CN102421799A - 用于高分子脂联素分析的新型单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与中分子(MMW)脂联素不表现出交叉性、仅与高分子(HMW)脂联素特异性反应的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体可使用HMW脂联素作为抗原来制作。根据本发明的单克隆抗体，可以提供简便、高精度且通用性高的HMW脂联素分析用试剂。

Description

用于高分子脂联素分析的新型单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及新型高分子脂联素（アディポネクチン）特异性单克隆抗体、以及使用其的高分子脂联素的选择性分析(特别是测定)方法。

背景技术

脂联素是在脂肪细胞中特异性表达的分泌蛋白，已报道了其抗动脉硬化作用、胰岛素抗性改善作用。近年来认为其还显示与癌症、炎症、代谢综合征的相关性，发挥生物体的防御因子的作用。已知人脂联素由244个氨基酸残基形成，单体的分子量约为28 kDa。另一方面，已经确认血液中的脂联素是以三聚体(LMW：低分子量)为基本骨架，以其聚合而成的六聚体(MMW：中分子量)、以及它们进一步多个聚合而成的多聚体(HMW：高分子量)的形式存在。

这些脂联素的各分子量体所具有的生理活性也不同。例如有报道称，C2C12细胞株中的NF-κB的活化能力在HMW和MMW中观察到，在LMW中未观察到。另外，有报道称，脂联素分泌具有变异的人无法形成HMW脂联素，发生低脂联素血症和糖尿病，与健康人相比，在冠状动脉疾病患者中，多聚体脂联素的存在比例降低。进一步还有报导称，节食前后在血液中浓度发生变动的是HMW。因此，只检出HMW脂联素对于脂联素的研究以及各种疾病的研究是重要的。

通常，蛋白质分子可以通过以该蛋白质作为抗原而特异性识别的单克隆抗体来分离。但是，如脂联素那样，抗原是由相同单体构成的各种形态的多聚体混合存在时，很难发现只特异性地针对特定尺寸的分子的抗体。多数情况下抗体识别抗原的初级氨基酸序列，因此，抗原为多聚体时，抗体通常识别构成该多聚体的单体的初级氨基酸序列。另一方面，脂联素由相同的单体构成，因此识别脂联素单体的抗体可以同时识别所有形态的脂联素多聚体。另外，即使在单克隆抗体识别立体结构的情况下，在如HMW脂联素这样基本骨架大量聚合的分子中难以避免与其它分子的交叉。

因此，利用常规抗体时，难以只检测出特定尺寸的脂联素分子。

为了将特定分子尺寸的脂联素进行定量，以往常规方法是通过凝胶过滤等预处理，按照分子量分级，并检出各峰的方法；或者用特定的蛋白酶消化特定分子，然后进行检出的方法。还开发了不需要凝胶过滤或蛋白酶等预处理的ELISA技术，但仍可见与MMW的交叉，很难说是HMW特异性的。因此，人们要求通过简易的预处理方法或者无预处理，可以只检出特定分子尺寸的脂联素的方法。

作为公知的特定分子尺寸的脂联素的测定方法，除上述的凝胶过滤法之外，还已知以下两种方法。

(1)用分解LMW和MMW的酶进行预处理，测定不被酶解而残留的脂联素，由此只检出HMW的方法 (专利文献1)。

(2)使用不与脂联素单体反应、但识别三聚体和/或具有其凝集而成的结构的高分子脂联素的抗体，只检出该高分子脂联素抗原的方法(专利文献2)。

但是，用酶进行预处理时需要数十分钟的酶解处理时间，且在进行超过最佳时间的长时间孵育时，存在靶分子本身被混合存在的蛋白酶分解的危险，因此必须严格规定孵育的时间。并且酶解处理必须根据目标抗原的类型选择最佳种类的分解酶，因此很难说是通用的方法。

另一方面，利用公知的识别高分子脂联素的抗体时，与高分子体(HMW)一起，同时也一起识别了其他多聚体结构(LMW或MMW)，因此很难说是可纯粹地只检出HMW的方法。目前尚未知特异性地只识别HMW脂联素的抗体。

专利文献1：国际公开第WO2005/038457号小册子

专利文献2：日本特许第3624216号说明书。

发明内容

在以往的无预处理型的HMW检出用ELISA中，对于大量含有MMW的标本，存在与MMW显示交叉性的问题，因此难以真实地进行HMW特异性的测定，并且在ELISA中，即使是HMW选择性强的抗体，也会由于乳胶标记而失去HMW选择性，极难通过乳胶简单地测定HMW脂联素。因此，本发明的课题在于：提供与MMW脂联素不显示交叉性、只选择性地检出或定量HMW脂联素的单克隆抗体，以及简便、高精度且通用性高的高分子脂联素分析用试剂。

本发明人进行了可以更简便地、只选择性地检出或定量HMW脂联素的高分子脂联素分析用乳胶试剂的构建，以及其中所使用的单克隆抗体的筛选。结果确认，即使是在夹心ELISA体系中HMW特异性较强的抗体，以乳胶试剂的形式进行评价时也完全不显示HMW特异性，因此只使用人血液中的脂联素HMW级分，重新制作单克隆抗体。发现：本单克隆抗体与由其他大肠杆菌重组脂联素制作的单克隆抗体相比，在蛋白质印迹分析中即使具有同等的反应性，如果用夹心ELISA体系评价，则HMW特异性极强。并且，构建使用该单克隆抗体的脂联素分析用乳胶试剂时，结果发现本试剂与MMW不显示交叉性，可选择性地测定HMW脂联素，从而完成了本发明。

本发明涉及以下内容：

[1] 单克隆抗体，其特征在于：其与高分子脂联素特异性地反应。

[2] [1]的单克隆抗体的制造方法，其特征在于：使用高分子脂联素作为抗原。

[3] 高分子脂联素的免疫学分析方法，其特征在于：采用[1]的单克隆抗体。

[4] [3]的免疫学分析方法，其是乳胶凝集法。

[5] 高分子脂联素的免疫学分析用试剂，其含有[1]的单克隆抗体。

[6] [5]的免疫学分析用试剂，其含有担载了[1]的单克隆抗体的乳胶颗粒。

根据本发明的新型的单克隆抗体，可以提供更简便且准确、可只选择性地分析(检出或定量)高分子(HMW)脂联素的高分子脂联素分析用试剂(特别是乳胶试剂)和分析方法。

附图说明

图1是表示使用采用公知的单克隆抗体的各种ELISA试剂盒，测定人血清(MMW低值标本)的凝胶过滤级分中的脂联素量的结果的曲线图。

图2是表示使用与图1相同的ELISA试剂盒测定人血清(MMW高值标本)的凝胶过滤级分中的脂联素量的结果的曲线图。

图3是表示通过使用公知单克隆抗体ANOC9121制作的乳胶试剂来测定人血清的凝胶过滤级分中的脂联素量的结果的曲线图。

图4是表示除了与图1相同的ELISA试剂盒之外还使用本发明的ELISA试剂盒来测定人血清(MMW低值标本)的凝胶过滤级分中的脂联素量的结果的曲线图。

图5是表示使用与图4相同的ELISA试剂盒测定人血清(MMW高值标本)的凝胶过滤级分中的脂联素量的结果的曲线图。

图6是表示通过使用本发明的单克隆抗体Clone8D制作的本发明的乳胶试剂，测定人血清的凝胶过滤级分中的脂联素量的结果的曲线图。

具体实施方式

本发明的单克隆抗体与高分子脂联素特异性地反应。本说明书中，“与高分子脂联素特异性地反应”是指与高分子脂联素反应但与三聚体脂联素不反应、实质上与六聚体脂联素不反应。应予说明，本说明书中，有时分别将高分子脂联素、六聚体脂联素、三聚体脂联素称为HMW脂联素、MMW脂联素、LMW脂联素(或简称为HMW、MMW、LMW)。

另外，本说明书中，“高分子脂联素”是以LMW和/或MMW的聚合物作为基本骨架的多聚体，是指在非改性下进行分级时，被分级为约440 kDa以上(即，HMW与MMW的分界为约440 kDa)、在670 kDa附近具有峰的上述多聚体。

应予说明，上述分子量是由后述比较例和实施例中实施的凝胶过滤确定的值，该凝胶过滤条件如下。

柱：Superdex 200 prep grade (GEヘルスケア バイオサイエンス)

移动相(溶剂)：D-PBS

给液速度：1 mL/分钟

分子量标记：

(1) 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)：67,000 (Da)

(2) 醛缩酶(Aldolase)：158,000

(3) 过氧化酶(Catalase)：232,000

(4) 铁蛋白(Ferritin)：440,000

(5) 甲状腺球蛋白(Thyroglobulin)：669,000

(6) 蓝葡聚糖2000(Blue Dextran 2000)：2,000,000

本说明书中，“实质上与六聚体脂联素(MMW)不反应”是指在非改性下对人血清进行分级时，与在400 kDa附近具有峰、在约250-440 kDa处洗脱的分子不显示反应性。

作为本发明的HMW脂联素特异性抗体的制作方法，使用直接由生物体采集、分级为HMW的脂联素作为免疫原，除此之外，可以按照以往的单克隆抗体的制作方法进行。

作为免疫原使用的生物体试样只要是可能含有HMW脂联素的生物学液体即可，没有特别限定，例如可举出：直接由生物体采集得到的生物体液[例如血液(即全血)、血清、血浆、尿液、脊髓液或分泌液等]，或者将由生物体采集的生物体材料(例如器官、组织或细胞等)进行处理得到的来自生物体材料的液体(例如器官、组织或细胞的各种提取液、或者组织或细胞的各种培养液等)等。

作为免疫原的HMW脂联素级分可如下制备：使用上述生物体试样，分取含有HMW脂联素的各种分子量的脂联素，然后通过凝胶过滤色谱分取HMW。对于含有HMW脂联素的各种分子量的脂联素的采集，可以采用将识别HMW脂联素的抗体进行固定的亲和层析。固定的抗体只要是至少可识别HMW脂联素的抗体即可，也可以识别MMW或LMW脂联素。亲和层析或凝胶过滤色谱的具体方法可以根据所使用的抗体或生物体试样的量等适当实施。另外，通过凝胶过滤色谱分取后还可以通过亲和层析分取。

这样制作的HMW脂联素单克隆抗体除免疫球蛋白分子本身之外，还可以按照公知的方法制备抗体片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)₂或Fv等，可以在HMW脂联素的选择性测定方法中使用。

可通过本发明进行分析的被检试样只要是可能含有HMW脂联素的生物学液体即可，没有特别限定，例如可举出：直接由生物体采集得到的生物体液[例如血液(即全血)、血清、血浆、尿液、脊髓液或分泌液等]，或者将由生物体采集的生物体材料(例如器官、组织或细胞等)进行处理得到的来自生物体材料的液体(例如器官、组织或细胞的各种提取液、或者组织或细胞的各种培养液等)等。

HMW脂联素例如在正常人血液中以数μg/mL-数十μg/mL的浓度存在。或者可通过预实验等适当选择处理液(例如提取用溶液或培养用溶液)的量，使所得的来自生物体材料的液体中HMW脂联素浓度为数μg/mL-数十μg/mL。

这样，可由本发明进行分析的生物学液体(特别是血液)以数μg/mL-数十μg/mL的浓度含有HMW脂联素，通过本发明的HMW脂联素分析用试剂，可以无需预稀释，即可进行分析。

作为本发明的HMW脂联素分析方法，可以采用公知的免疫学测定方法。免疫学测定方法可举出：ELISA法或RIA法、免疫凝集法或免疫色谱法等。更具体地记载使用乳胶的免疫凝集法。

本发明中使用的乳胶颗粒可举出公知的乳胶颗粒，例如由聚苯乙烯、或苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物等制成的乳胶颗粒。担载针对HMW脂联素的特异性抗体的乳胶的平均粒径例如可根据作为被检试样的生物学液体的种类、HMW脂联素的含有浓度或测定仪器等，通常在0.05-1.0 μm的范围内适当选择。

例如，在分析血液中HMW脂联素时，在正常人标本中是以数μg-数十μg/mL这样的高浓度存在HMW脂联素，因此通过适当选择上述乳胶粒径，可以保证血液中HMW脂联素测定体系的测定范围。例如，粒径为0.1 μm以下时，有时不能保证临床意义上高的5 μg/mL以下的测定正确性，粒径为0.5 μm以上时，有时无法测定正常高值标本。因此，作为血液中HMW脂联素的测定体系，优选平均粒径0.1-0.5 μm的乳胶颗粒。

本发明的HMW脂联素分析用乳胶试剂只要含有担载了针对HMW脂联素的特异性的单克隆抗体的乳胶颗粒悬浮液即可，其形态没有特别限定，例如可以是：含有用HMW脂联素特异性抗体致敏的乳胶颗粒和缓冲液两者的单液系的试剂；或者由作为缓冲液的第1试剂、和含有用HMW脂联素特异性抗体致敏的乳胶颗粒的第2试剂构成的双液系的试剂等的各种形态。

本发明的HMW脂联素分析方法为，在取得可能含有脂联素的生物学液体后，无需对取得的上述生物学液体进行预稀释和/或预处理，而是直接以取得的状态或者根据需要在实施适当的处理后，与担载了本发明的针对HMW脂联素的特异性抗体的乳胶颗粒悬浮液(优选本发明的HMW脂联素分析用乳胶试剂)接触。

例如，作为本发明方法的优选方案之一的、使用自动分析测定装置的HMW脂联素分析方法包含以下步骤：(1)取得可能含有脂联素的生物学液体的步骤；以及(2)将上述步骤中取得的生物学液体直接以上述步骤中取得的状态或者在实施适当的预稀释和/或预处理后，在自动分析测定装置内与担载了针对HMW脂联素的特异性抗体的乳胶颗粒悬浮液接触，光学分析乳胶颗粒的凝集程度的步骤。

各种生物学液体例如血液中的HMW脂联素测定采用以往的测定方法——放射免疫检定或酶免疫测定时，例如必须有将标本稀释至500-5000倍的步骤。与此相对，本发明的HMW脂联素分析方法中，例如通过适当选择乳胶颗粒的粒径(例如在血液中HMW脂联素的情况下，优选0.1-0.5 μm的粒径)，无需对标本进行预稀释或预处理，可以以原液作为试样实施乳胶凝集反应。

本发明的HMW脂联素分析方法中，使用担载了针对HMW脂联素的特异性抗体的乳胶颗粒(例如本发明的HMW脂联素分析用乳胶试剂)进行凝集反应，通过光学分析(特别是测定)生成的凝集的程度(凝集度)，可以对生物学液体中(例如血液中)的HMW脂联素的量进行分析(特别是测定)。对乳胶颗粒的凝集度进行光学分析的具体方法例如可以是目视观察，或者使用测定散射光强度、吸光度或透射光强度的光学仪器进行测定。优选的测定波长为300-800 nm。测定方法可按照公知的方法，通过所使用的乳胶颗粒的大小(平均粒径)或浓度的选择、或反应时间的设定，通过测定散射光强度、吸光度或透射光强度的增加或减少来进行。另外，也可以将这些方法结合使用。

通常，存在于乳胶凝集反应的测定体系中的针对HMW脂联素的特异性抗体致敏乳胶的浓度例如可根据所共存的盐、蛋白质或糖类等添加物的浓度适当选择。通常，作为反应体系的最终液量的浓度，可制备为：针对HMW脂联素的特异性抗体致敏乳胶优选0.05-10 mg/mL，更优选0.1-2 mg/mL。如果针对HMW脂联素的特异性抗体致敏乳胶的浓度过低，则凝集反应的低浓度测定有时不充分，如果过高则凝集反应的高浓度测定有时不充分，重现性变差。

本发明中，通过调节影响针对HMW脂联素的特异性抗体致敏乳胶的凝集反应的其它因素，可以更精密地测定乳胶颗粒的凝集反应，可以使低浓度区域和高浓度区域的可定量的范围进一步扩大。对乳胶凝集反应有影响的其它因素例如可举出：乳胶颗粒的浓度、乳胶颗粒上的抗体致敏量或乳胶颗粒的粒径等。

本发明的HMW脂联素分析方法中的乳胶凝集反应的条件可以与常规条件相同，反应介质可以适当地选择与各种生物学液体中的HMW脂联素分析相适应的各种缓冲液。对血液中HMW脂联素进行分析时，只要该缓冲液具有不会使血液中HMW脂联素失活、并且不阻碍乳胶凝集反应的离子强度、pH即可，没有特别限定。例如可以使用顾德缓冲液（Good's buffer）、甘氨酸缓冲液或Tris缓冲液等。反应的pH为5-10，特别优选6-8。反应温度为0-50℃，特别优选20-40℃。反应时间可适当确定。

实施例

以下，通过实施例具体说明本发明，但它们并不限定本发明的范围。

比较例1

公知的单克隆抗体

为了与本发明的单克隆抗体进行比较，作为公知的单克隆抗体使用将大肠杆菌重组脂联素抗原对小鼠致敏而制作的两种单克隆抗体ANOC9121、Clone5A。将两种单克隆抗体与人血液中脂联素的反应性汇总于表1。在非还原条件下的蛋白质印迹法中，两种抗体均可同等地检出血液中的MMW、HMW。但是，在同一抗体之间的夹心ELISA中，Clone5A识别血液中所有的分子，而在ANOC9121之间的夹心ELISA中，可见与MMW的微弱的交叉。

[表1]

公知单克隆抗体的问题-1：与MMW的交叉反应性

使用之前制作的ANOC9121的夹心ELISA试剂盒、和无需预处理的市售的高分子脂联素ELISA试剂盒(富士レビオ)，测定两种人血清的凝胶过滤级分。另外，总脂联素的测定使用人脂联素ELISA试剂盒(大塚制药株式会社)。

只要无特别说明，本说明书的比较例和实施例中实施的凝胶过滤按以下条件实施。

柱：Superdex 200 prep grade (GEヘルスケア バイオサイエンス)

移动相(溶剂)：D-PBS

给液速度：1 mL/分钟

分子量标记：

(1) 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)：67,000 (Da)

(2) 醛缩酶(Aldolase)：158,000

(3) 过氧化酶(Catalase)：232,000

(4) 铁蛋白(Ferritin)：440,000

(5) 甲状腺球蛋白(Thyroglobulin)：669,000

(6) 蓝葡聚糖2000(Blue Dextran 2000)：2,000,000

使用MMW的含有比不高的血清样品时的结果如图1所示，使用MMW的含有比高的血清样品时的结果如图2所示。图1和图2中，A表示使用ANOC9121的夹心ELISA的结果，B表示市售的高分子脂联素ELISA试剂盒(富士レビオ)的结果，C表示总脂联素测定用人脂联素ELISA试剂盒(大塚制药株式会社)的结果。

结果如图1所示，在MMW不高的样品中，ANOC9121 ELISA试剂盒、市售的高分子脂联素ELISA试剂盒均可特异性测定高分子(H)。另一方面，图2所示的MMW高值的样品中，两种试剂盒均可确认与MMW的交叉反应性，因此难以特异性测定HMW。

应予说明，上述凝胶过滤条件中，HMW级分、MMW级分和LMW级分分别是分子量>约440 kDa、约250-440 kDa、＜约250 kDa的级分。

比较例2

公知单克隆抗体的问题-2：乳胶试剂化的问题

使用在ELISA中具有MMW反应性但HMW的特异性高的ANOC9121单克隆抗体尝试制备乳胶试剂。

(1) ANOC9121单克隆抗体致敏乳胶试剂的制备

将ANOC9121单克隆抗体以0.5 mg/mL的浓度溶解于0.01 mol/L Tris缓冲液(pH 8.0)，在9 mL该所得液体中添加1 mL平均粒径0.2 μm的聚苯乙烯乳胶(固形成分10%重量)，在室温下搅拌60分钟。接着向该液体中添加含有0.5%重量牛血清白蛋白的Tris缓冲液(pH 8.0)，在室温下搅拌60分钟，然后将该混合液以20000 rpm离心分离。在所得沉淀物中添加10 mL Tris缓冲液(pH8.0)，使乳胶悬浮，制备ANOC9121单克隆抗体致敏乳胶液。

(2) 缓冲液的制备

在含有0.5% (%重量)的浓度的牛血清白蛋白的0.1 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)中添加0.9%(%重量)浓度的氯化钠，制成缓冲液。

(3) HMW脂联素分析用乳胶试剂

本比较例中使用的人脂联素抗原测定试剂是以双液系试剂的形式构成的，该双液系试剂由在(2)中制备的缓冲液作为第1试剂、和在(1)中制备的ANOC9121单克隆抗体致敏乳胶作为第2试剂构成。

脂联素的测定

(1) 脂联素级分的测定

在35 μL人血清中的脂联素级分(MMW低值样品)中混合90 μL在脂联素测定用试剂的制备(2)中制备的缓冲液，在37℃下保持适当时间，然后添加90 μL在脂联素测定用试剂的制备(1)中制备的ANOC9121单克隆抗体致敏乳胶液，搅拌，然后测定5分钟后在波长570 nm处的吸光度。以该期间的吸光度的变化量作为吸光度变化量(ΔAbs)。根据由标准脂联素抗原液得到的ΔAbs和该抗原浓度制作标准曲线。使用该标准曲线，由被检样品的ΔAbs计算脂联素值。测定使用日立自动分析装置7170型进行。

此时，使用市售的人脂联素乳胶试剂盒(三菱化学ヤトロン)，同时进行总脂联素测定。为了比较两种试剂的峰，对于测定得到的吸光度，校正ANOC9121抗体致敏乳胶试剂中的测定吸光度，使第109号级分的吸光度一致。

图3示出了使用这样制作的ANOC9121而制备的HMW脂联素分析用乳胶试剂，对人血清中的脂联素级分进行评价的结果(图3E)。

与已有市售的总脂联素分析用乳胶试剂的结果(图3D)比较可知，使用ANOC9121的脂联素分析用乳胶试剂未表现出与相当于LMW的级分的反应性，但对于HMW、MMW，与总脂联素分析用乳胶试剂同样地检出，对于MMW低值样品也检出MMW，无法重现ELISA性能。

ELISA的结果未被反映于乳胶试剂中，认为其原因是：与和一次抗体反应、接着和二次抗体反应的ELISA相比，乳胶试剂中同时开始凝集等，由反应机理不同引起的，不过，认为也可能是对HMW的特异性或亲和性低引起的。

实施例1

(1) 免疫原的制备和新型单克隆抗体的制作

在已经尝试了的通过大肠杆菌重组脂联素制作抗体中，判断HMW特异性高的单克隆抗体的制作困难，只由人血液中脂联素提取HMW级分，进行单克隆抗体的制作。人血液中总脂联素的纯化中使用上述的ANOC9121结合柱。该柱通过将3-10 mg/mL的纯化ANOC9121与4 g CNBr-活化琼脂糖4B偶联来制作，在用磷酸缓冲液洗涤后的该柱中施用5-20 mL的人血清。用磷酸缓冲液洗涤除去多余的血清成分，然后用洗脱液洗脱人血液中的脂联素。洗脱液可使用数mol/L尿素等的蛋白改性剂、离液序列高的离子、或数mol/L氯化钠溶液，本实施例中使用6 mol/L尿素。并且，洗脱的脂联素通过凝胶过滤纯化，仅回收HMW级分中比HMW的峰更高分子量一侧的级分，由此来纯化人血液中的脂联素的HMW。

纯化的人血液中HMW脂联素与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂一起，对小鼠Balb/C以1-10 μg/个体隔周免疫数次，免疫多次。由小鼠摘出脾脏，然后按照常规方法使用小鼠骨髓瘤细胞株P3U1与聚乙二醇法使其融合，制作杂交瘤。

为了由制作的杂交瘤中筛选对天然型的脂联素特异性更高的单克隆抗体，利用血液中的脂联素作为完全未发生改性的脂联素。具体来说，制作将Fc部分消化得到的ANOC9121 F(ab’)₂，制作ANOC9121 F(ab’)₂固相板。使适当稀释的人血清与该F(ab’)₂板反应，接着使杂交瘤的培养上清液反应。进一步添加辣根过氧化物酶(HRP)标记得到的抗小鼠IgG Fc抗体，孵育，然后测定3,3’5,5’-四甲基联苯胺的显色强度，由此筛选生成对天然型脂联素的特异性、亲和性均高的单克隆抗体clone8D的Mouse-Mouse hybridoma Clone8D（小鼠-小鼠杂交瘤Clone8D）。

(2) 新制作的单克隆抗体利用蛋白质印迹法进行的评价

使用利用由血液中纯化的HMW脂联素级分而制作的、抗人脂联素单克隆抗体Clone8D，通过蛋白质印迹法对人血液中的脂联素分子进行分析。作为样品，在非还原非加热条件下以及利用2-巯基乙醇的还原条件下对人血液进行电泳，使上述ANOC9121、Clone5A和Clone8D三种抗体与其反应并染色。人血液中脂联素在非还原非加热条件下以HMW或MMW、LMW等多种形态存在，而在还原条件下，三聚体以上的形态消失，只以作为单体的约28,000 Da的形态或相当于二聚体的分子形式存在。单克隆抗体ANOC9121在非还原非加热条件下和还原下识别所有的分子量体。另一方面，单克隆抗体Clone5A和本次使用人血液中的脂联素而制作的Clone8D表现出不识别被还原改性的单体，而识别非还原非加热条件下的高分子量体，仅通过蛋白质印迹法评价，并未见到与高分子量体反应性在三者之间有很大差异。

实施例2

新制作的单克隆抗体利用ELISA进行的评价

构建使用Clone8D而成的夹心ELISA，与以往的夹心ELISA就HMW特异性进行比较。具体来说，将以5-10 μg/mL浓度在磷酸缓冲液中稀释得到的Clone8D添加到市售的96孔ELISA板中，进行固相反应过夜。接着用含有0.1-1%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液进行封闭操作。将使用Superdex200柱(GEヘルスケア)进行HPLC分级得到的人血清与该抗体固相板反应，洗涤后使生物素标记的Clone8D反应。进一步添加HRP结合链霉亲和素，孵育后洗涤过量的HRP结合链霉亲和素。测定由3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的添加得到的显色强度，由此确定各级分的脂联素的量。

进一步通过比较例1中使用的ANOC9121之间的夹心ELISA试剂盒、无需预处理的市售高分子脂联素ELISA试剂盒(富士レビオ)测定同一级分，确认与MMW的交叉性。另外，总脂联素的测定中使用人脂联素ELISA试剂盒(大塚制药株式会社)。其结果如图4和图5所示。使用Clone8D的夹心ELISA (图4和图5的F)与其他测定方法相比，不仅在如图5所示的MMW低值标本，而且在如图6所示的大量含有MMW的标本中也未显示与MMW的交叉性，可特异性测定HMW。

实施例3

使用新型单克隆抗体的高分子脂联素分析用乳胶试剂的制备

(1) Clone8D单克隆抗体致敏乳胶试剂的制备

以0.5 mg/mL的浓度将Clone8D单克隆抗体溶解于0.01 mol/L Tris缓冲液(pH 8.0)，在9 mL所得液体中添加1 mL平均粒径0.2 μm的聚苯乙烯乳胶(固形成分10%重量)，在室温下搅拌60分钟。接着，向该液体中添加含有0.5%重量牛血清白蛋白的Tris缓冲液(pH 8.0)，在室温下搅拌60分钟，然后将该混合液以20000 rpm离心分离。向所得沉淀物中添加10 mL Tris缓冲液(pH 8.0)，使乳胶悬浮，制备Clone8D单克隆抗体致敏乳胶液。

(2) 缓冲液的制备

在含有0.5% (%重量)浓度的牛血清白蛋白的0.1 mol/L Tris缓冲液(pH 8.0)中添加0.9% (%重量)浓度的氯化钠，制成缓冲液。

(3) HMW脂联素分析用乳胶试剂

本实施例中使用的人脂联素抗原测定试剂是以双液系试剂的形式构成的，该双液系试剂由在(2)中制备的缓冲液作为第1试剂、和在(1)中制备的Clone8D单克隆抗体致敏乳胶作为第2试剂构成。

脂联素的测定

(1) 脂联素级分的测定

在35 μL人血清中的脂联素级分中混合90 μL在脂联素测定用试剂的制备(2)中制备的缓冲液，在37℃下保持适当时间，然后添加90 μL在脂联素测定用试剂的制备(1)中制备的Clone8D单克隆抗体致敏乳胶液，搅拌，然后测定5分钟后的波长570 nm处的吸光度。以该期间的吸光度的变化量作为吸光度变化量(ΔAbs)。根据由标准脂联素抗原液得到的ΔAbs和该抗原浓度制作标准曲线。使用该标准曲线，由被检样品的ΔAbs计算脂联素值。测定使用日立自动分析装置7170型进行。

此时，使用市售的人脂联素乳胶试剂盒(三菱化学ヤトロン)，同时进行总脂联素测定。为了比较两种试剂的峰，对于测定得到的吸光度，校正Clone8D抗体致敏乳胶试剂中的测定吸光度，使第109号级分的吸光度一致。

结果如图6所示。图6中，D表示市售的人脂联素乳胶试剂盒(三菱化学ヤトロン)的结果，G表示本发明的Clone8D抗体致敏乳胶试剂的结果。使用本试剂测定人血清脂联素的凝胶过滤级分，结果可见HMW特异性乳胶凝集反应。

产业实用性

本发明的单克隆抗体可用于脂联素分析的用途。

以上按照特定的方案说明了本发明，但对本领域技术人员来说显而易见的变形或改良也包含在本发明的范围内。

保藏号

Mouse-Mouse hybridoma Clone8D于平成21年（2009年）3月5日保藏于作为国际保藏机构的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(╤305-8566日本国茨城县つくば市东1丁目1番地1中央第6)(保藏号FERM BP-11106)。

Claims (6)

1. 单克隆抗体，其特征在于，与高分子脂联素特异性地反应。

2. 权利要求1所述的单克隆抗体的制造方法，其特征在于，使用高分子脂联素作为抗原。

3. 高分子脂联素的免疫学分析方法，其特征在于，采用权利要求1所述的单克隆抗体。

4. 权利要求3所述的免疫学分析方法，其是乳胶凝集法。

5. 高分子脂联素的免疫学分析用试剂，其含有权利要求1所述的单克隆抗体。

6. 权利要求5所述的免疫学分析用试剂，其含有担载了权利要求1所述的单克隆抗体的乳胶颗粒。

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