WO2015025975A1 - 糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法及びキット - Google Patents
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Abstract
被験者の尿を含む試料を用い, afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoprotein から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する工程を有する、糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法。
Description
本発明は、糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する方法と、その検出キットに関する。
近年、多くの国で糖尿病患者数が年々急増している。糖尿病腎症から腎不全となって透析導入となる患者が増加傾向にあり、透析導入の原因疾患の中で45％と第一位を占めている。透析療法の導入は、糖尿病患者のQOLを著しく低下させるばかりでなく、生命予後も不良となる。
糖尿病の国内患者は710万人、潜在的には推計2210万人であり、患者の90％以上を占める2型糖尿病がインスリン分泌低下及びインスリン抵抗性が合併して発症する多因子性疾患である。
糖尿病腎症の治療においては、腎機能障害の軽度の段階で治療を開始しなければ、腎機能不全が治療の有無に関わらず進行するが、自覚症状が全くないために治療可能な時期を逸することが多い。糖尿病腎症の診断には、尿検査が重要であるが、一般的な尿検査でタンパク尿が出た時には腎機能障害が既に進行していて完治することは不可能である。
糖尿病の国内患者は710万人、潜在的には推計2210万人であり、患者の90％以上を占める2型糖尿病がインスリン分泌低下及びインスリン抵抗性が合併して発症する多因子性疾患である。
糖尿病腎症の治療においては、腎機能障害の軽度の段階で治療を開始しなければ、腎機能不全が治療の有無に関わらず進行するが、自覚症状が全くないために治療可能な時期を逸することが多い。糖尿病腎症の診断には、尿検査が重要であるが、一般的な尿検査でタンパク尿が出た時には腎機能障害が既に進行していて完治することは不可能である。
糖尿病性腎症は、糖尿病によって腎臓の糸球体が細小血管障害のため硬化して減少していく病気であり、次の第１期～第５期に分類される。
第1期（腎症前期）：糸球体濾過量が増加する。第2期（早期腎症）：微量のアルブミンが尿に漏れ出す。第3期（顕性腎症）：持続的にタンパク尿になる。 第4期（腎不全期）：糸球体濾過量が減少し、血清クレアチニンが増加する。第5期（透析療法期）。
第1期（腎症前期）：糸球体濾過量が増加する。第2期（早期腎症）：微量のアルブミンが尿に漏れ出す。第3期（顕性腎症）：持続的にタンパク尿になる。 第4期（腎不全期）：糸球体濾過量が減少し、血清クレアチニンが増加する。第5期（透析療法期）。
最近、尿中の微量アルブミンを測定して、初期腎症を診断する検査が行われるようになったが、現時点では糖尿病腎症による腎不全を減少させるまでは至っていない。
微量アルブミン尿は、動脈硬化性疾患との関連性が指摘されていて、糖尿病腎症の特異的なマーカーであるかは明らかではない （非特許文献１）。また、抗体非反応性アルブミン・酸化型アルブミン・質量の異なるアルブミンの存在が明らかとなり、免疫学的測定法にて把握しきれない尿中アルブミンの質的な変化が問題になりつつある。
微量アルブミン以外の尿マーカーとしては、IV型コラーゲンが既に臨床の現場で使われ出しているが、腎症の早期診断マーカーとしての意義は未だ十分には確立していない。
微量アルブミン尿は、動脈硬化性疾患との関連性が指摘されていて、糖尿病腎症の特異的なマーカーであるかは明らかではない （非特許文献１）。また、抗体非反応性アルブミン・酸化型アルブミン・質量の異なるアルブミンの存在が明らかとなり、免疫学的測定法にて把握しきれない尿中アルブミンの質的な変化が問題になりつつある。
微量アルブミン以外の尿マーカーとしては、IV型コラーゲンが既に臨床の現場で使われ出しているが、腎症の早期診断マーカーとしての意義は未だ十分には確立していない。
近年、質量分析計等の分析機器の進歩によって、生体試料のような多種類のタンパク質の混合物であるサンプルから微量タンパク質を検出して同定することが可能となった。このプロテオーム解析の技術を用いて様々な疾患の患者から採取した血清、組織等の臨床検体を試料として、その中に含まれるタンパク質を網羅的に同定することによって、疾患の病態の変動、治療に対する反応などの指標となるバイオマーカーの探索が盛んに行われている。
しかし、血液（血清または血漿）や尿タンパク質のプロテオーム解析では、タンパク質濃度のダイナミックレンジが広いことや高濃度タンパク質の存在が解析の障害となる。また、質量分析装置は、存在量の多いタンパク質から優先的に測定するという特徴を有するため、尿プロテオーム解析ではアルブミン、IgGなどをはじめとする多量タンパク質が多く同定されてしまう傾向にある。実際、CE-MSを用いた尿中ペプチドマーカーを探索した報告では、273ものペプチドバイオマーカーのうち74%がコラーゲン断片であることが報告されている（非特許文献２）。
しかし、血液（血清または血漿）や尿タンパク質のプロテオーム解析では、タンパク質濃度のダイナミックレンジが広いことや高濃度タンパク質の存在が解析の障害となる。また、質量分析装置は、存在量の多いタンパク質から優先的に測定するという特徴を有するため、尿プロテオーム解析ではアルブミン、IgGなどをはじめとする多量タンパク質が多く同定されてしまう傾向にある。実際、CE-MSを用いた尿中ペプチドマーカーを探索した報告では、273ものペプチドバイオマーカーのうち74%がコラーゲン断片であることが報告されている（非特許文献２）。
そのため、ショットガンプロテオミクスによるバイオマーカー探索アプローチでは、機能性タンパク質に多く見られるng/mLオーダー以下の低濃度で存在する新規関連タンパク質を同定することは困難であり、二次元電気泳動 (非特許文献３、４）とSELDI-TOF (非特許文献５)を用いた少数のタンパク質の検出・同定しか行われていない。
糖尿病腎症に関連する従来技術には、特許文献１～５もあるが、糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する有用な手段は得られていない。
Deckert et al. Diabetes Care (1992) 15, 1181-1191
Protepmics Clin Appl 2011, 5:367-374
Sharma et al. Proteomics (2005) 5, 2648-2655
Rao et al. Diabetes Care (2007) 30, 629-637
Dihazi et al. Clin Chem (2007) 53, 1645-1653
J. Proteome Res., 2008, 7: 731－740
Clin Proteomics. (2014) 11, 23
BJU Int. (2013) 112, 407－15
Lupus. (2002) 11, 514－27
J Proteome Res. (2007) 6, 2631－9
Mol Immunol. (2004) 40, 1325－32
Mamm Genome. (2006) 17, 976－90
J Proteome Res. (2013) 12, 4074－88
Cancer Lett. (2010) 296, 43－8
J Proteomics. (2013) 84, 40－51
そこで、本発明は、糖尿病腎症の発症または発症リスクの指標となる低濃度の尿タンパク質を同定し、糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法及びそのキットを提供することを課題とする。
本発明の糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する方法は、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する工程を有することを特徴とする。
上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1B-glycoprotein、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、Calbindin、CD44、ceruloplasmin、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、Dynein heavy chain 12, axonemal、epiplakin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1 、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質を用いることが有用である。
本発明の糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出するキットは、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備えることを特徴とする。
上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1B-glycoprotein、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、Calbindin、CD44、ceruloplasmin、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、Dynein heavy chain 12, axonemal、epiplakin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1 、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質を用いることが有用である。
ここで、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの染色剤を具備させてもよい。
afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの生物活性を測定する試薬を具備させてもよい。
afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの抗体を具備させてもよい。
本発明によると、糖尿病腎症の発症または発症リスクが早期に容易に検出されるので、その予防や治療に寄与する。
以下に、本発明の実施形態を説明する。実施形態は、先行技術文献や従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能である。
本発明者は、健常者、２型糖尿病患者、糖尿病腎症患者より採取した尿検体を用いて、糖尿病腎症のバイオマーカータンパク質を同定し評価を行った。
これにより、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知することによって、糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出することが可能になった。
これにより、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知することによって、糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出することが可能になった。
上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1B-glycoprotein、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、Calbindin、CD44、ceruloplasmin、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、Dynein heavy chain 12, axonemal、epiplakin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1 、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質を用いることが有用であった。
上記タンパク質の認識及び定量には、該当タンパク質そのものでもよいが、該当タンパク質を認識する固有の部分タンパク質やポリペプチドなどでもよい。
なお、ポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で連結されたものであり、比較的短鎖のペプチドまたはオリゴペプチドと呼ばれるものからタンパク質と呼ばれる長鎖のものまでを含み得る。ポリペプチドを検出するために抗体を作製する場合に、ポリペプチドには、遺伝的にコードされている２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸や、修飾されたアミノ酸を含んでもよい。その修飾には、ペプチド結合の主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端、カルボキシル末端において、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、脂質や脂質誘導体との共有結合、架橋結合の生成、ジスルフィド結合、糖鎖の付加、ＧＰＩアンカーの付加、リン酸化及びプレニル化などが挙げられる。
ポリペプチドは、上記の遺伝子産物におけるアミノ酸置換の他に、ポリペプチドを認識する抗体の抗原として機能する限り、１もしくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、付加されたものであってもよい。抗体が認識するエピトープ以外の部位に、このような変異が含まれていてもよい。
このようなポリペプチドは、化学合成によって直接ペプチドを調製する方法の他に、これらをコードするポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発法などにより作製し、適当な系で発現させることによって調製することも可能である。
このようなポリペプチドは、化学合成によって直接ペプチドを調製する方法の他に、これらをコードするポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発法などにより作製し、適当な系で発現させることによって調製することも可能である。
ポリペプチドの検知は、例えば、本発明の抗体を用いたＥＩＡやＥＬＩＳＡなどの免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークエンサーなどペプチドのアミノ酸配列分析法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳやＥＳＩ Ｑ－ＴＯＦ／ＭＳ法などの質量分析によって検出することができる。
本発明の検出キットは、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1B-glycoprotein、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、Calbindin、CD44、ceruloplasmin、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、Dynein heavy chain 12, axonemal、epiplakin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1 、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備えることを特徴とし、その検知手段としては、該当タンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの染色剤を具備するか、生物活性を測定する試薬を具備するか、抗体を具備するものが有用に利用できる。
尿による試料は、尿量等によって尿中のタンパク質濃度が影響を受けやすいから、その影響を低減するために、例えば尿中クレアチニン濃度を検知し補正することが好ましい。
尿による試料は、尿量等によって尿中のタンパク質濃度が影響を受けやすいから、その影響を低減するために、例えば尿中クレアチニン濃度を検知し補正することが好ましい。
上記タンパク質、その部分タンパク質、ポリペプチドの合成には、例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用することができる。
その方法では、例えばタンパク質またはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、公知の各種縮合方法により所望のアミノ酸配列に順次樹脂上で結合させていく。縮合反応には、好ましくは公知の各種活性化試薬を用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基を除去することにより目的のものを得ることができる。
遊離型のものとして得られた場合には、公知の方法またはそれに準じた方法で塩に変換することができ、またそれらは塩として得られた場合には、公知の方法またはそれに準じた方法で遊離型のものまたは他の塩に変換することができる。塩としては、生理的に許容されるものまたは医薬として許容されるものが好ましいが、これらに限定されない。その塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、例えば酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが挙げられる。また、アンモニウム塩、例えばエチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ヒドロキシエチルアミンなどの有機塩基との塩なども挙げられる。
その方法では、例えばタンパク質またはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、公知の各種縮合方法により所望のアミノ酸配列に順次樹脂上で結合させていく。縮合反応には、好ましくは公知の各種活性化試薬を用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基を除去することにより目的のものを得ることができる。
遊離型のものとして得られた場合には、公知の方法またはそれに準じた方法で塩に変換することができ、またそれらは塩として得られた場合には、公知の方法またはそれに準じた方法で遊離型のものまたは他の塩に変換することができる。塩としては、生理的に許容されるものまたは医薬として許容されるものが好ましいが、これらに限定されない。その塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、例えば酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが挙げられる。また、アンモニウム塩、例えばエチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ヒドロキシエチルアミンなどの有機塩基との塩なども挙げられる。
抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。
なお、抗体としては、上記タンパク質及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、F(ab')2 , Fab' 及びFab といったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原またはエピトープ結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、または、例えばクワドローム、トリオームなどの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾または加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合またはハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成または半合成技術を使用して得られた抗体、DNA組換え技術を用いて調製される抗体、標的抗原物質または標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体または結合特性を有する抗体を包含してもよい。
なお、抗体としては、上記タンパク質及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、F(ab')2 , Fab' 及びFab といったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原またはエピトープ結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、または、例えばクワドローム、トリオームなどの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾または加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合またはハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成または半合成技術を使用して得られた抗体、DNA組換え技術を用いて調製される抗体、標的抗原物質または標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体または結合特性を有する抗体を包含してもよい。
好ましくは抗体は、天然型の上記タンパク質を特異的に識別できるものである。
ポリクローナル抗体として得るためには、免疫源である上記タンパク質またはそのフラグメント、配列の一部のペプチドを、哺乳動物、鳥類などに免疫し、その哺乳動物、鳥類などから抗血清を採取し、その抗血清に含まれるポリクローナル抗体を使用することができる。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスターなど、さらに、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、サルなどの霊長類、ニワトリなどの鳥類等が使用される。さらに、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい場合もある。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物などの腹腔内または皮下に注射することにより行われる。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、動物から採血した血液から調製することができる。
ポリクローナル抗体として得るためには、免疫源である上記タンパク質またはそのフラグメント、配列の一部のペプチドを、哺乳動物、鳥類などに免疫し、その哺乳動物、鳥類などから抗血清を採取し、その抗血清に含まれるポリクローナル抗体を使用することができる。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスターなど、さらに、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、サルなどの霊長類、ニワトリなどの鳥類等が使用される。さらに、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい場合もある。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物などの腹腔内または皮下に注射することにより行われる。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、動物から採血した血液から調製することができる。
モノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる公知の方法を用いて産生される。
個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なったエピトープに対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常のポリクローナル抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリン類の夾雑がないかまたは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来や免疫グロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、または軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、またはヘテロジーニアスなタンパク質と融合させたりして得ることができる。
モノクローナル抗体を製造する方法の例には、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 、トリオーマ法、EBV-ハイブリドーマ法などが挙げられる。
個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なったエピトープに対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常のポリクローナル抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリン類の夾雑がないかまたは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来や免疫グロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、または軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、またはヘテロジーニアスなタンパク質と融合させたりして得ることができる。
モノクローナル抗体を製造する方法の例には、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 、トリオーマ法、EBV-ハイブリドーマ法などが挙げられる。
モノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されるかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導されるかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるキメラ抗体（免疫グロブリン) を包含する。
また、哺乳動物由来のハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものを挙げることができる。
抗体を産生するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して作製できる。すなわち、上記タンパク質またはそのフラグメントを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
上記タンパク質またはそのフラグメントの調製方法及び哺乳動物に対する免疫方法等に関しては、上述したポリクローナル抗体を含む抗血清を調製する手法に準じて行うことができる。この場合、特に、哺乳動物に対して免疫した後、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
抗体を産生するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して作製できる。すなわち、上記タンパク質またはそのフラグメントを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
上記タンパク質またはそのフラグメントの調製方法及び哺乳動物に対する免疫方法等に関しては、上述したポリクローナル抗体を含む抗血清を調製する手法に準じて行うことができる。この場合、特に、哺乳動物に対して免疫した後、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、哺乳動物のミエローマ細胞を利用できる。免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合などは、基本的には公知の方法、例えば、ケラー及びミルステイン方法等に準じて行うことができる。
モノクローナル抗体は例えば、次のような工程で作製できる。(1) 免疫原性抗原の調製、(2) 免疫原性抗原による動物の免疫、(3) ミエローマ細胞の調製、(4) 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合、(5)ハイブリドーマの選択及びモノクローン化、(6) モノクローナル抗体の製造。
モノクローナル抗体は例えば、次のような工程で作製できる。(1) 免疫原性抗原の調製、(2) 免疫原性抗原による動物の免疫、(3) ミエローマ細胞の調製、(4) 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合、(5)ハイブリドーマの選択及びモノクローン化、(6) モノクローナル抗体の製造。
また、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例えば、その他の哺乳動物は、本発明による免疫原ポリペプチド産物に対する抗体を発現するのに用いることができる。
また、こうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。モノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばマウス抗体の重鎖や軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの公知の手法で単離し配列決定することができる。一旦単離されたDNAは、発現ベクターに入れ、CHO, COSなどの宿主細胞に入れることができる。DNA は、例えばホモジーニアスなマウスの配列に代えて、ネコの重鎖や軽鎖の定常領域ドメインをコードする配列に置換するなどして修飾することが可能である。所望の結合特異性を有するキメラ抗体やハイブリッド抗体も調製することが可能である。
また、抗体は、縮合剤を用いることを含めた化学的なタンパク合成技術を適用して、キメラ抗体やハイブリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。さらに、トリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるFab 、Fab'、F(ab')2といった抗体フラグメントにして使用してもよい。
また、こうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。モノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばマウス抗体の重鎖や軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの公知の手法で単離し配列決定することができる。一旦単離されたDNAは、発現ベクターに入れ、CHO, COSなどの宿主細胞に入れることができる。DNA は、例えばホモジーニアスなマウスの配列に代えて、ネコの重鎖や軽鎖の定常領域ドメインをコードする配列に置換するなどして修飾することが可能である。所望の結合特異性を有するキメラ抗体やハイブリッド抗体も調製することが可能である。
また、抗体は、縮合剤を用いることを含めた化学的なタンパク合成技術を適用して、キメラ抗体やハイブリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。さらに、トリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるFab 、Fab'、F(ab')2といった抗体フラグメントにして使用してもよい。
抗体は、公知の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、免疫沈降検定に使用することができる。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、公知の方法を使用することができ、標識物を付与する抗体としては、IgG 画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Fab'を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ-D- ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質または放射性同位元素などがある。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、公知の方法を使用することができ、標識物を付与する抗体としては、IgG 画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Fab'を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ-D- ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質または放射性同位元素などがある。
本発明での検知・測定は、免疫染色、例えば組織または細胞染色、免疫電子顕微鏡、免疫クロマトクグラフィー、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができる。好ましくは、放射免疫測定法(RIA), FIA, LIA, EIA, ELISA などを用いることができる。
例えばサンドイッチ型アッセイでは、一方を本発明の上記タンパク質ポリペプチドに対する抗体または上記タンパク質の関連ペプチド断片に対する抗体とし、他方を上記タンパク質のC末端側残基に対する抗体とし、一方を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、すなわちポリペプチド抗原の量と比例する。このアッセイは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワードサンドイッチ型アッセイまたは逆サンドイッチ型アッセイなどと分類される。
例えばサンドイッチ型アッセイでは、一方を本発明の上記タンパク質ポリペプチドに対する抗体または上記タンパク質の関連ペプチド断片に対する抗体とし、他方を上記タンパク質のC末端側残基に対する抗体とし、一方を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、すなわちポリペプチド抗原の量と比例する。このアッセイは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワードサンドイッチ型アッセイまたは逆サンドイッチ型アッセイなどと分類される。
本発明の測定法によれば、測定すべき物質を酵素などで標識した抗血清、精製抗体またはモノクローナル抗体などの標識抗体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させることも同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、標識した抗血清、精製抗体またはモノクローナル抗体などの標識抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後感作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより測定を行うことができる。
免疫学的測定法の際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製またはポリビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、微粒子または試験管などの種々の材料及び形態を任意に選択し、使用することができる。
免疫学的測定法の際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製またはポリビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、微粒子または試験管などの種々の材料及び形態を任意に選択し、使用することができる。
測定には、至適pH、例えばpH約４～約９に保つように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス－塩酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗原抗体反応は約０～約６０℃の間の温度で行うことが好ましい。酵素などで標識された抗血清、精製抗体、またはモノクローナル抗体などの抗体試薬及び担体に結合させられた抗体試薬、さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の平衡が達成されるよりも早い時点で固相と液相とを分離して限定されたインキュベーション処理の後に反応を止めることができ、液相または固相のいずれかにおける酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。
測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように処置することができる。
測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように処置することができる。
非特異的な反応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、または測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加えることもできる。非特異的結合反応を防ぐための公知のブロッキング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正常血清や血清タンパク質、アルブミン、ヘモグロビン、オボアルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができる。
試料や固相などの洗浄には、緩衝液系や食塩液から適宜適当な液を選択でき、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤の他、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤などを添加して使用できる。
試料や固相などの洗浄には、緩衝液系や食塩液から適宜適当な液を選択でき、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤の他、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤などを添加して使用できる。
キットの基本構成としては、例えば、湿潤状態で物質の移動を可能にする担体に、(a) 検体を適用する部位、(b) 標識抗体を含有した部位、(c) 抗原検出部位、(d) 反応終了判定部位を順次形成してあるものから成る。(i) 標識抗体を含有した部位には、湿潤状態において該担体上を抗原検出部位、反応終了判定部位へと順次移動し得る、上記タンパク質に対する標識した抗体を含有させ、(ii) 検出部位には、固相化したコーキシンに対する抗体を存在させるようにし、(iii) 反応終了判定部位には、標識抗体として使用した抗体に対する第二抗体 を固相化した部位を形成して、検体を適用する部位に検体を適用することにより、検体を担体において移動させ、標識抗体を溶出させ、抗原検出部位の固相化抗体及び反応終了判定部位の第二抗体部位を通過させることにより、検体中の上記タンパク質を検出する。
更に、上記タンパク質またはその構成ドメインをコードする核酸とハイブリダイゼーションする核酸を有効成分として具備させてもよい。
ハイブリダイゼーションする核酸としては、例えばプローブ及びプライマーなどが挙げられる。上記タンパク質遺伝子またはその産物とハイブリダイゼーションするプローブであれば、その目的に合致するかぎり制限なく利用できる。
ハイブリダイゼーションする核酸としては、例えばプローブ及びプライマーなどが挙げられる。上記タンパク質遺伝子またはその産物とハイブリダイゼーションするプローブであれば、その目的に合致するかぎり制限なく利用できる。
本発明者は既に、尿タンパク質の限外濾過による濃縮と尿中アルブミン等の多量タンパク質除去を組み合わせた前処理を行ったサンプルを蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動(2D-DIGE)及び質量分析機で分析すると、2000種前後のタンパク質を比較解析することが可能となる系を確立していた。
この解析系を用いて、現時点で早期腎症として診断可能な微量アルブミン尿を有する病期2期より早い段階の尿中タンパク質を多角的な視野から網羅的に解析することによって、微量アルブミン量より有用な糖尿病腎症の早期マーカーを探索した。
この解析系を用いて、現時点で早期腎症として診断可能な微量アルブミン尿を有する病期2期より早い段階の尿中タンパク質を多角的な視野から網羅的に解析することによって、微量アルブミン量より有用な糖尿病腎症の早期マーカーを探索した。
図１は、解析に用いた糖尿病腎症患者、2型糖尿病患者及び健常者対照群の臨床像を示す表である。
健常者(H)8名、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)16名、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)16名から随時尿を採取した。微量アルブミン尿の判定は尿アルブミン／クレアチニン比30～300mg/g Crを閾値として判定した。採取した尿を限外ろ過にて濃縮し、Albumin and IgG Removal Kit (GE) にてアルブミン、IgGを除去後のサンプルをCyDyeにてラベルし、尿タンパク質プロファイルを2D-DIGE法にて解析した。
健常者(H)8名、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)16名、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)16名から随時尿を採取した。微量アルブミン尿の判定は尿アルブミン／クレアチニン比30～300mg/g Crを閾値として判定した。採取した尿を限外ろ過にて濃縮し、Albumin and IgG Removal Kit (GE) にてアルブミン、IgGを除去後のサンプルをCyDyeにてラベルし、尿タンパク質プロファイルを2D-DIGE法にて解析した。
ゲルイメージの解析はDeCyderにより行い、各群間で有意に変化したスポットを切り出した。切り出したスポットからトリプシン消化後にペプチドを抽出しエレクトロスプレーイオン源を装備したLCQ-DECA XP Plus(Thermo Electron)にてLC-MS/MS解析を行った。得られたMS/MSスペクトルデータをMASCOTにてデータベース検索し、タンパク質を同定した。
2D-DIGE解析とは独立した患者群（H 14名、T2DM 13名、DN2 15名、糖尿病腎症病期3期(DN3)患者 16名）から採取した尿検体58サンプルを用い、2D-DIGE解析にて同定されたタンパク質を対象にMRM法にて定量解析を行った。
MRM transitionの設定は、2D-DIGE解析にて得られたMSデータに基づきMRM Pilotソフトウェアにて行った。標的ペプチド配列が設定MRM transitionにより同定されているかの確認はenhanced product ion (EPI)-MS/MSにより行った。EPI-MS/MSにて標的ペプチド配列が同定できない場合には合成ペプチドを用いたLC-MRMを行い、分析用試料とMRM取得ピーク、溶出時間が一致することを確認した。
MRM transitionの設定は、2D-DIGE解析にて得られたMSデータに基づきMRM Pilotソフトウェアにて行った。標的ペプチド配列が設定MRM transitionにより同定されているかの確認はenhanced product ion (EPI)-MS/MSにより行った。EPI-MS/MSにて標的ペプチド配列が同定できない場合には合成ペプチドを用いたLC-MRMを行い、分析用試料とMRM取得ピーク、溶出時間が一致することを確認した。
尿検体はAlbumin and IgG Removal Kitにてアルブミン、IgGを除去し、タンパク質変性、システイン残基の還元アルキル化後にトリプシンにて酵素消化した。酵素消化産物に内部標準ペプチドとして安定同位体元素標識ペプチド10 fmolを添加した。MRM解析は、nanoLCを接続した5500QTrap（ABSciex）システムにて行った。MRM測定により得られた各ペプチドのシグナル面積値を内部標準物質より得られたペプチドのシグナル面積値で補正し、相対タンパク質濃度を算出した。
各測定値は平均値±標準偏差で示した。多群間の有意差検定はKruskal-Wallis検定にて行い、p＜0.05を有意とした。重回帰分析、ロジスティック回帰分析、receiver-operating characteristic（ROC） 解析はIBM SPSS statistics 20ソフトウェアにて行った。
図２は、DN2群にてH群と比較して増加した尿タンパク質スポットを示す写真であり、図３は、DN2群にてH群と比較して減少した尿タンパク質スポットを示す写真である。
糖尿病腎症患者由来尿タンパクを解析するにあたり、尿の限外濾過にて濃縮後に高含有量タンパク質の除去を行う前処理を行った後に、2D-DIGE法にてディファレンシャル解析を行うとゲル当たり約2000種のタンパク質スポットを検出することが可能となった。この系を用いて、T2DM 16名、DN2 16名、H 8名からの尿検体から尿タンパクを精製し、2D-DIGE法にて解析した。
糖尿病腎症患者由来尿タンパクを解析するにあたり、尿の限外濾過にて濃縮後に高含有量タンパク質の除去を行う前処理を行った後に、2D-DIGE法にてディファレンシャル解析を行うとゲル当たり約2000種のタンパク質スポットを検出することが可能となった。この系を用いて、T2DM 16名、DN2 16名、H 8名からの尿検体から尿タンパクを精製し、2D-DIGE法にて解析した。
図４は、H群と比べてDN2群にて有意に増加した尿タンパク質を示す表であり、図５は、H群と比べてDN2群にて有意に減少した尿タンパク質を示す表であり、図６は、T2DM群と比べてDN2群にて有意に変動した尿タンパク質を示す表であり、図７は、H群と比べてT2DM群にて有意に変動した尿タンパク質を示す表である。
2D-DIGEの結果では、DN2群にてH群由来尿と比較して有意に変動するタンパク質スポットを増加227個、減少85個を認めた。DN2群由来尿とT2DM群由来尿の比較では、有意に増加するタンパク質スポットは93個、減少は30個であった。また、T2DM群由来尿とH群由来尿の比較では、有意に増加するタンパク質スポットは58個、減少は9個であった。
これらの有意に変動したタンパク質スポットをゲル内消化後にLC-MS/MSにて解析した結果、HとT2DM, HとDN2, T2DMとDN2の比較にて有意に発現上昇するタンパク質が24種、有意に発現減少するタンパク質が8種同定された。
2D-DIGEの結果では、DN2群にてH群由来尿と比較して有意に変動するタンパク質スポットを増加227個、減少85個を認めた。DN2群由来尿とT2DM群由来尿の比較では、有意に増加するタンパク質スポットは93個、減少は30個であった。また、T2DM群由来尿とH群由来尿の比較では、有意に増加するタンパク質スポットは58個、減少は9個であった。
これらの有意に変動したタンパク質スポットをゲル内消化後にLC-MS/MSにて解析した結果、HとT2DM, HとDN2, T2DMとDN2の比較にて有意に発現上昇するタンパク質が24種、有意に発現減少するタンパク質が8種同定された。
2D-DIGE解析にて発現変動を示すタンパク質を対象に独立した糖尿病腎症患者由来の尿検体を用いて発現変動の検証を行った。
図８は、検証に用いた糖尿病腎症患者、2型糖尿病患者及び健常者対照群の臨床像を示す表である。
健常者(H)14名、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)13名、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)15名、3，4期患者(DN3/4) 16名から随時尿を採取した。2型糖尿病患者は糖尿病罹病期間10年以上で糖尿病性網膜症(DR)を合併しておらず正常蛋白尿の患者とした。糖尿病腎症2期患者は2型糖尿病で罹病歴10年以上、またはDRを合併している患者のうち微量アルブミン尿を呈する患者、糖尿病腎症3, 4期患者は2型糖尿病で罹病歴10年以上、またはDRを合併している患者のうち顕性アルブミン尿、またはeGFR 60未満を呈する患者とした。
図８は、検証に用いた糖尿病腎症患者、2型糖尿病患者及び健常者対照群の臨床像を示す表である。
健常者(H)14名、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)13名、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)15名、3，4期患者(DN3/4) 16名から随時尿を採取した。2型糖尿病患者は糖尿病罹病期間10年以上で糖尿病性網膜症(DR)を合併しておらず正常蛋白尿の患者とした。糖尿病腎症2期患者は2型糖尿病で罹病歴10年以上、またはDRを合併している患者のうち微量アルブミン尿を呈する患者、糖尿病腎症3, 4期患者は2型糖尿病で罹病歴10年以上、またはDRを合併している患者のうち顕性アルブミン尿、またはeGFR 60未満を呈する患者とした。
2D-DIGE解析では36タンパク質の有意な発現変動が糖尿病腎症患者群、あるいは2型糖尿病患者群と健常者群間で認められたが、2D-DIGE解析にて得られたMSデータに基づきMRM transitionを選抜した結果、36タンパク質中30タンパク質(発現上昇タンパク質:23, 発現減少タンパク質:7)がMRM定量解析可能であった。
図９は、その解析により同定されたタンパク質を対象とし、図８に挙げた患者尿検体を用いて測定したMRM定量解析結果を示す表である。H 17名、T2DM 13名、DN2 15名の尿検体を用いて相対定量解析を行った結果、25タンパク質がH, T2DM, DN2群間で有意な発現変動を示した。
このうち2D-DIGE解析と同様の発現変動が検証されたタンパク質は20種(発現上昇タンパク質:14, 発現減少タンパク質:6)であった。発現上昇タンパク質は、afamin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin-III、ceruloplasmin、complement C4、glutamyl aminopeptidase、haptoglobin、leucine-rich alpha-2-glycoprotein、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、plasma alpha-L-fucosidase、serotransferrin、throxine-binding globulin、zinc-alpha-2-glycoproteinであり、発現減少タンパク質は、calbindin、deoxyribonuclease-1、kininogen-1、lysosomal alpha-glucosidase、pancreatic alpha-amylase、polymeric immunoglobulin receptorであった。
図９は、その解析により同定されたタンパク質を対象とし、図８に挙げた患者尿検体を用いて測定したMRM定量解析結果を示す表である。H 17名、T2DM 13名、DN2 15名の尿検体を用いて相対定量解析を行った結果、25タンパク質がH, T2DM, DN2群間で有意な発現変動を示した。
このうち2D-DIGE解析と同様の発現変動が検証されたタンパク質は20種(発現上昇タンパク質:14, 発現減少タンパク質:6)であった。発現上昇タンパク質は、afamin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin-III、ceruloplasmin、complement C4、glutamyl aminopeptidase、haptoglobin、leucine-rich alpha-2-glycoprotein、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、plasma alpha-L-fucosidase、serotransferrin、throxine-binding globulin、zinc-alpha-2-glycoproteinであり、発現減少タンパク質は、calbindin、deoxyribonuclease-1、kininogen-1、lysosomal alpha-glucosidase、pancreatic alpha-amylase、polymeric immunoglobulin receptorであった。
糖尿病腎症の早期尿中関連因子を絞り込む目的で、DN3患者16名における30タンパク質の尿中タンパク質濃度を追加測定し先のデータと併せて重回帰分析を行った。
その結果、尿中アルブミン・クレアチニン比にafamin (β:0.443, p＜0.001)、antithrombin III（β:0.286, p＜0.001)、ceruloplasmin (β:0.224, p＝0.002)の3タンパク質が関連することが示された。
その結果、尿中アルブミン・クレアチニン比にafamin (β:0.443, p＜0.001)、antithrombin III（β:0.286, p＜0.001)、ceruloplasmin (β:0.224, p＝0.002)の3タンパク質が関連することが示された。
これら3タンパク質に、性別、糖尿病罹病期間、BMI、収縮期血圧、トリグリセリド、空腹時血糖、HbA1c、eGFRを説明変数とした多重ロジスティック回帰分析を行った。
その結果、早期腎症以降への進展に及ぼす因子としてeGFR (オッズ比:0.968; 95% CI:0.941-0.995; p＝0.019)、afamin (オッズ比:2.808, 95% CI:1.223-6.447, p＝0.015)が選択された。
早期腎症以降への進展を基準評価としたROC解析では、afamin, antithrombin III, ceruloplasminのROC曲線下面積(AUC)はそれぞれ0.940, 0.836, 0.903であり、いずれのタンパク質もeGFR (AUC:0.745)に比べて高い診断能を示した。
その結果、早期腎症以降への進展に及ぼす因子としてeGFR (オッズ比:0.968; 95% CI:0.941-0.995; p＝0.019)、afamin (オッズ比:2.808, 95% CI:1.223-6.447, p＝0.015)が選択された。
早期腎症以降への進展を基準評価としたROC解析では、afamin, antithrombin III, ceruloplasminのROC曲線下面積(AUC)はそれぞれ0.940, 0.836, 0.903であり、いずれのタンパク質もeGFR (AUC:0.745)に比べて高い診断能を示した。
図１０は、DN2及びDN3患者群とH及びT2DM群との間における３タンパク質のカットオフ値に対する感度、特異度、ROC曲線下面積を示す表である。
afamin, antithrombin III, ceruloplasminのそれぞれのカットオフ値に対する感度、特異度は、eGFRのカットオフ値を76.8とした場合の感度、特異度に比べていずれも高値を示した。
そのため、尿中アルブミン・クレアチニン比に関連するこの３タンパク質は、早期腎症以降への進展をeGFRよりも高い精度で判別したので、糖尿病腎症の発症及び進展をより早期に検出する診断及び予測マーカーとして使用可能である。
afamin, antithrombin III, ceruloplasminのそれぞれのカットオフ値に対する感度、特異度は、eGFRのカットオフ値を76.8とした場合の感度、特異度に比べていずれも高値を示した。
そのため、尿中アルブミン・クレアチニン比に関連するこの３タンパク質は、早期腎症以降への進展をeGFRよりも高い精度で判別したので、糖尿病腎症の発症及び進展をより早期に検出する診断及び予測マーカーとして使用可能である。
図１１は、図９で示すMRM解析で得られた各尿中タンパク質濃度を、健常者(H)、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)、3，4期患者(DN3/4)の群別に示したグラフである。なお、各尿中タンパク質濃度は対数表示である。
Serotransferrin、zinc-alpha-2-glycoproteinの2タンパク質は、健常者群に比べて2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇し、calbindin、pancreatic alpha-amylase の2タンパク質は、健常者群に比べて2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が減少していた。さらに、2型糖尿病群よりも糖尿病腎症2期群で、糖尿病腎症2期群よりも糖尿病腎症3/4期群で尿中濃度の上昇または減少がみられ、糖尿病腎症の進行に伴う段階的な濃度変化がみられた。特にpancreatic alpha-amylaseの尿中濃度が糖尿病腎症の進行度に応じて変動することは、これまでに報告されていない。従って、これら4タンパク質濃度の検知により、罹病期間の短い2型糖尿病患者であっても糖尿病腎症の発症リスクを早期に見出すことが可能である。
Serotransferrin、zinc-alpha-2-glycoproteinの2タンパク質は、健常者群に比べて2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇し、calbindin、pancreatic alpha-amylase の2タンパク質は、健常者群に比べて2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が減少していた。さらに、2型糖尿病群よりも糖尿病腎症2期群で、糖尿病腎症2期群よりも糖尿病腎症3/4期群で尿中濃度の上昇または減少がみられ、糖尿病腎症の進行に伴う段階的な濃度変化がみられた。特にpancreatic alpha-amylaseの尿中濃度が糖尿病腎症の進行度に応じて変動することは、これまでに報告されていない。従って、これら4タンパク質濃度の検知により、罹病期間の短い2型糖尿病患者であっても糖尿病腎症の発症リスクを早期に見出すことが可能である。
図１２は、同様に、MRM解析で得られた各尿中タンパク質濃度を、健常者(H)、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)、3，4期患者(DN3/4)の群別に示したグラフである。
Afamin、Alpha-1-antitrypsin、Alpha-1B-glycoprotein、Ceruloplasmin、Haptoglobin、Leucine-rich alpha-2-glycoproteinの6タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群に比べて、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇していた。最近、尿中afamin濃度、ならびにleucine-rich alpha-2-glycoprotein濃度がIgA腎症患者にて上昇することが報告されたものの、糖尿病腎症の進行度と関連することはこれまでに報告されていない。なお、尿中leucine-rich alpha-2-glycoproteinについては卵巣癌（非特許文献７）や膀胱癌（非特許文献８）との関連も報告されている。
Afamin、Alpha-1-antitrypsin、Alpha-1B-glycoprotein、Ceruloplasmin、Haptoglobin、Leucine-rich alpha-2-glycoproteinの6タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群に比べて、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇していた。最近、尿中afamin濃度、ならびにleucine-rich alpha-2-glycoprotein濃度がIgA腎症患者にて上昇することが報告されたものの、糖尿病腎症の進行度と関連することはこれまでに報告されていない。なお、尿中leucine-rich alpha-2-glycoproteinについては卵巣癌（非特許文献７）や膀胱癌（非特許文献８）との関連も報告されている。
図１３は、同様に、MRM解析で得られた各尿中タンパク質濃度を、健常者(H)、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)、3，4期患者(DN3/4)の群別に示したグラフである。
Deoxyribonuclease-1、Kininogen-1、Lysosomal alpha-glucosidase、Polymeric immunoglobulin receptorの4タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群に比べて、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が減少していた。尿中Deoxyribonuclease-1と糖尿病腎症との関連はこれまでに報告されていないが、Deoxyribonuclease-1ノックアウトマウスの解析ではループス腎炎を呈することが報告されており、尿中Deoxyribonuclease-1濃度が糖尿病腎症をはじめとする慢性腎臓病と関連することが推測される（非特許文献９）。また、尿中Kininogen-1、Lysosomal alpha-glucosidase、Polymeric immunoglobulin receptorと糖尿病腎症との関連もこれまでに報告されていない。なお、尿中Polymeric immunoglobulin receptorについては膀胱癌（非特許文献１０）との関連も報告されている。
Deoxyribonuclease-1、Kininogen-1、Lysosomal alpha-glucosidase、Polymeric immunoglobulin receptorの4タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群に比べて、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が減少していた。尿中Deoxyribonuclease-1と糖尿病腎症との関連はこれまでに報告されていないが、Deoxyribonuclease-1ノックアウトマウスの解析ではループス腎炎を呈することが報告されており、尿中Deoxyribonuclease-1濃度が糖尿病腎症をはじめとする慢性腎臓病と関連することが推測される（非特許文献９）。また、尿中Kininogen-1、Lysosomal alpha-glucosidase、Polymeric immunoglobulin receptorと糖尿病腎症との関連もこれまでに報告されていない。なお、尿中Polymeric immunoglobulin receptorについては膀胱癌（非特許文献１０）との関連も報告されている。
図１４は、同様に、MRM解析で得られた各尿中タンパク質濃度を、健常者(H)、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)、3，4期患者(DN3/4)の群別に示したグラフである。
Antithrombin-III、Complement C4 beta chain、Hemopexinの3タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群に比べて、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇していた。Complement C4 beta chainに関してはComplement C4 beta chain多型と糸球体腎炎との関連が報告されているが（非特許文献１１）、尿中濃度と糖尿病腎症との関連はこれまでに報告されていない。
Antithrombin-III、Complement C4 beta chain、Hemopexinの3タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群に比べて、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇していた。Complement C4 beta chainに関してはComplement C4 beta chain多型と糸球体腎炎との関連が報告されているが（非特許文献１１）、尿中濃度と糖尿病腎症との関連はこれまでに報告されていない。
図１５は、糖尿病腎症モデルマウスであるiNOSトランスジェニックマウスより腎皮質部を摘出しRNA調製し、図１１～１４にて発現変動したタンパク質の遺伝子産物を対象に発現解析を行った結果を示すグラフである。
iNOSトランスジェニックマウスは、膵β細胞特異的にiNOSを過剰発現するマウスであり、出生直後より著しい高血糖を示す。
15週齢時の体重、随時血糖値、尿中アルブミン・クレアチニン比(ACR)を図１５の上段に示す。対照ICRマウス群に比べてiNOSトランスジェニックマウス群にて有意な血糖値の上昇と、尿中アルブミン量の増加が認められた。
iNOSトランスジェニックマウスは、膵β細胞特異的にiNOSを過剰発現するマウスであり、出生直後より著しい高血糖を示す。
15週齢時の体重、随時血糖値、尿中アルブミン・クレアチニン比(ACR)を図１５の上段に示す。対照ICRマウス群に比べてiNOSトランスジェニックマウス群にて有意な血糖値の上昇と、尿中アルブミン量の増加が認められた。
iNOSトランスジェニックマウス腎PAS標本及びPAM標本にて行った組織学的な解析にて、軽度の糸球体硬化病変が認められた。16週齢にてiNOSトランスジェニックマウス、対照ICRマウスより腎皮質部を摘出し(n=6/各群)、real-time RT-PCR法により図１１～１４で示した17遺伝子の発現解析を行った。図１５の下段に示すpolymeric immunoglobulin receptor、complement C4 beta chain の2遺伝子の発現変動が、糖尿病腎症患者尿の発現変動に一致した。これらの2遺伝子の腎臓における発現変動は、糖尿病腎症患者の尿中濃度変動に起因している可能性があるため、糖尿病腎症発症の診断マーカーや治療標的として使用可能である。
本発明者は、非標識定量法を用いた定量プロテオミクスにより尿中関連タンパク質の同定を行った。
非標識定量法を用いた定量プロテオミクスは、測定したペプチドサンプルのLC-MSデータをretention time, m/z, シグナル強度の3次元に集約し比較解析する方法であり、多検体の比較解析に有用な方法である。この方法では、比較サンプル群間で有意な変動を示すペプチドピークを拾い出し、拾い出したペプチドピークに標的を絞ってペプチド同定、ならびにタンパク質同定を行うため、網羅的なショットガンプロテオミクス法では同定されにくいタンパク質を優先的に同定することが可能となる。
非標識定量法を用いた定量プロテオミクスは、測定したペプチドサンプルのLC-MSデータをretention time, m/z, シグナル強度の3次元に集約し比較解析する方法であり、多検体の比較解析に有用な方法である。この方法では、比較サンプル群間で有意な変動を示すペプチドピークを拾い出し、拾い出したペプチドピークに標的を絞ってペプチド同定、ならびにタンパク質同定を行うため、網羅的なショットガンプロテオミクス法では同定されにくいタンパク質を優先的に同定することが可能となる。
2型糖尿病患者、顕性タンパク尿を呈する糖尿病腎症患者から採取した尿検体を用いて非標識定量プロテオミクス解析を行い、両群間で発現変動を示すタンパク質群を同定した。独立した集団にて発現変動が検証されたタンパク質を対象に尿中アルブミン・クレアチニン比と関連するタンパク質を解析した結果、これまでに2型糖尿病や糖尿病腎症との関連が報告されていないタンパク質12種を含む16タンパク質の同定に成功した。
図１６は、解析に用いた2型糖尿病患者及び健常者対照群の臨床像を示す表である。
微量アルブミン尿を呈していない2型糖尿病患者(T2DM, 男性4名、女性2名)、腎症病期3期の糖尿病腎症患者(DN3, 男性4名、女性2名)から採取した随時尿を探索用検体とした。検証用検体として、T2DM群（男性9名、女性10名）、DN3群（男性10名、女性6名）に加え、腎症病期2期の糖尿病腎症患者（DN2, 男性10名、女性9名）から採取した随時尿を解析対象とした。また、検証用検体における健常者対照群（H）として男性15名、女性9名より随時尿を採取した。
微量アルブミン尿を呈していない2型糖尿病患者(T2DM, 男性4名、女性2名)、腎症病期3期の糖尿病腎症患者(DN3, 男性4名、女性2名)から採取した随時尿を探索用検体とした。検証用検体として、T2DM群（男性9名、女性10名）、DN3群（男性10名、女性6名）に加え、腎症病期2期の糖尿病腎症患者（DN2, 男性10名、女性9名）から採取した随時尿を解析対象とした。また、検証用検体における健常者対照群（H）として男性15名、女性9名より随時尿を採取した。
患者より採取した随時尿検体は、3000×g、10分、4℃で遠心分離を行い、不純物を取り除いたのち速やかに凍結し解析に用いるまで-80℃にて保管した。各群の検体は、3 kDa cut offのAmicon Ultrafreeの限外ろ過で脱塩と濃縮を行った後にAlbmin & IgG Drpletion SpinTrap (GE Healthcare) にて尿中多量タンパク質を除去した。再び、3 kDa cut offのAmicon Ultrafreeの限外ろ過で脱塩と濃縮を行い乾固した後に12 mM sodium deoxycholate (SDC)/12 mM sodium N-lauroylarcosinate (SLS) にて溶解し、95 ℃ 5分の変性、ならびに37℃にてLys-C、トリプシンによる酵素消化を行った。さらにDTTを加え37℃、1時間、ヨードアセトアミドで暗室1時間反応させ還元アルキル化を行った。界面活性剤の除去はPhase Transfer Surfactant 法（非特許文献６）にて行い、Mono Spin C18 (GE Healthcare) にて精製後、得られたペプチドをLC-MS解析用サンプルとした。
断片化された尿ペプチドサンプルの測定は、QSTAR Elite system（Applied Biosystems）にPAL/Paradigm LC system（ARM）を接続した装置を用いた。カラムは0.3 × 5 mm L-trap column と0.1 × 150 mm L-column （財団法人化学物質評価研究機構）を用いて、流速300 nL/min 、A溶媒 （2% ACN and 0.1%FA）、B溶媒（90% ACN and 0.1%FA）で175 min間（グラジエント5－30% B, 20 min);30－95% B, 1 min; 95% B, 3 min; 95－5% B, 1 min; 5% B, 10 min）測定を行った。
質量分析器のピーク検出と正規化、定量化は2DICALソフトウェア（三井情報株式会社）を用いた。検出されたペプチドピークのうち、保持時間（RT）10-100min、ピーク最大強度30以上でDN3-T2DM群間のピーク強度に有意差のある(P値0.05未満)ピークを選出した。選出されたペプチドピークがT2DM群とDN3群で強度比に差のあるピークであることは目視でも確認しLC-MS/MS測定を行った。
質量分析器のピーク検出と正規化、定量化は2DICALソフトウェア（三井情報株式会社）を用いた。検出されたペプチドピークのうち、保持時間（RT）10-100min、ピーク最大強度30以上でDN3-T2DM群間のピーク強度に有意差のある(P値0.05未満)ピークを選出した。選出されたペプチドピークがT2DM群とDN3群で強度比に差のあるピークであることは目視でも確認しLC-MS/MS測定を行った。
タンパク質の同定に当たっては、2DICALのピーク情報をもとにm/zとRTをinclude listに設定しLC-MS/SM測定を行った。得られたターゲットピーク情報からSwissProtデータベースとMascotソフトウェア（Matrix science）を用いてタンパク質同定を行い、2DICAL上のピークに対応させた。Mascotソフトウェアの検索パラメーターには、MS の許容誤差0.1Da、MS/MSの許容誤差0.1Da、固定修飾carbamidomethyl (C)、可変修飾acetyl (N-term)、deamidated (NQ)、oxidation (M)、価数2+, 3+, 4+を用いた。T2DM群とDN3群の発現差異を認めるピークの選定には、（１）DN3群のピーク定量値がT2DM群のピーク定量値に対して3倍以上または3分の1以下、（２）RATIO P値＜0.05、（３）DN3-T2DM群間でのピーク強度差が有意である(Mann-Whitney U検定によるP値＜0.05)、（４）Mascot Score≧20の指標を用いた。
H群、T2DM群、DN2群、DN3群から構成される尿検体78サンプルを用いて、非標識定量解析にて同定された発現変動タンパク質群の検証を行った。
バイオマーカー候補タンパク質群の相対タンパク質濃度はMRM法により算出した。MRM transitionには、Mascotデータからペプチドの親イオンのm/zをQ1とし、フラグメントイオンのm/zをQ3とし設定した。また、Enhanced Product Ion（EPI）-MS/MSにてタンパク質の同定を行い、設定したMRM transitionにより標的ペプチド配列が同定されることを確認した。
バイオマーカー候補タンパク質群の相対タンパク質濃度はMRM法により算出した。MRM transitionには、Mascotデータからペプチドの親イオンのm/zをQ1とし、フラグメントイオンのm/zをQ3とし設定した。また、Enhanced Product Ion（EPI）-MS/MSにてタンパク質の同定を行い、設定したMRM transitionにより標的ペプチド配列が同定されることを確認した。
なお、EPI-MS/MSにて同定できないペプチド配列に関しては、合成ペプチドを用い分析用試料と同時測定してMRM取得ピーク、溶出時間が一致することを確認した。尿検体の酵素消化産物に内部標準ペプチドとして安定同位体元素標識ペプチド30fmolを加え、分析用試料としてMRM測定を行った。MRM定量解析は、4000QTrap（ABSciex）にLC800 HPLC system （ジーエルサイエンス）を接続したシステムを用いて行った。カラムはACQUITY UPLC BET C18 カラム（Waters）を用いて流速100nl/min, 0%-30% Bで90分直線濃度勾配にて溶出した。Multiquant Software 2.0（AB Sciex）にてMRM測定により得られた各ペプチドのシグナル面積値を内部標準物質より得られたペプチドのシグナル面積値で補正し、相対タンパク質濃度を算出した。
各測定値は平均値±標準偏差で示した。2群間の有意差検定はMann－Whitney U testにて、多群間の有意差についてはKruskal-Wallis検定にて行い、p＜0.05を有意とした。重回帰分析、receiver-operating characteristic（ROC） 解析はIBM SPSS statistics 20ソフトウェアにて行った。
図１７は、ペプチドピークの2次元ゲル画像であり、図１８は、図１７の２次元ゲル画像におけるID=512, 424のペプチドピークについて、T2DM群とDN3群でのシグナル強度を示すグラフである。
T2DM群及びDN3群の各6名ずつの検体から尿中タンパク質を精製しプロテアーゼ消化を行った。2DICALを用いた解析により合計3,334ピークが得られ、そのうち保持時間（RT）10-100min、ピークの最大強度30以上、RATIO P値0.05未満のピークは234であった。その全てのペプチドピークの2次元ゲル画像が図１７である。m/zをX軸、RTをY軸とし、最大強度30以上あった234ピークを赤色で強調した。選出された234ピークのなかで、DN1群とDN3群間で有意な強度差のある107ピークを、図１８に示すように目視により確認した。
T2DM群及びDN3群の各6名ずつの検体から尿中タンパク質を精製しプロテアーゼ消化を行った。2DICALを用いた解析により合計3,334ピークが得られ、そのうち保持時間（RT）10-100min、ピークの最大強度30以上、RATIO P値0.05未満のピークは234であった。その全てのペプチドピークの2次元ゲル画像が図１７である。m/zをX軸、RTをY軸とし、最大強度30以上あった234ピークを赤色で強調した。選出された234ピークのなかで、DN1群とDN3群間で有意な強度差のある107ピークを、図１８に示すように目視により確認した。
図１９は、T2DM群に比べてDN3群にて有意な発現変動を示した尿ペプチド・タンパク質の表である。
DN3-T2DM群間で有意差を示す107ピークのLC-MS/MS測定により、T2DM群に対してDN3群で3倍以上、または3分の1以下の有意な発現変動を示すタンパク質が29種類(48ペプチド)同定された。
DN3-T2DM群間で有意差を示す107ピークのLC-MS/MS測定により、T2DM群に対してDN3群で3倍以上、または3分の1以下の有意な発現変動を示すタンパク質が29種類(48ペプチド)同定された。
図２０は、検証用検体の臨床情報を示す表である。
図２１は、2DICAL解析により同定されたタンパク質の検証用検体群における尿中濃度の解析結果を示す表である。
2DICALにて選出された33種類のタンパク質のなかで、メチオニンの酸化もしくは、miss cleavageの存在が推定された10種類のタンパク質を除く23種類のタンパク質(発現上昇タンパク質：19、発現減少タンパク質：4)について、一斉分析が可能な定量解析法であるMRM法を用いて尿中相対タンパク質濃度を測定した。
図２１は、2DICAL解析により同定されたタンパク質の検証用検体群における尿中濃度の解析結果を示す表である。
2DICALにて選出された33種類のタンパク質のなかで、メチオニンの酸化もしくは、miss cleavageの存在が推定された10種類のタンパク質を除く23種類のタンパク質(発現上昇タンパク質：19、発現減少タンパク質：4)について、一斉分析が可能な定量解析法であるMRM法を用いて尿中相対タンパク質濃度を測定した。
MRM法のtransition設定は以下に従って行った。すなわち、Mascotデータからペプチドの親イオンのm/zをQ1とし、フラグメントイオンのm/zをQ3の値とした111組のtransitionで測定した。EPI-MS/MS測定により、12種類の標的ペプチド配列が同定され、残り13種類のタンパク質については合成ペプチドを用いてMRM transitionの確認を行った。25種類のタンパク質を標的とするMRM transitionを用いて、T2DM群19名、DN3群15名の検体の尿中相対タンパク質濃度を測定した。
その結果、25種類のタンパク質中19種類のタンパク質が、T2DM群、DN3群間で有意な発現変動を示した。このうち非標識定量解析と同様の発現変動が検証されたタンパク質は16種類(発現上昇タンパク質：13、発現減少タンパク質：3)であった（図２１）。
発現上昇タンパク質は、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、Dynein heavy chain 12,axonemal、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrinであり、発現減少タンパク質は、CD44、SUN domain-containing protein 1、WAP four-disulfide core domain protein 2であった。
その結果、25種類のタンパク質中19種類のタンパク質が、T2DM群、DN3群間で有意な発現変動を示した。このうち非標識定量解析と同様の発現変動が検証されたタンパク質は16種類(発現上昇タンパク質：13、発現減少タンパク質：3)であった（図２１）。
発現上昇タンパク質は、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、Dynein heavy chain 12,axonemal、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrinであり、発現減少タンパク質は、CD44、SUN domain-containing protein 1、WAP four-disulfide core domain protein 2であった。
図２２は、尿中アルブミン・クレアチニン比と有意な関連を示すタンパク質の表である。
糖尿病腎症の早期尿中関連因子を絞り込む目的で、H群24名、DN2群20名における25タンパク質の尿中相対タンパク質濃度を追加測定し、尿中アルブミン・クレアチニン比との関連をステップワイズ多重回帰法にて解析した。
その結果、尿中アルブミン・クレアチニン比は、afamin (β:0.33, p＝1.8×10-7)、CD44 antigen（β:-0.17, p＝1.5×10-3)、alpha-1-antitrypsin (β:0.21, p＝7.5×10-5)、epiplakin (β:0.21, p＝4.9×10-6)、Ig alpha-1 chain C region（β:0.15, p＝1.5×10-3)、WAP four-disulfide core domain protein 2 (β:-0.15, p＝6.4×10-3)、alpha-1-acid glycoprotein 1 (β:0.12, p＝0.027)の7タンパク質と有意に関連することが示された。
糖尿病腎症の早期尿中関連因子を絞り込む目的で、H群24名、DN2群20名における25タンパク質の尿中相対タンパク質濃度を追加測定し、尿中アルブミン・クレアチニン比との関連をステップワイズ多重回帰法にて解析した。
その結果、尿中アルブミン・クレアチニン比は、afamin (β:0.33, p＝1.8×10-7)、CD44 antigen（β:-0.17, p＝1.5×10-3)、alpha-1-antitrypsin (β:0.21, p＝7.5×10-5)、epiplakin (β:0.21, p＝4.9×10-6)、Ig alpha-1 chain C region（β:0.15, p＝1.5×10-3)、WAP four-disulfide core domain protein 2 (β:-0.15, p＝6.4×10-3)、alpha-1-acid glycoprotein 1 (β:0.12, p＝0.027)の7タンパク質と有意に関連することが示された。
図２３は、早期腎症以降への進展を基準評価としたROC解析の結果を示す。
epiplakinを除くafamin (AUC:93.5%)、CD44 antigen（AUC:90.7%)、alpha-1-antitrypsin (AUC:81.4%)、Ig alpha-1 chain C region（AUC:75.2%)、WAP four-disulfide core domain protein 2 (AUC:77.3%)、alpha-1-acid glycoprotein 1 (AUC:87.6%)の6タンパク質が良好な診断能を示した。なお、腎機能評価に用いられるeGFRのROC曲線下面積は64.9％であり、本発明での検証集団における判定能はeGFRよりも上記6タンパク質の方が優れていた。
epiplakinを除くafamin (AUC:93.5%)、CD44 antigen（AUC:90.7%)、alpha-1-antitrypsin (AUC:81.4%)、Ig alpha-1 chain C region（AUC:75.2%)、WAP four-disulfide core domain protein 2 (AUC:77.3%)、alpha-1-acid glycoprotein 1 (AUC:87.6%)の6タンパク質が良好な診断能を示した。なお、腎機能評価に用いられるeGFRのROC曲線下面積は64.9％であり、本発明での検証集団における判定能はeGFRよりも上記6タンパク質の方が優れていた。
さらに上記6タンパク質に加えて性別、糖尿病罹病期間、BMI、収縮期血圧、トリグリセリド、空腹時血糖、HbA1c、eGFRを説明変数とした多重ロジスティック回帰分析を行った。その結果、早期腎症以降への進展に及ぼす因子として、afamin (オッズ比:1.71; 95% CI:1.16-2.52; p＝0.007)と、CD44 (オッズ比:0.98, 95% CI:0.96-0.99, p＝0.004)が選択された。
なお、afaminは、糖尿病及び糖尿病性血管合併症に関する血清・尿プロテオーム解析にてその発現が上昇することが報告されているものの、その機能や意義についての報告はなかった。CD44は、ヒアルロン酸をはじめとする細胞外マトリックスと結合する接着分子であり、(1) リンパ球ホーミング、(2) リンパ球活性化、(3) 細胞-細胞間接着及び細胞-基質間接着、(4) 細胞運動、(5) 癌細胞増殖・転移などに深く関与していることが報告されている。CD44の機能は発現量だけでなく、alternative splicing variant isoformsの発現、糖鎖付加やリン酸化等の翻訳後修飾によっても制御される。CD44は癌幹細胞マーカーとしての役割ばかりでなく、糖尿病腎症モデルであるOVE26マウス腎尿細管、ラット虚血腎モデルでの浸潤炎症細胞、腎移植後の急性拒絶反応時の尿においても発現上昇するとの報告がある。
図２４は、図１５及び２３の表中５タンパク質を対象に、糖尿病腎症患者尿を用いてウェスタンブロットした結果を示す写真である。
前記実施例１及び２において認められた発現上昇タンパク質及び発現減少タンパク質と同様の結果が検証された。なお、CD44, ceruloplasminについては、アミノ酸配列から予想される分子量よりも低分子量のバンドが検出され、細胞外ドメインが切断されたshedding formである可能性がある。これらのshedding formの発現変動が、2型糖尿病や糖尿病腎症の発症・進展と関連するとの報告はこれまでにない。
前記実施例１及び２において認められた発現上昇タンパク質及び発現減少タンパク質と同様の結果が検証された。なお、CD44, ceruloplasminについては、アミノ酸配列から予想される分子量よりも低分子量のバンドが検出され、細胞外ドメインが切断されたshedding formである可能性がある。これらのshedding formの発現変動が、2型糖尿病や糖尿病腎症の発症・進展と関連するとの報告はこれまでにない。
図２５は、MRM解析で得られた各尿中タンパク質濃度を、健常者(H)、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)、3，4期患者(DN3/4)の群別に示したグラフである。なお、各尿中タンパク質濃度は対数表示である。
Serotransferrin、afaminの2タンパク質は、健常者群に比べて2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇していた。さらに、2型糖尿病群よりも糖尿病腎症2期群で、糖尿病腎症2期群よりも糖尿病腎症3/4期群で尿中濃度の上昇がみられ、糖尿病腎症の進行に伴う段階的な濃度変化がみられた。これら2タンパク質の発現変動は上記実施例１と同様の傾向だった。従って、これら2タンパク質濃度の検知により、罹病期間の短い2型糖尿病患者であっても糖尿病腎症の発症リスクを早期に見出すことが可能である。
Serotransferrin、afaminの2タンパク質は、健常者群に比べて2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇していた。さらに、2型糖尿病群よりも糖尿病腎症2期群で、糖尿病腎症2期群よりも糖尿病腎症3/4期群で尿中濃度の上昇がみられ、糖尿病腎症の進行に伴う段階的な濃度変化がみられた。これら2タンパク質の発現変動は上記実施例１と同様の傾向だった。従って、これら2タンパク質濃度の検知により、罹病期間の短い2型糖尿病患者であっても糖尿病腎症の発症リスクを早期に見出すことが可能である。
図２６は、同様に、MRM解析で得られた各尿中タンパク質濃度を、健常者(H)、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)、3，4期患者(DN3/4)の群別に示したグラフである。
Alpha-1-antitrypsin、Alpha-1-acid glycoprotein 1、Alpha-1B-glycoprotein、 NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、Probable E3 ubiquitinprotein ligase TRIP12、Poly [ADP-ribose]polymerase 14、Obscurin、Dynein heavy chain 12,axonemalの8タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群に比べて、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇していた。 NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrialはAlport症候群の原因遺伝子として報告されているが（非特許文献１２）、尿中NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrialと糖尿病腎症との関連はこれまでに報告されていない。また、Probable E3 ubiquitinprotein ligase TRIP12、Poly [ADP-ribose]polymerase 14、Obscurin、Dynein heavy chain 12,axonemalと糖尿病腎症との関連もこれまでに報告されていない。
Alpha-1-antitrypsin、Alpha-1-acid glycoprotein 1、Alpha-1B-glycoprotein、 NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、Probable E3 ubiquitinprotein ligase TRIP12、Poly [ADP-ribose]polymerase 14、Obscurin、Dynein heavy chain 12,axonemalの8タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群に比べて、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇していた。 NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrialはAlport症候群の原因遺伝子として報告されているが（非特許文献１２）、尿中NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrialと糖尿病腎症との関連はこれまでに報告されていない。また、Probable E3 ubiquitinprotein ligase TRIP12、Poly [ADP-ribose]polymerase 14、Obscurin、Dynein heavy chain 12,axonemalと糖尿病腎症との関連もこれまでに報告されていない。
図２７は、同様に、MRM解析で得られた各尿中タンパク質濃度を、健常者(H)、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)、3，4期患者(DN3/4)の群別に示したグラフである。
CD44、WAP four-disulfide core domain protein 2の2タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群に比べて、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が減少していた。これまでに尿中WAP four-disulfide core domain protein 2が卵巣癌と関連するとの報告がみられるが（非特許文献１３～１４）、糖尿病腎症との関連についてはこれまでに報告されていない。
CD44、WAP four-disulfide core domain protein 2の2タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群に比べて、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が減少していた。これまでに尿中WAP four-disulfide core domain protein 2が卵巣癌と関連するとの報告がみられるが（非特許文献１３～１４）、糖尿病腎症との関連についてはこれまでに報告されていない。
図２８は、同様に、MRM解析で得られた各尿中タンパク質濃度を、健常者(H)、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)、3，4期患者(DN3/4)の群別に示したグラフである。
Alpha-1-antichymotrypsin、Ig alpha-1 chain C region、Epiplakinの3タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群に比べて、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇し、SUN domain-containing protein 1は、健常者群、2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群に比べて、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が減少していた。Alpha-1-antichymotrypsin、Ig alpha-1 chain C region、Epiplakin、SUN domain-containing protein 1の4タンパク質はいずれも糖尿病腎症との関連がこれまでに報告されていない。
Alpha-1-antichymotrypsin、Ig alpha-1 chain C region、Epiplakinの3タンパク質は、健常者群、2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群に比べて、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇し、SUN domain-containing protein 1は、健常者群、2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群に比べて、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が減少していた。Alpha-1-antichymotrypsin、Ig alpha-1 chain C region、Epiplakin、SUN domain-containing protein 1の4タンパク質はいずれも糖尿病腎症との関連がこれまでに報告されていない。
図２９は、糖尿病腎症モデルマウスであるiNOSトランスジェニックマウスより腎皮質部を摘出しRNA調製し、図２５～２８にて発現変動したタンパク質の遺伝子産物を対象に発現解析を行った結果を示すグラフである。
16週齢iNOSトランスジェニックマウス、対照ICRマウスより腎皮質部を摘出し(n=6/各群)、real-time RT-PCR法により図２５～２８で示した16遺伝子の発現解析を行った。その結果、糖尿病腎症患者尿中のタンパク質発現変動と一致した遺伝子はWAP four-disulfide core domain protein 2のみであり、iNOS トランスジェニックマウス腎におけるWAP four-disulfide core domain protein 2 mRNA発現量は対照マウスに比べて有意に低下していた。WAP four-disulfide core domain protein 2の腎臓における発現変動が糖尿病腎症患者の尿中濃度変動に起因している可能性があるため、糖尿病腎症発症の診断マーカーや治療標的として使用可能である。
16週齢iNOSトランスジェニックマウス、対照ICRマウスより腎皮質部を摘出し(n=6/各群)、real-time RT-PCR法により図２５～２８で示した16遺伝子の発現解析を行った。その結果、糖尿病腎症患者尿中のタンパク質発現変動と一致した遺伝子はWAP four-disulfide core domain protein 2のみであり、iNOS トランスジェニックマウス腎におけるWAP four-disulfide core domain protein 2 mRNA発現量は対照マウスに比べて有意に低下していた。WAP four-disulfide core domain protein 2の腎臓における発現変動が糖尿病腎症患者の尿中濃度変動に起因している可能性があるため、糖尿病腎症発症の診断マーカーや治療標的として使用可能である。
本発明者は、これまでに2型糖尿病マウスモデルであるKK-Ayマウス血清を用いたプロテオーム解析により、2型糖尿病の発症早期から発現上昇する血中タンパク質alpha-1-antichymotrypsin (serine proteinase inhibitor A3K:SERPINA3K)を同定し、SERPINA3Kと2型糖尿病との関連を初めて報告した（非特許文献１５）。図２８に示したように、Alpha-1-antichymotrypsin (SERPINA3)の尿中濃度は糖尿病腎症3/4期群で健常者群、2型糖尿病群、糖尿病腎症2期群に比べて有意に上昇していることから、Alpha-1-antichymotrypsin (SERPINA3)と糖尿病腎症との関連を検討した。
図３０は、図２０に挙げた対象者の尿検体を用いて、Alpha-1-antichymotrypsin (SERPINA3)を測定後、尿中クレアチニン濃度(Cre)にて補正した結果を、健常者(H：control)、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)、3，4期患者(DN3/4)の群別に示したグラフである。なお、各統計解析にはSERPINA3/Cre比を対数変換した値を用いた。
尿中SERPINA3濃度は、健常者群、2型糖尿病群に比べて、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇していた。
尿中SERPINA3濃度は、健常者群、2型糖尿病群に比べて、糖尿病腎症2期群、糖尿病腎症3/4期群で有意に尿中濃度が上昇していた。
図３１は、SERPINA3/Cre比と相関する臨床指標をステップワイズ多重回帰分析にて解析した結果を示す表及びグラフである。
尿中アルブミン・クレアチニン比(ACR) (β:0.76, p＝1.3×10-4)、BUN(β:-0.41, 3.5×10-3)、性別(β:0.29, p＝0.017) の各因子が、SERPINA3/Cre比と関連を示した。特に、SERPINA3/Cre比は、尿中ACRと有意な正の相関を示す一方、eGFR とは有意ではないものの負の相関を示す傾向が認められた。
尿中アルブミン・クレアチニン比(ACR) (β:0.76, p＝1.3×10-4)、BUN(β:-0.41, 3.5×10-3)、性別(β:0.29, p＝0.017) の各因子が、SERPINA3/Cre比と関連を示した。特に、SERPINA3/Cre比は、尿中ACRと有意な正の相関を示す一方、eGFR とは有意ではないものの負の相関を示す傾向が認められた。
図３２は、糖尿病腎症(DN2群、DN3/4群)を状態変数とした多変量ロジスティック回帰分析を行い、尿中SERPINA3の糖尿病腎症に対する危険度の検討を行った結果を示す表である。
オッズ比(OR)が有意であったのは、SERPINA3/Cre比(OR＝3.0, 95% CI:1.4-6.2, p＝0.0039）、eGFR(OR＝0.96, 95% CI:0.92-0.9998, p＝0.049)であった。尿中SERPINA3濃度の上昇は、糖尿病腎症の発症や進展と関連する可能性が認められた。
オッズ比(OR)が有意であったのは、SERPINA3/Cre比(OR＝3.0, 95% CI:1.4-6.2, p＝0.0039）、eGFR(OR＝0.96, 95% CI:0.92-0.9998, p＝0.049)であった。尿中SERPINA3濃度の上昇は、糖尿病腎症の発症や進展と関連する可能性が認められた。
本発明によると、尿を試料とする簡便な手段で糖尿病腎症を検知でき、早期治療や予防に有効であり、産業上有用である。
Claims (7)
- 糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する方法であって、
被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する工程を有する
ことを特徴とする糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法。 - 糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する方法であって、
被験者の尿を含む試料を用い、afamin、antithrombin III、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1B-glycoprotein、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、Calbindin、CD44、ceruloplasmin、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、Dynein heavy chain 12, axonemal、epiplakin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1 、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する工程を有する
請求項１に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法。 - 糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出するキットであって、
被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoprotein
から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備える
ことを特徴とする糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。 - 糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出するキットであって、
被験者の尿を含む試料を用い、afamin、antithrombin III、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1B-glycoprotein、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、Calbindin、CD44、ceruloplasmin、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、Dynein heavy chain 12, axonemal、epiplakin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1 、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備える
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。 - afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの染色剤を備える
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。 - afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの生物活性を測定する試薬を備える
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。 - afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、Calbindin、ceruloplasmin、CD44、Complement C4 beta chain、Deoxyribonuclease-1、epiplakin 、Dynein heavy chain 12, axonemal、Glutamyl aminopeptidase、Haptoglobin、Hemopexin、Ig alpha-1 chain C region、Kininogen-1、Leucine-rich alpha-2-glycoprotein、Lysosomal alpha-glucosidase、Lysosome-associated membrane glycoprotein 2、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、Pancreatic alpha-amylase、Plasma alpha-L-fucosidase、Polymeric immunoglobulin receptor、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、serotransferrin、SUN domain-containing protein 1、Thyroxine-binding globulin、WAP four-disulfide core domain protein 2、Zinc-alpha2-glycoproteinから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの抗体を備える
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。
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