KR101803287B1 - 키누레닌 대사 비율 변화를 이용한 위암 진단용 키트 - Google Patents

키누레닌 대사 비율 변화를 이용한 위암 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실질적인 위암의 표현형(phenotype)을 잘 반영하는 소분자 대사체로 키누레닌산 및 키누레닌의 혈액 및/또는 위액에서의 농도를 정량분석하고, 키누레닌에서 키누레닌산으로의 대사율을 분석함으로써 위암의 발병여부를 정확하고 간편하게 진단할 수 있으며, 임상 적용이 가능하다. 본 발명에 따르면 혈액 및 위액 검사만으로 위암 발병 이전의 예후를 예측하여 예방적 조치가 가능하고, 위암의 예방 또는 치료의 성공 여부도 판단할 수 있다.

Description

키누레닌 대사 비율 변화를 이용한 위암 진단용 키트{Kit for diagnosis gastric cancer using the change of kynurenine metabolic ratio}
본 명세서에 기재된 내용은 대사체를 이용하여 위암을 진단 또는 예측할 수 있는 위암 진단용 키트 및 위암 진단용 기초 정보 제공 방법에 관한 것이다.
미국 FDA에서 승인된 암에 대한 바이오마커는 20종 남짓으로, 실제 암과 같은 난치성 질환은 혈액을 이용한 조기 진단마커가 없어 그 진단 및 예후예측에 어려움이 있어왔다. 바이오마커는 시장 규모는 크지만 실제 의료결정을 내리는데 개입하는 비중은 매우 적다. 위암은 대장암 다음으로 높은 사망률을 기록하는 조기 진단이 필요한 질병이나, 현재 발굴된 대부분의 위암 진단기술은 단백질 및 유전자를 기반으로 하는 것으로, 소분자 대사체를 기반으로 한 진단기술은 없었다. 이에 현재 발굴된 바이오 마커는 실질적인 질병의 표현형(phenotype)을 직접적으로 반영하지 못한다는 문제가 있다.
대한민국공개특허공보 제10-2010-0016546호(2010.2.12 공개) 국제특허출원공개공보 WO2013-106886A1(2013.1.17 공개)
본 발명의 목적은 위암을 진단할 수 있는 소분자 대사체를 발굴하고, 이 소분자 대사체의 체내 농도를 분석하여 간단하면서도 정확하게 위암을 진단할 수 있는 진단용 키트 및 진단용 기초 정보 제공방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 관점은 키누레닌(kynurenine) 및 키누레닌산(kynurenic acid)을 포함하는 대사체의 체내로부터 분리된 생체 시료내 농도 측정부를 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 상기 본 발명의 일 관점은 상기 키트에 트립토판(tryptophan) 및 키누레닌의 체내로부터 분리된 생체 시료내 농도 측정부를 더 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 일 관점은, 생체 시료로부터 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율을 측정하는 체내 대사율 측정단계; 및 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교하는 단계를 포함하는 위암 진단용 기초 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 상기 본 발명의 일 관점에 따른 방법은 상기 체내 대사율 측정 단계가 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율 측정단계를 더 포함하는 위암 진단용 기초 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 관점은 혈액 및 위액 중 하나 이상을 포함하는 생체시료로부터 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율을 측정하는 체내 대사율 측정단계; 및 상기 생체시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과, 정상 대조군과 비교하여 위액 또는 혈액에서의 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율의 증가여부를 체크하는 단계를 포함하는 생체시료 분석 방법을 제공한다.
또한, 상기 본 발명의 일 관점에 따른 방법은, 상기 체내 대사율 측정단계가 혈액 및 위액 중 하나 이상을 포함하는 생체시료로부터 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율을 측정하는 단계를 더 포함하고, 상기 생체시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과, 혈액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 감소; 및 위액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 증가; 중 하나 이상에 해당하는지 여부를 체크하는 단계를 더 포함하는 생체시료 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 위암 진단용 키트는 실질적인 위암의 표현형(phenotype)을 잘 반영하는 소분자 대사체로 키누레닌산 및 키누레닌의 혈액 및/또는 위액에서의 농도를 정량분석하고, 상기 키누레닌에서 키누레닌산으로의 대사율을 분석함으로써 위암의 발병여부를 정확하고 간편하게 진단할 수 있으며, 임상 적용이 가능하다.
본 발명은 종래 2개 이상의 유전자 변이의 조합으로 복잡한 결정단계가 필요했던 기술과 달리 대사체 농도 및 대사율의 비교만으로 간단하고 효율적으로 위암을 진단할 수 있으며, 단백질 기반의 바이오마커보다 위암 증상 변화를 민감하게 감지할 수 있다. 나아가, 혈액 및 위액 검사만으로 위암 발병 이전의 예후를 예측하여 예방적 조치가 가능하고, 위암의 예방 또는 치료의 성공 여부도 판단할 수 있다.
도 1는 위암 환자군과 정상 대조군의 혈액 및 위액에서의 키누레닌에 대한 키누레닌산의 대사율(KA/KYN 대사율)을 비교하여 나타낸 도이다.
본 명세서에 개시되는 용어 "정상 대조군"은, 일측면에서 건강한 정신과 신체 조건을 가진 사람을 포함한 포유동물 또는 이들로 이루어진 군을 의미하며, 다른 일측면에서 암에 걸리지 않은 사람을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예는 키누레닌(kynurenine) 및 키누레닌산(kynurenic acid)을 포함하는 대사체의 체내로부터 분리된 생체 시료내 농도 측정부를 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다. 또한, 상기 위암 진단용 키트는 일 실시예로서 트립토판(tryptophan) 및 키누레닌(kynurenine)의 체내로부터 분리된 생체 시료내 농도 측정부를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 따른 상기 키누레닌(Kynurenine)의 대사 경로는 트립토판의 대사 중 하나로서, 트립토판(Tryptophan, Trp)은 체네 필수 아미노산으로 체내 단백질의 구성요소일 뿐만 아니라 다양한 생리활성을 갖는 물질들의 전구체(precursor) 역할을 한다. 상기 키누레닌의 대사경로는 위암을 포함하여 다양한 암세포에서 활성화되어 있다. 키누레닌의 대사 경로는 하기 [화학식 1]에 나타내었다.
Figure 112015057501716-pat00001
키누레닌 대사 경로에서 트립토판은 인돌아민 2,3-이산소화효소(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)와 트립토판 2,3-이산소화효소(tryptophan 2,3-dioxygenase, TDO)에 의해 트립토판이 키누레닌으로 분해된다. 이후 키누레닌은 키누레닌산 (kynurenic acid)을 포함하여 안쓰라닉산(anthranilic acid), 니코틴아마이드(nicotinamide) 또는 니코틴산(nicotinic acid)으로 대사될 수 있다. 이 중 키누레닌산으로의 키누레닌의 대사 경로인 "키누레닌 대사 경로"는 트립토판 대사 경로 중 암 및 염증에 관련된 대사 경로로, 인돌아민 2,3-이산소화효소(IDO)와 관련된 트립토판-키누레닌 경로는 트립토판 대사 경로의 rate-limiting step으로 전체적인 대사 경로 중 가장 중요한 조절 단계이다. 이에 반해 안쓰라닉산 및 니코틴아마이드로의 대사경로는 키누레닌에 비해 상대적으로 트립토판으로부터 여러 단계 이후에 있는 대사체이므로 rate-limiting step으로부터 멀어질 뿐만 아니라 위암과의 직접적 관련성도 줄어든다(하기 화학식 2 참조). 또한 안쓰라닌산은 대조군의 혈장 및 위액에서 모두 매우 미미하게 검출되기 때문에 비교가 수치상 대사율 계산이 어려우며 그 범위로써만 가늠할 수 있으므로, 생체시료로부터 위암을 정확하게 진단할 수 없다.
Figure 112015057501716-pat00002
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 생체 시료는 위액, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 조직, 세포 내액 및 외액 등에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 체내의 상기 대사체를 검출할 수 있다면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 대사체의 생체 시료내 농도 측정부는 생체 시료내에서 상기 키누레닌, 키누레닌산 및 트립토판 중 하나 이상을 포함하는 대사체를 검출할 수 있는 물질, 조성물 또는 검출장치 등을 포함할 수 있으며, 질량분석기, 핵자기공명(Nuclear magnetic resonance, NMR)이나 분광광도계(Photodiode Array, PDA), 자외선 분광기(UV spectrophotometer) 등 상기 대사체의 생체 시료내 농도를 측정 또는 검출할 수 있는 것이면 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적인 예로서, 상기 생체 시료내 농도 측정부는 액체크로마토그래피-질량분석기질량분석기(liquid chromatography-Tandem Mass Spectrometry; LC-MS/MS)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 생체 시료내 농도 측정부는 위암 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서 상기 위암 진단용 키트를 이용하여 키누레닌산, 키누레닌 및 트립토판을 정량 분석하면 위암 환자군의 경우 혈액내 트립토판은 유의적인 변화가 없으나 위액에서는 유의적으로 증가한다. 또한 키누레닌산은 혈액과 위액에서 모두 유의적으로 증가한 반면, 키누레닌은 혈액에서는 감소하고 위액에서는 증가한다. 상기 측정된 키누레닌산, 키누레닌 및 트립토판의 체내 농도를 이용하면 하기 수학식 1에 따라 체내 키누레닌 대사경로(kynurenine metabolic pathway)의 대사율을 계산할 수 있다.
[수학식 1]
대사율 = 대사체의 농도 / 전구체(precursor)의 농도
상기 관점에서, 상기 지시서는 일 실시예로서 상기 생체 시료내 농도 측정부로부터 분석된 위액 및 혈액 중 하나 이상에서의 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율(키누레닌산/키누레닌)이 정상 대조군과 비교하여 증가한 경우 위암 또는 위암 가능성이 있다고 진단하는 감별방법을 포함할 수 있다. 또한, 상기 지시서는, 상기 생체 시료내 농도 측정부로부터 분석된 혈액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율(키누레닌/트립토판)이 정상 대조군과 비교하여 감소; 및 위액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 증가; 중 하나 이상에 해당하는 경우 위암 또는 위암 가능성이 있다고 진단하는 감별방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 위암 진단용 키트를 이용하면, 상기와 같이 체내로부터 분리된 생체 시료로부터 키누레닌, 키누레닌산, 트립토판의 체내 농도를 측정하고, 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율 및/또는 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율을 분석함으로써 위암의 발병여부를 진단할 수 있고, 위암의 예후를 예측하여 위암을 예방할 수 있다. 나아가, 상기 키트는 위암에 한정되지 않고 위암과 관련된 질환이라면 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예는 생체 시료로부터 키누레닌(kynurenine)에 대한 키누레닌산(kynurenic acid)의 체내 대사율을 측정하는 체내 대사율 측정단계; 및 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교하는 단계;를 포함하는 위암 진단용 기초 정보 제공 방법을 제공한다. 또한, 상기 체내 대사율 측정단계는 트립토판(tryptophan)에 대한 키누레닌(kynurenine)의 체내 대사율 측정단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 체내 대사율 측정단계는 키누레닌 및 키누레닌산의 체내 농도를 측정하는 단계; 및 키누레닌의 체내 농도에 대한 키누레닌산의 체내 농도의 비율을 계산하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 트립토판 및 키누레닌의 체내 농도를 측정하는 단계; 및 트립토판의 체내 농도에 대한 키누레닌의 체내 농도의 비율을 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예로서 상기 생체 시료는 위액, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 조직 등에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 체내에서 상기 대사체들의 체내 대사율을 측정할 수 있다면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예로 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교하는 단계는, 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과, 위액 및 혈액 중 하나 이상에서의 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 증가한 경우 위암 가능성이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다.
보다 구체적인 일 실시예로는, 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과 상기 위액에서의 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율이 정상 대조군의 1 초과 내지 100배, 5 내지 80배, 10 내지 50배 또는 20 내지 40배에 해당하는 경우 위암 가능성이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과 상기 혈액에서의 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율이 정상 대조군의 1 초과 내지 20배, 1 초과 내지 10배, 1.5 내지 8배 또는 2 내지 6배에 해당하는 경우 위암 가능성이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 일 실시예로서 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교하는 단계는, 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과, 상기 위액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 증가; 및 혈액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 감소 중 하나 이상에 해당하는 경우 위암 가능성이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다.
보다 구체적인 일 실시예로는, 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과, 상기 위액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군의 1 초과 내지 30배, 3 내지 25배, 5 내지 18배 또는 6 내지 12배에 해당하는 경우 위암 가능성이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과, 상기 혈액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군의 0.1 내지 1 미만 배, 0.2 내지 0.9배, 0.3 내지 0.8배 또는 0.5 내지 0.7배에 해당하는 경우 위암 가능성이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예는, 혈액 및 위액 중 하나 이상을 포함하는 생체시료로부터 키누레닌(kynurenine)에 대한 키누레닌산(kynurenic acid)의 체내 대사율을 측정하는 체내 대사율 측정단계; 및 상기 생체시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과, 정상 대조군과 비교하여 위액 또는 혈액에서의 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율의 증가여부를 체크하는 단계를 포함하는 생체시료 분석 방법을 제공할 수 있다.
일 실시예로서 상기 체내 대사율 측정단계는 혈액 및 위액 중 하나 이상을 포함하는 생체시료로부터 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 생체시료 분석 방법은 상기 생체시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과, 혈액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 감소; 및 위액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 증가; 중 하나 이상에 해당하는지 여부를 체크하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 체내 대사율 측정단계는 일 실시예로서 키누레닌 및 키누레닌산의 혈액 또는 위액 내 농도를 측정하는 단계; 및 키누레닌의 체내 농도에 대한 키누레닌산의 혈액 또는 위액 내 농도를 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 체내 대사율 측정단계는 일 실시예로서 트립토판 및 키누레닌의 혈액 또는 위액 내 농도를 측정하는 단계; 및 트립토판의 체내 농도에 대한 키누레닌의 혈액 또는 위액 내 농도를 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 실험대상 및 분석대상물질 표준용액 제조
1. 실험 대상 환자 정보 및 생체시료(혈액 및 위액) 표본의 수집
위암 환자군으로 대한민국 소재 서울 성모병원의 성인남녀 위암 환자 35명을 대상으로 하였다. 정상 대조군으로는 상기 서울 성모병원의 성인남녀 위염 환자 17명을 대상으로 하였다.
상기 위암 환자군과 정상 대조군에 포함되는 실험참가자들로부터 혈액 및 위액을 채취하였다. 위액의 채취는 위 내시경 중 실시하였고, 혈액 시료는 원심분리한 후 상층액인 혈장 시료를 채취, 분석하였다. 모든 표본은 분석 이전까지 섭씨 -80℃에서 보관하였다.
2. 대사체 분석을 위한 표준용액의 제조
분석 대상 물질은 키누레닌(kynurenine), 키누레닌산(kynurenic acid) 및 트립토판(tryptophan)을 포함하고 있으며, 내부표준물질(internal standard)로는 트립토판-d3와 키누레닌산-d5을 사용하였다. 각 물질의 표준용액은 용해도 특성에 따라 0.1% 포름산(formic acid) 또는 0.1 M 수산화나트륨(NaOH)이 들어있는 메탄올 용매에 녹여 조제하였다. 각 분석 대상 물질을 농도에 맞게 혼합하여 계열 희석된 혼합 표준용액을 제조하고 -20℃에 보관하였다.
혈장 및 위액 시료는 아세토니트릴(acetonitrile)을 이용한 제단백 방법을 사용하였다. 구체적으로, 상온에서 녹인 상기 각 혈장시료 및 위액 시료(50 μL)에 10 μL의 내부표준물질 용액(10μM 트립토판-d3와 50 μM 키누레닌산-d5)과 0.1% 포름산(formic acid) 용액을 추가한 후 시료의 8배 부피(400 μL)의 차가운 아세토니트릴(ice-cold acetonitrile)을 첨가하였다. 30초 동안 완전히 섞어 준 후 원심분리를 시행하여 상층액 일정량을 수집하고, 질소가스 하에서 건조시켰다. 건조시켜 얻은 잔사를 100 μL의 0.1% 포름산(formic acid) 수용액으로 재용해하여 LC-MS/MS 분석에 사용하였다.
[실시예 2] 생체 시료 내 키누레닌산, 키누레닌 및 트립토판의 정량분석
1. 액체 크로마토그램-질량분석기(LC-MS/MS) 분석법
상기 실시예 1에서 준비한 혈장 및 위액 시료에서의 키누레닌산, 키누레닌, 트립토판의 정량분석은 액체 크로마토그램-질량분석기(liquid chromatography-Tandem Mass Spectrometry; LC-MS/MS; Agilent사의 1200 series HPLC system 및 AB SCIEX사의 API3200 MS system)를 사용하였다. 질량분석은 전기분무이온화(electrospray ionization, ESI) 방법을 통하여 포지티브 이온화 모드(positive ionization mode)에서 분석하였다. 모든 분석 물질은 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring, MRM)모드로 동시 분석하였는데 각 물질의 자세한 분석 조건은 아래 표 1에 제시하였다.
분석 물질 머무름 시간
(Retention time) (min)		 전구체 이온 (Precursor ion)
(Da)		 생성이온
(Product ion) (Da)		 체류시간
(Dwell time) (msec)		 DP (volts) EP (volts) CEP
(volts)		 CE (volts) CXP (volts)
트립토판(Tryptophan) 11.3 205.2 188.1 85 26 4.5 12 13 4
키누레닌산(Kynurenic acid) 13.6 190.0 144.0 85 41 4.5 12 25 4
키누레닌(Kynurenine) 6.3 209.2 94.1 85 26 4.5 12 17 4
키누레닌산- d5(Kynurenic acid-d5) 13.6 195.1 149.2 85 71 7 12 31 4
트립토판-d5(Tryptophan-d3) 11.3 208.2 191.1 85 21 9.5 12 13 4
* 디클러스터링 전압(declustering potential, DP), 출입 전압(entrance potential, EP), 충돌 셀 출입 전압(collision cell entrance potential, CEP), 충돌에너지(collision energy), 충돌 셀 출구 전압(collision cell exit potential, CXP)
액체 크로마토그래피는 Atlantis T3 (2.1×150 mm, 3 μm) 컬럼을 사용하여 상기 분석 대상물질을 분리하였고, 컬럼(column) 온도와 오토-샘플러(auto-sampler) 온도는 각각 35℃, 4℃로 설정하였다. 이동상은 0.1% 포름산(formic acid)이 포함된 5% 메탄올(이동상 A)과 0.1% 포름산(formic acid)이 포함된 95% 메탄올 (이동상 B)을 사용하였고 기울기 용리(gradient elution) 방법을 통해 분석하였다.
2. 위액 내 전체 단백질 정량
위액 내 상기 분석대상 물질 3종(키누레닌산, 키누레닌, 트립토판)의 농도를 위액 중 전체 단백질 양으로 보정하기 위하여 위액 내 단백질을 정량하였다. 전체 단백질은 브레드포드 어쎄이(Bradford assay) 방법을 사용하여 간단하게 정량하였고, 단백질 표준 물질은 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 사용하였다. 브레드포드 어쎄이 방법은 브레드포드 시약을 단백질에 처리하여 나오는 발색의 흡광도를 자외선 분광 광도계(UV spectrophotometer)로 검출하여 단백질을 정량하는 방법이다.
3. 위암 환자군 및 정상 대조군의 혈장 및 위액 중 키누레닌산 , 키누레닌 및 트립토판의 정량분석
상기 실시예 1에서 준비한 위암 환자 및 정상 대조군의 혈장과 위액 시료를 각각 상기 액체 크로마토그램-질량분석기로 상술된 조건으로 분석하여 키누레닌산, 키누레닌 및 트립토판의 농도 데이터를 얻었다. 위액 시료에서의 모든 농도 값은 전체 단백질양으로 보정하여 나타내었다(표 2). 위암 환자군과 정상 대조군 사이에서 트립토판 및 대사체들의 유의적인 차이는 스튜던트 t-test를 실시하여 검증하였고 그 결과도 표 2에 정리하였다.
분석 물질 정상 대조군 위암 환자군 P-value 변화 배수 변화
평균 표준편차 평균 표준편차
혈액 시료 (μM)
트립토판(Tryptophan) 54.1 9.15 55.1 23.0 0.811 - -
키누레닌산(Kynurenic acid) 0.0281 0.0105 0.0439 0.0218 <0.001 증가 1.56
키누레닌(Kynurenine) 1.77 0.432 0.898 0.472 <0.001 감소 0.507
위액 시료 (μM / mg·mL-1 protein)
트립토판(Tryptophan) 89.6 58.3 1054 2590 0.037 증가 11.8
키누레닌산(Kynurenic acid) 0.0109 0.0274 0.604 1.68 0.048 증가 55.5
키누레닌(Kynurenine) 0.101 0.123 16.7 52.7 0.076 - -
위액 내 전체 단백질 (mg·mL-1) 0.320 0.458 5.82 8.44 0.001 증가 18.2
상기 표 2에서 알 수 있듯이 정상 대조군에 비해 위암 환자군에서 혈액 중 트립토판 농도는 통계적으로 유의적인 변화를 보이지 않은데 반해, 키누레닌산 및 키누레닌의 농도는 유의적인 변화를 나타내었다. 위암 환자군에서 혈액내 키누레닌산의 농도는 증가하였고 키누레닌의 농도는 감소하였다. 반면, 위액 시료에서는 위암 환자군의 트립토판과 키누레닌산 농도가 증가하였고, 키누레닌 농도는 증가하였으나 통계적 유의성을 나타내지 않았다.
4. 정상 대조군과 위암 환자군에서의 대사율 비교 및 경로 비율 확인
정상 대조군과 위암 환자군에서 각 대사체의 생성 비율을 확인하기 위해서 각 대사경로에 따른 대사율(metabolic ratio, MR)를 계산하였다. 대사율의 계산은 전구체 대비 대사체의 생성 비율을 나타내는 값으로, 상술된 수학식 1의 '대사체 농도/전구체 농도'와 같이 계산한다. 상술된 화학식 1의 키누레닌산, 키누레닌 및 트립토판의 대사경로에 근거하여 각 대사율을 계산하고, 정상 대조군과 위암 환자군 사이의 대사율 유의적 차이에 대해 스튜던트 t-test를 실시하고 하기 표 3에 정리하였다.
대사율 (metabolic ratio) 정상 대조군 위암 환자군 P-value 변화 배수 변화
평균 표준편차 평균 표준편차
혈액 시료
KYN / Trp 0.030 0.013 0.019 0.013 <0.001 감소 0.62
KA / KYN 0.017 0.0070 0.066 0.053 <0.001 증가 4.0
위액 시료
KYN / Trp 0.0011 0.0014 0.010 0.014 <0.001 증가 9.2
KA / KYN 0.077 0.16 2.3 7.9 <0.001 증가 29.9
* 키누레닌(kynurenine, KYN), 트립토판(tryptophan, Trp), 키누레닌산(kynurenic acid, KA)
상기 표 3에서 알 수 있듯이, 위암 환자군의 혈중에서 정상 대조군보다 '키누레닌/트립토판(KYN/Trp)'의 비율은 유의적으로 감소(0.62배)하였고, '키누레닌산/키누레닌' 비율은 유의적으로 증가(4배)하였다. 반면, 위액 시료에서는 '키누레닌/트립토판'과 '키누레닌산/키누레닌'의 비율 모두 유의적으로 증가하였다. 위액에서의 대사율은 각각 9.2배, 29.9배의 큰 차이로 변화하여 위암 질병의 정확한 진단에 응용될 수 있음을 확인할 수 있다.
이 중 '키누레닌/트립토판'의 대사율은 위암 환자군이 정상 대조군과 비교하여 위액 및 혈액에서 상반된 결과를 보인데 반해, '키누레닌산/키누레닌'의 대사율은 위암 환자군이 정상 대조군과 비교하여 위액 및 혈액에서 모두 증가하는 것으로 일치된 결과가 나타났으므로, 위암진단의 정확도가 높음을 확인할 수 있었다.
[비교예] 생체 시료 내 안쓰라닌산 및 키누레닌의 정량분석
본 발명의 비교예로서, 키누레닌에서 키누레닌산이 아닌, 안쓰라닌산으로의 대사경로를 위암진단에 사용할 경우를 확인하기 위하여 하기의 실험을 실시하였다.
분석 대상 물질을 키누레닌 및 안쓰라닌산으로 선정한 것을 제외하고는, 상기 [실시예 1] 및 [실시예 2]과 동일한 방법으로 키누레닌에 대한 안쓰라닌산의 대사율을 정량분석하고, 그 결과를 하기 표 4로 나타내었다.
대사율 (metabolic ratio) 정상 대조군 위암 환자군 P-value 변화 배수 변화
평균 표준편차 평균 표준편차
혈액 시료
안쓰라닉산
(Anthranilic acid)		 <0.005 - 0.0524 0.0473 <0.001 증가 >10.4
AA / KYN <0.0031 - 0.075 0.075 <0.001 증가 12.6
위액 시료
안쓰라닉산
(Anthranilic acid)		 <0.005 - 0.54 1.34 <0.001 증가 >108
AA / KYN <0.185 - 5.7 25.6 <0.001 증가 >30.6
* 키누레닌(kynurenine, KYN), 안쓰라닌산(anthranilic acid,AA)
상기 표에 기재된 바와 같이, 키누레닌에서 키누레닌산이 아닌, 안쓰라닌산으로의 대사경로를 위암 진단에 활용하고자 할 경우, 안쓰라닌산은 정상 대조군의 혈장 및 위액에서 모두 매우 미미하게 검출되기 때문에 비교가 수치상 대사율 계산이 어려우며 그 범위로만 가늠할 수 있으므로, 생체시료로부터 위암을 정확하게 진단할 수 없음을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (19)

  1. 키누레닌(kynurenine) 및 키누레닌산(kynurenic acid)을 포함하는 대사체의 체내로부터 분리된 생체 시료내 농도 측정부를 포함하고,
    상기 농도 측정부는 위암 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함하며,
    상기 지시서는 상기 생체 시료내 농도 측정부로부터 분석된 위액 및 혈액 중 하나 이상에서의 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 증가한 경우 위암 또는 위암 가능성이 있다고 진단하는 감별방법을 포함하는 위암 진단용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 위암 진단용 키트는 트립토판(tryptophan) 및 키누레닌(kynurenine)의 체내로부터 분리된 생체 시료내 농도 측정부를 더 포함하는 위암 진단용 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체 시료는 혈액 및 위액 중 하나 이상을 포함하는, 위암 진단용 키트.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체 시료내 농도 측정부는 액체크로마토그래피-질량분석기를 포함하는, 위암 진단용 키트.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 지시서는,
    혈액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 감소; 및
    위액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 증가;
    중 하나 이상에 해당하는 경우 위암 또는 위암 가능성이 있다고 진단하는 감별방법을 포함하는, 위암 진단용 키트.
  7. 생체 시료로부터 키누레닌(kynurenine)에 대한 키누레닌산(kynurenic acid)의 체내 대사율을 측정하는 체내 대사율 측정단계; 및
    상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교하는 단계;
    를 포함하는 위암 진단용 기초 정보 제공 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 체내 대사율 측정 단계는,
    트립토판(tryptophan)에 대한 키누레닌(kynurenine)의 체내 대사율 측정단계를 더 포함하는, 위암 진단용 기초 정보 제공 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 체내 대사율 측정단계는,
    키누레닌 및 키누레닌산의 체내 농도를 측정하는 단계; 및
    키누레닌의 체내 농도에 대한 키누레닌산의 체내 농도의 비율을 계산하는 단계;
    를 포함하는 위암 진단용 기초 정보 제공 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 체내 대사율 측정 단계는,
    트립토판 및 키누레닌의 체내 농도를 측정하는 단계; 및
    트립토판의 체내 농도에 대한 키누레닌의 체내 농도의 비율을 계산하는 단계;
    를 포함하는 위암 진단용 기초 정보 제공 방법.
  11. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 생체 시료는 혈액 및 위액 중 하나 이상을 포함하는, 위암 진단용 기초 정보 제공 방법.
  12. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과,
    위액 및 혈액 중 하나 이상에서의 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 증가한 경우 위암 가능성이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함하는, 위암 진단용 기초 정보 제공 방법.
  13. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과,
    위액에서의 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율이 정상 대조군의 1 초과 내지 100배; 및
    혈액에서의 키누레닌에 대한 키누레닌산의 체내 대사율이 정상 대조군의 1 초과 내지 20배;
    중 하나 이상에 해당하는 경우 위암 가능성이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함하는, 위암 진단용 기초 정보 제공 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과,
    위액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 증가; 및
    혈액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군과 비교하여 감소;
    중 하나 이상에 해당하는 경우 위암 가능성이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함하는, 위암 진단용 기초 정보 제공 방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 생체 시료로부터 얻은 체내 대사율을 정상 대조군의 체내 대사율과 비교한 결과,
    위액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군의 1 초과 내지 30배; 및
    혈액에서의 트립토판에 대한 키누레닌의 체내 대사율이 정상 대조군의 0.1 내지 1 미만 배;
    중 하나 이상에 해당하는 경우 위암 가능성이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함하는, 위암 진단용 기초 정보 제공 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
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