CN104204807A - 用于胃癌的生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与胃癌相关联的生物标志物。具体地，本发明提供诊断对象中的胃癌(GC)的方法，所述方法包括：检测所述对象中一种或多种蛋白质的表达水平，其中所述一种或多种蛋白质选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)和Afamin；将该对象中的所述或各蛋白质的表达水平与所述或各蛋白质的参比表达水平做比较；和基于所述比较来诊断所述对象中的GC。基于对与胃癌相关联的生物标志物的鉴定，本发明还提供测定对象是否易于发展胃癌的方法，评估对象中胃癌进展的方法，筛选可用于治疗对象中的胃癌的候选治疗剂的方法，和用于诊断对象内胃癌的试剂盒。

Description

用于胃癌的生物标志物及其应用
优先权
本国际专利申请要求2012年1月20日提交的澳大利亚临时专利申请2012900233的优先权，其内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明涉及对与胃癌相关联的生物标志物的鉴定。具体地，已鉴定胃癌和多种蛋白质差异表达之间的联系。所述生物标志物可用于多种目的，包括用于诊断胃癌的方法、用于鉴定易于患胃癌的个体的方法，和用于评估胃癌进展的方法。
发明背景
胃癌(本文中也称作“GC”)是世界上第四大常见癌症，并且是第二大癌症致死原因。在西方国家中，诊断的预计5年存活率仅为10～30％。这可归因于极少的诊断性症状以及之后的晚期时内窥镜诊断。不幸的是，当GC症状出现时，在>80％的病例中已经出现其本身转移。
日本是拥有世界最高GC率的国家之一。在日本，通过胃部荧光照相术对无症状个体执行的大量筛选项目已增加了早期GC病例的检测数量，将总体5年存活率提高至超过50％。胃部荧光照相术的灵敏度和特异度较佳，分别是70-90％和80-90％。然而，成本效益研究指出，胃部荧光照相术在GC发生率较低的西方国家并不可行。更加合适的诊断方法将涉及准确、非侵入性且高成本效益的测试，供于检测GC病原学中涉及的GC生物标志物。
用于GC的现有临床标志物，癌胚抗原(CEA)、糖抗原(CA)19-9和CA 72-4既不足够灵敏又对常规筛选没有特异性，并且主要用于监测治疗后疾病的进展。胃蛋白酶原I/II的血清比显示具有作为亚洲种群的替代性GC指示物的些许潜力，然而，其在其它族群(包括西方群体)中仍存在适用性问题。
存在与GC生物标志物发现相关联的若干不小的障碍。鉴于其无症状的特点，难以获得人类早期疾病样品。该问题因人类群体的遗传多样性和不可控环境因素的影响而更加复杂，意味着潜在的生物标志物可能因生物标志物表达中的高度自然变异而不明显。
上述这些困难导致GC指示性的生物标志物具有极小灵敏度和特异度。因此，急需对于合适检测大群体中早期GC的新生物标志物的鉴定。
在该说明书中参考的任何现有技术不应认为或不应作为承认或任何形式暗示表明该现有技术在任何国家中构成一般常识的一部分。
发明内容
为了克服前述困难，本发明人采用遗传学工程改造的炎性相关GC的小鼠模型(gp130F/F)。该gp130F/F小鼠自发且可重复地在胃的腺体部分中发展腺瘤，所述胃显示与源自受幽门螺旋杆菌(H.pylori)长期感染的人类中的肠型GC相关联的所有进展性组织学特点。这已导致对早期GC的新生物标志物指示物的鉴定。
因此，在第一方面中，本发明提供诊断对象中的胃癌(GC)的方法，所述方法包括：
(a)检测该对象中一种或多种生物标志物的表达水平，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素(clusterin)、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin；
(b)比较所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平和所述或各生物标志物的参比表达水平；和
(c)基于所述比较来诊断对象中的GC。
在一个实施方式中，检测获自所述对象的样品中的所述一种或多种生物标志物的表达水平。在一个实施方式中，所述样品是血清样品。就这点而言，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平，包括检测所述样品中生物标志物蛋白质的水平。在一个实施方式中，所述样品是组织样品。就此而言，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平，包括检测所述样品中生物标志物mRNA的水平。
在一些实施方式中，所述生物标志物是人VDBP。在一个实施方式中，所述对象中VDBP的表达水平低于VDBP的参比表达水平指示该对象中的GC。
在一些实施方式中，所述生物标志物是人凝聚素。在一个实施方式中，所述对象中凝聚素的表达水平低于凝聚素的参比表达水平指示该对象中的GC。
在一些实施方式中，所述生物标志物是人IGFALS。在一个实施方式中，所述对象中IGFALS的表达水平高于IGFALS的参比表达水平指示该对象中的GC。
在一些实施方式中，所述生物标志物是人Afamin。在一个实施方式中，所述对象中Afamin蛋白的水平低于Afamin蛋白的参比表达水平指示该对象中的GC。
在第二方面中，本发明提供测定对象是否易于发展胃癌(GC)的方法，所述方法包括：
(a)检测该对象中一种或多种生物标志物的表达水平，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin；
(b)比较所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平和所述或各生物标志物的参比表达水平；和
(c)基于所述比较来确定该对象是否易于发展GC。
在一个实施方式中，检测获自所述对象的样品中的所述一种或多种生物标志物的表达水平。在一个实施方式中，所述样品是血清样品。就这点而言，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平，包括检测所述样品中生物标志物蛋白质的水平。在一个实施方式中，所述样品是组织样品。就此而言，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平，包括检测所述样品中生物标志物mRNA的水平。
在本发明第二方面的一些实施方式中，所述生物标记物是人VDBP。在一个实施方式中，所述对象中VDBP的表达水平低于VDBP的参比表达水平指示该对象中的GC。
在本发明第二方面的一些实施方式中，所述生物标记物是人凝聚素。在一个实施方式中，所述对象中凝聚素的表达水平低于凝聚素的参比表达水平指示该对象中的GC。
在本发明第二方面的一些实施方式中，所述生物标记物是人IGFALS。在一个实施方式中，所述对象中IGFALS的表达水平高于IGFALS的参比表达水平指示该对象中的GC。
在本发明第二方面的一些实施方式中，所述生物标记物是人Afamin。在一个实施方式中，所述对象中Afamin蛋白的水平低于Afamin蛋白的参比表达水平指示该对象中的GC。
在第三方面中，本发明提供评估对象中胃癌(GC)进展的方法，所述方法包括：
(a)检测该对象中一种或多种生物标志物的表达水平，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin；
(b)比较所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平和所述或各生物标志物的参比表达水平；和
(c)基于所述比较来评估该对象中GC的进展。
在一个实施方式中，所述对象经历针对GC的治疗。
在本发明第三方面的一些实施方式中，检测获自所述对象的样品中的所述一种或多种生物标志物的表达水平。在一个实施方式中，所述样品是血清样品。就这点而言，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平，包括检测所述样品中生物标志物蛋白质的水平。在一个实施方式中，所述样品是组织样品。就这点而言，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平，包括检测所述样品中生物标志物mRNA的水平。
在本发明第三方面的一些实施方式中，所述生物标记物是人VDBP。在一个实施方式中，所述对象中VDBP的表达水平低于VDBP的参比表达水平指示该对象中的GC。
在本发明第三方面的一些实施方式中，所述生物标记物是人凝集素。在一个实施方式中，所述对象中凝聚素的表达水平低于凝聚素的参比表达水平指示该对象中的GC。
在本发明第三方面的一些实施方式中，所述生物标记物是人IGFALS。在一个实施方式中，所述对象中IGFALS的表达水平高于IGFALS的参比表达水平指示该对象中的GC。
在本发明第三方面的一些实施方式中，所述生物标记物是人Afamin。在一个实施方式中，所述对象中Afamin蛋白的水平低于Afamin蛋白的参比表达水平指示该对象中的GC。
在第四方面中，本发明提供用于筛选能用于治疗对象中胃癌(GC)的候选治疗剂的方法，所述方法包括测定所述候选治疗剂在调节一种或多种生物标志物的表达水平中的活性，所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin。
在本发明第四方面的一个实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(a)给予所述对象所述候选治疗剂；
(b)检测该对象中所述或各生物标志物的表达水平；和
(c)比较所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平和所述或各生物标志物的参比表达水平，
其中，若所述或各生物标志物的表达水平接近或等于所述或各生物标志物的参比表达水平，则该候选治疗剂可用于治疗该对象中的GC。
在本发明第四方面的一个实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(a)使所述候选治疗剂暴露至表达所述或各生物标志物的细胞；
(b)检测所述细胞中的所述或各生物标志物的表达水平变化；和
(c)比较所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平和所述或各生物标志物的参比表达水平，
其中，若所述或各生物标志物的表达水平接近或等于所述或各生物标志物的参比表达水平，则该候选治疗剂可用于治疗对象中的GC。
在本发明第四方面的一些实施方式中，所述候选治疗剂使该对象或细胞中的VDBP表达水平提高至与VDBP参比表达水平近似或相同的水平。在一些实施方式中，所述候选治疗剂使该对象或细胞中的凝聚素表达水平提高至与凝聚素参比表达水平近似或相同的水平。在一些实施方式中，所述候选治疗剂使该对象或细胞中的IGFALS表达水平降低至与IGFALS参比表达水平近似或相同的水平。在一些实施方式中，所述候选治疗剂使该对象或细胞中的Afamin表达水平提高至与Afamin参比表达水平近似或相同的水平。
在本发明前述方面的一些实施方式中，所述方法还包括检测所述对象或细胞中的生物标志物载脂蛋白E(ApoE)和/或生物标志物触珠蛋白的表达水平。
在第五方面，本发明提供用于诊断对象中胃癌(GC)，确定对象是否易于发展GC或评估对象中GC进展的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测该对象内一种或多种生物标志物的表达水平的器具，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin。
附图简要说明
应参考下文的发明详述和实施例，并联合附图来进一步理解本发明的方面和优势。
图1-实施例1的组织学分析在指示基因型的周龄小鼠上进行。然后切除胃并沿外弯曲切开，用钉将胃朝外固定，使腔面对观测器(插入)。沿虚线的纵向切断面用H&E染色，并设置窦的方向使其面对左侧。所有gp130F/F和gp130F/F；Il6-/-小鼠的胃显示窦的腺部分中的4-6种不同的腺瘤(箭头)(a)，其特点为细长且常与炎性浸润(星号)相关联地分支腺体。在gp130F/F；Stat3+/-小鼠(箭头)可见小区域的增生上皮，表示延迟和削弱的肿瘤形成11。底部(f)的鳞状上皮从不显示增生迹象。标尺为200μm(插入)和50μm(H+E切片)。
图2-(A)实施例1中用于发现、检验和确认胃癌(GC)的候选血清蛋白质标志物的策略方案。矩形框内的步骤是实验方法，而菱形框中的步骤是分析方法。虚线指示在第1阶段验证，绕过第2阶段检验而在第3阶段通过人样品中的ELISA直接确认的三周功能蛋白质。(B)具有非GC表型的野生型样品的代表性2D凝胶点图。(C)具有GC表型的gp130F/F基因型小鼠(FF)样品的代表性2D凝胶点图。(D)由512个匹配点生成的分级聚类树枝形结构联系图。(E)由512个匹配点生成的主成分分析(PCA)分数图。显示分配至各主成分的方差百分数。
图3-描述实施例1中所用的基于消耗小鼠血清样品的38多重亲和分离系统(MARS)来鉴定候选GC生物标志物的实验工作流的流程图。然后采用涉及小鼠基因型多重比较、受试者工作特征(ROC)分析和质谱(MS)鉴定后的候选物优先级分级的成熟策略来选择供于人血清中的检验和确认的八种最相关蛋白质。图4-实施例1中鉴定的二维凝胶电泳差异(2D DIGE)点的标准化丰度值的盒须图，也称作体积，并且发现其与gp130F/F突变而非GC表型相关联。
图5-(A)GC(绿色)和非GC(红色)样品的代表性覆盖的2D DIGE图显示对应于实施例1中鉴定的八种候选生物标志物蛋白质的38个感兴趣点的位置。以绿色描述的那些点是在GC中上调的，而红色的那些是下调的。(B)在2DDIGE上的与所述八种感兴趣蛋白质相关联的匹配点体积的盒须图。就所有38个点而言，GC表型组(即FF/FFIL6基因型)获得的平均点体积与非GC表型组(即WT/IL6/FFStat3基因型)的平均值具有显著差异，斯氏t检验P值<0.01。
图6-(A)实施例1中在GC小鼠(FF基因型,n＝5)和非-GC(WT,n＝5)小鼠血清中鉴定的四种候选生物标志物的Western印迹检测。采用免疫球蛋白轻链作为输入对照供于密度分析。(B)小鼠apoE、纤连蛋白、Afamin和凝聚素的Western印迹密度测定。P值采用曼-惠特尼U检验计算。误差棒代表平均值的标准误差。(C)GC患者(n＝11)和对照(n＝13)血清中的五种候选生物标志物的Western印迹检测。采用免疫球蛋白轻链作为输入对照供于密度分析。(D)人Afamin、apoE、凝聚素、纤连蛋白和触珠蛋白的Western印迹密度测定。P值采用曼-惠特尼U检验计算。误差棒代表平均值的标准误差。
图7-(A)图表显示实施例1中对GC患者(n＝11)和对照(n＝13)血清进行的七个ELISA的结果。P值采用曼-惠特尼U检验计算。中空数据点指示女性对象。误差棒代表平均值和平均值的标准误差。(B)由经证明其蛋白质浓度在GC患者和对照之间具有统计学显著差异的四种蛋白质和CA 72-4获得的ROC曲线。还指示了其各自的曲线下面积(AUC)值。
图8-描述实施例1中AACT和纤连蛋白的ELISA结果(标准化浓度)的散点图，其显示GC患者和对照之间没有明显调节。P值采用曼-惠特尼U检验计算。中空数据点指示女性对象。误差棒代表平均值和平均值的标准误差。
图9-显示实施例2中对胃癌(GC)患者(n＝25)和对照(n＝10)血清进行的五次ELISA的结果的图。P值采用曼-惠特尼U检验计算。GC血清由点代表，对照血清由方形代表。绿色符号指示女性，黑色符号指示男性。空心圆指示早期GC而实心圆指示晚期GC。蛋白质水平上的倍数变化在x轴上表示，并且指示由对照向GC的转变。
图10-实施例2中分析的五种蛋白质各自获得的ROC曲线，指示灵敏度(真阳性率–TPR)、特异度(假阳性率–FPR)和曲线下面积(AUC)。
图11–实施例2中分析的五种蛋白质(Afamin–A；凝聚素–C；触珠蛋白–H；IGFALS–I；VDBP–V)的二级组合获得的ROC曲线。
图12–实施例2中分析的五种蛋白质(Afamin–A；凝聚素–C；触珠蛋白–H；IGFALS–I；VDBP–V)的三级组合获得的ROC曲线。
发明详述
本发明部分预计对多种生物标志物的鉴定，其表达水平在获自患胃癌(GC)的患者的样品中有变化。这些生物标志物的差异表达指示它们是合适的标志物，其可形成供于GC的诊断和预后测试的基础。
生物标志物是有效的有机生物分子，相较于其它表型状态(例如，未患某疾病)而言，其在取自一种表型状态(例如，患有该疾病)的对象的样品中差异存在。如果经计算，所述组间的生物标志物的平均或中值表达水平不同(即，更高或更低)，则该生物标志物在不同表型状态组间差异存在。因此，生物标志物，无论单一或组合，均能指示对象属于某一表型状态或其它表型状态。
因此，在第一方面中，本发明提供诊断对象中的胃癌(GC)的方法，所述方法包括：
(a)检测该对象中一种或多种生物标志物的表达水平，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素(clusterin)、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin；
(b)比较所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平和所述或各生物标志物的参比表达水平；和
(c)基于所述比较来诊断对象中的GC。
通过采用遗传学工程改造的炎症相关GC的小鼠模型(gp130F/F)，本发明人已确定前述生物标志物在胃腺瘤发展早期差异表达。
因此，在第二方面中，本发明提供测定对象是否易于发展胃癌(GC)的方法，所述方法包括：
(a)检测该对象中一种或多种生物标志物的表达水平，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin；
(b)比较所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平和所述或各生物标志物的参比表达水平；和
(c)基于所述比较来确定该对象是否易于发展GC。
贯穿说明书使用的术语“胃癌”或“GC”指胃部癌症，包括胃的腺癌。本领域技术人员应理解，胃包括如下四个部分：贲门(包括贲门凹口)；基底；体或主体(包括角切迹或凹口)；和幽门(包括括约肌、幽门窦和幽门管)。术语“胃癌”或“GC”还涵盖胃肠道其它区域的癌症。
本发明方面中的上述方法需要检测生物标志物VDBP、凝聚素、IGFALS和Afamin中一种或多种的表达水平。下文中详细讨论这些标志物。
如本文中所用，术语“检测”生物标志物的“表达水平”包括：(1)检测对应基因转录成为信使RNA(mRNA)分子的水平；和/或(2)检测所述mRNA翻译成为蛋白质的水平(即，检测蛋白质本身的水平)；和/或(3)检测翻译后蛋白质的活性水平。
结果，生物标志物的表达水平可在RNA和/或蛋白质表达阶段检测。
因此，本文所用的术语“生物标志物”包括但不限于，蛋白质(多肽)、多核苷酸(例如，mRNA)和/或代谢物，在患有胃癌的对象中或在取自患有胃癌的对象的样品中，所述这些物质的表达水平(例如，转录水平、翻译水平和/或活性水平)相较于正常样品中相同生物标志物的表达水平(即，参比表达水平)而言升高或下降。本文所述的任何生物标志物还包括能够轻易被本领域技术人员鉴定的其基因和蛋白质同义物。
应理解，术语“基因”指染色体组核苷酸序列(核或线粒体)的某一区域，其包括编码区，所述编码区被转录并翻译成蛋白质。因此，本发明内容中的“基因”可包括调节区(例如，启动子区)、转录区、外显子、内含子、未翻译区和与该基因相关联的其它功能性和/或非功能性序列区域。因此，在一个实施方式中，对象或样品中生物标志物的“表达水平”可反应该对象或样品中对应基因转录成为mRNA的程度。
本领域技术人员应理解，蛋白质是初级由氨基酸组成的功能性生物分子，其氨基酸序列由对应基因决定。因此，在一个实施方式中，对象或样品中生物标志物的“表达水平”可反应该对象或样品中对应基因的mRNA翻译成为蛋白质的程度。
用于检测mRNA翻译成蛋白质的水平的方法是本领域已知的。例如，蛋白质水平可通过如下技术检测，所述技术包括但不限于：基于抗体的测试(包括Western印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附实验(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、免疫沉淀反应和解离增强的里镧系元素氟免疫测定(DELFIA))、蛋白质组学技术、表面等离子体共振(SPR)、通用基于纤维的SPR、化学发光、荧光偏振技术、磷光、免疫组织化学、免疫荧光、基质辅助的激光解吸/离子化质谱(MALDI-MS)，如WO 2009/004576中所述(包括表面增强激光解吸/离子化质谱(SELDI-MS)，特别是表面增强的亲和性捕获(SEAC)、蛋白质微阵列、表面增强的需求解吸(SEND)或表面增强的光标记物附着和释放(SEPAR))、基质辅助的激光解吸/离子化-飞行时间(MALDI-TOF)质谱、微细胞计数、微阵列、显微镜法、荧光活化的细胞分选(FACS)和流式细胞术。
对于基于抗体的测试方法例如免疫组织化学法和免疫印迹法，采用抗体或抗血清，优选多克隆抗血清，且最优选对在研的各蛋白质具有特异性的单克隆抗体来检测蛋白质丰度。所述抗体可通过直接标记抗体本身，例如采用放射性标记物、荧光标记物、半抗原标记物(例如生物素或酶例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)来检测。或者，可将未经标记的一抗和经标记的二抗联用，包括对所述一抗具有特异性的抗血清、多克隆抗血清或单克隆抗体。免疫组织化学方案和试剂盒是本领域中熟知的，并且市售可得。抗体可通过本领域中熟知的方法生成，例如，通过用在研蛋白质免疫动物。
还设想传统的免疫测定，包括，例如夹心法免疫测定，包括ELISA或基于荧光的免疫测定，以及其它酶免疫测定。比浊法是在液相中进行的试验，其中抗体在溶液中。在研蛋白质与所述抗体的结合导致可检测的吸光度变化。在基于SELDI的免疫测定中，使针对感兴趣蛋白质的生物特异性捕获试剂连接至MS探针的表面，例如预活化的蛋白质芯片(ProteinChip)阵列(见下文)。然后，所述蛋白质通过该试剂特异性地捕获在所述生物芯片上，随后捕获的蛋白质通过质谱检测(见下文)。
采用基于抗体的平台来评估蛋白质水平的其它技术涉及通用的基于纤维的表面等离子体共振(VeSPR)生物传感器，其如PCT国际公开号WO2011/113085中所述。传统的SPR是成熟建立的用于无标记生物传感的方法，其依赖于电介质基质和薄金属覆层之间界面处的游离电子的激发。使引入光线结合进入等离子体波的条件取决于入射角和引入光线的波长，以及传感器本身的物理性质(介电常数/折射率)和周围环境。出于该原因，SPR甚至对传感器的紧密邻近处的密度(折射率)中的小的变化敏感，因而不需要采用荧光标记物。由生物分子(例如蛋白质)结合至所述传感器表面而诱导的折射率的小变化可通过监测经由引入光的入射角或波长的结合条件来检测。现有的SPR系统采用大容量且昂贵的Krestchmann棱镜构造，其中所述棱镜的一侧被覆金属，例如金或银，其可支持等离子体波。基于光学纤维已开发出替代性的SPR构造，其在所述纤维的短切断面周围沉淀有金属覆层。该方法降低了此类传感器的复杂性和成本，开创了不同的应用方式，例如倾角传感(dip sensing)。传感器表面的材料通过监测广谱中的因结合至表面等离子体而被吸收的波长来探测。这些技术的问题来自与对细致温度校正的需求相关联的实际操作限制，这导致难以一贯地分析大量样品。已在近期开发出基于光学纤维的SPR传感器(称作VeSPR)的新型且有力的变化形式。VeSPR经证明在多个方面优于现有SPR技术，这些优势包括：(i)较高的信号-噪音比，从而具有较高灵敏度；(ii)转导信号的自参考，从而避免昂贵/庞大的温度控制；和(iii)采用单一纤维对不同分析物进行多重检测的能力。
还可采用蛋白质组学来分析某一时间点处样品中存在的感兴趣蛋白质的表达水平。具体而言，可采用蛋白质组学来评估样品中蛋白质表达的全局变化(也称作表达蛋白质组学)。蛋白质组学分析通常包括：(i)通过2-D凝胶电泳(2-D PAGE)来分离样品中的个体蛋白质；(ii)鉴定从该凝胶回收的个体多肽，例如，通过质谱或N末端测序进行所述鉴定；和(iii)利用生物信息学分析数据。
还可采用蛋白质微阵列(也称作生物芯片)来测定样品中感兴趣蛋白质的表达水平。本领域中描述了多种蛋白质芯片，其包括：例如由塞弗吉生物系统公司(Ciphergen Biosystems,Inc.)(加利福尼亚州菲蒙市)、Zyomyx公司(加利福尼亚州海沃德)、英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)、Biacore公司(瑞典乌普萨拉)和Procognia公司(英国伯克郡)。此类蛋白质芯片的示例表述于如下专利或公开的专利申请中：美国专利号6,225,047、6,537,749、6,329,209和5,242,828，以及PCT国际公开号WO 00/56934和WO 03/048768。
感兴趣蛋白质的表达水平还可通过质谱来检测，其为采用质谱仪来检测气相离子的方法。质谱仪的示例有飞行时间、磁式扇形分析仪、四极滤质器、离子阱、离子回旋共振、电子式扇形分析仪以及这些的组合。
质谱仪可以是激光解吸/离子化质谱仪。在激光解吸/离子化质谱仪中，将待测的一种或多种蛋白质置于质谱探针的表面上，该装置适合接合该质谱仪的探针界面并且将所述一种或多种蛋白质呈现至电离能量，供于离子化和引入质谱仪。激光解吸质谱仪采用激光能量(通常来自紫外线激光器，但也可来自红外线激光器)，以解吸来自表面的分析物，以使其挥发或离子化并使其能够接触该质谱仪的离子光学系统。通过LDI的蛋白质分析可如下所述以MALDI或SELDI的方式进行。
SELDI方法在例如美国专利号5,719,060和6,225,047中有描述，并且涉及解吸/离子化气相离子光谱法(例如，质谱)，其中分析物(在该情况下是一种或多种待测蛋白质)被捕获在SELDI质谱探针的表面上。SELDI还涵盖亲和捕获质谱、表面增强亲和捕获(SEAC)和免疫捕获质谱(icMS)，如Penno MA等.2012(Res.Vet.Sci.,93:611-617所述。这些平台涉及探针的应用，所述探针在探针表面上具有某种材料，该材料通过其与蛋白质之间的非共价亲和相互作用(吸附)来捕获蛋白质。所述材料被广泛地称作“吸附剂”、“捕获试剂”、“亲和试剂”或“结合部分”。此类探针可被称作“亲和捕获探针”并具有“吸附表面”。
所述捕获试剂可以是能够结合蛋白质的任何材料。所述捕获试剂可通过物理吸附或化学吸附来连接至所述探针表面。可以采用功能化生物芯片或磁珠形式的探针可已在其表面连接有捕获试剂，或所述探针是预活化的并且包括能够结合所述捕获试剂的反应性部分，例如，通过反应形成共价键或配位共价键。环氧化物和酰基-咪唑是可用的反应性部分，以共价结合蛋白质捕获试剂，例如抗体或细胞受体。次氮基三乙酸和亚氨基二乙酸是可用的反应性部分，其作为螯合剂来结合与含组氨酸的蛋白质非共价相互作用的金属离子。吸附剂一般分为色谱吸附剂和生物特异性吸附剂。
色谱吸附剂指色谱中通常采用的吸附材料。色谱吸附剂包括，例如，离子交换物质、金属螯合剂(例如，次氮基三乙酸或亚氨基二乙酸)、固定的金属螯合物、疏水相互作用吸附剂、亲水相互作用吸附剂、染料、简单生物分子(例如，核苷酸、氨基酸、单糖和脂肪酸)和混合的模式吸附剂(例如，疏水吸引/静电排斥吸附剂)。
生物特异性吸附剂指的是包含生物分子的吸附剂，所述生物分子例如核酸分子(例如，适体)、多肽、多糖、脂质、类固醇或其偶联物(例如，糖蛋白、脂蛋白、糖脂、核酸(例如，DNA-蛋白质偶联物)。在某些情况中，所述生物特异性吸附剂可以是大分子结构，例如多蛋白复合物、生物膜或病毒。生物特异性吸附剂的示例有抗体、受体蛋白和核酸。生物特异性吸附剂对于靶蛋白通常具有比色谱吸附剂高的特异性。
一般而言，使有吸附表面的探针接触测试样品足以允许该在研蛋白质结合至所述吸附剂的一段时间。在孵育阶段之后，清洗该基质以去除未结合的物质。可采用任何合适的清洗溶液；优选采用水性溶液。可以通过调节所述清洗的严谨度来控制分子保持被结合的程度。清洗溶液的洗脱性质可视如下条件而定，例如，pH、离子强度、疏水性、离液度、去污强度和温度。除非所述探针具有SEAC和SEND性质(如本文所述)，然后对带有结合的生物标志物的基质施加能量吸收分子。
在另一个方法中，在研蛋白质可用具有特异性结合至该蛋白质的抗体的固相结合免疫吸附剂捕获。在清洗该吸附剂以去除未结合的物质之后，所述蛋白质从该固相洗脱并通过将其施加至结合该蛋白质的生物芯片来检测。
在气相离子光谱仪(例如飞行时间质谱仪)中检测结合至所述基质的在研蛋白质。所述蛋白质通过离子化源(例如激光器)离子化，生成的离子通过离子光学组件收集，然后质量分析仪分散并分析通过的离子。然后，检测仪将检测的离子的信息翻译成质量-电荷比。对蛋白质的检测通常会涉及对信号强度的检测。因此，可测定所述蛋白质的量和质量。
激光解吸质谱的另一种方法称作表面增强净解吸(SEND)。SEND涉及探针的应用，所述探针包含与该探针表面(“SEND探针”)化学结合的能量吸收分子。短语“能量吸收分子”(EAM)指能够从激光解吸/离子化源吸收能量，此后促进与其接触的分析物分子的解吸和离子化的分子。EAM种类包括用于MALDI的分子，常被称为"基质(matrix)"并且示例有肉桂酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰基-羟基-肉桂酸(CHCA)和二羟基苯甲酸、阿魏酸和羟基丙酮-苯基酮衍生物。可将能量吸收分子纳入线性或交联聚合物，例如，聚甲基丙烯酸酯。例如，所述组合物可以是α-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸和丙烯酸酯的共聚物。或者，所述组合物可以是α-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸、丙烯酸酯和3-(三-乙氧基)甲硅烷基丙基异丁烯酸酯的共聚物，或可以是α-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸和十八基异丁烯酸酯的共聚物("Cl 8SEND")。SEND在美国专利号6,124,137和PCT国际公开号WO 03/64594中有进一步描述。
SEAC/SEND是激光解吸质谱的形式，其中捕获试剂和能量吸收分子连接至样品呈递表面。因此，SEAC/SEND探针允许通过亲和捕获和离子化/解吸来捕获在研蛋白质，而无需应用额外基质。Cl 8SEND生物芯片是SEAC/SEND的一种形式，其包含作为捕获试剂的Cl 8部分和作为能量吸收部分的CHCA部分。
LDI的另一种形式称为表面增强的光不稳定附着和释放(SEPAR)。SEPAR涉及探针的应用，所述探针具有附着至能共价结合蛋白质和的表面的部分，然后通过在暴露至光(例如，暴露至激光)之后使该部分中的光不稳定键断裂来释放所述蛋白质。SEPAR和SELDI的其它形式容易适用于本发明方法中所需的对于蛋白质或蛋白质概况的检测。
MALDI是激光解吸/离子化的传统方法。在一种MALDI方法中，使待测试样品与基质混合，并直接沉积在MALDI芯片上。视测试的样品而定，测试的样品优选首先用偶联至固体支持物(例如树脂)(例如在离心柱中)的生物特异性(例如抗体)或色谱材料捕获。可能结合该检测的蛋白质的特异性亲和材料如上所述。在该亲和材料上进行纯化之后，在研蛋白质经洗脱然后由MALDI检测。
通过飞行时间质谱法分析的蛋白质产生飞行时间谱。最终分析的飞行时间谱通常不代表来自针对样品的离子化能量的单一脉冲的信号，而是来自多个脉冲的信号之和。这降低噪音并扩大动态范围。然后，采用特定软件对该飞行时间数据进行数据处理。数据处理通常包括用以生成质谱的TOF-M/Z转换，用以消去仪器抵消的基线扣除和用以减少高频噪音的高频噪音过滤。通过蛋白质的解吸和检测产生的数据可采用可编程的数字计算机来分析。该计算机程序分析所述数据以指示检测到的蛋白质的数量，并任选地指示各测得蛋白质的信号强度和测定的分子量。数据分析可包括测定蛋白质信号强度和从预定统计学分布剔除偏离数据的步骤。例如，可通过计算相对于一些参比的各峰的高度来使观察到的峰标准化。计算机能够将所得数据转换成供于显示的不同形式。可显示标准谱，但在一种有用形式中，仅从该谱视图保留峰高和质量信息，产生更清楚的图像并使具有近乎相同的分子量的蛋白质更容易地被观察到。在另一个有用形式中，比较两个或更多个谱，将样品间表达水平不同的蛋白质方便地高亮显示。采用任何这些形式，均能够容易地确定特定蛋白质是否存在于样品中，以何种水平存在。
分析通常涉及对谱中代表某一蛋白质信号的峰的鉴定。峰的选择可通过肉眼完成，但也可采用市售软件来使峰的检测自动化。一般而言，该软件的作用是鉴定具有高于选定阈值的信噪比的信号，并在该峰信号的质心处标记该峰的质量。在一个有用的应用中，可比较多个谱来鉴定一些选定百分比的质谱中存在的相同的峰。该软件的一个形式聚集看似在确定质量范围的不同谱中的所有的峰，并对处于该质量(M/Z)集合终点附近的所有的峰分配质量(M/Z)。
用于分析数据的软件可包括如此编码，所述编码对信号分析应用算法以确定该信号是否代表信号中对应于在研蛋白质的峰。该软件还可对观察到的蛋白质的峰的有关数据进行分类树或ANN分析，以确定蛋白质峰或蛋白质峰的组合是否存在，其指示所检测的特定临床参数的状态。对于所述数据的分析可以从对所述样品的质谱分析直接或间接地获得的各种参数为“重心()”。这些参数包括但不限于：一个或多个峰的存在或不存在、一个峰或一组峰的形状、一个或多个峰的高度、一个或多个峰的高度的log，以及对于峰高数据的其它算术处理。
对于蛋白质活性的检测，测定类型将视在研蛋白质的功能而定。例如，VDBP是维生素D3及其代谢物的主要血浆载体，并且确保维生素D被运转至肝脏，25(OH)2D3被运转至肾脏，且1,25(OH)2D3被运转至靶细胞和器官。VDBP还显示在巨噬细胞活化中具有重要作用，这与其维生素D结合能力不同。例如，已显示VDBP增强活化的补体肽的白细胞趋化活性，所述补体肽是巨噬细胞活化因子的前体。此类活性可形成对VDBP蛋白质活性分析的基础。对于凝聚素而言，已显示该蛋白质与多种活性有关，包括编程的细胞死亡、对补体介导的细胞裂解的调节、膜再循环、细胞-细胞粘附和src诱导的转化。凝聚素也有补体抑制剂的作用，其作为补体攻击复合物的部分。在这些活性的进行中，凝聚素结合至多种伴侣，例如免疫球蛋白、脂质、肝素、细菌、补体成分、对氧磷酶、β淀粉状蛋白、瘦素等。此类活性和结合伴侣可形成对凝聚素蛋白质活性分析的基础。对于IGFALS而言，已知该蛋白质结合胰岛素样生长因子，延长其半衰期并增加其血管定位。例如，IGFALS结合胰岛素样生长因子结合蛋白质-3(IGFBP-3)，因而可采用检测所述两种蛋白质之间结合程度的试验。此外，已知Afamin具有维生素E结合活性，从而检测所述两者之间的结合的量或水平的试验将反映特定样品中Afamin蛋白的水平。可将该水平与正常对照样品中的结合水平做比较。
用于检测基因转录成mRNA的方法也是本领域已知的。例如，可通过如下技术来检测mRNA的水平，所述技术包括但不限于Northern印迹、RNA原位杂交、反转录酶PCR(RT-PCR)、实时(定量)RT-PCR、微阵列或“基于标签”的技术，例如SAGE(基因表达序列分析)。微阵列和SAGE可用于同时定量多于一种基因的表达。可基于所述基因或其转录本的核苷酸序列来设计引物或探针。可采用与Paik等,2004(NEJM,351(27):2817-2826)或Anderson等,2010(Journal ofMolecular Diagnostics,12(5):566-575)中公开类似的方法来检测一种或多种感兴趣基因的表达。标准分子生物学课本中也描述了多种方法，例如Sambrook等.(Molecular Cloning–A Laboratory Manual(《分子克隆-实验室手册》)，第3版、冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，2000)。
对于RT-PCR而言，第一步通常是从获自在研对象的样品分离总RNA。该情况中典型的样品将是组织样品，例如胃肿瘤样品(以及，若可能，对应的正常胃组织)，尽管下文中描述了预期的其它样品来源。若RNA来源来自肿瘤，也可以从例如先前获自所述对象的冰冻或存档的石蜡包埋且固定(例如，福尔马林固定)的组织样品提取RNA。后续可从总RNA样品纯化信使RNA(mRNA)。然后，采用合适的反转录酶使总RNA样品(或纯化的mRNA)反转录成cDNA。视RNA模板而定，所述反转录步骤通常采用寡dT引物、随机六聚物或对相关基因具有特异性的引物来开始。然后，源自所述反转录反应的cDNA作为典型PCR反应的模板。就这点而言，采用对相关基因具有特异性的两种寡核苷酸PCR引物来生成PCR产物。在该PCR反应中，还采用设计以检测另两个PCR引物之间定位的核苷酸序列的第三寡核苷酸或探针。该探针不可由PCR反应中所用的TaqDNA聚合酶伸长，并且用报告子荧光染料和淬灭剂荧光染料标记。当两种染料在探针上彼此定位接近时，来自所述报告子染料的任何激光诱导的发射由所述淬灭剂染料淬灭。在PCR扩增反应过程中，Taq DNA聚合酶以模板依赖性方式切割所述探针。所得的探针片段在溶液中分离，而来自分离的报告子染料的信号从第二荧光团的淬灭效应中释放。每个合成的新分子放出一个报告子染料分子，而对未淬灭的报告子染料的检测提供用于对数据进行定量说明的基础。
在实时RT-PCR中，产物形成的量和产物形成的时间，在所述PCR反应中与起始模板的量相关。具有较高水平mRNA的样品相较于标准或“正常”样品而言将更快速地累积RT-PCR产物。实时RT-PCR检测DNA荧光插入染料(例如插入合成的PCR产物的Sybr Green)或可检测PCR产物积累，所述检测通过双标记的荧光生成探针(即，TaqMan探针)进行。RT-PCR反应的进行可采用PCR仪(例如应用生物系统公司(Applied Biosystem)的Prism 7000或罗氏公司(Roche)的LightCycler，其检测实时中的产物积累)监测。实时RT-PCR与定量竞争性PCR和定量比较性PCR兼容。前者采用各靶序列的供于标准化的内部竞争物，而后者采用样品中包含的标准化基因或管家基因用于RT-PCR。
用于在转录水平检测基因的表达水平的微阵列的生产和应用是本领域中熟知的。一般而言，在微阵列中，核苷酸序列(例如寡核苷酸、cDNA或基因组DNA)代表占据底物上已知位置的一种或多种相关基因的部分或全部。通常而言，所述底物包括大量核苷酸序列，从而能够同时分析一种或多种所述相关基因。然后，使获自感兴趣对象的核酸靶标样品(例如，总RNA或mRNA)杂交至所述微阵列，并对杂交至所述阵列上各探针的靶核酸的量定量，然后与标准或“正常”样品的杂交做比较。一个示例性的定量方法是采用共聚焦显微镜和荧光标记物。Affymetrix GeneChipTM阵列系统(昂飞(Affymetrix)，加利福尼亚州圣克拉拉市)和AtlasTM人类cDNA表达阵列系统特别适合于定量所述杂交；然而，对本领域技术人员显而易见的是，也可采用任何类似的系统或其它功效等同的检测方法。荧光标记的cDNA探针也可代表核酸靶标样品。此类探针可通过在提取自测试对象的样品的总RNA或mRNA的反转录过程中纳入荧光核苷酸来生成。施加至所述微阵列的经标记的cDNA探针将会特异性地杂交至该阵列上DNA的当量斑点。对于各分析成分的杂交的定量允许评估与标准或“正常”样品中观察到的丰度相比较的该样品中对应的mRNA的丰度。采用双色荧光，使产生自两种RNA来源的分开标记的cDNA探针成对杂交至该阵列。因此，同时测定对应于各特定基因的两个来源的转录本的相对丰度。采用微阵列分析的减小规模的杂交提供对于大量基因的表达模式的方便且快速的评价。此类方法已显示具有检测稀少转录本(以几个拷贝/细胞的量表达)所需的灵敏度，并且可重现性地检测表达水平中的至少约两倍差异。
在所述对象中，可直接检测一种或多种所述蛋白质的表达水平，或在替代性实施方式中，可在获自对象的样品中检测一种或多种所述蛋白质的表达水平。需清楚的是，通过本发明方法分析的获自所述对象样品可于先前从该对象获得，并且，例如，已贮存于合适的储藏室。在该情况中，所述样品将已经以分离的方式从该对象获得，因而不包括在本发明方法中。
获自所述对象的样品可包括但不限于：血液样品或源自血液的样品(例如，血清样品或血浆样品或血成分、血清或血浆样品、血液细胞)、唾液、口腔拭子、胃液、粪便样品、膀胱洗液、精液、尿液和胃肠组织样品(例如胃或食道组织样品)。在某些情况下，所述样品可在获得后以任何方式处理，例如通过采用试剂、溶解或富集某些组分(例如在研的相关蛋白质或多肽)进行处理。
在一个实施方式中，所述样品是获自所述对象的血清样品。血清源自血浆，其是血液的黄色液体成分，全血中的血细胞在正常情况下是悬浮于其中的。其占总血液体积的约55％。其大部分是水(90％以体积计)并包含溶解的蛋白质、葡萄糖、凝固因子、矿物质离子、激素和二氧化碳。血浆通过使装有新鲜血液的管在离心机中离心直至血细胞沉降至管底来制备。然后，倒出或放出血浆。血浆，优选补充有凝固抑制剂，例如肝素或EDTA，其密度约为1.025kg/1。血清是不含纤维蛋白原或其它凝固因子的血浆(即，全血减去细胞和凝固因子)。
在一个实施方式中，所述样品是获自所述对象的组织样品。例如，所述组织样品可以是取自肿瘤的活检物。所述组织样品可经固定并无限期地贮存或贮存直至进行分析。取自所述样品的组织切片可染色供于组织学分析和进行上述试验以测定该样品中存在的生物标志物蛋白质的水平。或者，可从获自所述对象的组织样品提取RNA，并对所述RNA进行上述试验以测定该样品中存在的生物标志物mRNA的水平。在所述样品是组织样品的情况下，出于比较的目的，理想上应获得邻近正常胃组织的样品。
一旦检测了该对象内或获自该对象的样品内的一种或多种生物标志物的表达水平，即可将该表达水平与各生物标志物的参比表达水平做比较。特定生物标志物的参比表达水平是与已知胃癌(GC)状态相关联的该生物标志物的表达水平，即，在未患GC的对象(本发明内容中的“正常”对象)中发现的已知表达水平。各生物标志物的参比表达水平可获自至少一位正常对象，并且优选获自多位对象(例如，n＝2～100或更大)的平均，其中所述一个或多个对象没有先前GC史。各生物标志物的参比表达水平还可获自来自疑似患有GC的对象的一个或多个正常样品。例如，各生物标志物的表达水平可获自至少一个正常样品，并且优选获自多个正常样品(例如，n＝2～100或更大)的平均，其中所述对象疑似患有GC。
在一些实施方式中，测试样品中的所述一种或多种生物标志物的表达水平可能高于获自一个或多个正常样品的参比表达水平。在一些实施方式中，测试样品中的所述一种或多种生物标志物的表达水平可能低于获自一个或多个正常样品的参比表达水平。下文将更详细讨论这一点。
如上所述，本发明方法涉及检测一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin。这些生物标志物以及其相关基因和编码的蛋白质的详细信息可从国家生物技术信息中心的GenBank数据库获得(www.ncbi.nlm.nih.gov)。例如，人VDBP的基因编号是2638，人凝聚素是1191，人IGFALS是3483，而人Afamin是173。这些GenBank记录的内容通过引用纳入本文。
在需要检测翻译阶段的一种或多种前述生物标志物的表达水平(例如检测蛋白质本身的水平)的本发明实施方式中，由各生物标志物编码的氨基酸序列的详细信息也可从GenBank数据库获得。例如，人VDBP基因编码三种蛋白质变体，其由如下GenBank登录号代表：NP_000574.2(变体1)、NP_001191235.1(变体2)和NP_001191236.1(变体3)。人凝聚素基因编码的蛋白质由GenBank登录号NP_001822.3代表。人IGFALS基因编码的两种蛋白质变体由如下GenBank登录号代表：NP_001139478.1(变体1)和NP_004961.1(变体2)。人Afamin基因编码的蛋白质由GenBank登录号NP_001124.1代表。或者，由各生物标志物编码的氨基酸序列的详细信息可从UniProt数据库(www.uniprot.org)获得，其中人VDBP蛋白(包括各变体)的UniProt编号是P02774，人凝聚素蛋白是P10909，人IGFALS是Q8TAY0(变体1和2)和P35858(变体2)，而人Afamin蛋白是P43652。
在需要检测转录阶段的一种或多种前述生物标志物的表达水平(例如检测对应基因的mRNA水平)的本发明实施方式中，转录的一条或多条核苷酸序列的详细信息也可从GenBank数据库获得。例如，人VDBP基因转录成为的三种变体由如下GenBank登录号代表：NM_000583.3(变体1)，NM_001204306.1(变体2)和NM_001204307.1(变体3)。人凝聚素基因也转录成三种变体，其由如下GenBank登录号代表：NM_001831.3(变体1)，NR_038335.1(变体2)和NR_045494.1(变体3)。然而，仅转录本变体1编码功能蛋白。人IGFALS基因也转录成三种变体，其由如下GenBank登录号代表：NM_001146006.1(变体1)，NM_004970.2(变体2)和NR_027389.1(变体3)。然而，这三种变体不编码功能蛋白。最后，人Afamin基因转录成由GenBank登录号NM_001133.2代表的核苷酸序列。
对于上述两段，应该清楚述及VDBP、凝聚素、IGFALS和Afamin包括述及这些生物标志物的天然产生的变体。就这点而言，生物标志物的“变体”可显示与天然生物标志物具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.9％相同性的氨基酸或核酸序列。在一些实施方式中，天然生物标志物的变体可保留天然生物活性或与其基本等同的活性。在一些实施方式中，变体可具有基本生物活性，例如如同作为所述生物活性生物标志物的前体的那些变体。VDBP、凝聚素、IGFALS和Afamin的天然发生的变体的示例如上所述。
本文中所用的术语“对象”指任何动物(例如，哺乳动物)，其包括但不限于，人、非人灵长类、狗、猫、马、牛、绵羊、鹿、猪、啮齿类和已知患GC的任何其它动物。因此，当人氨基酸和mRNA序列已如上述及时，应理解本发明方法不限于人类。不同物种的这些特定蛋白质及其相关氨基酸和mRNA序列的细节可容易地从GenBank和UniProt数据库获得(例如，小家鼠(Mus musculus)VDBP的基因编号是14473，凝聚素是12759，IGFALS是16005，而Afamin是280662)或序列可通过BLAST检索鉴定。在一些情况下，可用于检测一种物种中的蛋白质/基因表达的引物、探针或抗体也可用于不相关的物种。
在一些实施方式中，所述生物标志物可以是VDBP，包括例如人VDBP。在一些实施方式中，对VDBP表达水平的检测包括检测对象中VDBP蛋白或mRNA的水平，例如通过采用上文详细描述的方法进行所述检测。
本发明人发现，对象内VDBP的表达水平低于VDBP参比表达水平指示该对象内的GC，或指示该对象易于发展GC。本文所述的关于本文述及的生物标志物(包括VDBP)在翻译(蛋白质)或转录(mRNA)阶段的表达水平“低于”意在指该生物标志物的表达水平比参比表达水平低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、5倍、5.1倍、5.2倍、5.3倍、5.4倍、5.5倍、5.6倍、5.7倍、5.8倍、5.9倍、6.0倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
在一些实施方式中，所述生物标志物可以是凝聚素，包括例如人凝聚素。在一些实施方式中，对凝聚素表达水平的检测包括检测对象中凝聚素蛋白或mRNA的水平，例如通过采用上文详细描述的方法进行所述检测。
本发明人发现，凝聚素的表达水平低于凝聚素参比表达水平指示该对象内的GC，或指示该对象易于发展GC。
在一些实施方式中，所述生物标志物可以是IGFALS，包括例如人IGFALS。在一些实施方式中，对IGFALS表达水平的检测包括检测对象中IGFALS蛋白或mRNA的水平，例如通过采用上文详细描述的方法进行所述检测。
本发明人发现，对象内IGFALS的表达水平高于IGFALS参比表达水平指示该对象内的GC，或指示该对象易于发展GC。本文所述的关于本文述及的生物标志物(包括IGFALS)在翻译(蛋白质)或转录(mRNA)阶段的表达水平“高于”意在指该生物标志物的表达水平比参比表达水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
在一些实施方式中，所述生物标志物可以是Afamin，包括例如人Afamin。在一些实施方式中，对Afamin表达水平的检测包括检测对象中Afamin蛋白或mRNA的水平，例如通过采用上文详细描述的方法进行所述检测。
本发明人发现，Afamin的表达水平低于Afamin参比表达水平指示该对象内的GC，或指示该对象易于发展GC。
对GC中前述生物标志物的差异表达的鉴定一使方法能够评估针对GC进行治疗的对象中的治疗功效。
因此，在第三方面中，本发明提供评估对象中胃癌(GC)进展的方法，所述方法包括：
(a)检测该对象中一种或多种生物标志物的表达水平，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素(clusterin)、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin；
(b)比较所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平和所述或各生物标志物的参比表达水平；和
(c)基于所述比较来评估该对象中GC的进展。
在本发明的一些实施方式中，在多于一个时间点检测一种或多种生物标志物的表达水平。这种“连续”取样非常适于，例如，监测胃癌的进展。连续取样可以任何所需的时间线进行，例如每月、每季度(即，每三个月)、每半年、每年、每两年或更低频率。检测的对象中的表达水平和参比表达水平之间的比较可在每次新样品检测时进行，或可将水平有关的数据供于更低频率的分析。
在本发明第三方面的一个实施方式中，所述对象经历针对GC的治疗。所述治疗可以是传统治疗例如化疗或放疗，或所述治疗可以是替代性治疗。在一个替代性实施方式中，所述对象可能根本不经历治疗。
在本发明第三方面的一些实施方式中，对VDBP、凝聚素、IGFALS和/或Afamin生物标志物的表达水平的检测包括检测对象中或取自该对象的样品中的VDBP、凝聚素、IGFALS和/或Afamin蛋白质或mRNA的水平。在一些实施方式中，VDBP、凝聚素和/或Afamin的表达水平低于各生物标志物的参比表达水平指示该对象中的GC进展。在一些实施方式中，IGFALS的表达水平高于IGFALS的参比表达水平指示该对象中的GC进展。
在一些实施方式中，本发明第三方面的方法可用于进行新药的临床试验，以及监测对象对该药物的进展。治疗或临床试验涉及以特定方案给予测试药物。所述方案可涉及一定时间内该药物的单剂量给药或该药物的多剂量给药。医生或临床研究者监测所述药物在给予时程内对该对象的影响。若该药物对GC有药理学影响，则前述生物标志物的表达水平将会近似或等于所述蛋白质的参比表达水平。因此，可在治疗时程过程中监测该对象内的所述生物标志物的表达水平的趋势。可采用上文详述的方法来测定一种或多种生物标志物的表达水平。该方法的一个实施方式涉及在药物治疗过程中的至少两个不同时间点(例如，第一时间和第二时间)测定前述生物标志物的表达水平，并比较所述生物标志物表达水平的变化(若存在)。例如，可在药物给予之前和之后或药物给予过程中的不同时间点检测所述生物标志物的表达水平。基于这些比较来确定治疗的效果。若治疗有效，则前述生物标志物的表达水平将近似或等于所述生物标志物的参比表达水平，而若治疗无效，则前述生物标志物的表达水平将保持高于或低于所述生物标志物的参比表达水平。
在第四方面中，本发明提供用于筛选能用于治疗胃癌的候选治疗剂的方法，所述方法包括测定所述候选治疗剂在调节一种或多种生物标志物的表达水平中的活性，所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin。
筛选试验可以体外和/或体内方式进行。例如，可在基于细胞的试验中筛选预期的试剂以鉴定用于治疗胃癌的候选治疗剂。就此而言，使各预期试剂与培养的细胞(例如获自正常对象或患胃癌对象的胃肠道的细胞，或源自正常或患病对象的细胞系)孵育，然后检测生物标志物表达水平的转变。因此，在本发明第四方面的一个实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(a)使所述候选治疗剂暴露至表达所述或各生物标志物的细胞；
(b)检测所述细胞中的所述或各生物标志物的表达水平变化；和
(c)比较所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平和所述或各生物标志物的参比表达水平，
其中，若所述或各生物标志物的表达水平接近或等于所述或各生物标志物的参比表达水平，则该候选治疗剂可用于治疗对象中的GC。
在另一个示例中，可在基于器官培养的试验中筛选候选治疗剂。就此而言，使各预期治疗剂与源自非人类动物的完整器官或器官的部分(例如正常或患病对象的胃肠道的部分)孵育，并检测所述目标生物标志物的表达水平的转变。
筛选方法还可采用给予患胃癌的对象预期的治疗试剂。因此，在本发明第四方面的一个实施方式中，所述方法包括检测该对象中所述或各生物标志物的表达水平，其中所述表达水平在给予所述对象候选治疗剂之后检测。然后，将所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平和所述或各生物标志物的参比表达水平做比较。若该对象中所述或各生物标志物的表达水平接近或等于所述或各生物标志物的参比表达水平，则可认为该候选治疗剂可用于治疗GC。可通过上文详述的方法来检测一种或多种生物标志物的表达水平。
在本发明第四方面的一些实施方式中，所述候选治疗剂将使对象或细胞内的VDBP、凝聚素或Afamin的表达水平提高，或使IGFALS的表达水平降低，其所达到的水平近似或等于各生物标志物的参比表达水平。
本发明前述方面的方法需要检测VDBP、凝聚素、IGFALS或Afamin生物标志物中一种或多种的表达水平。然而，本领域技术人员应理解，可额外或与VDBP、凝聚素、IGFALS和/或Afamin同时检测其它生物标志物的表达水平。例如，已知在GC中差异表达的生物标志物也可纳入本发明方法。
例如，发明人已显示载脂蛋白E(ApoE)和触珠蛋白在GC样品中差异表达。具体而言，GC样品中的ApoE和触珠蛋白的表达水平高于其在“正常”样品中的表达水平。因此，本发明方法可涵盖检测VDBP、凝聚素、IGFALS或Afamin中一种或多种的表达水平，联合检测ApoE和触珠蛋白之一或两者的表达水平。ApoE和触珠蛋白的表达水平可采用上文详述的方法检测。
ApoE和触珠蛋白生物标志物的详细信息可从国家生物技术信息中心的GenBank数据库获得(www.ncbi.nlm.nih.gov)。例如，人ApoE的基因编号是348，而人触珠蛋白是3240。这些GenBank记录的内容通过引用纳入本文。
在需要检测翻译阶段的ApoE和触珠蛋白生物标志物的表达水平(例如检测蛋白质本身的水平)的本发明实施方式中，由各基因编码的氨基酸序列的详细信息也可从GenBank数据库获得。例如，人ApoE基因编码的蛋白质由GenBank登录号NP_000032.1代表，而人触珠蛋白基因编码的两种蛋白质变体由如下GenBank登录号代表：NP_005134.1(变体1)和NP_0011195741.1(变体2)。或者，由这些生物标志物各自编码的氨基酸序列的详细信息可从UniProt数据库(www.uniprot.org)获得，其中人ApoE蛋白的UniProt编号是P02649，而人触珠蛋白是P00738。
在需要检测转录阶段的ApoE和触珠蛋白生物标志物的表达水平(例如检测对应基因的mRNA水平)的本发明实施方式中，转录的一条或多条核苷酸序列的详细信息也可从GenBank数据库获得。例如，人ApoE基因转录成由GenBank登录号NM_000041.2代表的核苷酸序列。人触珠蛋白基因转录成的两种变体由GenBank登录号NM_005143.3(变体1)和NM_001126102.1(变体2)代表。
在第五方面，本发明提供用于诊断对象中的胃癌(GC)，测定对象是否易于发展GC，或评估对象中GC进展的试剂盒。所述试剂盒包括用于如下目的的用具：检测该对象中一种或多种生物标志物的表达，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin；
在一个实施方式中，所述试剂盒包含固体支持物，例如芯片、传感器、微量滴定板或其上附有捕获试剂的珠或树脂，其中所述捕获试剂结合对应于本发明的一种或多种生物标志物的蛋白质。因此，例如，所述试剂盒可包含国内关于SELDI的质谱探针，例如阵列，或通用的基于纤维的SPR传感装置。在生物特异性捕获试剂的情况中，所述试剂盒可包含带有反应性表面的固体支持物，以及包含所述生物特异性捕获试剂的容器。
在一个实施方式中，所述试剂盒还可包含清洗溶液或用于进行清洗的说明，其中所述捕获试剂和所述清洗溶液的组合允许捕获所述固体支持物上的一种或多种生物标志物蛋白以供后续检测，例如，通过质谱进行的检测。所述试剂盒可包含多于一种类型的吸附剂，其各存在于不同的固体支持物上。
在一些实施方式中，所述试剂盒可包含标签或分开的嵌入物形式的供于合适操作参数的说明。例如，所述说明可告知用户如何收集样品，如何清洗探针或特定生物标志物蛋白或待测蛋白质。
在一些实施方式中，所述试剂盒可包含装有样品的一个或多个容器，所述样品代表各生物标志物的参比表达水平，并因此被用作标定标准。
就本领域技术人员而言显而易见的是，尽管本发明出于清楚和理解的目的已做出详细描述，可不偏离本说明书中公开的本发明概念的范围而做出对本文所述实施方式和方法的各种修改形式和变化
最后，引用了包含进行本发明涵盖的基础技术的方法的分子生物学标准课本。参见，例如，Sambrook和Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第三版)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，2001年。
以下文的实施例进一步说明本发明。这些实施例的目的仅在描述具体实施方式而不意在限制上文描述的内容。
实施例1
胃癌生物标志物的鉴定
发明人采用gp130F/F炎症相关胃癌(GC)遗传工程改造小鼠(GEM)模型供于生物标志物的发现和随后在人类样品中的验证。如上所述，该gp130F/F小鼠自然且可重复地在胃的腺体部分中发展腺瘤，所述胃显示与源自受幽门螺旋杆菌(H.pylori)长期感染的人类中的肠型GC相关联的所有进展性组织学特点。由于gp130F/F小鼠携带细胞因子受体gp130中的常规酪氨酸残基的苯丙氨酸(F)取代突变，其响应过量Stat3信号转导至同源gp130受体配体，包括白介素6(IL-6)和白介素11(IL-11)。因此，gp130F/F小鼠中的胃肿瘤形成的发生和进展通过遗传学上限制复合gp130F/F小鼠中的Stat3表达来抑制；Stat3+/-(FFStat3)小鼠。令人吃惊的是，遗传学上剔除IL6选择性地使gp130F/F小鼠的泛-炎性(pan-inflammatory)表型特点正常化，而不影响对应gp130F/F；Il6-/-(FFIL6)小鼠中的胃肿瘤形成。如此，不同的gp130F/F复合突变体允许对炎症相关的胃肿瘤形成的遗传解剖，而由IL6引发的全身炎性急性期反应符合多种病理学。材料与方法
GEM模型
所有涉及动物的实验均获得癌症研究伦理委员会Ludwig协会的批准。gp130F/F(FF)、gp130F/F；Il6-/-(FFIL6)、gp130F/F；Stat3+/-(FFStat3)、Il6-/-(IL6)和gp130F/F；Il11rα-/-(FFIL11Ra)GEM的制备在先前已有描述(参见Jenkins BJ等,2005,Nat.Med.11:845-852；Tebbutt NC等,2002,Nat.Med.8:1089-1097；JuddLM等,2009,J.Pathol.217:552-562；Ernst M等,2008,J.Clin.Invest.118:1727-38)。年龄匹配的无突变的同窝鼠仔称为野生型(WT)。通过12～14周龄下颌下出血直接收集血液进入Microvette 500血清凝胶管(德国奴姆布莱特的斯卡特德公司(Sarstedt))中。样品在室温下静置30分钟，然后以6,600xg离心5分钟以获得血清。血清上清液等分成约100μL体积并立即贮存在-80℃(第一等分物)。在一种情况下，样品在冰上解冻，重新等分成20μL体积并再次冷冻于-80℃(第二等分物)。对于Western印迹应用而言，使二次等分物在冰上解冻，在超纯水中1/70稀释，等分为包含约7μg总血清蛋白质的6.5μL体积，并再次冷冻于-80℃(第三等分物)。
人类研究群体
所有涉及人类的实验均获得阿德莱德大学的Peter MacCallum癌症研究协会的伦理委员会的批准。来自十一位外科手术前的患有肠型胃腺癌(Lauren分类法)的GC患者的血清通过Peter MacCallum癌症研究协会组织库获得，并以100μL第一等分物形式贮存在-80℃下。采用Vacutte Z Serum Sep Clot Activator管(德国弗里肯豪森的Greiner Bio-One公司)从13位未报告患有胃肠疾病的健康志愿者收集对照血清。血清在室温下凝结20～40分钟，然后以1,800x g离心十分钟。血清上清液以400μL体积等分(第一等分物)，并贮存在-80℃。如同对小鼠血清的处理那样，制备人血清的第二和第三制备物供于通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和Western印迹的验证目的。24位人对象的种群统计信息列于表1。
表1
高丰度血清蛋白质的消耗和2D DIGE
采用多重亲和分离系统(MARS，加利福尼亚州圣克拉拉市的安捷伦技术公司(Agilent Technologies))，对生产商的建议进行较小修改，从小鼠血清消耗白蛋白、转铁蛋白和IgG。简言之，因为该研究采用的GEM小鼠的数量相对较大(n＝38)，将血清样品分为两组，指定为实验1(3×WT，4×IL6，4×FFStat3，4×FF和4×FFIL6)和实验2(4×WT，3×IL6，4×FFStat3，4×FF和4×FFIL6)。对于实验1和2，分开进行多重亲和分离色谱(MARS)消耗和2D DIGE。
血清的第二等分物(20μL)在MARS缓冲液A中稀释(90μL)，并采用0.22μm离心装置(安捷伦技术公司)过滤。采用Hewlett Packard 1090HPLC系统，将100μL稀释的血清以0.5mL/分钟注射至MARS-M3柱(4.6x 100mm)上来进行色谱。该仪器方法如下：0-10分钟，100％缓冲液A，0.5mL/分钟；10.01-17分钟，100％缓冲液B，1mL/分钟；17.01-28分钟，100％缓冲液A，1mL/分钟。在冰上收集流通峰(2mL)，并立即添加冰冷的100％丙酮(8mL)。使丙酮中的分级分离部分在-20℃保留至多5天，之后通过离心回收蛋白质(在10℃以5,000x g离心10分钟)。蛋白质沉淀用冰冷的80％丙酮(10mL)清洗一次，用TUC4％缓冲液(7M脲，2M硫脲，30mM Tris，4％CHAPS；500μL)重溶，并在-20℃贮存至多一周。为了使样品进一步脱盐，从而确保其在等电聚焦(IEF)中的适合性，使消耗的血清样品解冻并采用10kDa MWCO Vivaspin 500离心装置(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司(GE Healthcare))在TUC4％中进行两轮缓冲液交换。终样品用TUC4％配至至多约200μL，然后用Horiba Twin Cond电导计(B-173型，日本东京的堀场公司(Horiba))来评估传导率，以确认水平低于300μS。样品的蛋白质浓度通过EZQ试验(加利福尼亚卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen))，按照生产商的建议测定。冻干的25nmol DIGE沸石最小Cy2、Cy3和Cy5CyDye(GE医疗保健公司)在125μL无水N,N-二甲基甲酰胺(密苏里州圣路易斯市的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))中重悬以产生200pmol/μL储液。将所述储液等分(1μL)进入旋盖管中，并在氩气下于-80℃贮存>12个月而不失灵敏度。当需要用于标记时，将合适体积的个体消耗的血清样品(含70μg蛋白质)直接添加至Cy3和Cy5等分物(染料/蛋白质比为200pmol/70μg)。进行生物复制物的染料交换以控制潜在的染料相关偏差。通过从具体试验中囊括的样品(有较少例外)汇集35μg的蛋白质来对所述两个试验分别准备分开的内标(参见结果部分)。所述内标用Cy2以200pmol染料/70μg蛋白质的比例标记。标记反应在冰上避光进行30分钟，并通过添加1μL的10mM赖氨酸/200pmol染料来淬灭。使合适的Cy3和Cy5样品与70μg内标和足量的TUC4％合并以使样品达到相等体积(参见补充表1和2)。还添加二硫苏糖醇(DTT，西格玛-奥德里奇公司)和pH 4-7载体两性电解质(IPG缓冲液；GE医疗保健公司)，从而最终样品包含210μg蛋白质、7M脲和2M硫脲、30mM Tris、4％w/v CHAPS、10mM DTT、0.5％v/v两性电解质加痕量的溴酚蓝以供着色。采用10kDa分子量截止值的Vivaspin 500离心装置将样品体积缩减至约150μL(以8,200x g离心5-10分钟；GE医疗保健公司)，然后杯式加载至24cm 4-7条固定因子干试条(GE医疗保健公司)上，其已在450μL再水化缓冲液(TUC4％含0.5％v/v两性电解质、1.2％v/v DeStreak试剂[GE医疗保健公司]和痕量溴酚蓝)中再水化过夜。将需要的Cy3、Cy5和Cy2样品合并供于电泳分离。采用IPGphor II(GE医疗保健公司)进行第一维度中的IEF 70,000总伏特时(Vhour)。
在IEF之后，所述试条在如下缓冲液中平衡15分钟：还原缓冲液(50mMTris-HCl pH 8.8,6M脲,30％v/v甘油,2％w/v SDS,1％w/v DTT)，然后是烷基化缓冲液(如上，含2.5％w/v碘乙酰胺(IAA)替代DTT)。采用内含1％w/v低熔点琼脂糖的专有阴极缓冲液(赛瓦电泳公司(Serva Electrophoresis))的熔融溶液将所述试条密封在2DGel DALT NF 12.5％预制凝胶(德国海德堡的赛瓦电泳公司)的顶部。荧光标记的ECL Plex彩虹标志物(GE医疗保健公司)包含于选定的少数凝胶上。采用EttanDALT 12单元(GE医疗保健公司)在阳极和阴极缓冲液(赛瓦电泳公司)的存在下于25℃采用如下三阶段程序来进行第二维度的蛋白质分离：(1)50V；5mA/凝胶，1小时，(2)100V；10mA/凝胶，1小时，(3)250V；30mA/凝胶，14小时。凝胶采用Ettan DIGE成像仪(GE医疗保健公司)以100μm分辨率采用如下曝光方式扫描：Cy2通道，0.4秒；Cy3通道，0.07秒；Cy5通道，0.1秒。一经扫描，即将所述凝胶在非固定状态下贮存在-80℃直至需要挑取斑点。
比较成像分析
成像分析采用DeCyder 2D软件(6.5和7.0版，GE医疗保健公司)进行。各凝胶图像在DeCyder的差异胶内分析(DIA)模块中分开处理，然后输出至生物变异分析(BVA)。基于预计的10,000各斑点，采用排除过滤器排除体积<30,000的斑点来进行DIA斑点检测。采用该软件自动化地进行背景消减和胶内标准化。将DIA工作台导入BVA以手动将斑点匹配至母凝胶(master gel)。因为利用该软件进行该任务时，大量斑点痕迹并未有效匹配，因而需要进行手动斑点匹配。采用相同的用户限定的母凝胶供于实验1和2以确保斑点鉴定的一致性。在实验1中，也在分析凝胶上构建所述母凝胶。在实验2中，所述母凝胶被导入BVA仅供于该目的，并不包括在统计学分析中。
通过分级聚类和主成分分析(PCA)进行多变量统计学检验，该检验采用DeCyder(7.0版)的扩展数据分析(EDA)模块基于>70％的凝胶中检测到的斑点进行。对于单变量统计学检验，将标准化体积的匹配斑点从DeCyder导出至Excel(华盛顿州雷蒙德市的微软公司(Microsoft))。通过用Cy3和Cy5通道的斑点体积除以各凝胶Cy2通道来产生标准化的丰度值(本文中称作“斑点体积”)。然后，所述斑点体积经log10转换以使数据正常分布，并且，就给定比较中的各组而言，计算各斑点的标准偏差(SD)。还基于经log10转换的斑点体积在Excel上进行不成对双尾斯氏T检验，并采用通过DeCyder获得的那些进行P值交叉参考，以确认其等同。各比较的因果力量计算采用Piface(1.64版，可获自http://www.cs.uiowa.edu/～rlenth/Power/)进行，(Lenth RV,2007,J.Anim.Sci.85:E24-29)如先前文献所述(Penno MA等,2009,J.Proteome Res.8:2812-2826)。简言之，对于每个纳入考虑的组而言，匹配斑点体积的所有标准偏差的75％百分点值被用作σ度量(Karp NA和Lilley KS,2005,Proteomics,5:3105-3115)，显著性水平设置在0.01(α)，所需力量是80％，且生物重复的数量为各组特定(n)。对所得的有效尺寸取幂以反转log10转换，由此提供最小倍数变化，此时比较的组的平均斑点体积可被认为是具有显著差异的。为了算入多元假设检验的问题(Karp NA等,2007,Mol.Cell Proteomics,6:1354-1364)，采用苏格兰生物数学与统计的Graham Horgan博士开发的Excel电子表格(下载自http://www.rowett.ac.uk/～gwh/qval.xls)来确定各匹配斑点的q值。将给定比较的P值导入电子表格，并基于Storey JD和Tibshirani R的等式计算q值，Storey JD和Tibshirani R,2003(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:9440-9445)。
若斑点属差异表达，其需要满足如下四个要求：
1.要求斑点存在于>70％的斑点图上(即，≥27/38)。512个斑点满足该标准，从而在后续分析中被考虑。
2.要求斑点的未成对双尾斯氏T检验P值<0.01(就给定比较而言基于经log10转换的斑点体积)。
3.要求测定的斑点体积的倍数变化>2.1量级(就比较1而言)、同样2.1(就比较2而言)和1.8(就比较3而言)，如因果力量计算所确定。基于平均斑点体积而非经log10转换的体积来计算倍数变化。将低于1的表达值(即，一组中的斑点对比比较中的其它斑点下调)分为-1以反映该变化。
4.要求斑点的q值<0.01以控制与多级假设检验相关联的高错误发现率。
通过对2D DIGE数据进行受试者工作特征(ROC)分析的进一步统计学检验在Excel中进行。
蛋白质鉴定
采用Ettan斑点切割机器人(GE医疗保健公司)，基于DeCyder中生成的挑取列表，从分析凝胶切出感兴趣的斑点。从2-6块凝胶汇集小块，供于用胰蛋白酶消化过夜(内含100ng的测序级修饰的胰蛋白酶[威斯康星州菲奇堡的普洛麦格公司(Promega)]的20μL的5mM碳酸氢铵，10％乙腈[ACN])。采用装配有封装在HPLC-芯片立方体中的蛋白质编号芯片柱组件(40nL捕获柱，具有0.075x 43mm C-18分析柱)的1100HPLC系统(均来自安捷伦技术公司)来分离提取的胰蛋白酶的肽。这直接与以阳离子模式操作的HCT Ultra 3D-离子阱质谱仪(马萨诸塞州比尔里卡的布鲁克道尔顿公司(Bruker Daltonics))相接。该柱用0.1％FA、3％ACN以0.5μL/分钟平衡，并且样品用ACN梯度洗脱(3％-31％，32分钟)。可电离的物质(300<m/z<1,200)被捕获，而届时被洗脱的最强离子中的一或两种通过碰撞-诱导的解离被分级分离。在获得两个谱之后，采用活性排除来排除前体离子30秒。采用DataAnalysis(3.4版，布鲁克道尔顿公司)对MS和MS/MS谱进行峰检测和去卷积。将MS和MS/MS质量列表导入BioTools(3.1版，布鲁克道尔顿公司)，然后发送至Mascot(2.2版)。检索说明为：数据库＝SwissProt 56.4，分类学＝哺乳动物(63826条序列)，酶＝胰蛋白酶，固定修饰＝半胱氨酸的脲甲基化，可变修饰＝甲硫氨酸的氧化，肽质量容限＝±0.3Da，片段质量容限＝±0.4Da，错误切割＝1，以及，肽荷电＝1+、2+和3+。在具有至少两个匹配肽和离子评分高于特定阈值的基础上进行蛋白质修饰。忽略与胰蛋白酶的匹配和污染性的人角蛋白。当在蛋白质鉴定中观察到冗余时，例如，当不同的蛋白质同种型与相同质量列表匹配时，仅考虑对应于全长序列的最合适的数据库入口和/或额外质量与之匹配至所述蛋白质的同种型特异性区域的入口。当在一个斑点中鉴定出多种蛋白质时，仅考虑最高emPAI得分的入口为该斑点的主要成分，并因而可能是其差异调节的贡献者(Ishihama Y等,2005,Mol.Cell.Proteomics,4:1265-1272)。小鼠蛋白质的人同源物采用UniProt的BLAST功能鉴定(http://www.uniprot.org/blast/)(UniProt Consortium,2011,Nucl.Acids Res.39:D214-219)。
Western印迹
包含6.5μL稀释血清的第三等分物与2.5μL的NuPAGE LDS样品缓冲液(4X)(英杰公司)和1μL的0.5M DTT混合。样品在95℃加热5分钟，然后将10μL体积加载至NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶上的每个泳道(英杰公司)。使选择用于进一步验证的十个小鼠样品在单一凝胶上跑动，其结果由两次技术重复来验证，不同之处在于凝聚素，其在单一实验中分析。使24个人样品同时在三块分开的凝胶上跑动，各凝胶包含相等数量的GC患者样品，以及年龄(若可能)/性别匹配的对照。采用NuPAGE MOPS SDS跑动缓冲液(英杰公司)使凝胶以200V跑动50分钟，并转移至止动剂-P PVDF膜(马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore))上，所述转移采用Towbin缓冲液(0.025M TRIS，0.192M甘氨酸，20％甲醇)以15V进行50分钟。转移后，膜用AmidoBlack染色溶液(内含0.1％(w/v)酰胺黑[萘酚蓝黑，西格玛-奥德里奇]的10％(v/v)乙酸)染色，并进行数字扫描，随后在甲醇中脱染。然后，膜在室温下于5％脱脂牛奶中封闭1小时，然后与针对目标蛋白的一抗在4℃下孵育过夜。该研究中所用六种一抗如下：
1.兔抗-人Afamin(英国剑桥的阿柏堪穆公司(Abcam))
2.兔抗-小鼠载脂蛋白E(apoE)(伊利诺州洛克福德的赛默公司(Thermo))
3.小鼠抗-人apoE(阿柏堪穆公司)
4.兔抗-人载脂蛋白J(凝聚素)(阿柏堪穆公司)
5.兔抗-人纤连蛋白(阿柏堪穆公司)
6.兔抗-人触珠蛋白(西格玛-奥德里奇公司)
在一抗中孵育过夜之后，膜用TBS-T(50mM Tris，150mM NaCl，0.05％吐温20，pH 7.6)冲洗三次，然后用辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的二抗在室温下孵育1小时。辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的二抗是：(1)兔抗-小鼠IgG-HRP(宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔的罗克兰德公司(Rockland))，(2)山羊抗-兔IgG-HRP(赛默公司)，和(3)山羊抗-小鼠IgG-HRP(赛默公司)。膜用TBS-T再冲洗三次，然后用西格玛强化化学发光过氧化物酶底物(西格玛-奥德里奇公司或密理博公司)和自动记录薄膜(比利时蒙恩的阿克发公司(Agfa))。Western印迹光密度分析采用ImageJ(国家健康研究院；http://rsb.info.nih.gov/ij/)或ImageQuant TL(7.0版，GE医疗保健公司)进行。针对在AmidoBlack染色的膜上的约25kDa所见免疫球蛋白轻链条带的密度来使感兴趣条带的强度标准化，以控制凝胶上样中的可能的差异。就各蛋白质而言，将GC和非GC组的标准化的强度值的分布导出至GraphPad Prism(5版；加利福尼亚州拉霍亚的GraphPad软件公司)并采用非参数曼-惠特尼检验以P<0.05作为显著性阈值来进行比较。
酶联免疫吸附试验
按照生产商的建议进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。该研究中所用的九种ELISA试剂盒是：
1.Afamin ELISA试剂盒(中国武汉的Uscnk公司)
2.人载脂蛋白E ELISA(瑞典Mabtech公司)
3.Quantikine人凝聚素ELISA试剂盒(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)
4.QuantiMatrix ELISA纤连蛋白试剂盒(马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司)
5.触珠蛋白人ELISA试剂盒(阿柏堪穆公司)
6.人α1-抗-胰凝乳蛋白酶ELISA(华盛顿州西雅图的卡米亚公司(Kamiya))
7.维生素D结合蛋白ELISA(卡米亚公司)
8.胰岛素样生长因子结合蛋白酸不稳定性亚基ELISA试剂盒(中国的Uscn公司)
9.碳水化合物抗原(CA)72-4ELISA，人(卡米亚公司)
血清浓度从试剂盒特异性标准曲线加入，所述标准曲线在GraphPad Prism(GraphPad软件公司)中生成。使所得的血清蛋白质浓度针对对照组中的各检测蛋白的平均浓度标准化。这便于以相等规模对标志物进行交叉候选物比较(Faca VM等,2008,PLoS Med.5:e123)。曼-惠特尼U检验(双尾，显著性阈值P<0.05)和ROC在GraphPad Prism中进行。
结果
FF突变小鼠的生物学
纯合型gp130F/F突变小鼠自发且可再现地在胃的腺体部分中发展明显腺瘤，其在约4-6周龄时变得组织学可见，因为出现3-5处个别病灶。其在接下来的2～3个月持续生长以产生约250mg的最大荷瘤，从而占到这些小鼠总体体重的0.8～1％。这些肿瘤发生具有100％的透入度，并且无关所述小鼠的遗传背景。先前已显示这些病灶复制与由幽门螺旋杆菌慢性感染引起的人的肠型GC相关联的多种进行性组织学特点(Jenkins BJ等,2005,Nat.Med.11:845-852；TebbuttNC等,2002,Nat.Med.8:1089-1097；Ernst M,Jenkins BJ.2004,Trends Genet.20:23-32.和Correa P等.1975,Lancet 2:58-60)。因此，这些病灶同时地显示萎缩性胃炎、肠上皮化生和上皮异型增生的特点，但其很少进展成腺癌。由于肿瘤形成在抗微生物治疗或Toll受体介导的信号转导的遗传损伤之后削弱，这些gp130F/F GEM代表人的早期炎症相关肠型GC的临床前验证的模型。
因为gp130F/F GEM在细胞因子受体gp130中的调节性酪氨酸残基上具有苯丙氨酸取代突变，这些小鼠响应对于包括IL6和IL11的同源gp130受体配体的过量Stat3信号转导。因此，FF小鼠中的胃肿瘤发生的出现和进展通过遗传上限制复合FFStat3小鼠中的潜在转录因子Stat3的表达而受到抑制和延迟(Jenkins BJ等,2005,Nat.Med.11:845-852)(图1)。令人吃惊的是，遗传学上剔除IL6选择性地使FF小鼠的泛-炎性(pan-inflammatory)表型特点正常化，而不影响对应的FFIL6小鼠中的胃肿瘤形成。同样地，相较于FF小鼠，FFIL6的总体存活率提高，表明是其泛性炎性反应而非其肿瘤荷载成为存活的速率限制。相反地，FFIL11Rα小鼠(其缺乏IL11-特异性IL11Rα受体亚基的表达并因而无法响应IL11)无法发展胃肿瘤，而FFIL11Rα小鼠的存活率保持与其IL11Rα准确对应物相似。因为仅消除了gp130F/F中的一个Il11rα等位基因；Il11rα-/+延迟并削减了肿瘤发生，IL11-依赖性gp130/Stat3活化的药理学干扰减少了具有已建立疾病的FF小鼠中的总体瘤荷[Ernst 2008，数据未显示]。因此，对FFIL6和FFIL11Rα小鼠之间的表型的划分允许区分全身性IL6-介导的炎性反应和IL11-依赖性的胃腺瘤形成促因.同时，复合FFStat3小鼠中的Stat3表达的全局遗传限制破坏了IL11-依赖性的肿瘤发生，以及IL6-依赖性的系统性炎症(Jenkins BJ等,2005,Nat.Med.11:845-852)。
GEM模型中的GC血清生物标志物的鉴定
该研究中所用的生物标志物鉴定工作流可被广泛地分类成三个阶段。在发现阶段，检测收集自遗传工程改造小鼠(GEM)胃癌(GC)模型的血清以鉴定差异表达的蛋白质作为候选血清生物标志物。在第二阶段，应用Western印迹的半定量技术来验证该GEM模型中候选生物标志物亚组的差异表达。在第三阶段，采用Western印迹以及临床相关的诊断平台，定量ELISA，针对GC患者和健康对照的人血清来验证小鼠中的经测试的生物标志物(图2A)。
在所述发现阶段，通过2D DIGE来分析来自由FF/FFIL6基因型代表的16只GC表型小鼠和由FFStat3/WT/IL6基因型代表的22只非GC表型小鼠的MARS消耗的血清，产生38个斑点图。GC和非GC表型血清的代表性斑点图示于图2B。采用DeCyder软件，总共有512个斑点与>70％的斑点图(即≥38个中的27个)匹配，并包括进后续的统计学分析中。基于所述512个斑点体积的无监管分级聚类揭示基于分级最低水平的小鼠基因型的聚类和基于较高水平的GC对比非GC表型的聚类(图2C)。主成分分析还显示基于在GC和非GC小鼠之间具有清楚对分的表型的不同分组(图2D)，表明一些匹配的斑点的表达与GC表型相关。此外，基于第一主成分的GC和非GC组的主要分离突出显示了该表型是该实验中的主要变异源。
开发出过滤方案以区分所述512个匹配的凝胶斑点中有哪些关联IL6介导的急性期反应进行调节，对比关联GC的那些(即，候选生物标志物)。该方法以图表形式总结于图3。最初，通过在该研究中纳入多重突变基因型促进了对所述512个匹配的斑点的体积的三个比较。在第一个比较中，将七只WT小鼠的斑点与七只IL6小鼠的斑点做比较，所述比较采用T检验(P<0.01)，计算错误发现率(q<0.01)和因果力量计算(倍数变化>量级2.1；参见补充信息部分1.4)。在第二个比较中，将八只FF小鼠的512个斑点体积与八只FFIL6小鼠做比较，所述比较采用与比较1中所述的相同参数。在第三个比较中，将16只GC表型小鼠(FF/FFIL6表型)与22只非GC表型(WT/IL6/FFStat3基因型)小鼠做比较，所述比较同样采用T检验(P<0.01)，计算错误发生率(q<0.01)和因果力量计算，最小倍数变化是量级1.8。结果总结于Venn图(示于图3)，指示三个斑点关联GC(C1)不存在时的IL6敲出而具有差异丰度，51个斑点关联GC(C2)存在下的IL6敲出而具有差异丰度，而10个斑点关联独立于GC(C1/C2交叉)的IL6敲出而具有差异丰度。十七个斑点可能是IL6-介导的急性期反应蛋白质，其在GC(C2/C3交叉)中调节，而132个斑点在GC(C3)中具有差异丰度。
进一步采用ROC分析来研究所述132个GC相关联的斑点体积区分GC和非GC表型的能力。对各斑点体积进行两次ROC计算。在ROC1中，认为GC表型(FF/FFIL6基因型)是阳性的，而非GC(WT/IL6/FFStat3基因型)是阴性的。九个斑点返回的曲线1下面积(AUC1)值<0.85，从而被排除在数据集外。在ROC2中，认为FF突变是阳性的(FF/FFIL6/FFStat3基因型)，而野生型gp130是阴性的(WT/IL6基因型)。十一个斑点返回AUC2值>AUC1值，表明其在携带FF突变基因型的那些小鼠中的调节比GC对比非GC表型更加类似并显著。肉眼观察与这些斑点相关联的盒须图证实了其与FF突变明显相关(图4)。总而言之，在最初132个GC关联的斑点中，有9个被认为是GC对比非GC表型的无效辨识物，而11个显示与gp130突变相关联。有趣的是，发现所述11个FF突变相关联的斑点中有8个包含肝羧酸酯酶N作为主要蛋白质成分(UniProt标识号ESTN_MOUSE，SwissProt登录号P23953，数据未显示)。该蛋白质与gp130突变相关的显著性不清楚。这导致112个感兴趣的斑点，其在GC对比非GC表型小鼠中特异性调节并具有差异丰度，而无关IL-6信号传输。
通过液相色谱MS(上文中关于“蛋白质鉴定”中描述)来分析所述112个GC相关的斑点，导致鉴定出对应于28个人蛋白质同源物的31中不同的鼠蛋白质。鉴于蛋白质的数量相对较大，采用优先策略来加速候选物检验与验证过程(Cima I等,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:3342-3347；和Surinova S等,2011,J.Proteome Res.10:5-16)。
首先，仅考虑显示全局调节的那些蛋白质(即，包含这些蛋白质的全部经鉴定的斑点上调或下调－参见表2)，因为采用充分表征的技术(例如Western印迹和ELISA)能够更容易地研究此类候选物的表达。
第二，可采用在线生物信息资源DAVID(用于注释、可视化和综合发现的数据库；国家过敏和感染疾病协会，国家健康协会；http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)(Huang da W等,2009,Nat.Protoc.4:44-57；和Huang da W等,2009,Nucl.Acids Res.37:1-13)来探寻并总结所述候选物和生物通路、组织特异性表达模式以及疾病分类之间的关联。
第三，考虑先前文献中涉及的所述候选物与GC的关联。最后，还考虑在2DDIGE实验中观察到的倍数变化量级。
表2
a指DeCyder中分配的2D DIGE凝胶上的主斑点数量；b指该2D DIGE实验中观察到的GC小鼠(FF/FFIL6基因型)和非GC小鼠(WT/IL6/FFStat3基因型)之间的斑点体积倍数变化；c指采用BLAST测定的小鼠蛋白质和人同源物之间的序列相同性。
基于这四个考虑，将所述2D凝胶上的代表38个斑点的八种蛋白质的亚组鉴定为后续分析的候选生物标志物，即，Afamin、α-1-抗胰凝乳蛋白酶(AACT，鼠丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K的人同源物)、载脂蛋白E(apoE)、凝聚素、纤连蛋白、触珠蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)和维生素D结合蛋白(VDBP)(参见表2)。所述38个斑点的MS汇总统计示于表3。
代表性的2D DIGE覆盖凝胶上的八种蛋白质的位置示于图5A。视检所述相关斑点体积的盒须图证明，其各自在GC对比非GC表型(FF/FFIL6对比WT/IL6/FFStat3)中特异性调节(图5B)。
小鼠血清中候选GC生物标志物的检验
GC相对于非GC小鼠血清中的Afamin、apoE、凝聚素和纤连蛋白的总蛋白水平的调节通过Western印迹采用来自五只WT和五只FF基因型小鼠的血清来检验。所有四种蛋白质被成功检测到(图6A)并相对于免疫球蛋白轻链定量(图6B)。发现FF对比WT小鼠中，apoE(P<0.01)和纤连蛋白(P＝0.016)的血清水平显著升高，而Afamin(P<0.01)和凝聚素(P<0.01)显著下调。获自Western印迹的结果在GC相对于非GC表型的调节方向上支持了2D DIGE数据。
人血清中候选GC生物标志物的验证
采用来自11位手术前的GC患者和13位健康对照的样品来研究人血清中的Afamin、apoE、凝聚素、纤连蛋白和触珠蛋白的总蛋白水平的调节。所有五种蛋白质均通过Western印迹被成功检测到并定量(图6C)。
对于GC患者对比对照的密度分析(图6D)显示，各蛋白质显示预计的在GEM模型中观察到的变化方向，由此apoE、纤连蛋白和触珠蛋白显示表达水平升高，而Afamin和凝聚素显示表达水平降低。就Afamin(P＝0.004)和触珠蛋白(P＝0.024)而言，所述表达水平在GC患者和对照血清之间具有显著差异(图6D)。
表3
为采用临床相关的分析平台获得定量更准确的数据，通过ELISA检测Afamin、apoE、触珠蛋白、纤连蛋白和凝聚素，以及VDBP、IGFALS和AACT的血清水平。为了比较该研究中鉴定的候选生物标志物蛋白质相对于现用的临床标志物的灵敏度和特异度，还对于血清CA72-4进行了ELISA。通过证据，已将较高的CA 72-4水平与GC所致的死亡风险升高相关联，表明其比CEA和CA19-9对GC更具预后性和特异性(Ucar E等,2008,Adv.Ther.25:1075-1084)。通过将各个个体的结果除以对照组中蛋白质的平均浓度来使所述九种蛋白质的浓度标准化。因此，对照组中所有蛋白质的平均浓度是1。这便于以相等规模对标志物进行交叉候选物比较(Faca VM等,2008,PLoS Med.5:e123)。
发现Afamin、apoE、凝聚素和触珠蛋白的血清浓度在GC患者和对照之间具有显著差异(P<0.05)(图7A)。基于倍数变化的量级，IGFALS和VDBP也显示组间差异表达(P>0.05)。GC组中，CA72-4稍有升高，其表达非显著地升高1.3倍(图7A)。描述AACT和纤连蛋白的ELISA结果的散布图显示在GC患者和对照之间没有明显的调节(P>0.5)，其示于图8。重要的是，就通过Western印迹和/或ELISA检测的所有候选物(甚至是不显示统计学显著性的那些)而言，在GC患者对比对照血清中观察到的调节方向与就GEM模型采用2D DIGE和Western印迹分析中所获得的数据一致。
通过ROC分析进一步拓展了调节的蛋白质Afamin、apoE、凝聚素和触珠蛋白，以及CA 72-4的诊断能力(图7B)。Afamin和凝聚素的灵敏度和特异度均分别是91％和92％(其均具有10/11个真阳性，12/13个真阴性)。apoE的灵敏度和特异度分别是91％和85％(10/11个真阳性，11/13个真阴性)，而就触珠蛋白而言，灵敏度是64％，特异度是100％(7/11个真阳性，13/13个真阴性)。相反，CA72-4的灵敏度和特异度分别仅有36％和77％(4/11个真阳性，10/13个真阴性)。
讨论
目前，缺乏在靶向内窥镜诊断之前用于检测GC的灵敏且特异的生物标志物。在该实施例中，基于以下三点开发出生物标志物探索策略：(i)采用人类疾病的高度可预知且临床相关的小鼠模型；(ii)采用最先进的蛋白质组学方法来鉴定候选生物标志物；和(iii)采用良好表征的诊断平台，ELISA，来翻译人样品中的经鉴定的候选生物标志物。集人类癌症的多种关键特征于一身的遗传近交小鼠是生物标志物的吸引人的来源，鉴于其对环境和遗传变异性的有效排除。近期尝试采用同源GEM模型，已产生后续成功在人组织(胰腺、结肠、乳腺、卵巢、肝细胞、前列腺和肺癌)中正交验证的候选生物标志物(Faca VM等,同上；Hung KE等,2009,Cancer Prev.Res.(Phila.),2:224-233；Pitteri SJ等,2008,J.Proteome Res.7:1481-1489；Pitteri SJ等,2009,PLoS One,4:e7916；Ritorto MS等,2011,J.Proteome Res.10:3012-3030；Cima I等,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:3342-3347；和Taguchi A等,2011,Cancer Cell.20:289-299)。
人们已采用人GC细胞系注射的裸异种移植小鼠(XM)模型十分努力地进行了对小鼠中GC生物标志物的鉴定。以该方式鉴定的数种蛋白质(包括apoA1和间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H3(ITIH3))的表达水平已在人血浆中被确证(Chong PK等,2010,J.Proteome Res.9:3671-3679；和Juan HF等,2004,Proteomics,4:2766-2775)。然而，关于该模型中对照组的合适治疗和GC特异性蛋白质的变化如何能从普遍存在的急性期反应外推仍存在问题。本文通过纳入代表多种突变基因型的小鼠(包括在全身性炎症不存在时发展胃肿瘤的FFIL6小鼠)解决了这些疑虑。因此，这些小鼠提供了用以鉴定和检验与胃肿瘤发生和IL-6与IL-11引发的全身性急性期反应相关联的蛋白质组学变化的遗传手段。此外，该研究还提供了用于进行癌症研究中GEM模型的应用的证据，由此本文鉴定的小鼠中的所有蛋白质采用两种不同的平台(Western印迹和ELISA)均在人血清中得到验证，其具有预计的倍数变化方向。
通过2D DIGE对MARS消耗的GEM血清进行的蛋白质组学分析导致鉴定出31种差异表达的鼠蛋白，对应于28种人类同源物。在检验和验证实验之后跟进8种蛋白质的亚组。通常，所述八种小鼠蛋白质在2D DIGE凝胶上观察到的分子量和等电点分别比基于表3中所示氨基酸序列的预计值更大且更酸性。这指示这些蛋白质可能经翻译后修饰。小鼠蛋白质的UniProt入口显示，所述八种中的七种包含潜在的N-连接的糖基化序列子，其具有已知被糖基化的多个位点。小鼠中的单个例外是apoE，尽管人apoE的UniProt入口指示其被N-连接的和O-连接的多糖修饰。
循环血清糖蛋白是癌症生物标志物的有希望的来源。已识别蛋白质表达和碳水化合物结构中的变化作为癌症的早期特点，其中糖蛋白在肿瘤侵入和转移中起重要作用。事实上，现用的临床标志物CA 72-4就是糖蛋白。本文中对CA72-4进行ROC分析所获得的灵敏度和特异度的值(灵敏度36％，特异度77％)稍低于文献中描述的那些(灵敏度40％，特异度>95％)。然而，这可以作为本文小规模数据集和/或所用特定ELISA的反映。不过，采用相同的患者和对照样品，Afamin、IGFALS、VDBP、凝聚素和触珠蛋白所获的结果显示对GC患者和对照的相比采用CA72-4而言的更准确区分。此外，Afamin和凝聚素的个体灵敏度和特异度高于胃部荧光照相术(用于日本的黄金标准筛选测试)报告的值。因此，该实施例中鉴定的生物标志物中的六种(即，Afamin、IGFALS、VDBP、凝聚素、apoE和触珠蛋白)提供用于区分GC患者和健康个体的有效手段。此外，这些生物标志物的诊断应用可通过联合多分析试验而得到改进。
实施例2
其它胃癌患者中的验证
上述实施例1中所得的结果在第二组胃癌患者(共25位)中进一步验证。在该实验中，从手术中的男性和女性患者收集血液，并将其血清贮存在-80℃直至酶联免疫吸附试验(ELISA)需要。所述患者的癌症包括五位早期(T1)和二十位晚期(T4)组织学亚型的组合。该实验总共包括10个对照样品，其血液由有经验的抽血师收集自健康志愿者。来自对照血液的血清也贮存在-80℃直至ELISA需要。如实施例1，所有实验均获得阿德莱德大学的Peter MacCallum癌症研究协会的伦理委员会的批准。
用于Afamin、凝聚素、触珠蛋白、IGFALS和VDBP蛋白的三明治ELISA试剂盒获自单一市售供应商(中国武汉的Uscn生命科学公司)以确保一致性，并且试验均按照生产商的说明进行。总而言之，收集的血清被解冻并用PBS稀释，制备标准物，然后将所有样品以两重形式添加至包被有针对感兴趣的特定蛋白质的合适抗体的96孔微滴定板。然后，将偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的亲和素(avadin)添加至各孔并孵育。这之后，添加TMB底物，导致仅包含特定蛋白质、生物偶联抗体和偶联有亲和素的酶的那些孔显示颜色变化。然后，通过添加硫酸来终止反应，并且在450nm处通过分光光度计来检测颜色变化。然后，通过将所述样品的光学密度与标准曲线做比较来确定特定蛋白质的浓度。将标准品的光学密度对标准品的已知浓度在log-log图上采用Graphpad Prism作图，并由此内推未知浓度。如实施例1中所述，通过将各测试样品的结果除以对照组中蛋白质平均浓度来对所述五种蛋白质的浓度进行标准化/正常化。因此，对照组中所有蛋白质的平均浓度是1。这便于以等同规模对标志物进行交叉候选比较。
根据内推的结果，对各蛋白质(±SE)制备个体图表，比较来自胃癌(GC)血清样品和对照血清样品的结果。结果示于图9，并总结于表4。随后对各蛋白质生成ROC曲线(如图10所示)，蛋白质的组合的ROC曲线示于图11(第二组合)和图12(第三组合)。
表4
该研究的目的在于确认Afamin、凝聚素、触珠蛋白、IGFALS和VDBP代表用于检测胃癌的一套生物标志物的合适性(如实施例1中所示)。根据实施例1的ELISA结果建设，采用来自一个生产商的ELISA试剂盒对新一组患者进行分析，由此提供贯穿蛋白质分析的一致性。
所述五种蛋白质各自的差异调节与实施例1的结果一致，其中相较于来自健康对照的血清中这些蛋白质的浓度而言，来自胃癌患者的血清具有较低的Afamin(p＝0.021)、凝聚素(p<0.0001)和VDBP(p<0.0001)浓度，以及较高的触珠蛋白(p＝0.373)和IGFALS(p＝0.087)浓度(图9)。
该研究的第二个目的在于确定这五种生物标志物是否还能用于鉴定早期GC。难以获得来自早期(T1)胃癌的患者的血清，这归因于该疾病的病理学，并且这些样品(n＝5)显示与晚期(T4)胃癌样品(n＝20)没有分别。鉴于对早期肿瘤的检测允许早期治疗并导致更好的患者结果，这尤其引起人们的兴趣。
显示各蛋白质的灵敏度和特异度以区分真阳性和假阳性读数的受试者工作条件(ROC)曲线(图10)显示VDBP、凝聚素和IGFALS各自具有特别的吸引力。图11显示触珠蛋白和VDBP、IGFALS和VDBP、IGFALS和Afamin、凝聚素和Afamin，以及VDBP和Afamin的ROC曲线的第二组合。特别值得注意的是，这些组合具有在采用所述一套蛋白质而开发的任何诊断中提高真阳性率并降低假阳性率的潜力。图12的ROC曲线中所示的第三组合也证明这些蛋白质的组合在任何开发的诊断中提高真阳性率并降低假阳性率的能力。

Claims (52)

1.一种诊断对象中的胃癌(GC)的方法，所述方法包括：
(a)检测该对象中一种或多种生物标志物的表达水平，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin；
(b)将所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平与所述或各生物标志物的参比表达水平相比较；和
(c)基于所述比较来诊断所述对象中的GC。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在获自所述对象的样品中检测所述一种或多种生物标志物的表达水平。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品是血清样品。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平包括检测所述样品中生物标志物蛋白质的水平。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品是组织样品。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平包括检测所述样品中生物标志物mRNA的水平。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人VDBP。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述对象中VDBP的表达水平低于VDBP的参比表达水平指示该对象中的GC。
9.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人凝聚素。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述对象中凝聚素的表达水平低于凝聚素的参比表达水平指示该对象中的GC。
11.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人IGFALS。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述对象中IGFALS的表达水平高于IGFALS的参比表达水平指示该对象中的GC。
13.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人Afamin。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述对象中Afamin的表达水平低于Afamin的参比表达水平指示该对象中的GC。
15.一种测定对象是否易于发展胃癌(GC)的方法，所述方法包括：
(a)检测该对象中一种或多种生物标志物的表达水平，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin；
(b)将所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平与所述或各生物标志物的参比表达水平相比较；和
(c)基于所述比较来确定该对象是否易于发展GC。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，在获自所述对象的样品中检测所述一种或多种生物标志物的表达水平。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述样品是血清样品。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平包括检测所述样品中生物标志物蛋白质的水平。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述样品是组织样品。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平包括检测所述样品中生物标志物mRNA的水平。
21.如权利要求15～20中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人VDBP。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述对象中VDBP的表达水平低于VDBP的参比表达水平指示该对象中的GC。
23.如权利要求15～20中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人凝聚素。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述对象中凝聚素的表达水平低于凝聚素的参比表达水平指示该对象中的GC。
25.如权利要求15～20中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人IGFALS。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述对象中IGFALS的表达水平高于IGFALS的参比表达水平指示该对象中的GC。
27.如权利要求15～20中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人Afamin。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述对象中Afamin的表达水平低于Afamin的参比表达水平指示该对象中的GC。
29.一种评估对象内胃癌(GC)进展的方法，所述方法包括：
(a)检测该对象中一种或多种生物标志物的表达水平，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin；
(b)将所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平与所述或各生物标志物的参比表达水平相比较；和
(c)基于所述比较来评估该对象中GC的进展。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述对象经历针对GC的治疗。
31.如权利要求29或权利要求30所述的方法，其特征在于，在获自所述对象的样品中检测所述一种或多种生物标志物的表达水平。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述样品是血清样品。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平包括检测所述样品中生物标志物蛋白质的水平。
34.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述样品是组织样品。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，检测所述一种或多种生物标志物的表达水平包括检测所述样品中生物标志物mRNA的水平。
36.如权利要求29～35中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人VDBP。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述对象中VDBP的表达水平低于VDBP的参比表达水平指示该对象中的GC。
38.如权利要求29～35中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人凝聚素。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述对象中凝聚素的表达水平低于凝聚素的参比表达水平指示该对象中的GC。
40.如权利要求29～35中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人IGFALS。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述对象中IGFALS的表达水平高于IGFALS的参比表达水平指示该对象中的GC。
42.如权利要求29～35中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是人Afamin。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述对象中Afamin的表达水平低于Afamin的参比表达水平指示该对象中的GC。
44.一种用于筛选能用于治疗对象中胃癌(GC)的候选治疗剂的方法，所述方法包括测定所述候选治疗剂在调节一种或多种生物标志物的表达水平中的活性，所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin。
45.如权利要求44所述的方法，该方法包括：
(a)给予所述对象所述候选治疗剂；
(b)检测该对象中所述或各生物标志物的表达水平；和
(c)将所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平与所述或各生物标志物的参比表达水平相比较，
其中，若所述或各生物标志物的表达水平接近或等于所述或各生物标志物的参比表达水平，则该候选治疗剂能用于治疗该对象中的GC。
46.如权利要求44所述的方法，该方法包括：
(a)使所述候选治疗剂暴露至表达所述或各生物标志物的细胞；
(b)检测所述细胞中的所述或各生物标志物的表达水平变化；和
(c)将所述对象中的所述或各生物标志物的表达水平与所述或各生物标志物的参考表达水平相比较，
其中，若所述或各生物标志物的表达水平接近或等于所述或各生物标志物的参比表达水平，则该候选治疗剂能用于治疗对象中的GC。
47.如权利要求45或权利要求46所述的方法，其特征在于，所述候选治疗剂使该对象或细胞中的VDBP表达水平提高至与VDBP参比表达水平接近或相同的水平。
48.如权利要求45或权利要求46所述的方法，其特征在于，所述候选治疗剂使该对象或细胞中的凝聚素表达水平提高至与凝聚素参比表达水平接近或相同的水平。
49.如权利要求45或权利要求46所述的方法，其特征在于，所述候选治疗剂使该对象或细胞中的IGFALS表达水平下降至与IGFALS参比表达水平接近或相同的水平。
50.如权利要求45或权利要求46所述的方法，其特征在于，所述候选治疗剂使该对象或细胞中的Afamin表达水平提高至与Afamin参比表达水平接近或相同的水平。
51.如权利要求1～50中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测该对象或细胞中的生物标志物载脂蛋白E(ApoE)和/或生物标志物触珠蛋白的表达水平。
52.一种用于诊断对象中胃癌(GC)、确定对象是否易于发展GC或评估对象中GC进展的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测该对象内一种或多种生物标志物的表达水平的器具，其中所述一种或多种生物标志物选自下组：维生素D结合蛋白(VDBP)、凝聚素、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物酸不稳定性亚基(IGFALS)，和Afamin。
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