免疫次数不少于3次。
(3)血清效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分离出后，高速离心，取上清，-20℃保存。
三、用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化
(1)取2mL抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4mL饱和硫酸铵溶液，4℃沉淀过夜。
(2)10000g低温离心10min，弃上清，将沉淀用2mL PBS溶解，缓慢滴加1mL饱和硫酸铵溶液，4℃静置1h。
(3)10000g低温离心10min，弃上清，将沉淀用1mL PBS溶解，用PBS溶液4℃透析过夜。
实施例2：念珠菌甘露聚糖Mn免疫亲和层析柱的制备
(1)将Mn抗原溶于碳酸盐缓冲液中，按每毫升湿的蛋白G微珠结合4mg Mn抗原，将Mn抗原和蛋白G微珠混合成为稀薄的匀浆，在总量为10mL的碳酸盐缓冲液中加入大约2mL蛋白G微珠，室温孵育1h，轻轻摇动混匀。
(2)用5-15倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH 8.0-9.5)洗涤匀浆2次，每次以3000g离心2min，或10000g离心30s，得到MN抗原-蛋白G微珠的混合物。
(3)用5-15倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH 8.0-9.5)重悬MN抗原-蛋白G微珠的混合物，留取相当于10mL湿蛋白G微珠的样品，加入足量的二甲基庚二酸酯(固体)至微珠匀浆中，使终浓度为20mmol/L；室温孵育30min，使结合在蛋白G微珠上的Mn抗原与蛋白G微珠基质发生交联，并轻轻混匀，留取相当于10mL交联微珠的样品，得到Mn抗原-蛋白G微珠交联复合物。
(4)用0.1-0.25mol/L乙醇胺(pH 8.0)洗涤Mn抗原-蛋白G微珠交联复合物1次以终止交联反应，然后将其重悬于0.2mol/L乙醇胺溶液中，室温孵育2h，轻轻混匀，微珠用PBS洗涤后，重悬于PBS，加入硫柳汞保存。
(5)将Mn抗原-蛋白G微珠交联复合物转入合适的层析柱中，用PBS冲洗容器，收集残留的微珠。
实施例3：念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体的免疫亲和纯化
(1)用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱。
(2)将初步纯化的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体上样，按每毫升柱体积大约1mL/h的流速，使样品流过层析柱，用蠕动泵控制流速。
(3)用10-25倍柱床体积的结合缓冲液洗柱。
(4)用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱。
(5)采用分段洗脱法，连续以0.4-0.8倍柱床体积的洗脱缓冲液通过层析柱，分管收集每一组分。
(6)检测每管的抗体含量，将浓度高的各管合并，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体。
(7)用10-25倍柱床体积的起始缓冲液流经基质，使层析柱再生，加入0.01％硫柳汞保存于4℃的环境中。
实施例4，念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体的检测
1.SDS-PAGE电泳检测
对实施例3制得的多克隆抗体进行SDS-PAGE电泳，对得到的凝胶进行考马斯亮蓝染色。
(1)配制浓度8％的SDS-PAGE凝胶，制胶；
(2)每孔加10μL实施例3制得的单克隆抗体样品；
(3)60V恒压电泳10min后120V恒压电泳大约1h，至溴酚蓝条带距胶板下边缘1cm时停止电泳；
(4)考马斯亮蓝染色1h；
(5)4℃脱色过夜；
(6)拍照并观察。
实验结果见图1(pAb泳道为多克隆抗体，M泳道为蛋白Marker)。由图中可看出，在25KD和50KD分子量区有清晰明显的条带，说明抗体纯度很高。
2.效价测定
用间接ELISA法对本发明实施例3制得的多克隆抗体的抗体效价进行测定。所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，阴性对照为PBS溶液，多克隆抗体分别稀释16,000、32,000、64,000、128,000、256,000、512,000、1,024,000倍，以抗体溶液的OD值大于阴性对照OD值的2倍为阳性判定标准。检测结果见表1和图2。
表1
稀释倍数 OD450
空白对照 0.048
1:500 3.361
1:1000 3.237
1:5000 2.532
1:10000 1.520
1:50000 0.879
1:100000 0.475
1:500000 0.277
从检测结果可知，本发明多克隆抗体效价很高，大于1:1×105。
本说明书上文中结合具体实施方式对本发明进行了阐释，但应理解，这些描述和阐释只是为了更好地理解本发明，而不构成对本发明的任何限定。本领域技术人员在阅读了本申请说明书之后可对本发明的具体实施方式进行必要的改动而不脱离本发明的精神和范围。

Claims (8)

1.一种念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体，其特征在于：按以下步骤制得：
(1)用灭活的念珠菌菌体作为免疫原免疫动物，经分离纯化后得到初步纯化的多克隆抗体；
(2)将念珠菌甘露聚糖Mn抗原交联于亲和层析基质，得到念珠菌甘露聚糖Mn免疫亲和层析柱；
(3)步骤(1)得到的初步纯化的多克隆抗体经步骤(2)得到的免疫亲和层析柱纯化后，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体。
2.如权利要求1所述的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体，其特征在于：所述步骤(1)中，所述动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体，其特征在于：所述念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体采用间接法ELISA检测，效价不低于1:1×105。
4.一种念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)用灭活的念珠菌菌体作为免疫原免疫动物，经分离纯化后得到初步纯化的多克隆抗体；
(2)将念珠菌甘露聚糖Mn抗原交联于亲和层析基质，得到念珠菌甘露聚糖Mn免疫亲和层析柱；
(3)步骤(1)得到的初步纯化的多克隆抗体经步骤(2)得到的免疫亲和层析柱纯化后，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴中的一种或多种；和/或，
所述步骤(1)中，免疫采用皮下注射法、脾内注射法、静脉注射法、腹腔注射法中的一种，免疫剂量为10-1000μg/只/次；和/或，
所述步骤(1)中，每隔5-9天测定免疫后动物的血清效价，免疫次数为3-5次；和/或，
所述步骤(1)中，分离纯化的方法包括饱和硫酸铵盐析法、辛酸沉淀法、DEAE离子交换层析法、羟基磷灰石层析法、凝胶层析法等。
6.如权利要求4所述的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体，其特征在于：所述步骤(2)中，所述念珠菌甘露聚糖Mn抗原是从念珠菌的培养物中提取，并通过偶联有念珠菌甘露聚糖Mn抗原的单克隆抗体的免疫亲和层析柱进行纯化。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述亲和层析基质选自蛋白A微珠、蛋白G微珠、活性微珠，优选为蛋白G微珠；和/或，
所述步骤(2)中，采用双功能结合剂将念珠菌甘露聚糖Mn抗原交联于亲和层析基质，所述双双功能结合剂选自二甲基庚二酸酯、羰基二咪唑、溴化氰、羟基丁二酰亚胺、乙酰基碘。
8.如权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：
(1)用反复冻融法和超声破碎法将灭活的念珠菌菌体进行破碎，用破碎后的念珠菌菌体免疫动物；测定免疫后动物的血清效价，从免疫后的动物体内取血；用饱和硫酸铵盐析法进行纯化，得到初步纯化的多克隆抗体；
(2)将念珠菌甘露聚糖Mn抗原溶于碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液中，并与亲和层析基质混合成匀浆，其中，每1mL亲和层析基质结合1-4mg念珠菌甘露聚糖Mn抗原；
用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液洗涤得到的匀浆，并离心，得到抗原与亲和层析基质的混合物，其中，硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5，用量为5-15倍亲和层析基质体积；
用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液重悬得到的抗原与亲和层析基质的混合物，向得到的混悬液中加入二甲基庚二酸酯，室温孵育20-40min，并混匀，液固分离，得到亲和层析基质-抗原交联复合物，其中，硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5，用量为5-15倍亲和层析基质体积，二甲基庚二酸酯在混悬液中的终浓度为10-30mmol/L；
用0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液洗涤得到的亲和层析基质-抗原交联复合物；
将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物重悬于0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液中，室温孵育1.5-2.5h，混匀；
将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物填充入层析柱中，制得念珠菌甘露聚糖Mn免疫亲和层析柱；
(3)用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；
将步骤(1)初步纯化的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体上样；
用10-25倍柱床体积的结合缓冲液洗柱；
用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；
采用分段洗脱法，连续以0.4-0.8倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱，分别收集洗脱组分，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗体；
其中，所述结合缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种；所述预洗脱缓冲液为碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液；所述洗脱缓冲液选自0.1M甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为3.0。
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