KR101764323B1

KR101764323B1 - 혈청 대사체를 이용한 제2형 당뇨병 진단 키트 및 진단 방법

Info

Publication number: KR101764323B1
Application number: KR1020150181083A
Authority: KR
Inventors: 이헌식; 김연정; 김정민; 김봉조
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2017-08-14
Also published as: KR20170072650A

Abstract

본 발명의 일 양상은 C16, PC ae C36:0, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 당뇨병 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 다른 일 양상은 C16, PC ae C36:0, glycine, lysoPC a C18:2, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 한국인의 당뇨병 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 또 다른 일 양상은 상기 혈청 대사체를 이용하여 당뇨병 진단 또는 한국인의 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공한다.

Description

혈청 대사체를 이용한 제2형 당뇨병 진단 키트 및 진단 방법{Diagnostic test kit for diagnosing diabetus mellitus and a method for diagnosing diabetus mellitus using serum metabollites}

본 발명은 혈청 대사체를 이용한 제2형 당뇨병 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 제2형 당뇨병 환자의 혈청에서 특이적으로 증감하는 제2형 당뇨병 연관 혈청 대사체 마커를 발굴하고, 그 혈청 대사체 마커를 이용한 제2형 당뇨병 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.

당뇨병은 제1형 당뇨병(소아 당뇨병) 및 제2형 당뇨병으로 구분되며, 제1형 당뇨병은 인슐린 부족으로 생기는데 반해, 제2형 당뇨병은 인슐린의 분비 조절은 원활하나 인슐린이 제기능을 하지 못하여 혈당 조절이 실패된 상태로서, 운동부족, 비만 또는 스트레스 등에 의한 후천적 요인에 의해 발생된다.

2008년 질병관리본부의 통계에 따르면, 30세 이상 한국인의 당뇨병의 유병률은 9.1%에 달하며 40세가 넘으면 유병률이 급격히 증가하여 50 대에는 20%에 달하는 것으로 나타났다. 우리나라의 경우 제2형 당뇨병 환자가 약 90-95%를 차지하고 있으며, 생활수준의 증가와 함께 당뇨병이 빠르게 증가하고 있으며, 그로 인한 사망률 또한 빠르게 증가하여 OCED 국가중 한국인의 당뇨병으로 인한 사망률이 1위라고 한다.

당뇨병은 망막증, 신부전, 말초신경합병증 등 매우 심각한 합병증을 초래할 수 있으므로, 조기에 정확히 진단하고 관리하는 것이 필수적이다.

미국당뇨협회의 당뇨 판단 기준에 따르면, 당화혈색소(HbAlc), FPG(Fast plasma gluclose value after fasting for at least 8 h), 2h-PG (75 g 경구 당부하 검사 (OGTT) 2 시간 후 혈장 글루코오스 수치)를 기준으로 당뇨병을 판단하지만, 최근 보다 정확한 진단을 위한 방법의 일환으로 당뇨병에 관한 마커 역할을 할 수 있는 혈청 대사체에 대한 연구가 진행되고 있다. 당뇨병에 관한 마커 역할을 할 수 있는 혈청 대사체는 당뇨병의 보다 정확한 진단에 이용되거나, 혹은 당뇨병 치료제 개발의 타겟으로서 역할을 수행할 가능성도 있다.

최근 혈청 대사체 연구는 인간 혈청 대사체들이 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병 및 전당뇨로 발생한 혈당부하와 관련이 있음을 보여주고 있다(비특허문헌 1 내지 4).

1. Zhang, X. et al., J.9 Proteome. Res., 8(11),5188-95(2009) 2. Huffman, K.M. et al., Diabetes Care., 32(9),1678-83(2009) 3. Bain, J.R. Diabetes., 58(11),16 2429-43(2009) 4. Zhao, X. et al., J. Physiol. Endocrinol. Metab., 296(2), E384-93(2009)

본 발명의 목적은 제2형 당뇨병과 연관된 혈청 대사체 마커를 발굴하고, 그 혈청 대사체 마커를 이용한 당뇨병 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한국인에 특이적인 제2형 당뇨병과 연관된 혈청 대사체 마커를 발굴하고, 그 혈청 대사체 마커를 이용한 당뇨병 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 제2형 당뇨병과 연관된 혈청 대사체 마커를 발굴하고, 그 대사체 마커를 이용하여 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한국인에 특이적인 제2형 당뇨병과 연관된 혈청 대사체 마커를 발굴하고, 그 대사체 마커를 이용하여 한국인의 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은

C16, PC ae C36:0, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 당뇨병 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양상은

C16, PC ae C36:0, glycine, lysoPC a C18:2, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 한국인의 당뇨병 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양상은

인간으로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 획득하는 단계; 및

상기 시료 중의 C16, PC ae C36:0, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체의 농도를 측정하는 단계를 포함하고,

상기 측정된 혈청 대사체의 농도가 대조군의 시료에서보다 증가하는 경우 당뇨병인 것으로 판단하는 것인, 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양상은

상기 시료 중의 C16, PC ae C36:0, glycine, lysoPC a C18:2, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체의 농도를 측정하는 단계를 포함하고,

상기 측정된 C16 또는 PC ae C36:0의 농도가 대조군의 시료에서보다 증가하거나, glycine 또는 lysoPC a C18:2의 농도가 대조군의 시료에서보다 감소하는 경우 당뇨병인 것으로 판단하는 것인,

한국인의 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 양상에 따르면, 새롭게 발굴된 당뇨병에 특이적인 혈청 대사체인 C16, PC ae C36:0, glycine, lysoPC a C18:2, 또는 이들의 임의의 조합에 대한 측정으로 통해, 종래 당뇨병 위험 생화학적 인자의 정량을 통한 당뇨병 진단에 비해 보다 정확한 당뇨병의 진단을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양상에 따르면, 새롭게 발굴된 당뇨병 특이적 혈청 대사체를 이용하여 보다 정확한 진단을 가능한 당뇨병 진단 키트 및 당뇨병 진단방법을 제공할 수 있다.

도 1은 정상군, 전당뇨군, 및 제2형 당뇨군으로 선별된 그룹을 대상으로 혈청 시료로부터 186종의 대사체를 정량적으로 프로파일링한 후, 종래 당뇨병 위험인자들로부터 독립적인 대사체를 선별하기 위해, 모델 1 및 2 각각[모델 1: 나이(age), 성별(sex), 체질량지수(Body Mass Indexs, BMI), 및 고밀도지단백질(High Density Lipoprotein, HDL), 모델 2:　모델 1 + 중성지방(triglyceride), 당화혈색소 (glycated hemoglobin, HbA1c), 공복혈당(fasting glucose), 및 공복인슐린(fasting insulin)]에 대하여 선형 회귀분석과 로지스틱 회귀분석을 수행한 다음, 선형 회귀분석에 의해 경구 당부하검사 (2h-oral glucose tolerance test, OGTT)의 변화에 영향을 미치는 22개의 대사체를 선별하고, 로지스틱 회귀분석을 통해 당뇨와 관련한 3개의 그룹을 가장 잘 구분해 주는 37개 대사체를 선별한 다음, 이들 대사체중 정상군과 2형 당뇨군, 그리고 전당뇨군과 2형 당뇨군 사이에 증감을 나타내는 대사체를 표시하고 모델 1 및 2에서 공통적으로 증감을 보이는 4종의 대사체(C16, PC ae C36:0, glycine, lysoPC a C18:2)를 유색으로 표현한 그림이다.
도 2는 상기 도 1에서 선별된 대사체에 대해 추가적인 랜덤포레스트 방법을 통한 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 도 1에서 공통적으로 증감을 보이는 4종의 대사체가 당뇨 예측에 어느 정도 효과가 있는지 확인하기 위해 당뇨위험인자들을 포함하는 모델 1 및 2와 비교하여 당뇨 예측률을 ROC(Receiver-Operating Characteristic) 분석을 통해 수행하여 AUC(Area Under Curve)를 계산한 결과를 나타낸 그래프이다 (3a: 당뇨군과 정상군에서의 예측율, 3b: 당뇨군과 비당뇨군(정상군+전당뇨군)에서 예측율, 3c: 전당뇨군과 정상군에서 예측율, 3d: 비정상군(전당뇨군+당뇨군)과 정상군에서 예측율, 3e: 당뇨군과 전당뇨군에서 예측율).

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 발명자들은 제2형 당뇨병에 특이적인 대사체 마커 발굴, 특히 한국인의 제2형 당뇨병에 특이적인 대사체 마커 발굴을 위해 연구하였다. 구체적으로는 정상군(nomral group), 전당뇨군(prediabetes group), 및 당뇨군(diabetes mellitus group) 사이에 유의한 차이를 보이는 대사체를 발굴하기 위하여, 표적화 대사체 프로파일링(Targeted metabolomics approach)과 다양한 통계적 분석 방법(Statistical analysis)을 수행하였다.

그 결과, 4 종의 대사체가 제2형 당뇨에 감수성을 보인다는 것을 발견하였다. 혈청 대사체 C16(Hexadecanoylcarnitine) 및 PC ae C36:0(phosphatidylcholine acyl-alkyl C36:0)은 정상군에 비해 당뇨군의 혈청에서 오즈비 (odd ratio)가 각각 1.97과 1.62로 양이 증가하는 것으로 입증되었으며, Glycine(Gly) 및 lysophosphatidylcholine acyl C18:2(lysoPC a C18:2)의 경우는 정상군에 비해 당뇨군의 혈청에서 오즈비가 각각 0.54와 0.51로 양이 감소하는 경향이 입증되었다(도 1 및 표 6 참조). C16 및 PC ae C36:0는 종래 당뇨 및 전당뇨 연관 대사체로서 기보고된 바가 없으며, Gly 및 C18:2는 종래 서양인의 당뇨 및 전당뇨 연관 대사체로서 기보고된 바 있으나 한국인의 당뇨병을 정상군 또는 전당뇨군과 구별할 수 있는 혈청 대사체로서 최초로 규명되었다. 상기 선별된 대사체는 당뇨위험인자만을 사용하여 당뇨를 예측했을 때보다 함께 사용했을 때 당뇨 예측율을 증가시켰다(도 3a 내지 3e 참조).

또한, 독립된 코호트에서 상기 대사체에 대해 검증 결과, C16, Gly, 및 lysoPC a C18:2의 경우, 당뇨병과 관련성 있는 대사체로 확인되었다(표 7 및 8 참조). 또한, 전장유전체연관분석(GWAS) 결과, 상기 4 종의 대사체가, 18종의 유전좌위(genetic loci)와 관련 되어 있음을 밝혔으며, 이중 7종의 유전좌위를 포함하는 유전자들은 기존에 당뇨나 비만과 관련된 것으로 보고된 것을 확인하였다(표 9).

따라서, 연구 결과에 따르면, 혈청 대사체 C16, PC ae C36:0, Gly, 및 lysoPC a C18:2가 정상군 또는 전당뇨군에 비해 당뇨군의 혈청에서 그 양이 변화하는 특이 혈청 대사체인 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 일 양상에 있어서,

상기 본 발명에 따른 당뇨병 진단 키트는 glycine, lysoPC a C18:2, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 혈청 대사체에 대한 추가적인 정량을 통해 보다 일관성이 있고 신뢰도 높은 당뇨병 진단이 가능하다.

본 발명은 다른 일 양상에 있어서,

본 명세서에서, 용어 “혈청 대사체”란 혈액 기원의 액상 시료로부터 수득한 대사산물을 의미한다. 상기 혈액 기원의 액상 시료는 예를 들어 전혈, 혈장, 또는 혈청이다. 일 구체예에서, 상기 혈액 기원의 액상 시료는 혈청이다. 상기 혈액 기원의 액상시료는 혈청 대사체의 검출을 위해, 전처리 할 수 있으며, 예를 들어 여과, 증류, 추출, 분리, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 혈청 대사체는 대사 및 대사 과정에 의해 생산된 물질, 또는 생물학적 효소 및 분자에 의한 화학적 대사 작용으로 발생한 물질 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 당뇨병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 명세서에서 용어 “제2형 당뇨병”은 인슐린은 정상적으로 분비되나 인슐린이 제 기능을 못하는 경우에 발병하는 당뇨병을 말하며 “성인형 당뇨병” 또는 “인슐린 비의존형 당뇨병”으로도 불리운다. 제2형 당뇨병은 세포가 췌장에서 생성된 인슐린에 효과적으로 반응하지 않는 경우에 발생하는데 이러한 상태를 인슐린 저항성이라고 한다. 인슐린 저항성이 있는 환자들은 처음에는 정상적인 혈당을 유지하기 위해 추가적으로 더 많은 인슐린을 생산하는데, 결국에는 인슐린 저항성이 진행하여 췌장이 인슐린 요구량을 감당할 수 없게 되어 혈당이 상승하게 되는 것이다.

일 구체예에서, 상기 본 발명의 임의의 양상에 따른 당뇨병 진단 키트는 중성지방, 당화혈색소, 공복혈당, 공복인슐린, 및 이들의 임의의 조합에서 선택된 생화학적 인자에 대한 정량장치를 추가로 포함한다. 상기 생화학적 인자의 추가적인 정량에 의해, 보다 일관성이 있고 신뢰도 높은 당뇨병 진단이 가능하다.

일 구체예에서, 상기 본 발명의 임의의 양상에 따른 당뇨병 진단 키트는 정상인 또는 전당뇨(prediabetes)와 구분하여 당뇨병을 진단할 수 있는 당뇨병 진단 키트이다.

일 구체예에서, 상기 본 발명의 진단키트로 진단되는 당뇨병은 제2형 당뇨병이다.

본 명세서에서, 용어 “전당뇨”란 혈당이 정상보다는 높기는 하지만 당뇨병으로 확진되기까지 추가적인 정보가 필요한 상태를 포함한다. 대부분의 사람들은 제2형 당뇨병으로 확진되기 전에 전당뇨 과정을 거친다. 전당뇨에서 나타나는 혈당의 상승은 인슐린 저항성 문제로 인해 시작되지만, 전당뇨에 있다고 해서 자동적으로 당뇨병으로 진행하지는 않지만 당뇨병으로 진행될 위험성이 높은 것은 사실이며, 전당뇨는 심장질환 발생의 위험 요인이 된다. 제2형 당뇨병 환자와 마찬가지로 전당뇨 사람들도 과체중인 경향이 있으며 혈압이 높고 비정상적인 콜레스테롤 농도를 보인다.

상기 본 발명의 임의의 양상에 있어서, 상기 정량장치는 상기 혈청 대사체를 정량할 수 있고 키트로서 사용될 수 있는 임의의 장치를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 정량장치는 크로마토그래프(liquid chromatography, LC) 및 질량분석기를 포함한다.

상기 크로마토그래피는 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다

상기 질량분석기는 MALDI-TOF MS, Q-TOF MS, 또는 흐름주입-질량분석기(FIA MS)를 포함하지만, 이에 제한되지 않고 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정성용 질량분석기를 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 질량분석기는 흐름주입-질량분석기이다. 상기 혈청 대사체는 다른 이동성에 따라 액체 크로마토크래피에서 각 성분들이 분리되며, 질량분석기를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 통해 구성성분을 확인할 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 정량장치는 액체크로마토그래프(liquid chromatography, LC) 및 흐름주입-질량분석기를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 본 발명의 임의의 양상에 따른 당뇨병 진단 키트는, 시료 중 C16, PC ae C36:0, 또는 이들의 조합의 농도가 대조군에 비해 증가하는 경우, 증가된 당뇨 위험도를 나타낸다.

일 구체예에서, 상기 본 발명의 임의의 양상에 따른 당뇨병 진단 키트는, glycine, lysoPC a C18:2, 또는 이들의 조합의 농도가 대조군에 비해 감소하는 경우 증가된 당뇨 위험도를 나타낸다.

일 구체예에서, 상기 본 발명의 임의의 양상에 따른 당뇨병 진단 키트는, 시료 중 C16 및 PC ae C36:0의 농도가 대조군에 비해 증가하고, glycine 및 lysoPC a C18:2의 농도가 대조군에 비해 감소하는 경우 증가된 당뇨 위험도를 나타낸다.

일 구체예에서, 상기 본 발명의 임의의 양상에 따른 당뇨병 진단 키트는, 중성지방, 당화혈색소, 공복혈당, 공복인슐린, 및 이들의 임의의 조합에서 선택된 생화학적 인자가 대조군에 비해 증가하는 경우 증가된 당뇨 위험도를 나타낸다.

본 명세서에서 용어“(혈청 대사체 농도의) 증가”는 대조군(정상군)에 비해 혈청 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 예를 들어 30% 이상, 보다 구체적으로는 50% 이상 증가된 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어“(혈청 대사체 농도의) 감소”는 대조군(정상군)에 비해 혈청 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 의미하며, 예를 들어 30% 이하, 보다 구체적으로는 40% 이하 감소된 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어“(생화학적 인자의) 증가”는 대조군(정상군)에 비해 상기 생화학적 인자의 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 일 양상은

당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은

상기 시료 중의 glycine, lysoPC a C18:2, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체의 농도를 측정하는 단계를 더 포함하고,

상기 측정된 혈청 대사체의 농도가 대조군의 시료에서보다 감소하는 경우 당뇨병인 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양상은

상기 모든 양상에 따른, 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법의 상세는, 상기 본 발명의 일 양상에 따른 경구용 고형제제에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.

상기 모든 양상에 따른, 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 중성지방, 당화혈색소, 공복혈당, 공복인슐린, 및 이들의 임의의 조합에서 선택된 생화학적 인자를 측정하는 단계를 더 포함하고,

상기 생화학적 인자가 대조군에 비해 증가하는 경우 당뇨병인 것으로 판단할 수 있다.

상기 모든 양상에 따른, 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에서, 정상인 또는 전당뇨와 구분하여 당뇨병을 진단할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험방법

(1) 실험 대상

본 발명의 실험 대상자들은 한국인유전체역학조사사업의 일환으로 2005년과 2006년 안성-안산 코호트(cohort) 3기 사업에 참여한 7,515명 중 생화학적 역학 자료를 기반으로 정상군(Normal glucose tolerance, NGT) 924명, 전당뇨군(Prediabetes, PD) 799명, 제2형 당뇨군(Type 2 diabetes, T2D) 517명 등 총 2,240명을 선별하였다. 당뇨 구분의 기준은 하기 표 1의 미국당뇨협회(American diabetes association, ADA)의 당뇨판단기준에 따랐다. 각 군의 연구 참여 대상자의 의학적, 생태학적 특징은 표 2에 나타내었다.

[표 1]

[표 2]

(2) 대사체 프로파일링

상기 선별된 2,240명의 혈청시료로부터 Biocrates AbsoluteIDQp180 kit을 사용하여 액체크로마토그래프(liquid chromatography, LC)와 흐름주입-질량 분석법(flow-injection analysis mass spectrometry; FIA-MS)을 이용하여 정량된 186종의 대사체를 정량적으로 프로파일링 하였다.

(3) 지노타입핑

상기 선별된 2,240명에 대한 지노타이핑 정보는 질병관리본부 형질연구과에서 2008년 한국인유전체분석사업을 통해 Affymetrix 5.0 GeneChip Array를 이용하여 생산된 안성-안산 코호트 1기 기반사업 참여자 8,842명의 유전체 정보로부터 추출되었다.

(4) 통계적 분석

프로그램과 IBM SPSS v20.0을 이용한 선형 회귀분석(linear regression method)과 로지스틱 회귀분석(logistic regression method)을 통해, 통계적 유의수준이 P < 4.07E-04 (다중비교, 123개 대사체에 대한 α=0.05)를 만족하는 2형 당뇨관련 대사체만을 선별하였다. 이때, 공변량으로는 나이(age), 성별(sex), 체질량지수(Body Mass Indexs, BMI), 및 고밀도지단백질(High Density Lipoprotein, HDL)을 모델 1(Model 1)에서, 모델 1 + 중성지방(triglyceride), 당화혈색소 (glycated hemoglobin, HbA1c), 공복혈당(fasting glucose), 공복인슐린(fasting insulin)을 모델 2(Model 2)로 사용하였다. 또한, 랜덤포레스트(random forest selection) 방법을 통해 상기의 결과를 검증하였다. 추가적으로, 한국인 2형 당뇨 특이 선별 대사체에 대해 GWAS 분석을 수행하였다 (P < 1.00E-05).

(5) 독립된 코호트를 이용한 대사체 결과의 검증

안성-안산 코호트를 이용한 한국인 특이 2형 당뇨 연관 대사체 결과를 검증하기 위해, 독일 아우그스부르그 건강조사사업 (the Cooperative Health Reaearch in the Region of Augsburg, KORA) 코호트 참여자를 대상(NGT=518, PD=699, T2D=126)으로 상기와 동일한 방법을 사용하여 결과 검증을 수행 하였다.

실험결과

(1) 대사체 프로파일링 결과

2240명에 대한 186개의 대사체 프로파일링 결과 필터링 조건을 통과한 123개(1 total hexoses(H1), 12 acylcarnitines, 21 amino acids, 7 biological amines, 10 sphingomyelines, 32 diacyl (aa) phosphatidylcholines(PCs), 32 acyl-alkyl(ae) PCs, 및 8 lysoPCs)의 대사체가 선별되었다. 선별 조건은 첫째, 36개 참조표준(reference standard) 시료 농도의 변동계수(coefficient of variance) < 15% 이면서 검출한계(limit of detection) 빈도 > 50%. 둘째, 실험용 시료군에서 대사체 정량 검출한계 빈도 > 50%를 만족하는 것으로 하였다.

2240명에 대한 186개의 대사체 프로파일링 결과를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

CV(%); 36번 반복된 참조정상표준(reference normal standard)시료 농도값의 변동 계수(15% 이상 제거),

>LOD(%)1: 36번 반복된 참조정상표준시료에서 최저한계검출 빈도(50% 이하 제거), >LOD(%)2: 2240개 시료에서 최저한계검출 빈도(50% 이하 제거),

농도; 2240개 시료의 검출농도 평균값,

선별: 3 가지 필터 기준에 충족되어 통계분석에 사용되는지 여부

(2) 통계적 분석 결과

상기 123개 대사체에 대해 정상군(NGT) 924명, 전당뇨군(PD) 799명, 2형 당뇨군(T2D) 517명간의 선형 회귀분석(linear regression method)과 로지스틱 회귀분석(logistic regression method)을 수행하였다. 먼저, 선형 회귀분석을 위해 경구 당부하검사 (2h-oral glucose tolerance test, OGTT)의 변화에 영향을 미치는 22개의 대사체를 선별하였다(표 4). 또한 로지스틱 회귀분석을 통해 당뇨와 관련한 3개의 그룹을 가장 잘 구분해 주는 37개 대사체를 선별하였다(표 5). 이들 대사체중 정상군과 2형 당뇨군, 전당뇨군과 2형 당뇨군 사이에 공통적으로 통계적 유의성을 보이는 4종의 대사체(C16, PC ae C36:0, glycine, lysoPC a C18:2)가 한국인 2형 당뇨 연관 특이 대사체로 최종 선별되었다(P < 4.07E-04) (도 1 및　표 6). 추가적인 랜덤포레스트 방법을 통한 분석에서는 C16, glycine, lysoPC a C18:2가 이들 군을 가장 잘 구분해 주는 것으로 확인되었다 (도 2). C16과 PC ae C36:0은 정상군에 비해 2형 당뇨에서 오즈비(odd ration)가 각각 1.97(CI, 1.51-2.57), 1.62(CI, 1.25-2.08)로 증가되는 것으로 나타났으며, glycine과 lysoPC a C18:2는 오즈비(odd ratio)가 각각 0.54(CI, 0.40-0.71), 0.51(CI, 0.38-0.68)로 감소되는 것으로 나타났다 (표 6).

[표 4]

[표 5]

[표 6]

(3) 독립된 코호트에서 특이 대사체 검증 결과

상기 안성-안산 코호트로부터 발굴된 한국인 특이 2형 당뇨 연관 대사체에 대해, 독립적인 독일 KORA 코호트를 사용하여 검증 분석을 수행하였다. 수행 결과, C16, glycine, lysoPC a C18:2 등이 선형회귀분석을 통해 2형 당뇨의 지표인 경구 당부하와 밀접한 관계가 있는 것으로 밝혀졌으며(P < 0.05), 로지스틱 회귀분석에서는 glycine과 lysoPC a C18:2가 당뇨 그룹 간에 통계적인 유의성 차이를 보였다(표 7 & 8). 결과적으로, C16, glycine, lysoPC a C18:2가 두 개의 독립적인 코호트에서 당뇨와 관련성 있는 대사체로 확인되었다.

[표 7]

[표 8]

(4) 상기 선별된 대사체와 당뇨위험인자를 이용한 당뇨 예측

상기에서 선별된 대사체가 당뇨 예측에 어느 정도 효과가 있는지 확인하기 위해 당뇨위험인자들을 포함하는 2개의 모델｛모델 1: 나이(age), 성별(sex), 체질량지수(Body Mass Indexs, BMI), 그리고 고밀도지단백질(High Density Lipoprotein, HDL), 모델 2:　모델 1 + 중성지방(triglyceride), 당화혈색소 (glycated hemoglobin, HbA1c), 공복혈당(fasting glucose), 공복인슐린(fasting insulin)과 비교하여 당뇨 예측률을 ROC(Receiver-Operating Characteristic) 분석을 통해 수행하여 AUC(Area Under Curve)를 계산하였다(도 3). 도 3a는 당뇨군과 정상군에서 종래 당뇨 위험인자들을 포함하는 모델 1 및 2에 의한 당뇨예측율보다 4종의 대사체 정보가 포함될 경우 당뇨예측율이 증가한다는 것을 보여주며, 이러한 결과는 B-E경우에서 동일하게 확인된다. 도 3b는 당뇨군과 비당뇨군(정상군+전당뇨군)에서 대사체와 위험인자들에 의한 당뇨예측율, 도 3c는 전당뇨군과 정상군에서 대사체와 위험인자들에 의한 전당뇨예측율, 도 3d는 비정상군(전당뇨군+당뇨군)과 정상군에서 대사체와 위험인자들에 의한 전당뇨 포함 당뇨 예측율, 도 3e는 당뇨군과 전당뇨군에서 대사체와 위험인자들에 의한 당뇨예측율을 나타낸다. 그 결과, 도 3a에서 혈청 대사체와 모델 1을 당뇨예측인자로 함께 사용했을 때 당뇨군과 정상군 간에 예측율은 모델 1만을 위험인자로 사용했을 때보다 14.5% 증가하였으며(AUC=0.709에서 0.854), 대사체와 모델 2를 당뇨위험인자로 함께 사용했을 때 당뇨군와 정상군 간의 예측율은 모델 2만을 위험인자로 사용했을 때보다 1.6% 증가 하였다(AUC=0.961에서 0.977). 도 3e에서 대사체와 모델 1을 당뇨예측인자로 함께 사용했을 때 당뇨군과 전당뇨군에서는 예측율이 13.4% 증가하였으며(AUC=0.641에서 0.775), 대사체와 모델 2를 당뇨위험인자로 함께 사용했을 때 예측율이 3.30% 증가 하였다(AUC=0.859에서 0.892). 도 3a에서와 같이 대사체를 포함했을 때 예측율이 증가하는 결과는, 당뇨군과 비당뇨군(정상군+전당뇨군, 그림 3b), 전당뇨군과 정상군(도 3c), 그리고 비정상군(당뇨군+전당뇨군)과 정상군(도 3d)의 비교에서도 유사한 결과가 나타나는 것으로 확인되었다. 결과적으로 이러한 대사체들은 당뇨뿐만 아니라 전당뇨를 예측하는데 중요한 지표로 사용가능하다.

(5) 상기 선별된 대사체의 GWAS 분석

당뇨관련 대사체의 유전적 요인과 연관성을 밝히기 위해 대사체와 유전체 데이데의 연계분석 결과, 상기 4종의 2형 당뇨관련 대사체가 18종의 유전좌위(genetic loci)와 관련되어 있음을 확인하였으며, 이중 7종의 유전좌위를 포함하는 유전자들은 기존에 당뇨나 비만과 관련된 것으로 보고된 것을 확인하였다 (표 9).

[표 9]

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

C16(Hexadecanoylcarnitine), PC ae C36:0(phosphatidylcholine acyl-alkyl C36:0), 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 당뇨병 진단 키트.
제1항에 있어서, glycine, lysoPC a C18:2(lysophosphatidylcholine acyl C18:2), 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 추가적으로 포함하는 것인 당뇨병 진단 키트.
C16, PC ae C36:0, glycine, lysoPC a C18:2, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 한국인의 당뇨병 진단 키트.
제1항 내지 제3항 중 한 항에 있어서, 중성지방, 당화혈색소, 공복혈당, 공복인슐린, 및 이들의 임의의 조합에서 선택된 생화학적 인자에 대한 정량장치를 포함하는 것인 당뇨병 진단 키트.
제1항 내지 제3항 중 한 항에 있어서, 정상인 또는 전당뇨와 구분하여 당뇨병을 진단할 수 있는 당뇨병 진단 키트.
제5항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것인 당뇨병 진단 키트.
제1항 내지 제3항 중 한 항에 있어서, 상기 정량장치는 액체크로마토그래프(liquid chromatography, LC) 및 흐름주입-질량분석기(flow-injection analysis mass spectrometer; FIA-MS)를 포함하는 것인 당뇨병 진단 키트.
제1항 내지 제3항 중 한 항에 있어서, 상기 정량장치는 C16, PC ae C36:0, 또는 이들의 조합의 농도가 대조군에 비해 증가하는 경우, 증가된 당뇨 위험도를 나타내는 것인 당뇨병 진단 키트.
제1항 내지 제3항 중 한 항에 있어서, 상기 정량장치는 glycine, lysoPC a C18:2, 또는 이들의 조합의 농도가 대조군에 감소하는 경우 증가된 당뇨 위험도를 나타내는 것인 당뇨병 진단 키트.
제4항에 있어서, 상기 생화학적 인자가 대조군에 비해 증가하는 경우 증가된 당뇨 위험도를 나타내는 것인 당뇨병 진단 키트.
인간으로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 획득하는 단계; 및
상기 시료 중의 C16, PC ae C36:0, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체의 농도를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 측정된 혈청 대사체의 농도가 대조군의 시료에서보다 증가하는 경우 당뇨병인 것으로 판단하는 것인, 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 시료 중의 glycine, lysoPC a C18:2, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체의 농도를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 측정된 혈청 대사체의 농도가 대조군의 시료에서보다 감소하는 경우 당뇨병인 것으로 판단하는 것인, 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
인간으로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 획득하는 단계; 및
상기 시료 중의 C16, PC ae C36:0, glycine, lysoPC a C18:2, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 혈청 대사체의 농도를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 측정된 C16 또는 PC ae C36:0의 농도가 대조군의 시료에서보다 증가하거나, glycine 또는 lysoPC a C18:2의 농도가 대조군의 시료에서보다 감소하는 경우 당뇨병인 것으로 판단하는 것인,
한국인의 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제11항 내지 제13항 중 한 항에 있어서,
중성지방, 당화혈색소, 공복혈당, 공복인슐린, 및 이들의 임의의 조합에서 선택된 생화학적 인자를 측정하는 단계를 더 포함하고,
상기 생화학적 인자가 대조군에 비해 증가하는 경우 당뇨병인 것으로 판단하는 것인,
당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 정상인 또는 전당뇨와 구분하여 당뇨병을 진단할 수 있는 것인, 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것인, 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제11항 내지 제13항 중 한 항에 있어서, 상기 대사체의 농도의 측정하는 단계는 액체크로마토그래프(liquid chromatography, LC) 및 흐름주입-질량분석법(flow-injection analysis mass spectrometry; FIA-MS)를 이용하는 것인, 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.