KR20120016117A - 고분자 아디포넥틴 분석을 위한 신규 모노크로날 항체와 그의 이용 - Google Patents

고분자 아디포넥틴 분석을 위한 신규 모노크로날 항체와 그의 이용 Download PDF

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키요노리 카추라기
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아야코 니시무라
미오 오오구치
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Abstract

중분자(MMW) 아디포넥틴에 교차성을 나타내지 않고, 고분자(HMW) 아디포넥틴에만 특이적으로 반응하는 모노크로날 항체를 개시한다. 본 발명의 모노크로날 항체는, HMW 아디포넥틴을 항원으로 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 모노크로날 항체에 의하면, 간편하고, 정확도 및 범용성이 높은 HMW 아디포넥틴 분석용 시약을 제공할 수 있다.

Description

고분자 아디포넥틴 분석을 위한 신규 모노크로날 항체와 그의 이용{Novel monoclonal antibody for analyzing high-molecular weight adiponectin and utilization of same}
본 발명은, 신규한 고분자 아디포넥틴(アディポネクチン, adiponectin) 특이적 모노크로날 항체 및 이를 이용한 고분자 아디포넥틴의 선택적 분석(특히 측정)방법에 관한 것이다.
아디포넥틴(アディポネクチン, adiponectin)은, 지방 세포에서 특이적으로 발현되는 분비 단백질이며, 항(抗)동맥경화 작용, 인슐린 저항성 개선 작용이 보고되고 있다. 근년에서는, 암, 염증, 메타볼릭 신드롬(メタボリックシンドロ-ム, 대사 증후군)과의 관계도 발견되고 있어 생체의 방어 인자로서 작용한다고 생각되고 있다. 인간 아디포넥틴은, 244개의 아미노산 잔기(殘基)로부터 형성되며, 단량체의 분자량은 약 28 kDa임이 알려져 있다. 한편, 혈액 중에서 아디포넥틴은, 3량체(LMW: Low molecular weight)를 기본 골격으로 하고, 그것이 중합된 6량체(MMW: Middle molecular weight), 그리고 다시 그것이 복수 중합된 다량체(HMW: High molecular weight)로서 존재하는 것이 확인되었다.
이들 아디포넥틴의 각 분자량체는, 가지는 생리 활성도 다르다. 예를 들면, C2C12 세포주에서 NF-κB의 활성화능(活性化能)은, HMW 및 MMW에서는 관찰되나, LMW에서는 관찰되지 않는 것으로 보고 되어 있다. 또한, 아디포넥틴 분비에 변이를 가지는 인간이, HMW 아디포넥틴을 형성하지 못하고 낮은 아디포넥틴 혈증(血症) 및 당뇨병을 발증(發症)하는 것과, 관(冠)동맥질환 환자에서는, 건강한 보통 사람에 비해 다량체 아디포넥틴의 존재비가 저하하는 것으로 보고되었다. 또한, 다이어트 전후에 혈액 중 농도가 변동하는 것은, HMW인 것도 보고되었다. 따라서, HMW 아디포넥틴만을 검출하는 것이, 아디포넥틴의 연구 및 각종 질환 연구에 있어서 중요하다.
통상, 단백질 분자는, 그 단백질을 항원으로 특이적으로 인식하는 모노크로날 항체에 의해 분리(單離)할 수 있다. 그러나 항원이, 아디포넥틴과 같이 동일 단량체로 된 각종 형태의 다량체가 혼재하는 것일 경우, 특정 사이즈 분자에만 특이적인 항체를 찾아내는 것은 곤란하다. 항체는 항원의 일차 아미노산 배열(配列)을 인식하는 경우가 많으므로, 항원이 다량체인 경우, 항체는 일반적으로, 그것을 구성하는 단량체의 일차 아미노산 배열을 인식한다. 한편, 아디포넥틴은, 동일 단량체로 형성되므로, 아디포넥틴 단량체를 인식하는 항체는, 동시에 모든 형태의 아디포넥틴 다량체를 인식하게 된다. 또한, 가령 모노크로날 항체가 입체 구조를 인식하는 경우에도, HMW 아디포넥틴과 같이 기본 골격이 다수 중합된 분자에서는 다른 분자와의 교차는 피하기 어렵다.
따라서, 일반적인 항체를 이용하는 경우, 특정 사이즈의 아디포넥틴 분자만을 검출하는 것은 곤란하다.
특정 분자 사이즈의 아디포넥틴을 정량(定量)하기 위해서는, 종래, 겔여과 등의 전처리에 의해 분자량 마다 분획(分畵)하고, 각 피크를 검출하는 방법이나, 특정 프로테아제(プロテア-ゼ)에 의해 특정 분자를 소화(消化)한 후 검출하는 방법이 일반적이었다. 또한, 겔여과나 프로테아제 등의 전처리를 요구하지 않는 ELISA기술도 개발되고 있으나, MMW로의 교차가 보여서, HMW 특이적이라고는 말하기 어렵다. 따라서, 간편하고 쉬운 전처리법으로, 또는 전처리 없이, 특정 분자 사이즈의 아디포넥틴만을 검출할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
공지의 특정 분자 사이즈 아디포넥틴의 측정법으로는 상기한 바와 같은 겔여과법 외에, 아래의 2가지 방법이 알려져 있다.
(1) LMW 및 MMW를 분해하는 효소로 전처리를 하고, 효소 분해되지 않고 남은 아디포넥틴을 측정하여, HMW만을 검출하는 방법(특허 문헌 1).
(2) 아디포넥틴 단량체에는 반응하지 않으나, 3량체 및/또는 그들이 응집한 구조를 가지는 고분자 아디포넥틴을 인식하는 항체를 이용하여, 당해 고분자 아디포넥틴 항원만을 검출하는 방법 (특허 문헌 2).
그러나, 효소 전처리의 경우, 수십분의 효소 처리 시간이 필요하고, 최적(至適) 시간을 넘는 장시간의 인큐베이트(インキュベ-ト)를 행할 경우, 혼재하는 프로테아제에 의해 표적(標的) 분자 자체가 분해될 우려가 있으므로, 인큐베이트 시간을 엄밀히 규정할 필요가 있다. 또한, 효소 처리는, 표적 항원의 타입에 따라 최적 종류의 분해 효소를 선택할 필요가 있으므로, 범용성 있는 방법이라고 말하기 어렵다.
한편, 공지의 고분자 아디포넥틴을 인식하는 항체를 이용하는 경우에도, 고분자체(HMW)와 함께 다른 다량체 구조(LMW 및 MMW)도 함께 인식되므로, 순수하게 HMW만을 검출할 수 있는 방법이라고 말하기 어렵다. HMW 아디포넥틴만을 특이적으로 인식하는 항체는, 지금까지 알려져 있지 않다.
특허 문헌 1: 국제 공개 제 WO 2005/038457호 팜플렛 특허 문헌 2: (일본)특허 제 3624216호 명세서
종래의 전처리가 필요없는(不要型) HMW 검출용 ELISA에는, MMW를 대량으로 함유하는 검체에 있어서 MMW에 교차성을 보이는 문제가 있으므로, 진실로 HMW 특이적인 측정이 곤란한 점, 또한 ELISA에서는 HMW 선택제(選擇制)가 강한 항체라도, 라텍스(ラテックス) 표식(標識)에 의해 HMW 선택성을 잃는 것이 있어서, 라텍스에 의해 간단하고 쉽게 HMW 아디포넥틴을 측정하는 것이 매우 곤란하였다. 그래서 본 발명의 과제는, MMW 아디포넥틴에 교차성을 보이지 않고, HMW 아디포넥틴만을 선택적으로 검출 또는 정량하기 위한 모노크로날 항체 및 간편하고, 정확도 및 범용성이 높은 고분자 아디포넥틴 분석용 시약을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 보다 간편하게 HMW 아디포넥틴만을 선택적으로 검출 또는 정량할 수 있는 고분자 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약의 구축 및 그것에 사용하는 모노크로날 항체의 스크리닝을 실시하였다. 그 결과, 샌드위치 ELISA계에서 비교적 HMW 특이성이 강한 항체이면서도, 라텍스 시약으로서 평가한 경우에는 전혀 HMW 특이성을 보이지 않는 것이 확인되었기 때문에, 인간(ヒト) 혈액 중 아디포넥틴의 HMW 분획만을 사용해서 신규한 모노크로날 항체를 제조하였다. 본 모노크로날 항체는, 다른 대장균 재조합(組替) 아디포넥틴에 의해 제조된 모노크로날 항체에 비해, 웨스턴 블로팅(western blotting) 해석에서는 동등한 반응성을 가지고 있어도, 샌드위치 ELISA계에서 평가하면 HMW 특이성이 매우 강한 것을 발견하였다. 또한, 이것을 사용한 아디포넥틴 분석용 라텍스(ラテックス) 시약을 구축한 결과, 본 시약은 MMW에 교차성을 보이지 않고 HMW 아디포넥틴을 선택적으로 측정하는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은,
[1] 고분자 아디포넥틴과 특이적으로 반응함을 특징으로 하는 모노크로날 항체,
[2] 고분자 아디포넥틴을 항원으로 사용함을 특징으로 하는, [1]의 모노크로날 항체의 제조 방법,
[3] [1]의 모노크로날 항체를 사용함을 특징으로 하는, 고분자 아디포넥틴의 면역학적 분석 방법,
[4] 라텍스 응집법인, [3]의 면역학적 분석 방법,
[5] [1]의 모노크로날 항체를 포함하는, 고분자 아디포넥틴의 면역학적 분석용 시약,
[6] [1]의 모노크로날 항체를 담지(擔持)시킨 라텍스 입자를 포함하는, [5]의 면역학적 분석용 시약에 관한 것이다.
본 발명의 신규 모노크로날 항체에 의하면, 보다 간편하게 그리고 정확하게 고분자(HMW) 아디포넥틴만을 선택적으로 분석(검출 또는 정량)할 수 있는 고분자 아디포넥틴 분석용 시약(특히 라텍스 시약) 및 분석 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 공지 모노크로날 항체를 사용하는 각종 ELISA 키트를 사용해서, 인간 혈청(MMW 낮은값(低値) 검체)의 겔여과 분획 중의 아디포넥틴량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 도 1과 동일한 ELISA키트를 사용하여, 인간 혈청(MMW 높은값(高値) 검체)의 겔여과 분획 중의 아디포넥틴량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 공지 모노크로날 항체 ANOC9121를 사용하여 제조한 라텍스 시약에 의해, 인간 혈청의 겔여과 분획 중의 아디포넥틴량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 도 1과 동일한 ELISA 키트에 부가하여, 본 발명의 ELISA 키트를 사용하여, 인간 혈청(MMW 낮은값 검체)의 겔여과 분획 중의 아디포넥틴량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 도 4와 동일한 ELISA 키트를 사용하여, 인간 혈청(MMW 높은값 검체)의 겔여과 분획 중의 아디포넥틴량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6는 본 발명의 모노크로날 항체 Clone8D를 사용하여 제조한, 본 발명의 라텍스 시약에 의해, 인간 혈청의 겔여과 분획 중의 아디포넥틴량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 모노크로날 항체는, 고분자 아디포넥틴과 특이적으로 반응한다. 본 명세서에서, 「고분자 아디포넥틴과 특이적으로 반응한다」는 것은, 고분자 아디포넥틴과 반응하나, 3량체 아디포넥틴과 반응하지 않고, 6량체 아디포넥틴과 실질적으로 반응하지 않는 것을 의미한다. 또한, 본 명세서에서는, 고분자 아디포넥틴, 6량체 아디포넥틴, 3량체 아디포넥틴을, 각각, HMW 아디포넥틴, MMW 아디포넥틴, LMW 아디포넥틴(또는, 간단히, HMW, MMW, LMW)으로 칭한다.
또한, 본 명세서에서, 「고분자 아디포넥틴」은, LMW 및/또는 MMW의 중합체를 기본 골격으로 한 다량체이며, 비변성(非變性)하에서, 분획(分畵)할 때에 약 440 kDa 이상으로 분획되고(즉, HMW와 MMW의 경계가 약 440 kDa), 670 kDa 주변에 피크를 가지는 상기 다량체를 의미한다.
또한, 상기 분자량은, 후술하는 비교예 및 실시예에서 실시한 겔여과에 의해 결정된 값이며, 그 겔여과 조건은 아래와 같다.
칼럼: superdex(슈퍼덱스) 200 prep grade (GE 헬스케어　바이오사이언스）
이동층(용매): D-PBS
송액(送液)속도: 1 mL/min
분자량 마커:
(1) 소혈청 알부민(Bovine Serum Albumin): 67,000(Da)
(2) 알도오스(Aldolase): 158,000
(3) 카탈라제(Catalase): 232,000
(4) 페리틴(Ferritin): 440,000
(5) 티로글로블린(Thyroglobulin): 669,000
(6) 블루덱스트란 2000(Blue Dextran 2000): 2,000,000
본 명세서에서, 「6량체 아디포넥틴(MMW)과 실질적으로 반응하지 않는다」는 것은 인간 혈청을 비변성하에서 분획할 때에, 400 kDa 주변에 피크를 가지며, 약 250~440 kDa에서 용출하는 분자에 반응성을 나타내지 않는 것을 말한다.
본 발명의 HMW 아디포넥틴 특이적 항체의 제조법으로는, 면역원으로서 생체로부터 직접 채취되고, HMW로 분획된 아디포넥틴을 사용하는 것 이외에는, 종래의 모노크로날 항체 제조법에 준해서 실행할 수 있다.
면역원으로 사용하는 생체 시료는, HMW 아디포넥틴을 함유할 가능성이 있는 생물학적 액체인 한, 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들면, 생체로부터 직접 채취하여 얻어질 수 있는 생체액 [예를 들면, 혈액(즉, 전혈(全血)), 혈청, 혈장, 뇨, 수액, 또는 분비액 등], 또는 생체로부터 채취한 생체 재료(예를 들면, 장기, 조직, 또는 세포 등)을 처리해서 얻을 수 있는 생체 재료 유래액(由來液)(예를 들면, 장기, 조직 또는 세포의 각종 추출액, 또는 조직 또는 세포의 각종 배양액 등) 등을 들 수 있다.
면역원으로서의 HMW 아디포넥틴 분획은, 상기 생체 시료를 사용해서, HMW 아디포넥틴을 포함하는 다양한 분자량의 아디포넥틴을 분취(分取)한 후, 겔여과(ゲルろ過) 크로마토그래피에 의해, HMW를 분취(分取)함에 의해서 조제할 수 있다. HMW 아디포넥틴을 포함하는 다양한 분자량의 아디포넥틴의 채취에는, HMW 아디포넥틴을 인식하는 항체를 고정한 어피니티(アフィニティ-) 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 고정화한 항체는, 적어도 HMW 아디포넥틴을 인식할 수 있는 항체이면 좋고, MMW나 LMW 아디포넥틴을 인식해도 좋다. 어피니티 크로마토그래피나 겔여과 크로마토그래프피의 구체적인 방법은, 사용하는 항체나 생체 시료의 양 등에 맞추어 적절히 실시할 수 있다. 또한, 겔여과 크로마토그래피에 의해 분취(分取)한 후, 어피니티 크로마토그래피에 의해 분취해도 좋다.
이와 같이 제조한 HMW 아디포넥틴 모노크로날 항체는, 면역 글로블린 분자 자체 외, 항체 프레그먼트(フラグメント), 예를 들면, Fab, Fab' , F(ab')２ 또는 Fｖ등, 공지의 방법에 따라 조제하여, HMW 아디포넥틴의 선택적 측정법에 사용할 수 있다.
본 발명에 의해 분석가능한 피검 시료는, HMW 아디포넥틴을 함유할 가능성이 있는 생물학적 액체인 한, 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들면, 생체로부터 직접 채취하여 얻을 수 있는 생체액[예를 들면, 혈액(즉, 전혈(全血)), 혈청, 혈장, 뇨, 수액 또는 분비액 등], 또는, 생체로부터 채취한 생체 재료(예를 들면, 장기, 조직, 또는 세포 등)을 처리해서 얻을 수 있는 생체 재료 유래액(예를 들면, 장기, 조직, 또는 세포의 각종 추출액, 또는 조직 또는 세포의 각종 배양액 등) 등을 들 수 있다.
HMW 아디포넥틴은, 예를 들면, 정상인 혈중에는, 수 μg/mL ~ 수십 μg/mL의 농도로 존재한다. 또는, 예비 실험 등에 의해 처리액(예를 들면, 추출용 용액 또는 배양용 용액)의 양을 적절히 선택함에 의해, 얻을 수 있는 생체 재료 유래액 중의 HMW 아디포넥틴 농도를 수 μg/mL ~ 수십 μg/mL로 할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 의해 분석 가능한 생물학적 액체(특히 혈액)는, HMW 아디포넥틴을 수 μg/mL ~ 수십 μg/mL의 농도로 포함하나, 본 발명의 HMW 아디포넥틴 분석용 시약에 의해, 전희석(前稀釋) 없이, 분석할 수도 있다.
본 발명의 HMW 아디포넥틴 분석법으로는, 공지의 면역학적 측정 방법을 사용할 수 있다. 면역학적 측정 방법으로는, ELISA법이나 RIA법, 면역 응집법이나 면역크로마토그래피(イムノクロマト)법 등을 들 수 있다. 라텍스를 사용한 면역 응집법에 대하여, 보다 구체적으로 기재한다.
본 발명에서 사용하는 라텍스 입자로서는, 공지의 라텍스 입자, 예를 들면, 폴리스티렌, 또는 스티렌-스티렌술폰(スチレン-スチレンスルホン)산염 공중합체 등으로 된 라텍스 입자를 들 수 있다. HMW 아디포넥틴에 대한 특이적 항체를 담지하는 라텍스의 평균 입경은, 예를 들면, 피검 시료인 생물학적 액체의 종류, HMW 아디포넥틴의 함유 농도, 또는 측정기기 등에 대응해서, 통상, 0.05 ~ 1.0 μｍ의 범위에서 적절히 선택할 수 있다.
예를 들면, 혈중 HMW 아디포넥틴을 분석하는 경우에는, 정상인 검체 중에 수 μｇ ~ 수십 μｇ／mL의 고농도로 HMW 아디포넥틴이 존재하기 때문에, 상기 라텍스 입경을 적절히 선택함에 의해, 혈중 HMW 아디포넥틴의 측정계의 측정 범위가 보증 가능하게 된다. 예를 들면, 입경이 0.1 μm 이하에서는, 임상적 의의가 큰 5 μg/mL 이하의 측정 정확성이 보증되지 않을 수 있고, 입경이 0.5 μm 이상이면, 정상 높은값(高値) 검체의 측정이 가능하지 않을 수 있다. 따라서, 혈중 HMW 아디포넥틴의 측정계로서는, 평균 입경 0.1 ~ 0.5 μｍ의 라텍스 입자가 바람직하다.
본 발명의 HMW 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약은, HMW 아디포넥틴에 대한 특이적인 모노크로날 항체를 담지한 라텍스 입자 현탁액을 포함하는 한, 그 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들면, HMW 아디포넥틴 특이적 항체를 감작(感作)한 라텍스 입자와 완충액 양자를 포함한 1액계(液系) 시약; 또는, 완충액인 제1 시약과, HMW 아디포넥틴 특이적 항체를 감작한 라텍스 입자를 포함하는 제2 시약으로 구성된 2액계(液系) 시약 등, 각종 형태일 수 있다.
본 발명의 HMW 아디포넥틴 분석 방법은, 아디포넥틴을 포함할 가능성 있는 생물학적 액체를 취득한 후, 취득한 상기 생물학적 액체에 대해서 전희석(前稀釋) 및/또는 전처리함 없이, 취득한 상태 그대로, 또는 소망하는 바에 따라 적당한 처리를 실시한 후, 본 발명의 HMW 아디포넥틴에 대한 특이적 항체를 담지한 라텍스 입자 현탁액(바람직하게는, 본 발명의 HMW 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약)과 접촉시킬 수 있다.
예를 들면, 본 발명 방법의 바람직한 양태의 하나인, 자동분석 측정장치를 사용하는 HMW 아디포넥틴 분석 방법은,
(1) 아디포넥틴을 포함할 가능성이 있는 생물학적 액체를 취득하는 공정, 및 (2) 상기 공정에서 취득한 생물학적 액체를, 상기 공정에서 취득한 상태 그대로, 또는 적당한 전희석(前稀釋) 및/또는 전처리를 실시한 후, 자동분석 측정장치 내에서, HMW 아디포넥틴에 대한 특이적 항체를 담지한 라텍스 입자 현탁액에 접촉시켜서, 라텍스 입자의 응집도를 광학적으로 분석하는 공정을 포함한다.
각종 생물학적 액체, 예를 들면, 혈액 중의 HMW 아디포넥틴 측정은, 종래의 측정 방법인 방사면역 측정법(ラジオイムノアッセイ) 또는 효소면역 측정법(エンザイムイムノアッセイ)을 사용한 경우에는, 예를 들면, 500 ~ 5000배로 검체를 희석하는 스텝을 필요로 한다. 그것에 대해서, 본 발명의 HMW 아디포넥틴 분석 방법에서는, 예를 들면, 라텍스 입자의 입경을 적절히 선택(예를 들면, 혈중 HMW 아디포넥틴의 경우에는, 0.1 ~ 0.5 μm의 입경이 바람직하다)함에 의해, 검체의 전희석이나 전처리를 필요로 하지 않고, 원액(原液)을 시료로 해서 라텍스 응집 반응을 실시할 수 있다.
본 발명의 HMW 아디포넥틴 분석 방법에 있어서는, HMW 아디포넥틴에 대한 특이적 항체를 담지한 라텍스 입자(예를 들면, 본 발명의 HMW 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약)을 사용해서 응집 반응을 행하고, 발생한 응집의 정도(응집도)를 광학적으로 분석(특별히, 측정)함에 의해, 생물학적 액체 중(예를 들면, 혈중)의 HMW 아디포넥틴의 양을 분석(특별히, 측정)할 수 있다. 라텍스 입자의 응집도를 광학적으로 분석하는 구체적 방법으로는, 예를 들면, 육안으로 관찰하거나, 또는 산란광 강도, 흡광도 또는 투과광 강도를 측정하는 광학기기를 사용해서 측정할 수 있다. 바람직한 측정 파장은 300 ~ 800 nm이다. 측정 방법은, 공지의 방법에 따라, 사용하는 라텍스 입자의 크기(평균 입경) 또는 농도의 선택, 또는 반응 시간의 설정에 의해, 산란광 강도, 흡광도, 또는 투과광 강도의 증가 또는 감소를 측정하여 수행할 수 있다. 또한 이들 방법을 병용하는 것도 가능하다.
일반적으로, 라텍스 응집 반응의 측정계에 존재하는 HMW 아디포넥틴에 대한 특이적 항체 감작(感作) 라텍스의 농도는, 예를 들면, 공존하는 염, 단백질, 또는 당류 등의 첨가물의 농도에 의해 적절히 선택할 수 있다. 일반적으로, 반응계의 최종 액량(液量)의 농도로서, HMW 아디포넥틴에 대한 특이적 항체 감작 라텍스가 바람직하게는 0.05 ~ 10 mg/mL, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 2 mg/mL로 되도록, 조제할 수 있다. HMW 아디포넥틴에 대한 특이적 항체 감작 라텍스의 농도가 너무 낮으면, 응집 반응의 저농도 측정이 충분하지 않을 수 있고, 너무 높으면, 응집 반응의 고농도 측정이 충분하지 않게 되어, 재현성(再現性)이 나빠질 수 있다.
본 발명에 있어서는, HMW 아디포넥틴에 대한 특이적 항체 감작 라텍스의 응집 반응에 영향을 줄 수 있는 다른 인자를 조절함에 의해서, 라텍스 입자 응집 반응을 더욱 정밀하게 측정하고, 저농도 영역 및 고농도 영역의 정량 가능 범위를 더욱 확장시킬 수 있다. 라텍스 응집 반응에 영향을 줄 수 있는 다른 인자로서는, 예를 들면, 라텍스 입자의 농도, 라텍스 입자 상의 항체 감작량(感作量), 또는 라텍스 입자의 입경 등을 들 수 있다.
본 발명의 HMW 아디포넥틴 분석 방법에 있어서 라텍스 응집 반응의 조건은, 통상의 조건과 동일해도 좋고, 반응 매체로서는, 각종 생물학적 액체 중의 HMW 아디포넥틴 분석에 대응한 각종 완충액이 적절히 선택될 수 있다. 혈중 HMW 아디포넥틴을 분석하는 경우는, 이 완충액은, 혈중 HMW 아디포넥틴을 실활(失活)시키지 않고, 게다가 라텍스 응집 반응을 저해하지 않는 이온 강도나 pH를 가지는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 구드(グッド) 완충액, 글리신(グリシン) 완충액, 또는 트리스 완충액 등이 사용가능하다. 반응의 pH는, 5 ~ 10, 특히 6 ~ 8이 바람직하다. 반응 온도는 0 ~ 50℃, 특히 20 ~ 40℃가 바람직하다. 반응 시간은 적절히 결정할 수 있다.
(실시예) 이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
《비교예 1》공지의 모노크로날 항체
본 발명의 모노크로날 항체와의 비교를 위해서, 공지 모노크로날 항체로서, 대장균 재조합 아디포넥틴 항원을 마우스에 감작시켜 제조한 2종의 모노크로날 항체 ANOC9121, Clone5A를 사용했다. 양 모노크로날 항체의 인간 혈중 아디포넥틴 반응성을 표 1에 정리하였다. 양 항체 모두 비환원(非還元)하의 웨스턴 블로팅에서는 혈중의 MMW, HMW를 동등하게 검출할 수 있다. 그러나, 동일 항체들의 샌드위치 ELISA에서는 Clone5A는 혈액 중의 모든 분자를 인식하나, ANOC9121들로 된 샌드위치 ELISA에서는 MMW로의 약한 교차가 발견되었다.
Figure pct00001
공지 모노크로날 항체의 문제점-1: MMW 로의 교차 반응성
먼저 제조한 ANOC9121들로 된 샌드위치 ELISA 키트 및, 전처리를 필요로 하지 않는 시판하는 고분자 아디포넥틴 ELISA 키트(후지레비오㈜(富士レビオ))를 사용하여, 2종류의 인간 혈청의 겔여과 분획을 측정하였다. 또한, 총 아디포넥틴의 측정은 인간 아디포넥틴 ELISA 키트 (오쓰까 세이야꾸 가부시키가이샤(大塚製藥株式會社))를 사용했다.
본 명세서의 비교예 및 실시예에서 실시한 겔여과는, 특별한 언급이 없는 한, 이하의 조건에서 실시하였다.
칼럼: Superdex 　200 prep grade (GE 헬스케어　바이오사이언스)
이동층(용매): D-PBS
송액(送液)속도: 1 mL/min
분자량 마커：　
(1) 소혈청 알부민(Bovine Serum Albumin): 67,000(Da)
(2) 알도오스(アルド-ス, Aldolase): 158,000
(3) 카탈라제(Catalase): 232,000
(4) 페리틴(Ferritin): 440,000
(5) 티로글로블린(Thyroglobulin): 669,000
(6) 블루덱스트란 2000(Blue Dextran 2000): 2,000,000
MMW의 함유비가 높지 않은 혈청 샘플을 사용한 경우의 결과를 도 1에, MMW의 함유비가 높은 혈청 샘플을 사용한 경우의 결과를 도 2에, 각각 나타내었다. 도 1 및 도 2에서, A는 ANOC9121을 사용한 샌드위치 ELISA의 결과를, B는 시판하는 고분자 아디포넥틴 ELISA 키트 (후지레비오㈜(富士レビオ))의 결과를, C는 총 아디포넥틴 측정용의 인간 아디포넥틴 ELISA 키트 (오쓰까 세이야꾸 가부시키가이샤(大塚製藥株式會社))의 결과를 나타낸다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, MMW가 높지 않은 샘플에서는, ANOC9121 ELISA 키트, 시판하는 고분자 아디포넥틴 ELISA 키트 모두 고분자(H)의 특이 측정이 가능하였다. 한편, 도 2에 나타난 바와 같은 MMW 높은값(高値) 샘플에서는, MMW로의 교차 반응성이 양 키트 모두에서 확인되므로, HMW 특이 측정은 곤란하게 된다.
또한, 상기 겔여과 조건에 있어서, HMW 분획, MMW 분획, 및 LMW 분획은, 각각 분자량이, ＞약 440 kDa, 약 250~440 kDa, ＜약 250 kDa의 분획이다.
《비교예 2》
공지 모노크로날 항체의 문제점-2: 라텍스 시약화의 문제
ELISA에서 MMW 반응성을 가지지만, HMW 특이성이 높은 ANOC9121 모노크로날항체를 사용해서 라텍스 시약의 조제를 시도했다.
(1) ANOC9121 모노크로날 항체 감작 라텍스 시약의 조제
ANOC9121 모노크로날 항체를 0.5 mg/mL의 농도에서 0.01 mol/L 트리스완충액(pH 8.0)에 용해한 액(液) 9 mL에, 평균 입경 0.2 μm의 폴리스티렌 라텍스 (고형분 10 중량%) 1 mL를 첨가하고, 실온에서 60분간 교반했다. 다음에, 이 액에, 소혈청 알부민을 0.5 중량％ 함유하는 트리스 완충액 (pH 8.0)을 첨가하고, 실온에서 60분간 교반한 후, 이 혼합액을 20000 rpm으로 원심분리했다. 얻어진 침전물에 트리스 완충액 (pH 8.0) 10 mL를 첨가하고, 라텍스를 현탁시켜서, ANOC9121 모노크로날 항체 감작 라텍스액을 조제하였다.
(2) 완충액의 조제
0.5% (중량％) 농도에서 소혈청 알부민을 함유하는 0.1 mol/L 트리스완충액 (pH 8.0)에, 0.9% (중량%)농도의 염화나트륨을 첨가해서 완충액으로 하였다.
(3) HMW 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약
본 비교예에서 사용한 인간 아디포넥틴 항원 측정 시약은, (2)에서 조제한 완충액으로 된 제1 시약과, (1)에서 조제한 ANOC9121 모노크로날 항체 감작 라텍스로 된 제2 시약으로 이루어진 2액계의 시약으로서 구성했다.
아디포넥틴의 측정
(1) 아디포넥틴 분획의 측정
인간 혈청 중의 아디포넥틴 분획（MMW 낮은값 샘플）35 μL에, 아디포넥틴 측정용 시약의 조제 (2)에서 조제한 완충액 90 μL를 혼합하고, 37℃에서 적시 유지(適時保持)한 후, 아디포넥틴 측정용 시약의 조제 (1)에서 조제한 ANOC9121 모노크로날 항체 감작 라텍스액 90 μL를 첨가 교반하고, 그 후, 5분 후의 파장 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이때의 흡광도의 변화량을 흡광도 변화량(ΔAbs)으로 하였다. 표준 아디포넥틴 항원액으로부터 얻은 ΔAbs와 그 항원 농도로부터 검량선(檢量線)을 작성하였다. 그 검량선을 사용해서, 피검 샘플의 ΔAbs로부터 아디포넥틴값을 계산하였다. 측정은, 히다찌 (日立) 자동 분석장치 7170형을 사용해서 수행했다.
이때, 시판하는 인간 아디포넥틴　라텍스 키트（미쯔비시 카가쿠 야트론(三菱化學ヤトロン))을 사용해서, 총 아디포넥틴의 측정도 동시에 수행했다. 측정해서 얻은 흡광도에 있어서, 2시약 사이의 피크를 비교하기 위해, 109번째의 프랙션(분획,フラクション) 흡광도가 일치하도록, ANOC9121 항체 감작 라텍스 시약에서의 측정 흡광도를 보정하였다.
도 3에, 이와 같이 제조한 ANOC9121을 이용한 HMW 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약을 사용하여 인간 혈청 중의 아디포넥틴 분획을 평가한 결과 (도 3의 E)로 나타낸다.
현재 시판되는 총 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약의 결과 (도 3의 D)와 비교하면, ANOC9121을 사용한 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약은, LMW에 상당하는 분획에 반응성을 보이지 않지만, HMW, MMW 모두 총 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약과 동등하게 검출하는 것이 분명하므로, MMW 낮은값(低値) 샘플에서도 MMW를 검출해 버려서, ELISA의 성능을 재현할 수 없었다.
ELISA의 결과가 라텍스 시약에 반영되지 않은 이유로서, 일차 항체와 반응시키고, 다음으로 이차 항체와 반응시키는 ELISA에 비해, 라텍스 시약에서는 동시에 응집이 개시하는 등의 반응 원리가 다른 것에 기인한 것으로 생각되지만, HMW에 대한 특이성이나 친화성이 낮은 것도 원인이 될 수 있다고 생각된다.
《실시예 1》
(１）면역원의 조제 및 신규 모노크로날 항체의 제조
이미 시행한 대장균 재조합 아디포넥틴에 의한 항체 제조에서는, HMW 특이성이 높은 모노크로날 항체의 제조는 곤란하다고 판단하고, 인간 혈액 중의 아디포넥틴으로부터 HMW 분획만을 추출하여 모노크로날 항체를 제조하였다. 인간 혈액중 총 아디포넥틴의 정제에는, 전술한 ANOC9121 결합 칼럼을 사용하였다. 이(同) 칼럼은, 3 ~ 10 mg/mL의 정제 ANOC9121을 CNBr-활성화 세파로스(セファロ-ス) 4B의 4g과 커플링하여 제작하고, 인산 완충액으로 세정 후의 동(同)칼럼에 5 ~ 20 mL의 인간 혈청을 적용(アプライ)하였다. 인산 완충액으로 여분의 혈청 성분을 세정 제거한 후, 용출액에서 인간 혈액중 아디포넥틴을 용출하였다. 용출액으로서는 수 mol/L 요소 등의 단백 변성제나, 카오토로픽 이온(カオトロピックイオン) 또는 수 mol/L의 염화나트륨용액을 사용할 수 있으나, 본 실시예에서는 6 mol/L 요소를 사용했다. 또한 용출된 아디포넥틴은, 겔여과 정제에 의해, HMW 분획 중, HMW의 피크 보다도 고분자량측만을 회수함으로써, 인간 혈중 아디포넥틴의 HMW를 정제했다.
정제된 인간 혈중 HMW 아디포넥틴은, 프로인트(Freund, フロイント) 완전 보조제(adjuvant, アジュバンド) 또는 프로인트 불완전 보조제와 함께, 마우스 Balb/C에 1 ~ 10 μg/개체를 격주로 수회 정도 면역하였다. 마우스로부터 비장(脾臟)을 적출한 후, 상법(定法)에 따라 마우스 미에로마(ミエロ-マ) 세포주 P3U1과 폴리에틸렌글리콜법을 사용해서 융합시키고, 하이브리도마를 제조하였다.
제조된 하이브리도마로부터, 보다 천연(Native)형의 아디포넥틴 특이성이 높은 모노크로날 항체를 스크리닝하기 위해, 전혀 변성이 일어나지 않는 아디포넥틴으로서 혈액중의 아디포넥틴을 이용했다. 상세하게는, Fc 부분을 소화(消化)한 ANOC9121 F(ab,)2를 제조하고, ANOC9121 F(ab,)2 고상 플레이트(固相プレ-ト)를 제조했다. 본 F(ab,)2 플레이트에, 적절히 희석한 인간 혈청을 반응시키고, 이어서 하이브리도마의 배양 상청(上淸)을 반응시켰다. 또한 호스래디쉬퍼옥시다아제(ホ-スラディッシュパ-オキシダ-ゼ; HRP）표식한 항마우스 IgG Fc항체를 첨가하고 인큐베이트한 후, 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘(テトラメチルベンジジン)의 발색 강도를 측정함에 의해, 천연형의 아디포넥틴에 특이성 및 친화성이 모두 높은 모노크로날 항체 clone8D를 생산하는 마우스-마우스 하이브리도마 Clone8D를 스크리닝했다.
(２）신규 제조된 모노크로날 항체의 웨스턴 블로팅에 의한 평가
혈액으로부터 정제한 HMW 아디포넥틴 분획을 사용하여 제작한, 항인간 아디포넥틴 모노크로날 항체 Clone8D를 사용해서 인간 혈중의 아디포넥틴 분자를, 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 샘플로서, 비환원 비가열 조건하 및 ２－메캅토(メルカプト)에탄올에 의한 환원 조건하에서 인간 혈액을 전기 영동(電氣泳動)하고, 이것에 전술한 ANOC9121, Clone5A 및 Clone8D의 3종류의 항체를 반응시켜서, 염색했다. 인간 혈중 아디포넥틴은, 비환원 비가열 조건하에서는, HMW나 MMW, LMW 등의 다양한 형태로 존재하는 한편, 환원 조건하에서는, 3량체 이상의 형태가 소실되고, 단량체인 약 28,000 Da의 형태 또는 2량체 상당의 분자로서 존재한다. 모노크로날 항체 ANOC9121은, 비환원 비가열 조건하 및 환원하에서, 이들 분자량체를 전부 인식하였다. 한편 모노크로날항체 Clone5A 및 이번에 인간 혈중 아디포넥틴을 사용해서 제작한 Clone8D는, 환원 변성된 단량체를 인식하지 않으나, 비환원 비가열 조건하의 고분자량체를 인식하는 것이 보였으나, 웨스턴 블로팅으로 평가하는 한에서는, 고분자량체에 대한 반응성이 3자간에 큰 차이는 보이지 않았다.
《실시예 2》
신규 제작된 모노크로날 항체의 ELISA 에 의한 평가
Clone8D를 사용한 샌드위치 ELISA를 구축하고, HMW 특이성을 종래의 샌드위치 ELISA와 비교했다. 상세하게는, 인산 완충액에 5 ~ 10 μg/mL 농도로 희석한 Clone8D를, 시판 96혈(穴) ELISA 플레이트에 첨가하고 하룻밤 고상화(固相化) 반응을 수행했다. 이어서, 0.1 ~ 1%의 소혈청알부민을 함유한 인산 완충액으로 블로킹(ブロッキング)조작을 수행하였다. 이 항체 고상 플레이트에, Superdeｘ 200 칼럼 (GE 헬스케어)를 사용해서 HPLC 분획한 인간 혈청을 반응시키고, 세정후 비오틴(ビオチン)표식한 Clone8D를 반응시켰다. 또한, HRP 결합 스트렙타아비딘(ストレプトアビジン)을 첨가하고, 인큐베이트한 후, 과잉량의 HRP 결합 스트렙타아비딘을 세정하였다. 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘을 첨가하여 얻어지는 발색 강도를 측정하여 각 분획의 아디포넥틴양을 결정하였다.
또한, 동일 분획을, 비교예１에서 사용한, ANOC9121 끼리의 샌드위치 ELISA 키트, 전처리를 필요로 하지 않는 시판 고분자 아디포넥틴 ELISA 키트（후지레비오㈜(富士レビオ))로 측정하여 MMW로의 교차성을 확인했다. 또한, 총 아디포넥틴의 측정에는 인간 아디포넥틴 ELISA 키트（오쓰까 세이야꾸 가부시키가이샤(大塚製藥株式會社))를 사용했다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. Clone8D를 사용한 샌드위치 ELISA(도 4 및 도 5의 F)는 다른 측정법에 비해, 도 5에 나타난 바와 같은 MMW 낮은값(低値)의 검체 뿐만 아니라, 도 6에 나타난 바와 같은 MMW를 대량으로 함유하는 검체에 있어서도 MMW로의 교차성을 보이지 않아 HMW 특이적인 측정이 가능하였다.
《실시예 3》
신규 모노크로날 항체를 사용한 고분자 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약의 조제
(1) Clone8D 모노크로날 항체 감작 라텍스 시약의 조제
Clone8D 모노크로날 항체를 0.5 mg/mL의 농도로 0.01 mol/L 트리스완충액 (pH 8.0)에 용해한 액 9mL에, 평균 입경 0.2 μm의 폴리스티렌 라텍스(고형분 10 중량%) 1 mL를 첨가하고, 실온에서, 60분간 교반하였다. 다음으로, 이 액에, 소혈청 알부민을 0.5 중량% 함유하는 트리스완충액 (pH 8.0)을 첨가하고, 실온에서 60분간 교반한 후, 이 혼합액을 20000 rpm으로 원심분리했다. 얻어진 침전물에 트리스완충액 (pH 8.0) 10 mL를 첨가하고, 라텍스를 현탁시켜서, Clone8D 모노크로날 항체 감작 라텍스액을 조제했다.
(2) 완충액의 조제
0.5 % (중량%) 농도로 소혈청알부민을 함유하는 0.1 mol/L 트리스 완충액 (pH 8.0)에, 0.9 % (중량％) 농도의 염화나트륨을 첨가해서 완충액으로 했다.
(3) HMW 아디포넥틴 분석용 라텍스 시약
본 실시예에서 사용하는 인간 아디포넥틴 항원 측정 시약은, (2)에서 조제한 완충액으로 된 제1 시약과, (1)에서 조제한 Clone8D 모노크로날 항체 감작 라텍스로 된 제2 시약으로 이루어진 2액계 시약으로 구성했다.
아디포넥틴의 측정
(1) 아디포넥틴 분획의 측정
인간 혈청 중의 아디포넥틴 분획 35 μL에, 아디포넥틴 측정용 시약의 조제 (2)에서 조제한 완충액 90 μＬ를 혼합하고, 37℃에서 적시 유지한 후, 아디포넥틴 측정용 시약의 조제 (1)에서 조제한 Clone8D 모노크로날 항체 감작 라텍스액 90μＬ를 첨가 교반하고, 이후, 5분 후의 파장 570 nm에서의 흡광도를 측정했다. 이때의 흡광도의 변화량을 흡광도 변화량（ΔAbs）으로 했다. 표준 아디포넥틴 항원액으로부터 얻어진 ΔAbs와 그 항원 농도로부터 검량선을 작성했다. 그 검량선을 사용해서, 피검 샘플의 ΔAbs로부터 아디포넥틴값을 계산했다. 측정은, 히다찌(日立) 자동분석장치 7170형을 사용하여 수행했다.
이때, 시판하는 인간 아디포넥틴　라텍스 키트 (미쯔비시 카가쿠 야트론(三菱化學ヤトロン))를 사용해서, 총 아디포넥틴의 측정도 동시에 수행했다. 측정해서 얻은 흡광도에 있어서, ２시약의 피크를 비교하기 위해, 109번째의 프랙션(フラクション) 흡광도가 일치하도록, Clone8D 항체 감작 라텍스 시약에서의 측정 흡광도를 보정하였다.
결과를 도 6에 나타낸다. 도 6에 있어서, D는 시판 인간 아디포넥틴　라텍스 키트(미쯔비시 카가쿠 야트론(三菱化學ヤトロン))의 결과를, G는 본 발명의 Clone8D 항체 감작 라텍스 시약의 결과를 나타낸다. 본 시약을 사용해서 인간 혈청 아디포넥틴의 겔여과 분획을 측정한 결과, HMW 특이적인 라텍스 응집반응을 확인할 수 있었다.
(산업상 이용가능성)
본 발명의 모노크로날 항체는, 아디포넥틴 분석 용도에 사용할 수 있다.
이상, 본 발명을 특정의 형태에 따라서 설명하였으나, 당업자에게 자명한 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.
(수탁번호)
마우스-마우스 하이브리도마 Clone8D은, 국제 기탁 당국인, 독립 행정법인 산업기술 총합연구소 특허생물 기탁센타(獨立行政法人産業技術總合硏究所特許生物寄託センタ-)((우)３０５－８５６６, 일본국 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1초메 1-1 츠쿠바 센트랄 6(日本國茨城縣つくば市東１丁目１番地１中央第6))에, 평성 21년(2009년) 3월 5일에 기탁(수탁번호 FERM BP-11106)되었다.
독립 행정법인 산업기술 총합연구소 특허생물 기탁센타 FERMBP-11106 20090305

Claims (6)

  1. 고분자 아디포넥틴과 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 모노크로날 항체.
  2. 고분자 아디포넥틴을 항원으로 사용하는 것을 특징으로 하는, 청구항 1에 기재된 모노크로날 항체의 제조 방법.
  3. 청구항 1에 기재된 모노크로날 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 고분자 아디포넥틴의 면역학적 분석 방법.
  4. 라텍스 응집법인, 청구항 3에 기재된 면역학적 분석 방법.
  5. 청구항 1에 기재된 모노크로날 항체를 포함하는, 고분자 아디포넥틴의 면역학적 분석용 시약.
  6. 청구항 1에 기재된 모노크로날 항체를 담지시킨 라텍스 입자를 포함하는, 청구항 5에 기재된 면역학적 분석용 시약.
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