ES2560559T3 - Anticuerpo monoclonal para analizar adiponectina de peso molecular alto y uso del mismo - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque reacciona específicamente con adiponectina de peso molecular alto, en donde el anticuerpo es producido por el clon del hibridoma ratón-ratón depositado como FERM BP-11106.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpo monoclonal para analizar adiponectina de peso molecular alto y uso del mismo Campo de la tecnica
La presente invencion se refiere a un nuevo anticuerpo monoclonal espedfico de adiponectina de peso molecular alto y a un procedimiento para analizar espedficamente (en particular medir) la adiponectina de peso molecular alto usando el anticuerpo monoclonal.
Tecnica anterior
La adiponectina es una protema secretora que se expresa espedficamente en los adipocitos y se ha comunicado que exhibe un efecto anti-arterioesclerotico y un efecto reductor de la resistencia a la insulina. En los ultimos anos, se ha comunicado que la adiponectina esta implicada en el cancer, inflamacion y smdrome metabolico, y se considera que actua como factor defensor en el organismo vivo. La adiponectina humana consiste en 244 restos de aminoacidos y se sabe que tiene un peso molecular de aproximadamente 28 kDa como monomero. Se ha confirmado que la adiponectina esta presente en la sangre en forma de un tnmero (PMB: peso molecular bajo) como estructura basica, un hexamero (PMM: peso molecular medio) compuesto por el tnmero, y multimeros (PMA: peso molecular alto) compuesto por uno o mas PMB y/o PMM.
Estas diversas formas de la adiponectina exhiben diferentes efectos fisiologicos. Por ejemplo, se ha comunicado que las de PMA y PMM activaban NF-KB en una lmea celular C2C12, pero la de pMb no. Adicionalmente, se ha notificado que las personas con deficit de secrecion de adiponectina no podfan producir adiponectina de PMA y sufnan hipoadiponectinemia y diabetes, y que la proporcion del contenido de adiponectina de PMA disminma en pacientes con arteriopatfa coronaria en comparacion con las personas sanas. Adicionalmente, se ha informado que la adiponectina cuyos niveles cambiaban antes y despues de una dieta era de PMA. Por consiguiente, es importante detectar adiponectina de PMA individualmente en los estudios de adiponectina y varias enfermedades.
En general, se puede detectar una molecula de protema usando un anticuerpo monoclonal que reconoce espedficamente la protema como antigeno. No obstante, en el caso en el que el antigeno sea una mezcla de multfmeros en varias formas compuestos por monomeros sencillos tales como adiponectina, es diffcil obtener un anticuerpo espedfico de solo una molecula que tiene un tamano espedfico. Dado que un anticuerpo normalmente reconoce una secuencia de aminoacido primaria de un antigeno, cuando un antigeno es multfmero, Dado que la adiponectina esta compuesta por monomeros sencillos, un anticuerpo que reconoce el monomero de adiponectina simultaneamente reconoce los multfmeros de adiponectina en cualquier forma. Incluso si un anticuerpo monoclonal reconoce una estructura terciaria, no se puede evitar la reactividad cruzada con otras moleculas en una molecula tal como adiponectina de PMA en la que se polimerizan muchas estructuras basicas.
Por tanto, en el caso de usar un anticuerpo general, es diffcil detectar una molecula de adiponectina que tiene un tamano espedfico solo.
Para determinar de forma cuantitativa la adiponectina que tiene un tamano molecular espedfico, como procedimientos convencionales, generalmente se usan un procedimiento en el que la adiponectina se pretrata (por ejemplo, filtracion en gel) para fraccionarla basado en su peso molecular y se detecta cada pico, y un procedimiento en el que se digieren una o mas moleculas espedficas y se detecta la molecula restante. Adicionalmente se desarrollo una tecnica de ELISA que no necesita pretratamiento, tal como filtracion en gel o un tratamiento con proteasa, pero se observa reactividad cruzada con la de PMM, y la tecnica de ELISA no es espedfica del PMA. Por tanto se desea una tecnica capaz de detectar adiponectina que tiene un tamano molecular espedfico individualmente mediante un pretratamiento simple o sin pretratamiento.
Como procedimientos convencionales para medir la adiponectina que tiene un tamano molecular espedfico, ademas del procedimiento de filtracion en gel mencionado anteriormente se conocen los siguientes dos procedimientos:
(1) un procedimiento en el que se lleva a cabo un pretratamiento con una enzima que digiere PMB y PMM y la adiponectina restante que no es digerida por la enzima se mide para detectar el PMA solo (literatura de patente
1), y
(2) un procedimiento en el que se usa un anticuerpo que no reacciona con el monomero de adiponectina pero que reconoce un tnmero y/o su molecula asociada, la adiponectina de peso molecular alto, para detectar el antfgeno de la adiponectina de peso molecular alto solo (literatura de patente 2).
No obstante, el pretratamiento con la enzima necesita un tiempo de tratamiento enzimatico de varias decenas de minutos. Ademas, en el caso de la incubacion durante un tiempo prolongado que supera un tiempo optimo, existe la posibilidad de que la molecula diana per se pueda ser digerida por una proteasa coexistente y, por tanto, es necesario seleccionar de forma estricta el tiempo de incubacion. Adicionalmente, en el tratamiento con una enzima se debera seleccionar una enzima digestiva optima de acuerdo con el tipo de un antfgeno diana y, por tanto, no es un procedimiento versatil.
En el caso de usar el anticuerpo convencional que reconoce la adiponectina de peso molecular alto, no solo se reconoce la adiponectina de peso molecular alto (PMA) sino tambien otros mulffmeros (PMB y PMA) y, por tanto, no es un procedimiento capaz de detectar espedficamente el PMA solo. Se desconoce un anticuerpo que reconoce de forma espedfica la adiponectina de PMA solo.
5 Nakano y col. ("A novel enzyme-linked immunosorbent assay specific for high-molecular-weight adiponectin", Journal of Lipid Research, vol. 47, 2006, paginas 1572 - 1582) describen el anticuerpo monoclonal antiadiponectina de PMA, IH7. Se produjo el IH7 contra la adiponectina de PMA y reacciona de forma cruzada con las formas de adiponectina hexamerica y trimerica.
Lista de citas
10 Literatura de Patente
[Literatura de patente 1] WO2005/038457 [Literatura de patente 2] patente japonesa N° 3624216
Resumen de la invencion
Problema tecnico
15 En el ELISA convencional para detectar PMA sin pretratamiento, existe el problema de que se observa reactividad cruzada con el PMM en una muestra que contiene un nivele elevado de PMM y, de hecho, fue diffcil la medicion espedfica de PMA. Ademas, incluso si un anticuerpo muestra una selectividad alta por el PMA en el ELISA, el anticuerpo a veces pierde la selectividad por el PMA mediante marcaje con latex y, por tanto, fue muy diffcil medir facilmente la adiponectina de PMA usando latex. Un objeto de la presente invencion es proporcionar un anticuerpo 20 monoclonal para detectar selectivamente o determinar de forma cuantitativa la adiponectina de pMa individualmente, sin mostrar reactividad cruzada con la adiponectina de PMM y un reactivo altamente preciso y versatil para analizar la adiponectina de peso molecular alto.
Solucion al problema
Los presentes inventores construyeron un reactivo de latex para analizar la adiponectina de alto peso molecular 25 capaz de detectar de forma mas conveniente y selectiva o determinar cuantitativamente la adiponectina de PMA de forma individual y someter a deteccion selectiva de un anticuerpo monoclonal usado en el reactivo de latex. Como resultado, se confirmo que incluso cuando se uso un anticuerpo que mostro una especificidad relativamente alta por el PMA en un ELISA de tipo sandwich, el anticuerpo no mostro ninguna especificidad de PMA cuando se evaluo como un reactivo de latex y, por tanto, los presentes inventores produjeron un nuevo anticuerpo monoclonal usando 30 la fraccion de PMA sola de adiponectina en sangre humana. Los presentes inventores confirmaron que este anticuerpo monoclonal tema reactividades similares en el analisis de transferencia de Western en comparacion con los anticuerpos monoclonales preparados usando la adiponectina recombinante expresada en E. coli, pero mostro una especificidad por PMA extremadamente alta cuando se evaluo mediante un sistema de ELISA de tipo sandwich. Adicionalmente, los presentes inventores construyeron un reactivo de latex para analizar la adiponectina usando el 35 anticuerpo monoclonal y encontraron que la adiponectina de PMA podfa medirse de forma selectiva usando el reactivo de latex sin reactividad cruzada con el PMM y completaron la presente invencion.
La presente invencion se refiere a:
[1] un anticuerpo monoclonal caracterizado porque reacciona espedficamente con la adiponectina de peso molecular alto producida por el hibridoma depositado como FERMBP-11106,
40 [2] un procedimiento para producir el anticuerpo monoclonal de [1], caracterizado por el uso de adiponectina de
peso molecular alto como anffgeno,
[3] un procedimiento para analizar inmunologicamente la adiponectina de peso molecular alto caracterizado por usar el anticuerpo monoclonal de [1],
[4] el procedimiento de [3], en el que el procedimiento es un procedimiento de aglutinacion de latex,
45 [5] un reactivo para analizar inmunologicamente la adiponectina de peso molecular, que comprende el anticuerpo
monoclonal de [1], y
[6] el reactivo de acuerdo con la reivindicacion 5, que comprende parffculas de latex portadoras del anticuerpo monoclonal de [1].
Efectos ventajosos de la invencion
50 De acuerdo con el nuevo anticuerpo monoclonal de la presente invencion se puede proporcionar un reactivo mas conveniente y preciso (en particular, un reactivo de latex) y procedimiento para analizar la adiponectina de peso molecular alto (PMA) capaz de analizar de forma selectiva (detectar o medir de forma cuantitativa) la adiponectina de peso molecular alto.
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Breve descripcion de las figuras
La FIG. 1 es un grafico que muestra los resultados obtenidos midiendo la cantidad de adiponectina contenida en las fracciones de la filtracion en gel de una muestra de suero humano (que muestra un nivel bajo de PMM) usando varios kits de ELISA usando anticuerpos monoclonales conocidos.
La FIG. 2 es un grafico que muestra los resultados obtenidos midiendo la cantidad de adiponectina contenida en las fracciones de la filtracion en gel de una muestra de suero humano (que muestra un nivel alto de PMM) usando los mismos kits de ELISA que los usados en la FIG. 1.
La FIG. 3 es un grafico que muestra los resultados obtenidos midiendo la cantidad de adiponectina contenida en las fracciones de la filtracion en gel de una muestra de suero humano usando un reactivo de latex preparado usando el anticuerpo monoclonal conocido ANOC9121.
La FIG. 4 es un grafico que muestra los resultados obtenidos midiendo la cantidad de adiponectina contenida en las fracciones de la filtracion en gel de una muestra de suero humano (que muestra un nivel bajo de PMM) usando el kit de ELISA de la presente invencion, asf como los mismos kits de ELISA que los usados en la FIG. 1. La FIG. 5 es un grafico que muestra los resultados obtenidos midiendo la cantidad de adiponectina contenida en las fracciones de la filtracion en gel de una muestra de suero humano (que muestra un nivel alto de PMM) usando los mismos kits de ELISA que los usados en la FIG. 4.
La FIG. 6 es un grafico que muestra los resultados obtenidos midiendo la cantidad de adiponectina contenida en las fracciones de la filtracion en gel de una muestra de suero humano usando el reactivo de latex de la presente invencion preparado usando el anticuerpo monoclonal Clone8D de la presente invencion.
Descripcion de las realizaciones
El anticuerpo monoclonal de la presente invencion reacciona espedficamente con la adiponectina de peso molecular alto. La expresion “reacciona espedficamente con la adiponectina de peso molecular alto” como se usa en el presente documento significa que reacciona con la adiponectina de peso molecular alto, no reacciona con la adiponectina trimerica y no reacciona sustancialmente con la adiponectina hexamerica. La adiponectina de peso molecular alto, la adiponectina trimerica y la adiponectina hexamerica en ocasiones se denominan adiponectina de PMA, adiponectina de PMM y adiponectina de PMB (o simplemente se denominan PMA pMm y PMB, respectivamente).
La expresion “adiponectina de peso molecular alto” como se usa en el presente documento significa multfmeros de los que la estructura basica es un polfmero de PMB y/o PMM y que se fraccionan en condiciones no desnaturalizantes en fracciones de aproximadamente 440 kDa o mas (es decir, el lfmite entre PMA y PMM es de aproximadamente 440 kDa) con un pico de aproximadamente 670 kDa.
Estos pesos moleculares son valores determinados mediante filtracion en gel realizada en ejemplos comparativos y ejemplos descritos mas adelante y las condiciones para la filtracion en gel son los siguientes.
Columna: Superdex 200 prep grade (GE Healthcare Bioscience)
Fase movil (disolvente): D-PBS Velocidad de bombeo: 1 ml / min Marcadores de peso molecular:
(1) seroalbumina bovina: 67.000 (Da)
(2) aldolasa: 158.000
(3) catalasa: 232.000
(4) ferritina: 440.000
(5) tiroglobulina: 669.000
(6) Dextrano azul 2000: 2.000.000
La expresion “no reacciona sustancialmente con la adiponectina hexamerica (PMM)” como se usa en el presente documento significa que no reacciona con moleculas que tienen un pico aproximadamente a 400 kDa y que eluye aproximadamente entre 250 y 440 kDa mediante fraccionamiento de un suero humano en condiciones no desnaturalizantes.
El anticuerpo espedfico de la adiponectina de PMA de la presente invencion se puede preparar de acuerdo con un procedimiento convencional para preparar anticuerpos monoclonales, a excepcion de que la adiponectina que se recoge directamente de un organismo humano y se fracciona en PMA se usa como antfgeno.
La muestra biologica que procede de un organismo humano y que se usa como antfgeno no esta particularmente limitada, siempre que sea un lfquido biologico del que se sospecha que contiene adiponectina de PMA. Los ejemplos de la muestra incluyen un fluido biologico (por ejemplo, sangre (es decir, sangre entera), suero, plasma, orina, lfquido cefalorraqrndeo o fluidos secretores) recogido directamente de un organismo vivo y un lfquido procedente de material biologico (por ejemplo, varios extractos de organos, tejidos o celulas o varios lfquidos de cultivo de tejidos o celulas) obtenido mediante el tratamiento de materiales biologicos (por ejemplo, organos, tejidos o celulas) recogidos de un organismo vivo.
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Una fraccion de adiponectina de PMA como anffgeno se puede preparar mediante fraccionamiento de la muestra biologica en una fraccion que contiene adiponectina con diversos pesos moleculares, incluyendo adiponectina de PMA, y separando la adiponectina de PMA de la fraccion mediante cromatograffa de filtracion en gel. La fraccion que contiene adiponectina con diversos pesos moleculares, incluyendo adiponectina de PMA se puede obtener mediante cromatograffa de afinidad inmovilizada con un anticuerpo que reconoce la adiponectina de PMA. El anticuerpo que se va a inmovilizar no esta particularmente limitado, siempre que pueda reconocer al menos la adiponectina de PMA, y se puede usar un anticuerpo que reconoce la adiponectina de PMM y/o de PMB. La cromatograffa de afinidad o la cromatograffa de filtracion en gel se puede llevar a cabo adecuadamente de acuerdo con un anticuerpo usado, la cantidad de una muestra biologica, y similares. La cromatograffa de afinidad se puede realizar despues de la separacion mediante cromatograffa de filtracion en gel.
El anticuerpo monoclonal frente a la adiponectina de PMA obtenida se puede usar en un procedimiento para medir de forma selectiva la adiponectina de pMa, como una molecula de inmunoglobulina per se, o como un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2 o Fv), que se puede preparar de acuerdo con un procedimiento convencional.
La muestra de ensayo que se va a analizar mediante la presente invencion no esta particularmente limitada, siempre que sea un lfquido biologico que se sospeche que contiene adiponectina de PMA. Los ejemplos de la muestra incluyen un fluido biologico (por ejemplo, sangre (es decir, sangre entera), suero, plasma, orina, lfquido cefalorraqrndeo o fluidos secretores) recogido directamente de un organismo vivo y un lfquido procedente de material biologico (por ejemplo, varios extractos de organos, tejidos o celulas o varios lfquidos de cultivo de tejidos o celulas) obtenido mediante el tratamiento de materiales biologicos (por ejemplo, organos, tejidos o celulas) recogidos de un organismo vivo.
La adiponectina de PMA esta presente, por ejemplo, a una concentracion de 1 pg/ml a varias decenas de pg/ml en sangre humana normal. Como alternativa, la concentracion de la adiponectina de PMA contenida en un lfquido procedente de material biologico se puede ajustar a de 1 pg/ml a varias decenas de pg/ml, mediante la determinacion adecuada de la cantidad de un lfquido de tratamiento (por ejemplo, una solucion para extraccion o una solucion para cultivo) de un ensayo piloto o similar.
Como anteriormente, un lfquido biologico (en particular sangre) que se va a analizar mediante la presente invencion contiene adiponectina de PMA a una concentracion de 1 pg/ml a varias decenas de pg/ml y, por tanto, se puede analizar, sin dilucion previa, mediante el reactivo de la presente invencion para analizar la adiponectina de PMA.
Como el procedimiento para analizar la adiponectina de PMA de la presente invencion se pueden usar procedimientos de medicion inmunologica convencional. Los ejemplos del procedimiento de medicion inmunologica incluyen un procedimiento de ELISA, un procedimiento RIA, un procedimiento de aglutinacion y un procedimiento de inmunocromatograffa. En lo sucesivo en el presente documento se explicara mas particularmente un procedimiento de aglutinacion.
Como las parffculas de latex usadas en la presente invencion, se pueden usar las parffculas de latex convencionales, tales como las parffculas de latex hechas de poliestireno, un copolfmero de estireno-sulfonato de estireno, o similares. El tamano de parffcula promedio de las parffculas de latex portadoras del anticuerpo espedfico de la adiponectina de PMA se puede seleccionar de forma adecuada del intervalo de 0,05 a 1,0 pm en general, de acuerdo con, por ejemplo, el tipo de lfquido biologico usado como muestra, la concentracion de adiponectina de PMA contenida o el aparato de medicion.
Por ejemplo, en un caso de analisis de la adiponectina de PMA en sangre, dado que la adiponectina de PMA esta presente en una muestra humana normal a una concentracion alta de 1 pg/ml a varias decenas de pg/ml, el intervalo de medicion de un sistema de ensayo para la adiponectina de PMA en sangre se puede garantizar seleccionando adecuadamente el tamano de parffcula de latex. Mas particularmente, cuando el tamano de parffcula es de 0,1 pm o menos, a veces no se garantiza la precision en la medicion de las concentraciones de 5 pg/ml o menos que son clmicamente significativas. Cuando el tamano de parffcula es de 0,5 pm o mas, en ocasiones no se puede medir una muestra normal con un nivel elevado. Por tanto, como el sistema de ensayo para la adiponectina de PMA en sangre, son preferibles las parffculas de latex que tiene un tamano de parffcula promedio de 0,1 a 0,5 pm.
El reactivo de latex para analizar la adiponectina de PMA de la presente invencion puede estar en cualquier forma, siempre que contenga una suspension lfquida de parffculas de latex portadoras del anticuerpo monoclonal espedfico de la adiponectina de PMA. El reactivo de latex puede estar en varias formas, por ejemplo, un reactivo componente de un lfquido que contiene un tampon y parffculas de latex sensibilizadas con el anticuerpo espedfico de la adiponectina de PMA, un reactivo componente de dos lfquidos compuesto por un tampon como primer componente reactivo y parffculas de latex sensibilizadas con el anticuerpo espedfico de adiponectina de PMA como segundo componente reactivo, o similares.
En el procedimiento para analizar la adiponectina de PMA de la presente invencion se puede recoger un fluido biologico que se sospecha que contiene adiponectina; el fluido biologico obtenido puede considerarse como una muestra sin dilucion previa y/o pretratamiento (es decir, mientras se mantiene en el estado original) o, como
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alternativa, la muestra obtenida se puede tratar adecuadamente para preparar una muestra; y la muestra se puede poner en contacto con la suspension ffquida de parffculas de latex portadoras del anticuerpo espedfico de la adiponectina de PMA de la presente invencion (preferentemente, el reactivo de latex para analizar la adiponectina de PMA de la presente invencion).
Por ejemplo, una realizacion preferida del procedimiento de la presente invencion, un procedimiento para analizar la adiponectina de PMA usando un aparato de analisis automatico incluye:
(1) obtener un fluido biologico que se sospecha que contiene adiponectina; y
(2) preparar una muestra del fluido biologico obtenido en la etapa previa manteniendo el estado original o
llevando a cabo una dilucion previa y/o pretratamiento adecuados, poner en contacto la muestra con una
suspension ffquida de parffculas de latex portadoras de un anticuerpo espedfico de la adiponectina de PMA en
un aparato de analisis automatico y analizar opticamente el grado de aglutinacion de las parffculas de latex.
En el caso de que la adiponectina de PMA contenida en varios fluidos biologicos, tales como sangre, se mida usando un procedimiento de medicion convencional tal como radioinmunoensayo o un enzimoinmunoensayo, por ejemplo, se necesita una etapa de dilucion de una muestra a 500 a 5.000. Por el contrario, en el procedimiento para analizar la adiponectina de PMA de la presente invencion se puede realizar una reaccion de aglutinacion con latex usando un fluido biologico original como muestra, sin dilucion previa ni pretratamiento del fluido biologico, por ejemplo, seleccionando adecuadamente el tamano de parffcula de las parffculas de latex (por ejemplo, en un caso de adiponectina de PMA en sangre, es preferible un tamano de parffcula de 0,1 a 0,5 pm).
En el procedimiento para analizar la adiponectina de PMA de la presente invencion se lleva a cabo una reaccion de aglutinacion usando parffculas de latex portadoras de un anticuerpo espedfico de la adiponectina de PMA (por ejemplo, el reactivo de latex para analizar la adiponectina de PMA de la presente invencion) y el grado de aglutinacion generado se analiza opticamente (en particular, se mide) para analizar (en particular, medir) la cantidad de adiponectina de PMA contenida en un fluido biologico (por ejemplo, sangre). El grado de aglutinacion de las parffculas de latex se puede analizar opticamente, por ejemplo mediante observacion visual o usando un dispositivo optico para medir la intensidad de la luz dispersada, la absorbancia o la intensidad de la luz transmitida. La longitud de onda de medicion es, preferentemente, de 300 a 800 nm. La medicion se puede realizar de acuerdo con un procedimiento convencional, seleccionando el tamano promedio de parffcula o la concentracion de las parffculas de latex usadas o un tiempo de reaccion y medir un incremento o una disminucion de la intensidad de la luz dispersada, la absorbancia o la intensidad de la luz transmitida. Estos procedimientos se pueden usar en una combinacion adecuada de los mismos.
En general, la concentracion del latex sensibilizado con un anticuerpo espedfico de la adiponectina de PMA, que esta contenida en el sistema para medir una reaccion de aglutinacion del latex, se puede seleccionar de forma adecuada de acuerdo con la concentracion de un aditivo coexistente, tales como sales, protemas o azucares. En general, como la concentracion en el volumen del ffquido final del sistema de reaccion, el latex sensibilizado con un anticuerpo espedfico de la adiponectina de PMA se puede ajustar a, preferentemente, de 0,05 a 10 mg/ml, mas preferentemente de 0,1 a 2 mg/ml. Cuando la concentracion del latex sensibilizado con un anticuerpo espedfico de la adiponectina de PMA es demasiado baja, la medicion de una reaccion de aglutinacion a un nivel bajo es, en ocasiones, diffcil, y cuando es demasiado alta, la medicion de una reaccion de aglutinacion a un nivel alto es, en ocasiones, diffcil, y la reproducibilidad a veces es mala.
En la presente invencion, la reaccion de aglutinacion de las parffculas de latex se puede medir con mas precision y el intervalo mensurable en un area de nivel bajo y un area de nivel alto se puede expandir adicionalmente, controlando otros factores que influyen sobre la reaccion de aglutinacion del latex sensibilizado con un anticuerpo espedfico de la adiponectina de PMA. Los ejemplos de los otros factores que incluyen sobre la reaccion de aglutinacion del latex incluyen la concentracion de las parffculas de latex, la cantidad del anticuerpo sensibilizado en las parffculas de latex y el tamano de la parffcula de las parffculas de latex.
Las condiciones para la reaccion de aglutinacion del latex en el procedimiento para analizar la adiponectina de PMA de la presente invencion pueden ser las condiciones habituales y varios tampones se pueden seleccionar aproximadamente como un medio de reaccion de acuerdo con el analisis para la adiponectina de PMA en varios fluidos biologicos. En el caso de analizar la adiponectina de PMA en sangre, el tampon no esta particularmente limitado, siempre que tenga una fuerza ionica y un pH que no inactive la adiponectina de PMA en sangre y que no inhiba la reaccion de aglutinacion del latex. Los ejemplos del tampon incluyen tampones de Good, un tampon de glicina y un tampon Tris. El pH de la reaccion es, preferentemente, de 5 a 10, mas preferentemente de 6 a 8. La temperatura de la reaccion es, preferentemente, de 0 a 50 °C, mas particularmente de 20 a 40 °C. El tiempo de reaccion se puede seleccionar adecuadamente.
Ejemplos
La presente invencion se ilustrara a continuacion adicionalmente mediante los ejemplos siguientes, que, de ningun modo, son limitantes.
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Ejemplo comparativo 1
Anticuerpos monoclonales convencionales
Para comparar con el anticuerpo monoclonal de la presente invencion se usaron dos anticuerpos monoclonales ANOC9121 y Clone5A, que se preparo mediante inmunizacion de ratones con un antigeno de adiponectina recombinante expresado en E. coli, como anticuerpos monoclonales convencionales. Las reactividades de estos anticuerpos monoclonales contra la adiponectina humana en sangre se resumen en la Tabla 2. Ambos anticuerpos pudieron detectar de igual forma PMM y PMA en sangre mediante transferencia de Western en condiciones no reductoras. No obstante, en ELISA de tipo sandwich que usan un solo anticuerpo, Clone5A reconocio todas las moleculas en la sangre y ANOC9121 sufrio una ligera reaccion cruzada con PMM.
Tabla 1
Anticuerpo
Transferencia de Western ELISA de tipo sandwich usando un solo anticuerpo
Reducido
No reducido
ANOC9121
Se detecto el monomero Se detectaron PMM y moleculas mas grandes Muy espedfico de PMA sufrio una ligera reaccion cruzada con PMM
Clone5A
No ha reaccionado Se detectaron PMM y moleculas mas grandes Se detectaron todas las moleculas
Problemas de los anticuerpos monoclonales convencionales (1): Reactividad cruzada con PMM
El kit de ELISA de tipo sandwich preparado anteriormente usando ANOC9121 solo y un kit de ELISA de adiponectina de alto peso molecular disponible comercialmente (FUJIREBIO Inc.), que no necesita pretratamiento, se usaron para medir las fracciones de filtracion en gel de dos sueros humanos. La adiponectina total se midio usando un kit de ELISA de adiponectina (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
A menos que se especifique otra cosa, las condiciones para la filtracion en gel llevada a cabo en los ejemplos comparativos y los ejemplos de la especificacion son las siguientes:
Columna: Superdex 200 prep grade (GE Healthcare Bioscience)
Fase movil (disolvente): D-PBS Velocidad de bombeo: 1 ml / min Marcadores de peso molecular:
(1) seroalbumina bovina: 67.000 (Da)
(2) aldolasa: 158.000
(3) catalasa: 232.000
(4) ferritina: 440.000
(5) tiroglobulina: 669.000
(6) Dextrano azul 2000: 2.000.000
Los resultados obtenidos usando una muestra de suero con una proporcion del contenido de PMM baja se muestran e la FIG. 1 y los resultados obtenidos usando una muestra de suero con una proporcion del contenido de PMM alta se muestran en la FIG. 2. En la FIG. 1 y la FIG. 2, A se muestran los resultados del ELISA de tipo sandwich usando ANOC9121, B muestra los resultados del kit de ELISA de adiponectina de peso molecular alto disponible comercialmente (FUJIREBIO Inc.), y C muestra los resultados del kit de ELISA de adiponectina humana (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) para medir la adiponectina total.
Como resultado, tanto el kit de ELISA de ANOC9121 como el kit de ELISA de adiponectina de peso molecular alto disponible comercialmente pudieron medir espedficamente la adiponectina de peso molecular alto (A), en el caso de la muestra con un nivel bajo de PPM como se muestra en la FIG. 1. Por el contrario, se observo reactividad cruzada con PMM en ambos kits, en el caso de la muestra con un nivel elevado de PPM como se muestra en la FIG. 2 y este resultado indica la dificultad de una medicion espedfica de PMA.
A este respecto, la fraccion de PMA, la fraccion de PMM y la fraccion de PMB son, respectivamente: una fraccion con pesos moleculares mayores que aproximadamente 440 kDa, una fraccion con pesos moleculares entre 250 kDa y 440 kDa, y una fraccion con pesos moleculares menores que aproximadamente 250 kDa, en las condiciones de filtracion en gel mencionadas anteriormente.
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Ejemplo comparativo 2
Problemas de los anticuerpos monoclonales convencionales (2): Problema en la preparacion del reactivo de latex
Se uso el anticuerpo monoclonal ANOC9121 que tiene una reactividad con el PMM y una especificidad alta por el PMA en el ELISA, para intentar preparar un reactivo de latex.
(1) Preparacion del reactivo de latex sensibilizado con el anticuerpo monoclonal ANOC9121
A 9 ml de un lfquido que se preparo mediante disolucion del anticuerpo monoclonal ANOC9121 a una concentracion de 0,5 mg/ml en un tampon Tris de 0,01 mol/l (pH 8,0) se anadio 1 ml de latex de poliestireno (contenido solido: 10 % en peso) que tiene un tamano de partfcula promedio de 0,2 pm y se agito a temperatura ambiente durante 60 minutos. Adicionalmente se anadio al lfquido un tampon Tris (pH 8,0) que contiene 0,5 % en peso de seroalbumina bovina y despues la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 60 minutos y se centrifugo a 20.000 rpm. El latex se suspendio anadiendo 10 ml de un tampon Tris (pH 8,0) al precipitado obtenido, para preparar un lfquido que contiene latex sensibilizado con el anticuerpo monoclonal ANOC9121.
(2) Preparacion de tampon
Se prepare un tampon mediante la adicion de cloruro sodico a una concentracion de 0,9 % (% en peso) a un tampon Tris de 0,1 mol/l (pH 8,0) que contiene seroalbumina bovina a una concentracion de 0,5 % (% en peso).
(3) Reactivo de latex para analizar la adiponectina de PMA
Se preparo un reactivo para medir un antigeno de la adiponectina humana usado en este ejemplo comparativo como un reactivo de componente de dos lfquidos compuesto por el tampon preparado en (2) como el primer reactivo y el latex sensibilizado con el anticuerpo monoclonal ANOC9121 preparado en (1) como el segundo reactivo.
Medicion de la adiponectina
(1) Medicion de las fracciones de adiponectina
A 35 pl de las fracciones de adiponectina de un suero humano (una muestra con un nivel bajo de PMM) se anadieron 90 pl del tampon preparado en (2) y se dejo que las mezclas reposaran a 37 °C durante un periodo de tiempo predeterminado. A cada una de las mezclas se anadieron adicionalmente 90 pl del lfquido que contiene latex sensibilizado con el anticuerpo monoclonal ANOC9121 preparado en (1) y se agito. Tras 5 minutos se midio la absorbancias a una longitud de onda de 570 nm. Una variacion en la absorbancia durante este periodo se considera la variacion de la absorbancia (AAbs). Se uso un lfquido de antfgeno de adiponectina estandar para preparar una curva de calibracion basada en los valores de ALAbs y las concentraciones del antfgeno. El valor de la adiponectina se calculo a partir de la AAbs de cada muestra de fraccion usando esta curva de calibracion. Esta medicion se llevo a cabo usando un analizador automatico HITACHI de tipo 7170.
De forma simultanea a esta medicion se midio la adiponectina total usando un kit de latex de adiponectina humana disponible comercialmente (Mitsubishi Kagaku latron, Inc.). Con respecto a los valores de absorbancia medidos, para comparar entre los picos obtenidos mediante ambos reactivos, los valores de absorbancia medidos usando el reactivo de latex sensibilizado con el anticuerpo monoclonal ANOC9121 se compensaron de forma que los valores de absorbancia de la fraccion n.° 109 concordaran entre sf.
Los resultados de la evaluacion para las fracciones de adiponectina de un suero humano usando el reactivo de latex que contiene ANOC9121 para analizar la adiponectina de PMA se muestran en la FIG. 3 (E en la FIG. 3).
A partir de la comparacion con los resultados del reactivo de latex disponible comercialmente para analizar la adiponectina total (D en la FIG. 3), se descubrio que el reactivo de latex usando ANOC9121 para analizar la adiponectina no reaccionaba con las fracciones correspondientes al PMB pero sf reaccionaba con el PMA y el PMM como el reactivo de latex para analizar la adiponectina total. Este resultado muestra que el reactivo de latex que usa ANOC9121 reacciona con el PMM, incluso en el caso de una muestra con un nivel bajo de PMM y no se pudo conseguir el mismo rendimiento que el del ELISA.
Como motivo de que el reactivo de latex no exhibiera el mismo rendimiento que el del ELISA, se considera la diferencia en los mecanismos de reaccion, es decir, el primer anticuerpo reacciona y, despues, el segundo anticuerpo reacciona en el ELISA, mientras que la aglutinacion se inicia simultaneamente en un reactivo de latex. Tambien se considera que se debe a una especificidad baja y a una afinidad baja por el PMA.
Ejemplo 1
(1) Preparacion de inmunogeno y nuevo anticuerpo monoclonal
Los inventores concluyeron que era diffcil obtener un anticuerpo monoclonal con una elevada especificidad por PMA mediante el procedimiento de produccion del anticuerpo intentado previamente usando una adiponectina
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recombinante expresada en E. coli y, por tanto, la fraccion de PMA individual se aislo de la adiponectina en la sangre humana y se uso para preparar el anticuerpo monoclonal. La adiponectina total en sangre humana se purifico usando una columna unida a ANOC9121 mencionada anteriormente. Esta columna se preparo acoplando de 3 a 10 mg/ml de ANOC9121 purificado con 4 g de Sepharose 4B activada con CNBr. La columna se lavo con un tampon fosfato y se aplico a la columna de 5 a 20 ml de un suero humano. La columna se lavo con un tampon fosfato para eliminar el exceso de componentes sericos y la adiponectina humana en la sangre se eluyo de la columna con un eluyente. Como el eluyente se puede usar un agente desnaturalizante de protemas tales como varios mol/l de urea, un ion caotropico, o una solucion de varios mol/l de cloruro sodico y se usaron 6 mol/l de urea en este ejemplo. La adiponectina eluida se aplico adicionalmente a purificacion por filtracion en gel para purificar la PMA de la adiponectina humana en sangre recogiendo, no todas las fracciones que contienen pMa, sino las fracciones tempranas solas antes del pico de PMA, es decir solo las fracciones que tienen pesos moleculares superiores al del pico de PMA.
La adiponectina de PMA humana purificada en sangre se uso, junto con adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund, para inmunizar ratones Balb/C en una cantidad de 1 a 10 pg/cuerpo varias veces en semanas alternas. Se extrajeron los bazos de los ratones y las celulas del bazo se fusionaron con la lmea celular de mieloma de raton P3U1 mediante el procedimiento de polietilenglicol, de acuerdo con un procedimiento convencional, para producir hibridomas.
Para la deteccion selectiva de los hibridomas obtenidos para un anticuerpo monoclonal con una especificidad elevada por la adiponectina mas nativa, la adiponectina contenida en la sangre se uso como adiponectina que no se desnaturalizo nada. Mas particularmente, la porcion Fc de ANOC9121 se digirio para preparar F(ab')2 de ANOC9121 y se preparo una placa en la que se inmovilizo F(ab')2 de ANOC9121. A esta placa con F(ab')2 se la hizo reaccionar con un suero humano diluido adecuadamente y despues se hicieron reaccionar los sobrenadantes del cultivo de los hibridomas. Un anticuerpo anti-Fc de IgG de raton marcado con peroxidasa de rabano (HRP) se anadio adicionalmente a la placa y se incubo la placa. Tras la incubacion, se midio la fuerza del desarrollo de 3,3',5,5'- tetrametilbencidina para obtener Clone8D del hibridoma de raton que produjo el anticuerpo monoclonal Clone8D que tiene una especificidad alta y una afinidad alta por la adiponectina nativa.
(2) Evaluacion del anticuerpo monoclonal recien producido mediante transferencia de Western
El anticuerpo monoclonal anti-adiponectina humana Clone8D, que se preparo usando la fraccion de adiponectina de PMA purificada de sangre, se uso para analizar la adiponectina en el organismo humano mediante transferencia de Western. Como muestras, la sangre humana se sometio a electroforesis en condiciones no reducidas y sin calentamiento y en condiciones reducidas con 2-mercaptoetanol, y estas muestras se hicieron reaccionar con los tres anticuerpos mencionados anteriormente ANOC9121, Clone5A, y Clone8D, y se tineron. La adiponectina humana en sangre esta presente en varias formas tales como PMA, PMM y PMB, en condiciones no reducidas y sin calentar, pero en condiciones reducidas, los multimeros tnmeros y superiores desaparecen y la adiponectina esta presente en forma monomerica con aproximadamente 28.000 Da o como molecula correspondiente al dfmero. El anticuerpo monoclonal ANOC9121 reconocio todas estas formas en condiciones no reducidas y sin calentar y en condiciones reducidas. Por el contrario, el anticuerpo monoclonal Clone5A y el anticuerpo monoclonal Clone8D preparados usando adiponectina humana en sangre no reconocieron el monomero desnaturalizado mediante reduccion, pero reconocieron una pluralidad de macromoleculas en condiciones no reducidas y sin calentar. No obstante, siempre que se evaluo mediante transferencia de Western no se observaron diferencias significativas entre los tres anticuerpos monoclonales con respecto a la reactividad con las macromoleculas.
Ejemplo 2
Evaluacion del anticuerpo monoclonal recien producido mediante ELISA
Se construyo un ELISA de tipo sandwich usando Clone8D y se comparo con los ELISA de tipo sandwich convencionales con respecto a su especificidad por PMA. Mas particularmente, Clone8D diluido a una concentracion de 5 a 10 pg/ml con un tampon fosfato se anadio a una placa de ELISA de 96 pocillos disponible comercialmente y se realizo una reaccion de inmovilizacion durante la noche. Esta placa con anticuerpo inmovilizado se bloqueo con un tampon fosfato que contiene de 0,1 to 1 % de seroalbumina bovina. En la placa con anticuerpo inmovilizado, las fracciones de suero humano que se habfan fraccionado mediante HPLC usando una columna Superdex 200 (GE Healthcare) se hicieron reaccionar y, despues de lavar, el Clone8D marcado con biotina se hizo reaccionar. Adicionalmente se anadio a la placa estreptavidina conjugada con HRP y se incubo la placa. Tras la incubacion, el exceso de estreptavidina conjugada con HRP se elimino mediante lavado. La fuerza del desarrollo obtenida mediante la adicion de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina se midio para determinar la cantidad de adiponectina en cada fraccion.
Adicionalmente, las mismas fracciones se midieron usando los kits de ELISA usados en el ejemplo comparativo 1, es decir el kit de ELISA de tipo sandwich usando ANOC9121 solo y el kit de ELISA de adiponectina de peso molecular alto disponible comercialmente (FUJIREBIO Inc.) que no necesita pretratamiento, para confirmar la reactividad cruzada con el PMA. Adicionalmente, el kit de ELISA para adiponectina humana (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) se uso para medir la adiponectina total.
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Los resultados se muestran en la FIG. 4 y la FIG. 5. El ELISA de tipo sandwich usando Clone8D (F en la FIG. 4 y la FIG. 5) pudo llevar a cabo una medicion espedfica de PMA son reactividad cruzada con PMM, no solo en el caso de una muestra con un nivel bajo de PMM como se muestra en la FIG. 4, sino tambien en el caso de una muestra con un nivel alto de PMM como se muestra en la FIG. 5, en contraste con los otros procedimientos de ELISA.
Ejemplo 3
Preparacion del reactivo de latex para analizar la adiponectina de peso molecular alto usando un anticuerpo monoclonal nuevo
(1) Preparacion del reactivo que contiene latex sensibilizado con el anticuerpo monoclonal Clone8D
A 9 ml de un lfquido que se preparo mediante disolucion del anticuerpo monoclonal Clone8D a una concentracion de 0,5 mg/ml en un tampon Tris de 0,01 mol/l (pH 8,0) se anadio 1 ml de latex de poliestireno (contenido solido: 10 % en peso) que tiene un tamano de partfcula promedio de 0,2 pm y se agito a temperatura ambiente durante 60 minutos. Adicionalmente se anadio al lfquido un tampon Tris (pH 8,0) que contiene 0,5 % en peso de seroalbumina bovina y despues la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 60 minutos y se centrifugo a 20.000 rpm. El latex se suspendio anadiendo 10 ml de un tampon Tris (pH 8,0) al precipitado obtenido, para preparar un lfquido que contiene latex sensibilizado con el anticuerpo monoclonal Clone8D.
(2) Preparacion de tampon
Se prepare un tampon mediante la adicion de cloruro sodico a una concentracion de 0,9 % (% en peso) a un tampon Tris de 0,1 mol/l (pH 8,0) que contiene seroalbumina bovina a una concentracion de 0,5 % (% en peso).
(3) Reactivo de latex para analizar la adiponectina de PMA
Se preparo un reactivo para medir un antfgeno de la adiponectina humana usado en este ejemplo como un reactivo de componente de dos lfquidos compuesto por el tampon preparado en (2) como el primer reactivo y el latex sensibilizado con el anticuerpo monoclonal Clone8D preparado en (1) como el segundo reactivo.
Medicion de la adiponectina
(1) Medicion de las fracciones de adiponectina
A 35 pl de las fracciones de adiponectina de un suero humano se anadieron 90 pl del tampon preparado en (2) y se dejo que las mezclas reposaran a 37 °C durante un periodo de tiempo predeterminado. A cada una de las mezclas se anadieron adicionalmente 90 pl del lfquido que contiene latex sensibilizado con el anticuerpo monoclonal Clone8D preparado en (1) y se agito. Tras 5 minutos se midio la absorbancias a una longitud de onda de 570 nm. Una variacion en la absorbancia durante este periodo se considera la variacion de la absorbancia (AAbs). Se uso un lfquido de antfgeno de adiponectina estandar para preparar una curva de calibracion basada en los valores de AAbs y las concentraciones del antigeno. El valor de la adiponectina se calculo a partir de la AAbs de cada muestra de fraccion usando esta curva de calibracion. Esta medicion se llevo a cabo usando un analizador automatico HITACHI de tipo 7170.
De forma simultanea a esta medicion se midio la adiponectina total usando el kit de latex de adiponectina humana disponible comercialmente (Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.). Con respecto a los valores de absorbancia medidos, para comparar entre los picos obtenidos mediante ambos reactivos, los valores de absorbancia medidos usando el reactivo de latex sensibilizado con el anticuerpo monoclonal Clone8D se compensaron de forma que los valores de absorbancia de la fraccion n.° 109 concordaran entre sf.
Los resultados se muestran en la FIG. 6. En la FIG. 6, D muestra los resultados del kit de latex de adiponectina humana disponible comercialmente (Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.), y G muestra los resultados del reactivo de latex sensibilizado con el anticuerpo Clone8D de la presente invencion. Una reaccion de aglutinacion del latex espedfica de PMA se confirmo mediante la medicion de las fracciones en filtracion en gel de adiponectina serica humana usando el reactivo de la presente invencion.
Aplicabilidad industrial
El anticuerpo monoclonal de la presente invencion se puede usar para el analisis de la adiponectina.
NUMERO DE DEPOSITO
El hibridoma de raton-raton Clone8D se deposito en una Autoridad de Deposito Internacional, el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Direccion: AIST Tsukuba Central 6, 1 - 1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305 - 8566 Japon), el 5 de marzo de 2009. El numero de deposito es FERM BP-11106.

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque reacciona espedficamente con adiponectina de peso molecular alto, en donde el anticuerpo es producido por el clon del hibridoma raton-raton depositado como FERM BP-11106.
  2. 2. Un procedimiento para producir el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por el 5 uso de adiponectina de peso molecular alto como antigeno.
  3. 3. Un procedimiento in vitro para analizar inmunologicamente la adiponectina de peso molecular alto caracterizado por el uso del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicacion 1.
  4. 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde el procedimiento es un procedimiento de aglutinacion de latex.
    10 5. Un reactivo para analizar inmunologicamente la adiponectina de peso molecular alto, que comprende el
    anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicacion 1.
  5. 6. El reactivo de acuerdo con la reivindicacion 5, que comprende partfculas de latex portadoras del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicacion 1.
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