KR20200062858A

KR20200062858A - 전당뇨 진단 키트 및 진단 방법

Info

Publication number: KR20200062858A
Application number: KR1020180148766A
Authority: KR
Inventors: 김봉조; 이헌식; 박태준
Original assignee: 대한민국(관리부서 질병관리본부장)
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2020-06-04
Also published as: KR102377089B1

Abstract

본 발명은 혈청 대사체를 이용한 전당뇨 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 당뇨병전기 즉 당뇨병전증(糖尿病前症) 환자의 혈청에서 특이적으로 증가하는 전당뇨 연관 혈청 대사체 마커를 발굴하고, 그 혈청 대사체 마커를 이용한 전당뇨 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.

Description

전당뇨 진단 키트 및 진단 방법{Diagnostic test kit for diagnosing prediabetes and a method for diagnosing prediabetes}

전당뇨(prediabetes)는 당뇨 확진 전의 단계로서 당대사의 잠재적 결함상태라 할 수 있는데 공복혈당 장애(impaired fasting glucose, IFG), 내당능 장애(impaired glucose tolerance, IGT), 당화혈색소 증가(Increased HbA1c level), 그리고 인슐린 저항성(Insulin resistance)과 같은 당뇨위험지표에 의해 진단되며, 당뇨 진행을 늦추거나 정상으로 회복 가능한 시기로 알려져 있으면서도 진성 당뇨병의 기준과는 맞지 않는다는 진단상의 어려움이 있다.

2008년 질병관리본부의 통계에 따르면, 30세 이상 한국인의 당뇨병의 유병률은 9.1%에 달하며 40세가 넘으면 유병률이 급격히 증가하여 50 대에는 20%에 달하는 것으로 나타났다. 우리나라의 경우 제2형 당뇨병 환자가 약 90-95%를 차지하고 있으며, 생활수준의 증가와 함께 당뇨병이 빠르게 증가하고 있으며, 그로 인한 사망률 또한 빠르게 증가하여 OCED 국가중 한국인의 당뇨병으로 인한 사망률이 1위로 보고되어 있다. 당뇨병은 망막증, 신부전, 말초신경합병증 등 매우 심각한 합병증을 초래할 수 있으므로, 조기에 정확히 진단하고 관리하는 것이 필수적이다. 미국당뇨협회의 당뇨 판단 기준에 따르면, 당화혈색소(HbAlc), FPG(Fast plasma gluclose value after fasting for at least 8 h), 2h-PG (75 g 경구 당부하 검사 (OGTT) 2 시간 후 혈장 글루코오스 수치)를 기준으로 당뇨병을 판단하지만, 최근 보다 정확한 진단을 위한 방법의 일환으로 당뇨병에 관한 마커 역할을 할 수 있는 혈청 대사체에 대한 연구가 광범위하게 진행되고 있다.

나아가 전당뇨에 대한 진단이 이루어지는 시기에는 이미 당뇨나 합병증(미세/거대혈관질환)이 진행된 경우가 자주 발생하기 때문에 대사체 연구를 통해 혈당 측정 방법의 단점을 보완하고, 보다 정확하게 당뇨 진행을 예측ㆍ예방할 수 있는 대사체 마커를 발굴하는 것이 당면한 과제이다. 혈청 대사체는 유전자 발현과 환경적 영향에 의한 생체내 생화학적 변화를 대변하는 소분자로서, 질환 진단과 발생 기작을 이해하는데 중요한 정보를 제공한다. 따라서 전당뇨에 관한 마커 역할을 할 수 있는 혈청 대사체는 당뇨병의 잠재적인 발병 가능성을 보다 정확히 진단하거나 혹은 당뇨병 치료제 개발의 타겟으로서 역할을 수행할 가능성도 있다. 이러한 배경하에 최근 혈청 대사체 연구는 인간 혈청 대사체들이 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병 및 전당뇨로 발생한 혈당부하와 관련이 있음을 보여주고 있다(비특허문헌 1 내지 4). 그러나 아직까지 전당뇨와 관련하여 신뢰할만한 혈청 대사체에 관한 보고는 부족한 상태이다.

한편 당뇨병의 진단과 관련된 특허문헌들도 보고되어 있다.

예컨대 특허문헌 1로 제시된 특허공개공보 제10-2017-0072650호의 경우 C16, PC ae C36:0, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 당뇨병진단 키트, 및 상기 혈청 대사체를 이용하여 당뇨병 진단 또는 한국인의 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하고 있다. 그러나 여기에서는 대사체 마커 자체가 제2형 당뇨병과 연관된 혈청 대사체 마커들이므로 이를 이용하여 진단하더라도 전당뇨 단계가 아니라 이미 진행된 당뇨병 자체를 진단하기 위한 것이다.

또한 특허문헌 2로 제시된 특허공개공보 제10-2016-0087035호의 경우 류신, 페닐알라닌 등의 말초혈액 단핵세포(PBMC) 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 당뇨병 진단키트, 및 상기 혈청 대사체를 이용하여 당뇨병 진단 또는 한국인의 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하고 있다. 그러나 여기서도 통계적 분석 수법이 본 발명과 차이가 있고 대사체 마커도 전당뇨 진단을 위한 것과는 차이가 있다.

나아가 특허문헌 3으로 제시된 미국 특허공개공보 US2010/0197028 A1의 경우 개체의 체액이나 조직으로부터의 샘플 내 대사체의 양을 결정하는 단계를 포함하는 당뇨 조건의 상태를 평가하는 방법을 개시하고 있으나 이 방법은 예컨대 인슐린 저항성, 전당뇨, 또는 당뇨 조건을 변환시키는 약에 대한 반응성을 진단 및 모니터링하기 위해 사용할 수 있음을 나타내고 있다. 여기서도 대사체 마커가 전체적으로 전당뇨에 관한 것으로서는 부족한 단점이 있다.

특허공개공보 10-2017-0072650 특허공개공보 10-2016-0087035 미국 특허공개공보 US2010/0197028 A1

Zhang, X. et al., J.9 Proteome. Res., 8(11),5188-95(2009) Huffman, K.M. et al., Diabetes Care., 32(9),1678-83(2009) Bain, J.R. Diabetes., 58(11),16 2429-43(2009) Zhao, X. et al., J. Physiol. Endocrinol. Metab., 296(2), E384-93(2009)

본 발명의 목적은 혈청에서 나타나는 대사체 변화를 통하여 전당뇨에 특이적인 대사체 마커를 새로이 발굴한 것에 기초하여 개발된 전당뇨에 대한 진단 키트를 제공하는 것이다.

나아가 전당뇨 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다. 이방법에 따라 수득괸 정보는 당뇨 진행에 대한 조기진단에 도움을 줄 수 있는 정보로서 기능하며 이를 통해 당뇨 예방 및 전당뇨 시기에 발병 가능성이 높은 다양한 혈관질환등의 합병증 예방이 가능하다. 나아가 당뇨병의 효과적인 치료 방법과 신약 개발 등에도 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명의 일 양상은 Alanine(Ala), Valine(Val), Gly(Glycine), Tyrosine(Tyr), Methionine(Met), lysoPhosphatidylcholine acyl C18:2(lysoPC a C18:2), Hydroxysphingomyeline C22:2(SM(OH) C22:2) Octadecenoylcarnitine(C18:1), Phosphatidylcholine diacyl C36:1(PC aa C36:1), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C30:0(PC ae C30:0), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C42:1(PC ae C42:1), Sphingomyeline C18:1(SM C18:1), 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 전당뇨 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 본 발명의 키트가 당뇨로의 진행을 예방, 예측, 또는 진단에 적용되는 전당뇨 진단 키트인 것을 제공한다.

본 발명의 또다른 일 양상은 상기 본 발명의 키트가 시료 제공자의 체질량지수가 경도비만인 경우(25kg/m²≤BMI< 30kg/m², AUC=0.58)에 적용되는 전당뇨 진단 키트인 것을 제공한다.

본 발명의 또다른 일 양상은 상기 본 발명의 키트가 중성지방, 당화혈색소, 공복혈당, 공복인슐린, 및 이들의 임의의 조합에서 선택된 생화학적 인자에 대한 정량장치를 더 포함하는 당뇨병 진단 키트인 것을 제공한다.

본 발명의 또다른 일 양상은 상기 본 발명의 키트가 상기 정량장치로서 액체크로마토그래프(liquid chromatography, LC) 및 흐름주입-질량분석기(flow-injection analysis mass spectrometer; FIA-MS)를 더 포함하는 당뇨병 진단 키트인 것을 제공한다.

나아가 본 발명의 일 양상은

인간으로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 획득하는 단계; 및

상기 시료 중의 Alanine(Ala), Valine(Val), Gly(Glycine), Tyrosine(Tyr), Methionine(Met), lysoPhosphatidylcholine acyl C18:2(lysoPC a C18:2), Hydroxysphingomyeline C22:2(SM(OH) C22:2) Octadecenoylcarnitine(C18:1), Phosphatidylcholine diacyl C36:1(PC aa C36:1), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C30:0(PC ae C30:0), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C42:1(PC ae C42:1), Sphingomyeline C18:1(SM C18:1), 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체의 농도를 측정하는 단계를 포함하고,

상기 측정된 혈청 대사체의 농도가 대조군의 시료에서보다 증가하는 경우 전당뇨인 것으로 판단하는 것인, 전당뇨의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 방법이 인간의 체질량지수가 경도비만인 경우(25kg/m²≤BMI< 30kg/m², AUC=0.58)에 적용되는 전당뇨의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법인 것을 제공한다.

본 발명의 또다른 일 양상은 상기 방법이 공복혈당에 의한 전당뇨 예측 정보를 제공하는 방법을 더 포함하는, 전당뇨의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법인 것을 제공한다.

본 발명의 또다른 일 양상은 상기 방법이 전당뇨 위험 인자(연령, 성별, 체질량지수 및 혈중 지질 농도 등)를 포함하는 CRF 모델에 의한 전당뇨 예측 정보를 제공하는 방법을 더 포함하는, 전당뇨의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법인 것을 제공한다.

본 발명의 또다른 일 양상은 상기 방법이 공복혈당에 의한 전당뇨 예측 정보를 제공하는 방법 및 전당뇨 위험 인자((연령, 성별, 체질량지수 및 혈중 지질 농도 등)를 포함하는 CRF 모델에 의한 전당뇨 예측 정보를 제공하는 방법을 더 포함하는, 전당뇨의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법인 것을 제공한다.

본 발명은 인구집단 코호트로부터 수집된 혈청에서 나타나는 대사체의 변화를 통하여 발굴된 전당뇨에 특이적인 대사체 마커에 기초한 것으로서 종래의 당뇨병 위험 생화학적 인자의 정량을 통한 진단이나 기존의 대사체 마커를 이용한 진단에 비해 보다 정확한 전당뇨의 진단이 가능하다. 나아가 당뇨 진행에 대한 조기진단이 가능하므로 이를 통해 당뇨 예방 및 전당뇨 시기에 발병 가능성이 높은 다양한 혈관질환등의 합병증에 대한 예방이 가능하다. 또한 본 발명은 당뇨병의 효과적인 치료 방법과 신약 개발 등에도 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 코호트 및 실험 대상으로서 참여자에 관한 모식도로서, 한국인 지역사회기반 3기(KARE AS3)를 기반(Baseline) 코호트로 하여 6년의 추적(KARE AS6)을 통한 추적(Follow-up) 코호트 및 각각의 참여자의 숫자를 나타낸다.
도 2는 기반 코호트에서 전당뇨 표현형에 따른 대사체의 분석결과를 나타내는 다이어그램이다(p<4.07E-04).
도 3은 12개의 전당뇨 마커(KARE)와, 다른 예측 모델간의 전당뇨에 대한 예측률을 대비하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 나이(A), 성별(B), 체질량지수(C)의 세부 그룹에서 12개의 전당뇨 마커(KARE)와 공복혈당 측정시의 전당뇨에 대한 예측률을 대비하여 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다.

본 명세서에서, 용어 “혈청 대사체”란 혈액 기원의 액상 시료로부터 수득한 대사산물을 의미한다. 상기 혈액 기원의 액상 시료는 예를 들어 전혈, 혈장, 또는 혈청이다. 일 구체예에서, 상기 혈액 기원의 액상 시료는 혈청이다. 상기 혈액 기원의 액상시료는 혈청 대사체의 검출을 위해 전처리할 수 있으며, 예를 들어 여과, 증류, 추출, 분리, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 혈청 대사체는 대사 및 대사 과정에 의해 생산된 물질, 또는 생물학적 효소 및 분자에 의한 화학적 대사 작용으로 발생한 물질 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 당뇨병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

이하 본 발명의 혈청 대사체 마커를 발굴한 과정에 관해 상세히 설명한다.

본 발명의 발명자들은 한국인유전체역학조사사업(KoGES)으로 확립된 지역사회기반코호트(KARE 3기)시료로부터 표적화 대사체 접근법(targeted metabolomics approach)으로 생산된 1,723명의 대사체 정보에 대해 다양한 통계분석(statistical analysis)을 사용하여 계층화된 전당뇨 표현형(당뇨협회 기준에 따른 전당뇨, 공복혈당 장애, 내당능 장애, 당화혈색소 증가, 인슐린 저항성)에 따른 한국인의 전당뇨 연관 대사체 마커를 발굴하였다.

또한, 추적 코흐트(KARE 코호트 6기)에서 500명의 추적 대사체 정보를 사용하여 ROC(receiver-operating characteristic)분석을 하였고 AUC(area under curve)를 계산하였다. 이의 결과 이들 마커의 전당뇨 예측률을 전당뇨 위험 인자나이(age), 성별(sex), 체질량지수(BMI), 고밀도지단백(HDL), 저밀도지단백(LDL), 중성지방(TG)을 통해 검증하고 서양인에서 이미 보고된 대사체 마커들(Framingham Heart Study in US; FHS, KORA cohort study in Germany; KORA)을 모델로 사용한 경우의 예측률에 대해 비교 분석하였다.

즉 기반 코호트 참여자를 대상으로 나이, 성별, 체질량지수를 공변량(covariate)으로 사용하여 회귀 분석(regression analysis)을 수행하여 계층화된 전당뇨 표현형에서 통계적 유의성(Bonferroni 사후 검정, p<4.07E-04)을 보이는 39개의 강화 대사체(enriched metabolites)를 확인 하였으며, 이들에 대한 랜덤 포레스트(random forest) 분석과 단계 회귀 분석(stepwise regression analysis)를 통해 최종적으로 전당뇨 연관 대사체 마커 12개를 발굴 하였다. 이중 7개의 대사체Alanine(Ala), Valine(Val), Gly(Glycine),Tyrosine(Tyr), Methionine(Met), lysoPhosphatidylcholine acyl C18:2(lysoPC a C18:2), Hydroxysphingomyeline C22:2(SM(OH) C22:2)는 서양인에서 전당뇨와 관련된 것으로 보고된 바 있으나, 본 발명과 관련된 연구과정에서 5개의 대사체 즉, Octadecenoylcarnitine(C18:1), Phosphatidylcholine diacyl C36:1(PC aa C36:1), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C30:0(PC ae C30:0), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C42:1(PC ae C42:1), Sphingomyeline C18:1(SM C18:1)가 전당뇨와 관련된 대사체로 최초로 확인되었다. 추적 코호트에서 이들 대사체 마커의 전당뇨 예측률(AUC 0.71)이 전당뇨 위험 인자에 의한 예측률(AUC 0.64) 보다 높게 확인 되었으며(p<0.01), 서양인에서 종래에 보고된 미국의 EPIC 코호트 모델(AUC 0.56) 과 독일의 KORA 코호트 모델(AUC 0.64) 보다 높은 예측률을 보였다 (p<0.005). 또한 나이(사분위수), 성별(여성/남성), 체질량지수(정상/과체중/경도비만)등의 세분화 그룹에서 대사체 마커에 의한 전당뇨 예측률과 공복혈당과의 예측률 비교에서는 나이에 따른 차이는 없었지만, 체질량지수가 경도비만인 경우(25kg/m²≤BMI< 30kg/m², AUC=0.58) 대사체 마커에 의한 예측률(AUC=0.79)이 더 높은 것으로 확인되었다(p<0.001). 또한, 성별이 여성인 경우(AUC=0.73 vs. 0.85, p<0.002)와 체질량지수가 정상인 경우(BMI<23kg/m², AUC 0.68 vs. 0.78, p<0.01)로 예측률이 낮은 것으로 확인 되었다.

따라서 상기한 연구 결과에 따르면 혈청 대사체 Alanine(Ala), Valine(Val), Gly(Glycine), Tyrosine(Tyr), Methionine(Met), lysoPhosphatidylcholine acyl C18:2(lysoPC a C18:2), Hydroxysphingomyeline C22:2(SM(OH) C22:2), Octadecenoylcarnitine(C18:1), Phosphatidylcholine diacyl C36:1(PC aa C36:1), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C30:0(PC ae C30:0), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C42:1(PC ae C42:1), Sphingomyeline C18:1(SM C18:1)가 정상군에 비해 당뇨군의 혈청에서 그 양이 변화하는 특이 혈청 대사체인 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 일 양상에 있어서,

Alanine(Ala), Valine(Val), Gly(Glycine), Tyrosine(Tyr), Methionine(Met), lysoPhosphatidylcholine acyl C18:2(lysoPC a C18:2), Hydroxysphingomyeline C22:2(SM(OH) C22:2) Octadecenoylcarnitine(C18:1), Phosphatidylcholine diacyl C36:1(PC aa C36:1), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C30:0(PC ae C30:0), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C42:1(PC ae C42:1), Sphingomyeline C18:1(SM C18:1), 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 당뇨병 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 명세서에서, 용어 “전당뇨”란 혈당이 정상보다는 높기는 하지만 당뇨병으로 확진되기까지는 추가적인 정보가 필요한 상태를 포함한다. 대부분의 사람들은 제2형 당뇨병으로 확진되기 전에 전당뇨 과정을 거친다. 전당뇨에서 나타나는 혈당의 상승은 인슐린 저항성의 문제로 인해 시작되지만, 전당뇨 단계에 있다고 해서 자동적으로 당뇨병으로 진행하지는 않는다. 다만 당뇨병으로 진행될 위험성이 높으며 전당뇨는 심장질환 발생의 위험 요인도 된다. 제2형 당뇨병 환자와 마찬가지로 전당뇨 사람들도 과체중인 경향이 있으며 혈압이 높고 비정상적인 콜레스테롤의 농도를 보인다.

상기 본 발명의 임의의 양상에 있어서, 상기 정량장치는 상기 혈청 대사체를 정량할 수 있고 키트로서 사용될 수 있는 임의의 장치를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 정량장치는 크로마토그래프(liquid chromatography, LC) 및 질량분석기를 포함할 수 있다.

상기 크로마토그래피는 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 관련업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다

상기 질량분석기는 MALDI-TOF MS, Q-TOF MS, 또는 흐름주입-질량분석기(FIA MS)를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며 관련업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정성용 질량분석기를 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 질량분석기는 흐름주입-질량분석기이다. 상기 혈청 대사체는 각 성분들의 상이한 이동성에 따라 액체 크로마토크래피에서 각 성분들이 분리되며, 질량분석기를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 통해 구성성분을 확인할 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 정량장치는 액체크로마토그래프(liquid chromatography, LC) 및 흐름주입-질량분석기를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 적절한 용기와 함께 제공될 수 있으며 사용 방법에 관한 지시사항과 함께 제공될 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험방법

1. 실험 대상

본 발명의 실험 대상자들은 한국인유전체역학조사사업의 일환으로 수집된 지역사회기반코호트 3기 사업 참여자중 미국당뇨협회 당뇨 진단 기준에 따른 생화학적 역학 자료를 기반으로 1,723명을 선별(기반 코호트)하여 대사체 정보를 생산하였다. 나아가 기반 코호트(Baseline) 참여 정상인에 대해 6년의 추적(지역사회기반코호트 6기)을 통해 여전히 정상이거나 전당뇨로 진행된 500명을 선별(추적 코호트)하여 대사체 정보를 생산하였다(표 1 및 도 1).

<당뇨협회 기준에 따른 참여자의 임상 정보>

NGT; Normal glucose tolerance(정상 당 내성), PD; prediabetes(전당뇨), BMI; Body mass index(신체질량지수), HDL; High-density lipoprotein cholesterol(고밀도 지단백 콜레스테롤), LDL; Low-density lipoprotein cholesterol(저밀도 지단백 콜레스테롤), TG; Triglyceride(트리글리세리드), HOMA-IR; Homeostatic model assessment of insulin resistance(인슐린 저항성의 항상성 모델 평가)

2. 대사체의 정량

상기 기반 코호트 및 추적 코호트에서 선별된 참여자로부터 수집된 혈청시료에 대해 AbsoluteIDQp180 kit(Biocrates, Austria)을 사용하여 액체크로마토그래프(lipid chromatography, LC)와 흐름주입(flow-injection analysis, FIA)-질량 분석법(mass spectrometry, MS)을 이용하여 186종의 대사체{40 아실카르니틴(acylcarnitines), 21 아미노산, 19 생체 아민(biogeneic amines), 1 헥소즈(hexose), 90 글리세로포스포리피드(glycerophospholipids), 그리고 15 스핑고리피드(sphingolipids)}를 정량하였다.

실험과정을 구체적으로 기술하자면 다음과 같다.

10 uL의 혈청을 100 x g로 2분간 원심분리 후, 상층액을 취하여 Agilent 1200 HPLC 장비(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 장착한 API 4000 QTRAP LC/MS/MS 장비(Applied Biosystems, Foster CIty, CA)를 이용하여 아크릴카르니틴, 글리세로포스포리피드 그리고 스핑고리피드를 양성 이온 모드로, 그리고 헥소즈를 음성 이온 모드로 흐름주입 질량분석법을 수행하였다. 또한 아미노산과 생체 아민의 경우 양성 이온 모드에서 액체크로마토그래프 질량분석을 수행하였다. 이들 대사체들은 키드내 ¹³C와 ¹⁵N등의 안전성 동위원소로 표지된 내부표준물질을 이용하여 탐지되었으며 MetVal^TM 분석툴(Biocrates life sciences AG, Innsbruck, Austria)을 사용하여 uM 농도 범위에서 정량되었다.

- LC-MS/MS 분석 조건

검출기: API 4000 QTRAP+Agilent 1200 HPLC

칼럼:　Zorbax Eclipse XDB C18(3.0 x 100mm, 3.5um, Agilent)

가드 칼럼: Security Guard Cartridges C18 4 x 100mm ID

칼럼오븐: 50 ℃

이동상: A(0.2% 포름산/물), B(0.2% 포름산/아세토니트릴)

Gradient 조건:

Step	총 시간(분)	유속(ul/분)	A(%)	B(%)
0	0.00	500	100	0
1	0.50	500	100	0
2	5.50	500	5	95
3	6.50	500	5	95
4	7.00	500	100	0
5	9.50	500	100	0

유속: 0.5 ml/분

주입량: 10ul

- FIA-MS/MS 분석 조건

검출기: API 4000 QTRAP+Agilent 1200 HPLC

이동상: B(Biocrates Solvent I diluted with 290 ml of methanol)

Isocratic 조건:

Step	총 시간(분)	유속(ul/분)	A(%)	B(%)
0	0.00	30	0	100
1	1.60	30	0	100
2	2.40	200	0	100
3	2.60	200	0	100
4	3.00	30	0	100

유속: 0.03 ml/분

주입량: 20 ul

3. 대사체 정보에 대한 정도 관리

생산된 대사체 정보에 대해 다음과 같은 조건으로 정도 관리를 수행 하였다. 정도 관리의 조건은 참조표준(reference standard) 시료의 반복 측정값의 변동계수(coefficient of variance, CV)가 15% 미만 이며, 키트 내 품질 대조시료(quality control)와 실험용 시료군 모두에서 대사체 정량이 50% 이상이면서 변동계수가 15 %미만을 기준으로 하였다. 그 결과, 기반 코호트로부터 123개{1 총 헥소즈(total hexoses), 12 아실카르니틴, 21 아미노산, 7 생물학적 아민(biological amines), 10 스핑고미엘린(sphingomyelines), 32 디아실포스파티딜콜린(diacyl phosphatidylcholines), 32 아실-일킬 포스파티딜콜린(acyl-alkyl phosphatidylcholines), 그리고 8 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholines)}의 대사체가 선별되었으며, 추적 코호트로부터 131개(1 총 헥소즈, 17 아실카르니틴, 20 아미노산, 7 생물학적 아민(biological amines), 13 스핑고미엘린, 29 디아실포스파티딜콜린, 34 아실-일킬 포스파티딜콜린, 그리고 10 리소포스파티딜콜린)의 대사체가 선별되었고, 이들을 통계 분석에 사용하였다.

4. 통계적 분석

R프로그램과 IBM SPSS v20.0을 이용하여 기반 코호트로부터 다양하게 계층화된 전당뇨 표현형(국제당뇨협회 기준에 따른 전당뇨, 공복혈당 장애, 내당능 장애, 당화혈색소 증가, 인슐린 저항성)에 따른 선형 회귀 분석(linear regression analysis)과 로지스틱 회귀 분석(logistic regression analysis)을 통해 통계적 유의수준이 p<4.07E-04(다중비교, 123개 대사체에 대한 α=0.05)를 만족하는 전당뇨 관련 대사체를 선별하였다. 이때, 공변량으로는 나이(age), 성별(sex), 체질량지수(body mass index, BMI)를 사용하였다. 또한 랜덤 포레스트(random forest selection) 방법을 통해 상기의 결과를 검증하였으며, 최적의 전당뇨 예측 모델을 만들기 위해 단계 회귀 분석(stepwise regression analysis)를 수행하였다.

5. 전당뇨 발병의 예측률

기반 코호트로부터 선별된 대사체 마커를 예측 모델(KARE)로 사용하여 추적 코호트로부터 전당뇨 발병에 대해 예측하였다. 전당뇨 예측률은 ROC(receiver-operating characteristic)분석을 통해 얻어진 AUC(area under curve, 그래프 내 면적)로 계산 되었으며, 전당뇨 마커에 의한 예측률을 전당뇨 위험 인자나이(age), 성별(sex), 체질량지수(BMI), 고밀도지단백(HDL), 저밀도지단백(LDL), 중성지방(TG), CRF 및 서양인에서 이미 보고된 대사체 마커들(Framingham Heart Study in US; FHS, KORA cohort study in Germany; KORA)을 모델로 사용한 경우의 예측률과 비교 분석 하였다. 또한, 본 발명에서 대사체 발굴을 위해 임상혼란 변수로 사용된 나이(age), 성별(sex), 체질량지수(BMI)등의 세분화 그룹에서 전당뇨 예측률의 차이를 비교하였다. 각 모델에서 예측률의 통계적 유의 수준은 DeLong 테스트를 통해 p< 0.05로 하였다.

실험결과

실시예 1. 기반 코호트로부터 전당뇨 대사체 마커의 발굴

기반 코호트로부터 정도 관리된 123개 대사체에 대해 당뇨협회 기준(표 1)에 따른 정상군(NGT, 924명, 공복혈당<100mg/dL 그리고 식후혈당<140 mg/dL 그리고 당화혈색소<5.7%)과 전당뇨군(PD, 799명, 100≤공복혈당<126 또는 140≤식후혈당<200 또는 5.7≤당화혈색소<6.5)에서 나이, 성별, 체질량지수를 공변량으로 사용하여 로지스틱 회귀 분석(logistic regression analysis)을 통해 두 군간에 44개의 대사체가 유의한 차이가 있는 것을 확인 하였으며, 전체 1,723 참여자의 공복혈당 값 및 식후혈당 값 증가에 따른 선형 회귀 분석(linear regression analysis) 수행 결과 각각 47, 52개의 대사체가 유의하게 변화하는 것이 확인 되었다(p<4.07E-04) (도 2의 좌측 상단).

또한 혈당 측정 방법 차이(표 4)에 의한 혈당치에 따른 전당뇨군의 계층화를 통한 공복혈당 장애군(IFG, 255명, 100≤공복혈당<126), 내당능 장애군(IGT, 265명, 140≤식후혈당<200), 그리고 공복혈당 장애 및 내당능 장애를 둘다 포함 하는 군(IFG+IGT, 206명, 100≤공복혈당<126 그리고 140≤식후혈당<200)과 정상군(NGT, 997명)에 대한 로지스틱 회귀 분석 결과 각각 34, 29, 28개의 대사체가 유의하게 변화하는 것이 확인 되었다(p<4.07E-04)(도 2의 우측 상단).

<기반 코호트에서 혈당 측정법(Fasting glucose, 2-h Glucose)에 따른 실험대상의 임상 정보>

IFG: 공복혈당장애군, Impaired fasting glucose,

IGT: 내당능 장애군, Impaired glucose tolerance

또한 당화혈색소(HbA1c)의 차이(표 5)에 따른 정상군(NGT, 1,105명, HbA1c<5.7)과 전당뇨군(PD, 618명, 5.7≤HbA1c<6.5)에서의 로지스틱 회귀 분석 결과와 당화혈색소 측정 값 증가에 따른 선형 회귀 분석의 수행 결과 각각 39, 47개의 대사체가 유의하게 변화되는 것이 확인 되었다(p<4.07E-04)(도 2의 좌측 하단).

<기반 코호트에서 당화혈색소(HbA1c)의 차이에 따른 참여자 임상 정보>

한편 인슐린저항성은 당뇨 진행의 중요한 지표로서 통상은 표준 방법인 고인슐린증 정상혈당 글루코스 클래프 테스트(Hyperinsulinemic euglycemic glucose clamp test)로 진단되지만 비용, 시간, 그리고 환자의 고통이라는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하고 대량의 시료로부터 인슐린저항성을 측정하기 위한 대체 방법으로 HOMA-IR(Homeostatic model assessment of insulin resistance)이 제시되었다. 인슐린 저항성의 경우 질환 판단에 대한 지표값이 없으므로 일반적으로 4분위 분석을 통해 분석한다. 인슐린저항성(HOMA-IR)에 따른 사분위수 분석에서 인슐린 저항성이 가장 낮은 1사분면(Q1, 431명)과 가장 높은 4사분면(Q4, 431명)간에 로지스틱 회귀 분석과 인슐린저항성 측정값(1,723명) 증가에 따른 선형 회귀 분석 결과 각각 25, 37개의 대사체가 유의하게 변화하는 것이 확인되었다(p<4.07E-04)(표 6, 도 2의 우측 하단).

<기반 코호트에서 인슐린저항성(HOMA-IR)에 따른 참여자 임상 정보>

결과적으로 계층화된 전당뇨 표현형(당뇨협회 기준에 따른 전당뇨, 공복혈당 장애, 내당능 장애, 당화혈색소 증가, 인슐린 저항성)에서 통계적 유의성(Bonferroni 사후 검정, p<4.07E-04)을 보이는 39개의 강화 대사체(enriched metabolites)가 선별되었다(표 7, 도 2의 중앙부).

<전당뇨 표현형에 따른 축적 대사체(enriched metabolites)>

즉 상기 표 7에서 보는 바와 같이 당뇨협회 기준에 따른 전당뇨(PD), 공복혈당 장애(IFG), 내당능 장애(IGT), 당화혈색소 증가(HbA1c), 인슐린 저항성(HOMA-IR)과 관련하여 39개의 축적 대사체가 선별되었다(Bonferroni 사후 검정, p<4.07E-04). 오즈비(OR, odds ratio)와 베타계수(Beta)는 각각 로지스틱 회귀분석과 선형 회귀분석을 통해 계산되었다.

이들에 대한 랜덤 포레스트(random forest) 분석을 통해 26개의 전당뇨 판별 대사체를 선별 하였다(표 8).

<랜덤 포레스트(random forest, RF) 분석을 통한 전당뇨 판별 대사체의 선별>

상기 표 8에서는 랜덤 포레스트(random forest, RF) 분석을 통해 전당뇨 판별 대사체를 선별하였다. 39개의 축적 전당뇨(enriched prediabetes metabolites)에 대해 Mean decreae accurary와 mean decrease gini를 통해 최적의 26개의 전당뇨 판별 대사체(굵은체)를 선별하였다.

또한 단계적 로지스틱 회귀분석(stepwise regression analysis)를 통해 최종적으로 전당뇨 연관 대사체 마커 12개를 갖는 최적의 전당뇨 예측 모델(KARE)을 선정하였다(표 9).

<단계적 로지스틱 회귀분석을 통한 최적의 전당뇨 예측 모델의 선정>

상기 표 9는 단계적 로지스틱 회귀분석(Stepwise logisitc regression)을 통해 선정된 최적의 전당뇨 예측 모델에서의 마커들을 나타내고 있다. 즉 26개 전당뇨 판별 대사체에 대한 단계적 로지스틱 회귀분석을 통해 12개의 대사체를 포함하는 전당뇨 예측 모델(KARE model)을 선정한 것이다.

이중 7개의 대사체 Alanine(Ala), Valine(Val), Gly(Glycine), Tyrosine(Tyr), Methionine(Met), lysoPhosphatidylcholine acyl C18:2(lysoPC a C18:2), Hydroxysphingomyeline C22:2(SM(OH) C22:2)는 서양인에서 전당뇨와 관련하여 이미 보고된 바 있었으나, 5개의 대사체 Octadecenoylcarnitine(C18:1), Phosphatidylcholine diacyl C36:1(PC aa C36:1), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C30:0(PC ae C30:0), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C42:1(PC ae C42:1), Sphingomyeline C18:1(SM C18:1)는 본 발명을 통해 최초로 밝혀진 것이다.

실시예 2. 대사체 마커를 이용한 전당뇨의 예측

추적 코호트로부터의 12개 대사체 마커(KARE)에 의한 전당뇨의 예측률을 도출하였다(도 3). 이에 따르면 KARE 모델을 통한 전당뇨 예측률[AUC 0.71(0.67, 0.76)]은 전당뇨 위험 인자((연령, 성별, 체질량지수 및 혈중 지질 농도 등)를 포함하는 CRF 모델에 의한 예측률[(AUC 0.64(0.59, 0.68)]보다 높게 확인되었음을 알 수 있다(p<0.01). 더욱이 서양인에서 이미 보고된 EPIC 모델[AUC 0.56(0.50, 0.61)]과 KORA 모델[AUC 0.63(0.58, 0.68)] 보다도 높은 예측률을 보였다(p<0.005).

비록 전당뇨 진단의 표준 지표로 사용되는 공복혈당에 의한 예측률[AUC 0.79(0.75, 0.83)]보다는 낮았으나(p<0.005), KARE 모델에 공복혈당 모델을 추가한 경우[AUC 0.84(0.80, 0.88)]에는 공복 혈당에 의한 예측률보다 증가하였다.

나아가, KARE 모델에 CRF 모델과 공복혈당 모델까지 추가한 경우에는 가장 높은 전당뇨 예측률[AUC 0.86(0.82, 0.89)]을 보였다. 그렇다면 이와 같은 결과는 한국인에 특이적인 전당뇨 마커가 존재하고, 이들 대사체 마커가 기존 전당뇨 진단 지표에 의한 전당뇨의 예측률을 증가시켜 줄 수 있다는 것을 의미하는 것이다.

추가적으로 나이(사분위수), 성별(여성/남성), 체질량지수(정상/과체중/경도비만)등의 세분화 그룹에서 KARE 모델과과 공복혈당에 의한 전당뇨 예측률을 대비하여 보았다(도 4). 여기에서는 나이에 따른 차이는 없었으며, 체질량지수가 경도비만인 경우(25kg/m²≤BMI< 30kg/m²), KARE 모델에 의한 예측률[AUC 0.79(0.72, 0.87)]이 공복혈당에 의한 예측률[AUC 0.58(0.48, 0.68)]보다 높은 것으로 확인되었다(p<0.001). 성별이 여성인 경우[AUC 0.73(0.66, 0.79) vs. 0.85(0.80, 0.89), p<0.002)]와 체질량지수가 정상인 경우[BMI<23kg/m², AUC 0.67(0.60, 0.74) vs. 0.78(0.71, 0.84), p<0.01)]에는 예측률이 낮은 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 체질량지수에 의한 초기 비만의 진행과정에서는 공복혈당보다 더 좋은 전당뇨 예측률을 보여줄 뿐만 아니라, 연령에 따라서는 공복혈당과 유사한 수준으로 전당뇨 예측이 가능하다는 것을 의미하는 것이다.

상기한 바와 같이 본 발명은 대사체 정보를 기반으로 계층화된 전당뇨 표현형에 따른 연관 대사체의 마커를 발굴하였으며 이는 한국인에 특이적인 전당뇨 대사체의 마커이다. 이들 마커는 놀랍게도 전당뇨 위험 인자나 기존 대사체 마커에 비해 향상된 전당뇨 예측률을 보였다. 이러한 결과는 전당뇨 예측과 진단에 활용 될 수 있으며, 예방 및 치료를 위한 의약품 개발의 표적으로 유용하게 이용될 수도 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 관련업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

Alanine(Ala), Valine(Val), Gly(Glycine), Tyrosine(Tyr), Methionine(Met), lysoPhosphatidylcholine acyl C18:2(lysoPC a C18:2), Hydroxysphingomyeline C22:2(SM(OH) C22:2) Octadecenoylcarnitine(C18:1), Phosphatidylcholine diacyl C36:1(PC aa C36:1), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C30:0(PC ae C30:0), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C42:1(PC ae C42:1), Sphingomyeline C18:1(SM C18:1), 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 전당뇨 진단 키트.
청구항 1에 있어서, 상기 키트는 당뇨로의 진행을 예방, 예측, 또는 진단에 적용되는 전당뇨 진단 키트.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 키트는 시료 제공자의 체질량지수가 경도비만인 경우(25kg/m²≤BMI< 30kg/m², AUC=0.58)에 적용되는 전당뇨 진단 키트.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 중성지방, 당화혈색소, 공복혈당, 공복인슐린, 및 이들의 임의의 조합에서 선택된 생화학적 인자에 대한 정량장치를 더 포함하는 것인 당뇨병 진단 키트.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 정량장치는 액체크로마토그래프(liquid chromatography, LC) 및 흐름주입-질량분석기(flow-injection analysis mass spectrometer; FIA-MS)를 더 포함하는 것인 당뇨병 진단 키트.
인간으로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 획득하는 단계; 및
상기 시료 중의 Alanine(Ala), Valine(Val), Gly(Glycine), Tyrosine(Tyr), Methionine(Met), lysoPhosphatidylcholine acyl C18:2(lysoPC a C18:2), Hydroxysphingomyeline C22:2(SM(OH) C22:2) Octadecenoylcarnitine(C18:1), Phosphatidylcholine diacyl C36:1(PC aa C36:1), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C30:0(PC ae C30:0), Phosphatidylcholine acyl-alkyl C42:1(PC ae C42:1), Sphingomyeline C18:1(SM C18:1), 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체의 농도를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 측정된 혈청 대사체의 농도가 대조군의 시료에서보다 증가하는 경우 전당뇨인 것으로 판단하는 것인, 전당뇨의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 방법은 인간의 체질량지수가 경도비만인 경우(25kg/m²≤BMI< 30kg/m², AUC=0.58)에 적용되는 전당뇨의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 6 또는 청구항 7에 있어서, 상기 방법은 공복혈당에 의한 전당뇨 예측 정보를 제공하는 방법을 더 포함하는, 전당뇨의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 6 또는 청구항 7에 있어서, 상기 방법은 전당뇨 위험 인자(연령, 성별, 체질량지수 및 혈중 지질 농도 등)를 포함하는 CRF 모델에 의한 전당뇨 예측 정보를 제공하는 방법을 더 포함하는, 전당뇨의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 6 또는 청구항 7에 있어서, 상기 방법은 공복혈당에 의한 전당뇨 예측 정보를 제공하는 방법 및 전당뇨 위험 인자((연령, 성별, 체질량지수 및 혈중 지질 농도 등)를 포함하는 CRF 모델에 의한 전당뇨 예측 정보를 제공하는 방법을 더 포함하는, 전당뇨의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.