CN110297094A - 检测afamin浓度的试剂盒、制备方法及测定afamin浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测afamin蛋白浓度的试剂盒、制备方法及利用试剂盒检测afamin浓度的方法,检测试剂盒包括试剂1和试剂2,其中所述试剂1包括包被有单克隆抗人afamin抗体的顺磁性微粒;所述试剂2包括单克隆抗人afamin抗体‑碱性磷酸酶结合物。本发明的检测试剂盒具有开放属性,可以应用于多种不同公司的化学发光检测仪器,无需昂贵的专用配套仪器,易于在国内市场推广;而且采用本发明试剂盒检测尿液中afamin浓度的方法灵敏度高、检测时间短、操作简单,并且可同时检测大量样本,提高了检测效率,检测结果准确,为临床上肾病的诊断和治疗提供指导,具有较好的临床实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断领域,具体涉及一种afamin化学发光检测试剂盒、制备方法及利用afamin检测试剂盒测定afamin浓度的方法。
背景技术
Afamin又称维生素E结合蛋白,是一种由肝脏合成的具有多种生物学效应的糖蛋白,分子量为75kDa,与白蛋白、甲胎蛋白、维生素D结合蛋白同属白蛋白家族。 Afamin的主要分子功能是运输维生素E,主要包括对α-生育酚和γ-生育酚的运输。研究发现,其存在于多种生物体液,比如血液、尿液、脑脊液、卵泡液和精液等。既往蛋白质组学研究发现尿液中afamin可能作为多种肾脏疾病的生物标志物,包括糖尿病肾病、小儿肾病综合征和慢性肾脏病。有研究发现在大鼠局灶节段肾小球硬化模型中,随疾病进展尿液afamin浓度逐渐升高,提示尿液afamin可能反映局灶节段肾小球硬化患者的疾病严重程度,同时有研究发现尿液afamin可以作为IgA肾病疾病严重程度的指标。
目前,检测血清afamin的主要方法是酶联免疫吸附试验(ELISA),但由于ELISA 方法的灵敏度低、实验时间长、不适宜自动化分析等缺点,并不适合检测尿液afamin。发光免疫分析(CLIA)是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。这种方法兼有发光分析的高灵敏性和抗原抗体反应的高特异性。自从Schroder和Halman在20世纪70年代末用化学发光免疫分析测定甲状腺素以来,化学发光免疫分析技术发展很快。其检测原理与放射免疫 (RIA)和酶免疫(EIA)相似,不同之处是以发光物质作为底物,并借助其自身的发光强度直接进行测定。
CLIA是化学物质在化学反应过程中,由基态跃迁到激发态,再由不稳定的激发态回到基态,化学能转化为光能释放出来。将高灵敏度的化学发光与高特异度的免疫分析结合起来,通过检测光信号值(RLU,发光强度值),即可知道待测物的含量。按照化学反应类型分类,可分为酶促化学发光和非酶促化学发光。化学发光酶免疫分析是以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应,免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物从而发光,用发光测定信号仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP),他们有各自的发光底物,HRP常用的发光底物为鲁米诺及其衍生物,ALP常用的发光底物是3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3'-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷(AMPPD)。在碱性条件下, ALP的发光底物AMPPD脱去磷酸根基团,形成一个不稳定的中间体AMPD,这个中间体随即自行分解,同时发射光子,这种发光物质发射的光稳定,持续时间可达几十分钟。
尿液中afamin的浓度高低,与肾损伤的严重程度直接相关,尿液中afamin的浓度高,说明患者的肾脏损伤程度高,因此,测定尿液中的afamin浓度,可以用于判断肾损伤的严重程度,对肾脏疾病的诊断和治疗具有明确的指导意义。
然而,现有的检测afamin浓度的方法仅有ELISA方法,其灵敏度低、耗时长、操作步骤复杂,不适宜于自动化分析,不能满足临床需要。CLIA既具有放射免疫分析的高灵敏度,又具有酶联免疫操作简便的特点,易于标准化,且测试中不使用有害的试剂。目前尚缺乏高灵敏度的尿液afamin化学发光检测试剂盒,因此有待开发对afamin检测灵敏度高、特异性好并能降低检测成本的化学发光检测技术。
发明内容
本发明的目的是针对现有测定尿液中afamin含量存在的技术问题,提供一种用于检测尿液中afamin含量的试剂盒、其制备方法以及利用该试剂盒检测尿液中 afamin浓度的方法,本发明的检测试剂盒具有开放属性,可以应用于多种不同公司的化学发光检测仪器,无需昂贵的专用配套仪器,易于在国内市场推广;而且采用本发明试剂盒检测尿液中afamin浓度的方法灵敏度高、检测时间短、操作简单,并且可同时检测大量样本,提高了检测效率,检测结果准确,为临床上肾病的诊断和治疗提供指导,具有较好的临床实用价值。
为实现本发明的目的,本发明一方面提供一种检测afamin蛋白浓度的试剂盒,包括试剂1和试剂2,其中所述试剂1包括包被有单克隆抗人afamin抗体的顺磁性微粒;所述试剂2包括单克隆抗人afamin抗体-碱性磷酸酶结合物。
其中,所述检测afamin蛋白浓度为检测血清或尿液中afamin蛋白浓度,优选为检测尿液中afamin蛋白浓度。
其中,所述试剂1、试剂2均还包括TritonX-100、牛血清白蛋白(BSA)、叠氮钠、ProClin 300。
特别是,试剂1中所述包被有单克隆抗人afamin抗体的顺磁性微粒的浓度为 1-2μg/mL,优选为1.5-1.6μg/mL,进一步优选为1.5μg/mL;试剂2中所述单克隆抗人afamin抗体-碱性磷酸酶结合物的浓度为1-2μg/mL,优选为1.5-1.6μg/mL,进一步优选为1.5μg/mL。
尤其是,所述试剂1中的TritonX-100的浓度为0.1mL/L、牛血清白蛋白(BSA) 的浓度为5g/L、叠氮钠的浓度为0.1%(质量体积百分比)、ProClin 300的浓度为0.1% (质量体积百分比);所述试剂2中的TritonX-100的浓度为0.1mL/L、牛血清白蛋白(BSA)的浓度为5g/L、叠氮钠的浓度为0.1%(质量体积百分比)、ProClin 300 的浓度为0.25%(质量体积百分比)。
特别是,所述试剂1还包括缓冲液A,所述缓冲液A为0.1mL/L TritonX-100、 5g/L牛血清白蛋白(BSA)、0.1%(质量体积百分比)叠氮钠及0.1%(质量体积百分比)ProClin300;所述试剂2还包括缓冲液B,其中所述缓冲液B为0.1mL/L TritonX-100、5g/L牛血清白蛋白(BSA)、0.1%(质量体积百分比)叠氮钠及0.25% (质量体积百分比)ProClin 300。
其中,所述试剂1中的所述包被有单克隆抗人afamin抗体与所述试剂2中所述单克隆抗人afamin抗体的抗原表位不相同。
特别是,所述试剂1中的所述包被有单克隆抗人afamin抗体为鼠单克隆抗人afamin抗体、兔单克隆抗人afamin抗体、猪单克隆抗人afamin抗体、牛单克隆抗人 afamin抗体或羊单克隆抗人afamin抗体;所述试剂2中所述单克隆抗人afamin抗体为鼠单克隆抗人afamin抗体、兔单克隆抗人afamin抗体、猪单克隆抗人afamin抗体、牛单克隆抗人afamin抗体或羊单克隆抗人afamin抗体。
特别是,试剂盒还包括afamin标准品、afamin质控品和化学发光底物。
其中,所述afamin标准品为浓度分别为0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0ng/mL 的afamin标准品溶液。
特别是,所述afamin标准品按照如下步骤配制而成:将afamin纯蛋白标准品用生理盐水配制成浓度分别为0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0ng/mL的afamin标准品溶液。
其中,所述afamin质控品为浓度分别为10.0、60.0ng/mL的afamin溶液。
特别是,所述afamin质控品按照如下步骤配制而成:将afamin纯蛋白标准品用生理盐水配制成浓度分别为10.0、60.0ng/mL的afamin质控品溶液。
其中,所述化学发光底物为Lumi-530试剂。
化学发光底物使用Lumigen公司的配套Lumi-530试剂,具体包括3-(2'- 螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3'-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷(AMPPD)和二钠盐。
特别是,试剂盒还包括洗液,所述洗液为pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。
尤其是,所述磷酸盐缓冲液洗液中含磷酸氢二钾2mmol/L、磷酸氢二钠 8mmol/L,pH 7.2-7.4。
本发明另一方面,提供一种检测afamin蛋白浓度的试剂盒的制备方法,包括如下进行的步骤:
1)将TritonX-100、叠氮钠、ProClin 300溶于1L蒸馏水中,配制第一缓冲系统;
2)将TritonX-100、牛血清白蛋白(BSA)、叠氮钠、ProClin 300溶于1L蒸馏水中,配制第二缓冲系统;
3)将单克隆抗人afamin抗体A、顺磁性微粒加入到第一缓冲系统中,混匀后,于2-8℃放置过夜,进行单克隆抗人afamin抗体A包被处理;
4)向包被处理后的混合溶于中加入第二缓冲系统,于35-38℃下进行封闭处理,封闭处理1.5-3h;获得试剂1,备用;
5)采用过碘酸盐氧化法将单克隆抗人afamin抗体B与碱性磷酸酶交联,制成酶标记物(即单克隆抗人afamin抗体B-碱性磷酸酶结合物);然后将酶标记物溶于第三缓冲系统,制成试剂2,备用;
6)将afamin纯蛋白标准品用生理盐水配制成浓度分别为0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0ng/mL的afamin标准品;
7)将afamin纯蛋白标准品用生理盐水配制为浓度分别10.0、60ng/mL的afamin 质控品;
8)将磷酸氢二钾、磷酸氢二钠溶于蒸馏水中配制成磷酸盐缓冲液洗液,其中洗液的pH 7.2-7.4,磷酸氢二钾2mmol/L、磷酸氢二钠8mmol/L。
9)将包被有单克隆抗人afamin抗体A的顺磁性微粒的试剂1、含有抗人afamin 抗体B-碱性磷酸酶结合物的试剂2、afamin标准品、afamin质控品、化学发光底物 Lumi-530试剂、洗液分别密封后与使用说明书置于包装盒中,即得。
其中,步骤1)中所述第一缓冲系统的组成为:0.1mL/L TritonX-100、0.1%(质量体积百分比)叠氮钠及0.1%(质量体积百分比)ProClin 300。
其中,步骤2)中所述第二缓冲系统的组成为:0.1mL/L TritonX-100、5g/L牛血清白蛋白(BSA)、0.1%(质量体积百分比)叠氮钠及0.1%(质量体积百分比)ProClin 300。
其中,步骤3)中每1L第一缓冲系统中加入所述单克隆抗人afamin抗体A2-4mg (优选为2.8-3.2mg,进一步优选为3mg);加入所述顺磁性微粒2-4mg(优选为 2.8-3.2mg,进一步优选为3mg),进行包被处理。
特别是,所述包被处理温度优选为4℃;包被处理时间优选为8-12h。
特别是,步骤3)中所述单克隆抗人afamin抗体为鼠单克隆抗人afamin抗体、兔单克隆抗人afamin抗体、猪单克隆抗人afamin抗体、牛单克隆抗人afamin抗体或羊单克隆抗人afamin抗体。
其中,步骤4)中所述封闭处理温度优选为37℃;封闭处理时间优选为2h。
特别是,步骤4)中所述包被处理后的混合液与第二缓冲系统的用量体积之比为1:1。
其中,步骤5)中所述酶标记物单克隆抗人afamin抗体B-碱性磷酸酶结合物按照如下步骤制备而成:
5A)将碱性磷酸酶溶于醋酸盐缓冲液后,加入到2,4-二硝基氟苯的无水乙醇溶液,搅拌均匀;接着加入NaIO4溶液,搅拌均匀后于2-8℃(优选为4℃)下放置 30-60min(优选为30min);然后加入乙二醇溶液,室温下搅拌0.5-1.5h(优选为1h),制得碱性磷酸酶标记液;
5B)将单克隆抗人afamin抗体B加入到碱性磷酸酶标记液中,接着加入CBS (碳酸盐缓冲液),调节混合液的pH至8.7-9.3(优选为9.0),并于2-8℃(优选为 4℃)下放置过夜(优选为8-12h);然后加入硼氢化钠溶液,混匀后于2-8℃(优选为4℃)下放置2-4h(优选为3h);再接着用PBS缓冲液于2-8℃(优选为4℃)下进行透析处理过夜(优选为8-12h);将透析后溶液进行离心处理,收集离心上清液;
5C)将离心上清液进行干燥处理制成粉末,即得酶标记物(单克隆抗人afamin 抗体B-碱性磷酸酶结合物),将酶标记物溶于第三缓冲系统,即得试剂2,备用。
其中,步骤5A)中所述醋酸盐缓冲液为0.2mol/L pH5.6醋酸盐缓冲液;所述2,4-二硝基氟苯的无水乙醇溶液的浓度为1%(质量体积百分比);所述NaIO4溶液的浓度为0.1mol/L;所述乙二醇溶液的浓度为2.5%(质量体积百分比)。
特别是,所述步骤5B)中所述CBS为1.0mol/L pH9.5的CBS;所述硼氢化钠溶液的浓度为1.0mol/L;所述PBS缓冲液为0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液。
尤其是,在透析处理过程中换液2-3次,优选为3次。
特别是,步骤5C)中所述干燥处理为冻干处理,将离心上清液制备成冻干粉末。
尤其是,还包括步骤5C-1),将TritonX-100、牛血清白蛋白(BSA)、叠氮钠、ProClin 300溶于1L蒸馏水中,配制第三缓冲系统,其中0.1mL/L TritonX-100、5g/L 牛血清白蛋白(BSA)、0.1%(质量体积百分比)叠氮钠及0.25%(质量体积百分比) ProClin300。
特别是,步骤5C)中每1L第三缓冲液中溶解所述酶标记物1.2-1.5mg,优选为1.5mg。
本发明再一方面提供一种利用上述检测afamin蛋白浓度的试剂盒测定afamin浓度的方法,包括如下步骤:
A)绘制afamin标准曲线
分别将试剂盒的试剂1、试剂2与不同浓度的afamin标准品混匀,冲洗3-5次(通常为3次)后,再分别加入化学发光底物,然后测定不同浓度afamin标准品的光信号值(RLU,发光强度值);
以afamin标准品溶液浓度的lg值为横坐标(即X轴),以不同浓度标准品测定的光信号值(RLU,发光强度值)为纵坐标(即Y轴)绘制标准曲线,并拟合得到相对应的回归方程;
B)样本准备
将采集的样本进行离心处理,去除沉淀,取上清液,备用;
C)样本测定
将试剂盒的试剂1、试剂2与步骤B)制备的样本上清液混匀,冲洗3-5次(通常为3次)后,再加入化学发光底物,然后测定样本中afamin蛋白的光信号值(RLU,发光强度值);
将测得的光信号值(RLU,发光强度值)在步骤A)绘制的afamin标准曲线中查找,获得相应的afamin蛋白的浓度;或将测得的光信号值(RLU,发光强度值) 带入相应的回归方程,计算获得相应的afamin蛋白的浓度。
其中,步骤A)中afamin标准品、试剂1、试剂2、发光底物的体积比为1:1: 1:1。
特别是,步骤A)中afamin标准品的用量是20μL,试剂1的用量是20μL,试剂2的用量是20μL,化学发光底物用量是20μL;所述洗液每次用量为100μL。
特别是,根据绘制的afamin标准曲线,以afamin标准品浓度为自变量(X),以其对应的光信号值(RLU,发光强度值)为因变量(Y),拟合获得回归方程。
将测定的光信号值(RLU,发光强度值)带入回归方程,计算得到待测样本中的afamin浓度。
特别是,在绘制标准曲线之前,还包括将afamin检测试剂盒于室温下放置 20-30min,优选为20min。
尤其是,采用化学发光免疫分析仪测定afamin标准品的光信号值(RLU,发光强度值)。
其中,步骤C)中样本上清液、试剂1、试剂2、发光底物的体积比为1:1:1: 1。
特别是,步骤C)中样本上清液的用量是20μL,试剂1的用量是20μL,试剂2 的用量是20μL,化学发光底物用量是20μL;所述洗液每次用量为100μL。
特别是,还包括步骤D),分别将试剂盒的试剂1与afamin质控品Ⅰ、质控品Ⅱ混匀,冲洗3-5次(通常为3次)后,加入试剂2,冲洗3-5次(通常为3次)后,再加入化学发光底物,再接着用化学发光免疫分析技术测定afamin质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的光信号值(RLU,发光强度值);再接着分别将测得的质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的光信号值(RLU,发光强度值)在步骤A)绘制的afamin标准曲线中查找,分别获得相应的afamin质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的浓度;或将测得的光信号值(RLU,发光强度值)分别带入相应的回归方程,计算获得相应的afamin质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的浓度;从标准曲线查找得到的质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的浓度或通过回归方程计算得到的质控品Ⅰ、质控品Ⅱ浓度与试剂盒内afamin质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的实际浓度进行比较,对于质控品Ⅰ,测定的浓度范围在9.0-11.0ng/mL(即标准误差范围10%);对于质控品Ⅱ,测定的浓度范围在54.0-66.0ng/mL(即标准误差范围10%),说明本发明方法和绘制的afamin标准曲线可以用于样本检测,检测结果准确。
本发明的具体检测原理为:采用化学发光酶免疫分析技术(双抗体夹心法)。
样本、标记了碱性磷酸酶的单克隆抗人afamin抗体以及包被了单克隆抗人afamin抗体的顺磁性颗粒一起加入到反应管中,样本中的afamin和顺磁性颗粒表面的抗体以及游离的酶结合物在不同的抗原位点上同时发生反应。而后,孵育后的反应管被传送到磁性分离区域用洗液进行多次冲洗,去除未和固相结合的其它成分。最后,在反应管中加入化学发光底物(Lumi-530),已与固相结合的碱性磷酸酶会使该底物发出光子并被光电倍增管所检测。最后,对照标准曲线中所描述的光信号值与标准品afamin的对应关系而计算出样本中的afamin浓度。
本发明提供的尿液afamin化学发光检测试剂盒具有以下优越性:
1、本发明提供的试剂盒具有开放属性,可以应用于多种不同公司的化学发光检测仪器,无需昂贵的专用配套仪器,易于在国内市场推广。
2、本发明可定量检测患者尿液afamin的浓度,检测结果准确,而且可以检测低浓度afamin蛋白浓度,通常可以低至5ng/mL,因此可通过尿液afamin的浓度高低,准确判断肾损伤的严重程度。
3、本发明采用化学发光免疫分析技术,既具有放射免疫分析的高灵敏度,又具有酶联免疫的操作简便的特点,易于标准化操作。
4、本发明通过检测发光信号值(RLU,发光强度值)分析显色底物,大大提高了检测的灵敏性,与ELISA方法相比,其分析灵敏度大幅度提高。
5、试剂盒操作安全,所用试剂无毒,检测所需样本量少、时间短,实用性强。
6、本发明的试剂盒采用顺磁性微粒作为免疫学载体,在没有磁场存在的情况下,顺磁性微粒悬浮在液体中,当外加磁场存在时,可以方便地快速洗涤分离。
附图说明
图1是以afamin标准品溶液浓度的lg值为横坐标,afamin的光信号值为纵坐标绘制的标准曲线图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。
在下面的描述中阐述了很多具体的细节以便于充分理解本发明,但是,本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施,因此,本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
本发明具体实施方式部分中使用的材料、试剂:
小鼠单克隆抗人afamin抗体A:购自santa公司;
小鼠单克隆抗人afamin抗体B:购自Abcam公司;
(不同公司生产的小鼠单克隆抗人afamin抗体针对不同的抗原表位)
牛血清白蛋白(BSA):购自Sigma-Aldrich公司;
碱性磷酸酶:购自Sigma-Aldrich公司。
实施例1:尿液afamin化学发光检测试剂盒的制备
1、制备试剂1
1-1、将TritonX-100、叠氮钠、ProClin 300溶于1L蒸馏水中,配制第一缓冲系统,第一缓冲系统具体如下:0.1mL/L TritonX-100、0.1%(质量体积百分比)叠氮钠及0.1%(质量体积百分比)ProClin 300;
1-2、将TritonX-100、牛血清白蛋白(BSA)、叠氮钠、ProClin 300溶于1L蒸馏水中,配制第二缓冲系统,第二缓冲系统具体如下:0.1mL/L TritonX-100、5g/L牛血清白蛋白(BSA)、0.1%(质量体积百分比)叠氮钠及0.1%(质量体积百分比) ProClin 300;
1-3、小鼠单克隆抗人afamin抗体A(购自santa公司)、顺磁性微粒与第一缓冲系统混匀,于4℃(通常为2-8℃)放置过夜(通常为8-12h),进行抗体包被处理,小鼠单克隆抗人afamin抗体固定在顺磁性为微粒的表面,其中,每1L第一缓冲系统中加入小鼠单克隆抗人afamin抗体3mg(通常为2-4mg,优选为2.8-3.2mg);顺磁性微粒3mg(通常为2-4mg,优选为2.8-3.2mg);
本发明实施例中以小鼠单克隆抗人afamin抗体为例进行说明,其他兔单克隆抗人afamin抗体、猪单克隆抗人afamin抗体、牛单克隆抗人afamin抗体或羊单克隆抗人afamin抗体均适用于本发明。
1-4、向包被处理后的混合溶于中加入第二缓冲系统,于37℃(通常为35-38℃) 下进行封闭处理,封闭处理2h(通常为1.5-3h)后,其中,包被处理后的混合液与第二缓冲体系的体积之比为1:1,制得试剂1,备用;
2、制备试剂2
采用过碘酸盐氧化法将小鼠单克隆抗人afamin抗体B(购自Abcam公司)与碱性磷酸酶交联,制成抗人afamin抗体-碱性磷酸酶结合物(即酶标记物)。
2-1、将TritonX-100、牛血清白蛋白(BSA)、叠氮钠、ProClin 300溶于1L蒸馏水中,配制第三缓冲系统,第三缓冲系统具体如下:0.1mL/L TritonX-100、5g/L 牛血清白蛋白(BSA)、0.1%(质量体积百分比)叠氮钠及0.25%(质量体积百分比) ProClin 300;
2-2、取碱性磷酸酶5mg溶于0.2mol/L pH5.6醋酸盐缓冲液1ml中,加入1% DNFB(2,4-二硝基氟苯)无水乙醇溶液0.1ml,室温下轻微搅拌1h,加入新鲜配置的0.1mol/LNaIO4 0.5ml,于4℃下放置30min,此时溶液由原棕色变为墨绿色,加入2.5%乙二醇1ml,室温下轻微搅拌1h,终止反应;
加入待标记的抗体小鼠单克隆抗人afamin抗体B(购自Abcam公司,该抗体与购自santa公司的小鼠单克隆抗人afamin抗体具有不同的抗原表位)7.5mg(通常为 5-10mg),用1.0mol/L pH9.5CBS(碳酸盐缓冲液),调节pH值至9.0,混匀,置4℃过夜(通常8-12h);加入1.0mol/L硼氢化钠溶液0.1ml,混匀,4℃放置3h;用0.01mol/L pH7.4PBS(磷酸盐缓冲液),4℃透析过夜,换液3次,透析液3000r/min离心30min,去除沉淀物,收集上清液;
2-3、上清液进行冻干处理后,制成冻干粉末;然后将冻干粉末溶于第三缓冲系统中,配制成试剂2,即含有抗人afamin抗体B-碱性磷酸酶结合物的溶液,备用,其中每1L第三缓冲系统中溶解1.2-1.5mg的冻干粉末(优选为1.5mg)。
3、配制afamin标准品
将afamin纯蛋白(购自cloud clone公司)用生理盐水配制成浓度为0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0ng/mL的afamin标准品溶液。
4、配制afamin质控品
将afamin纯蛋白(购自cloud clone公司)用生理盐水配制为浓度分别10.0、60ng/mL的afamin质控品Ⅰ、质控品Ⅱ,备用。
质控品和标准品的作用不同,其中,质控品有两个固定浓度,用于评估每次实验结果是否准确。
5、配制化学发光底物
使用Lumigen公司的配套Lumi-530试剂,具体包括3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3'-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷(AMPPD)和二钠盐。
6、配制洗液
将磷酸氢二钾、磷酸氢二钠溶于蒸馏水中配制成磷酸盐缓冲液洗液,其中洗液的pH 7.2-7.4,磷酸氢二钾2mmol/L、磷酸氢二钠8mmol/L。
配制的试剂分装后即为半成品,抽检合格后组装成试剂盒成品,成品抽检合格后方可出厂。
afamin质控品和标准品保存于-20℃,试剂盒中其他试剂(含有包被有小鼠单克隆抗人afamin抗体的顺磁性微粒的试剂1、含有小鼠单克隆抗人afamin抗体-碱性磷酸酶结合物的试剂2、化学发光底物、洗液)保存于4℃。
实施例2:尿液afamin化学发光检测试剂盒的使用
1、样本准备
可使用市售尿液采集管采集随机尿10mL,离心机离心处理,其中相对离心力(RCF)400g离心5min,留取上清液,丢弃沉渣,制得待测样本,备用;
保持样本管完全密闭情况下,在室温下保存不超过8h;如果8h内不能完成检测即应将样本放入2-8℃冰箱冷藏;如果24h内不能完成检测即应将样本放入-20℃冰箱冻藏。样本只能复融一次。
2、试剂准备
将实施例1制备的试剂盒,置于室温下平衡20min(即室温下静置20min,通常为20-30min)。
3、绘制标准曲线
将本发明的检测afamin蛋白浓度的试剂盒内的试剂1、试剂2分别放置在美国Beckman Coulter公司的Synchron DXI800全自动生化分析仪的试剂槽内;将化学发光底物放置于生化分析仪的基质盒内;将生化分析仪的洗液管插入洗液瓶中;将 afamin标准品放入分析仪的样本装载架内,盖好全自动生化分析仪的盖子后,启动仪器,afamin标准品、试剂1、试剂2在反应管内混合,afamin和顺磁性颗粒表面的抗体以及游离的酶结合物在不同的抗原位点上同时发生反应;反应管在分析仪的磁性分离区域冲洗3-5次(通常为3次),然后化学发光底物加入到反应管内,混合均匀后,测定不同浓度afamin标准品的光信号值(RLU,发光强度值);
以afamin标准品溶液浓度的lg值为横坐标(X轴),以不同浓度标准品测定的光信号值(RLU,发光强度值)为纵坐标(Y轴)绘制标准曲线,具体如图1所示;
以afamin标准品浓度为自变量(x),以其对应的光信号值(RLU,发光强度值) 为因变量(y),得到如下回归方程:其中y为样本的光信号值(RLU,发光强度值);x为afamin蛋白浓度,ng/mL;a、b、c、d的具体数值根据每次绘制标准曲线拟合而定。
4、afamin质控品浓度测定
将本发明的检测afamin蛋白浓度的试剂盒内的试剂1、试剂2分别放置在美国Beckman Coulter公司的Synchron DXI800全自动生化分析仪的试剂槽内;将化学发光底物放置于生化分析仪的基质盒内;将生化分析仪的洗液管插入洗液瓶中;将 afamin质控品Ⅰ、质控品Ⅱ分别放入分析仪的样本装载架内,盖好全自动生化分析仪的盖子后,启动仪器,afamin质控品、试剂1、试剂2在反应管内混合,afamin 和顺磁性颗粒表面的抗体以及游离的酶结合物在不同的抗原位点上同时发生反应;反应管在分析仪的磁性分离区域冲洗3-5次(通常为3次),然后发光底物加入到反应管内,混合均匀后,分别测定afamin质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的光信号值(RLU,发光强度值);
将本试剂盒的afamin质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的光信号值(RLU,发光强度值)在绘制的标准曲线图1中查找,获得相应的afamin质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的浓度值;
或者将光信号值(RLU,发光强度值)带入回归方程,计算得到相应的afamin 质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的浓度值。
从标准曲线查找得到的质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的浓度或通过回归方程计算得到的质控品Ⅰ、质控品Ⅱ浓度与试剂盒内afamin质控品Ⅰ、质控品Ⅱ的实际浓度进行比较,对于质控品Ⅰ,测定的浓度范围在9.0-11.0ng/mL(即标准误差范围10%);对于质控品Ⅱ,测定的浓度范围在54.0-66.0ng/mL(即标准误差范围10%),说明本发明方法和绘制的afamin标准曲线可以用于样本检测,检测结果准确。
5、样本检测
将步骤1制备的待测样本放置于分析仪的样本装载架内,盖好全自动生化分析仪的盖子后,启动仪器,待测样本、试剂1、试剂2在反应管内混合,样本内的afamin 和顺磁性颗粒表面的抗体以及游离的酶结合物在不同的抗原位点上同时发生反应;反应管在分析仪的磁性分离区域冲洗3-5次(通常为3次),然后发光底物加入到反应管内,混合均匀后,进行化学发光酶免疫分析,测定待测样本内afamin的光信号值(RLU,发光强度值);
将测定的待测样本的afamin的光信号值(RLU,发光强度值)在绘制的标准曲线图1中查找,获得相应的afamin蛋白的浓度值;或者将光信号值(RLU,发光强度值)带入回归方程,计算得到相应的afamin蛋白的浓度值。
以美国Beckman Coulter公司的Synchron DXI800全自动生化分析仪测定的具体步骤如下:
1-1装载试剂1和试剂2
在主屏幕按F3Supplies,选择Reagent Supplies,查看试剂状态,若需装载新试剂盒,可直接打开仪器右边的试剂仓门,将试剂放入试剂槽,关闭仓门即可。最多可同时装载4盒试剂。用完的试剂盒会自动掉进废品袋。
1-2装载化学发光底物
向上提起基质装载区的盖,向里按一下放基质的托,使其弹出,取出空基质盒,放入新的基质盒,条码向外,将基质连同托一起推入后,盖门自动放下,用扫描仪扫描条码即可。
1-3装载洗液
打开洗液瓶,将生化分析仪的洗液管插入洗液瓶中,拧紧瓶盖,用扫描仪扫描条码即可。
1-4标准品/质控品/样本编程
1-4-1单个编程:主屏幕→F1Sample Manager→F3New Request→F1Patient/QCRequests→输入样本架号→输入样本号以及选择检测项目→编完一架按F3New Request→F1Patient/QC Requests编下一架。
1-4-2批量编程:主屏幕→F1Sample Manager→F3New Request→F1Patient/QCRequests→输入样本架号→输入第一个样本号以及选择检测项目→F8More Options→F1Turn Batch Request On仪器自动选择和上一个样本同样的检测项目;F2 Turn AutoSample ID On仪器自动按顺序生成样本号→直接按回车键可进行批量编程,编程完毕请按F1Turn Batch Request OFF和F2Turn Auto Sample ID OFF关闭批量编程功能。
1-5将标准品或质控品或样本放入样本装载架,盖好盖子,仪器自动开始运行。
1-6查看结果
主屏幕→F2Test Result可显示所有结果
采用本发明的试剂盒检测afamin蛋白的方法,检测灵敏度高,可满足微量的检出要求,采用本发明的试剂盒检测样本中afamin蛋白浓度的检出限低,可以达到5 ng/ml;而且本发明方法可以进行大量样本的批量检测。本发明的试剂盒具有开放属性,能够在多种化学发光检测仪器中使用,检测结果准确。
本发明上述实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种检测afamin蛋白浓度的试剂盒,包括试剂1和试剂2,其特征是,所述试剂1包括包被有单克隆抗人afamin抗体的顺磁性微粒;所述试剂2包括单克隆抗人afamin抗体-碱性磷酸酶结合物。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征是,所述试剂1还包括TritonX-100、牛血清白蛋白、叠氮钠、ProClin 300;所述试剂2还包括TritonX-100、牛血清白蛋白、叠氮钠、ProClin300。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒,其特征是,试剂1中所述包被有单克隆抗人afamin抗体的顺磁性微粒的浓度为1-2μg/mL,优选为1.5μg/mL;试剂2中所述单克隆抗人afamin抗体-碱性磷酸酶结合物的浓度为1-2μg/mL,优选为1.5μg/mL。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒,其特征是,所述试剂1中的所述包被有单克隆抗人afamin抗体为鼠单克隆抗人afamin抗体、兔单克隆抗人afamin抗体、猪单克隆抗人afamin抗体、牛单克隆抗人afamin抗体或羊单克隆抗人afamin抗体;所述试剂2中所述单克隆抗人afamin抗体为鼠单克隆抗人afamin抗体、兔单克隆抗人afamin抗体、猪单克隆抗人afamin抗体、牛单克隆抗人afamin抗体或羊单克隆抗人afamin抗体。
5.如权利要求1或2所述的试剂盒,其特征是,还包括afamin标准品、afamin质控品和化学发光底物。
6.如权利要求1或2所述的试剂盒,其特征是,还包括洗液,所述洗液为pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。
7.一种检测afamin蛋白浓度的试剂盒的制备方法,其特征是,包括如下进行的步骤:
1)将TritonX-100、叠氮钠、ProClin 300溶于1L蒸馏水中,配制第一缓冲系统;
2)将TritonX-100、牛血清白蛋白、叠氮钠、ProClin 300溶于1L蒸馏水中,配制第二缓冲系统;
3)将单克隆抗人afamin抗体、顺磁性微粒加入到第一缓冲系统中,混匀后,于2-8℃放置过夜,进行单克隆抗人afamin抗体包被处理;
4)向包被处理后的混合液中加入第二缓冲系统,于35-38℃下进行封闭处理,封闭处理1.5-3h;制得试剂1,备用;
5)采用过碘酸盐氧化法将单克隆抗人afamin抗体与碱性磷酸酶交联,制成单克隆抗人afamin抗体-碱性磷酸酶结合物;然后将单克隆抗人afamin抗体-碱性磷酸酶结合物溶于第三缓冲系统,制成试剂2,备用;
6)将afamin纯蛋白标准品用生理盐水配制成浓度分别为0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0ng/mL的afamin标准品;
7)将afamin纯蛋白标准品用生理盐水配制成浓度分别为10.0、60.0ng/mL的afamin质控品;
8)将磷酸氢二钾、磷酸氢二钠溶于蒸馏水中配制成磷酸盐缓冲液洗液,其中洗液的pH7.2-7.4;
9)将试剂1、试剂2、afamin标准品、afamin质控品、化学发光底物Lumi-530试剂、洗液分别密封后与使用说明书置于包装盒中,即得。
8.一种测定afamin浓度的方法,其特征是,包括如下步骤:
A)绘制afamin标准曲线
分别将试剂盒的试剂1、试剂2与不同浓度的afamin标准品混匀,冲洗3-5次后,再分别加入化学发光底物,然后测定不同浓度afamin标准品的光信号值;
以afamin标准品溶液浓度的lg值为横坐标,以不同浓度标准品测定的光信号值为纵坐标,绘制标准曲线,并拟合得到相对应的回归方程;
B)样本准备
将采集的样本进行离心处理,去除沉淀,取上清液,备用;
C)样本测定
将试剂盒的试剂1、试剂2与步骤B)制备的样本上清液混匀,冲洗3-5次后,再加入化学发光底物,然后测定样本中afamin蛋白的光信号值;
将测得的样本信号值在步骤A)绘制的afamin标准曲线中查找,获得相应的afamin蛋白的浓度;或将测得的光信号值带入相应的回归方程,计算获得相应的afamin蛋白的浓度。
9.如权利要求8所述的方法,其特征是,步骤B)中所述待测样本选择尿液或血清,优选为尿液。
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