CN117554510A - 检测子痫前期的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体是检测子痫前期的生物标志物lysoPC(P‑18:1/0:0)、胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)和lysoPC(18:0/0:0)，及其在制备检测试剂盒中的应用。本发明的生物标志物组合的检测结果能由医师之类的医疗专家有效地用来判断子痫前期罹患与否，发展程度，治疗经过，尤其是能够有效地适用于子痫前期的早期诊断并为该病的发病机制提供新的见解。

Description

检测子痫前期的生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，是检测子痫前期的生物标志物及其在制备检测试剂盒中的应用。

背景技术

子痫前期(PE)是一种妊娠特异性疾病，通常定义为在妊娠20周或后出现新发高血压并发蛋白尿。据估计有3-5％的妊娠合并子痫前期(PE)仍然是全世界孕产妇、胎儿和新生儿死亡和发病率的主要原因，特别是在欠发达国家。高血压疾病占全世界所有孕产妇死亡的14％，由肾小球损伤引起的蛋白尿常被用于评估PE的严重程度和预测并发症。如果不进行治疗，这种复杂的多系统疾病可发展为严重子痫(以癫痫发作为标志)、肝脏破裂、肺水肿、急性肾损伤、中风或溶血、肝酶升高、慢血小板减少症(HELLP综合症)，所有这些都是致命的。虽然一些预防PE的干预措施，如药物和膳食补充剂，显示了潜在的影响，但这些益处需要进行或大或小的研究来验证。在缺乏治愈性治疗的情况下，PE唯一确定的治愈方法是及时娩出胎儿和胎盘。此外，PE也被视为后来生活中健康的一扇窗户，先前被诊断为PE的女性更容易患多种并发症，包括心血管疾病、高血压、肾损伤、糖尿病和子宫内膜癌。

尽管已经做出了大量的努力来增加我们对PE的了解，但其发病机制仍未完全阐明，并且被认为是多因素的，这使得预防和治疗都面临复杂的挑战。在PE中发现了父亲或胎儿的抗原特异性不耐受，同时激活先天和适应性免疫系统，这可能是一个原因。在全系统层面，越来越多的证据表明，该疾病与缺氧、氧化应激、血管内皮损伤、代谢综合征以及胎盘屏障内营养物质和废物交换异常密切相关。总的来说，这些发现表明，可能存在某些代表病理过程副产物的生化特征，甚至充当疾病的主要媒介。

系统生物学策略，如蛋白质组学/肽组学和代谢组学，用于发现生物标志物，正在妊娠相关疾病研究中变得越来越受欢迎。代谢组学是一门新兴的“组学”科学，包括使用分析化学技术(NMR、LC-MS和GC-MS)和复杂的计算方法对所有小分子(代谢物)进行综合研究。代谢物既代表基因表达的下游产物，也代表来自环境(食品、药物和肠道菌群)的上游输入，反映生物系统中正在发生的事情。因此，通过生物标志物识别，代谢组学方法使研究人员能够诊断复杂疾病，深入了解发病机制，并最终改善治疗。

一些血清蛋白已被提出作为预测和揭示PE分子基础的生物标志物。然而，考虑到PE的复杂性和异质性，认为这种疾病仅与少数蛋白质有关似乎是不合理的。相比之下，代谢组学关注的分子是构成生物系统代谢组的低分子量(生物)化学物质，其数量众多，可能更能真实地反映疾病状态。在过去的十年中，代谢组学在PE研究中的几个应用已经发表，包括胎盘组织和几种生物液体(包括孕产妇血液、尿液和脐带血)的分析样本。其中，大多数研究的重点是预测妊娠早期PE，因为广泛的循环代谢改变在临床症状出现之前就已发生。越来越多的代谢生物标志物被提出用于预测PE，但机制研究比较欠缺。此外，在生物学意义上，对这些差别代谢物的全面讨论通常是缺乏的。因此，有必要对代谢物进行非靶向轮廓分析并了解差异代谢物的生物学功能。

另外，关于子痫前期的生物标志物及其在制备检测试剂盒中的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供子痫前期诊断的生物标志物及其在制备检测试剂盒中的应用。所述的生物标志物能够简单、准确地检测子痫前期。

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现多个可用于子痫前期诊断的血液生物标志物，利用这些生物标志物可以高灵敏性、高特异性地评估待测对象的子痫前期风险，从而能够子痫前期的诊断并具有重要的应用价值。在此基础上完成了本发明。

本发明的第一方面，提供一种检测待测对象的子痫前期或评估待测对象的子痫前期患病风险的生物标志物组合，所述的生物标志物组合为lysoPC(P-18:1/0:0)、胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)和lysoPC(18:0/0:0)。

进一步的，当待测对象的生物标志物胆碱、lysoPS(18:2/0:0)和lysoPE(16:0/0:0)高于正常值，lysoPC(P-18:1/0:0)和lysoPC(18:0/0:0)低于正常值时，则判定该对象具有子痫前期患病风险或诊断该对象患有子痫前期。用上述代谢生物标志物组合来诊断子痫前期，ROC曲线的曲线下面积为0.992，灵敏度为93.33％，特异性为96.67％。

本发明的第二方面，提供一种如上所述的生物标志物组合在制备检测待测对象的子痫前期或评估待测对象的子痫前期患病风险的检测试剂或检测试剂盒中的应用。

本发明的第三方面，提供检测生物样品中如上所述的生物标志物组合水平的试剂在制备检测待测对象的子痫前期或评估待测对象的子痫前期患病风险的检测试剂盒中的应用。

进一步的，所述的生物样品为来源于待测对象的血液、血清或血浆样品。

本发明的第四方面，提供一种检测待测对象的子痫前期或评估待测对象的子痫前期患病风险的检测试剂盒，所述的检测试剂盒中包含检测生物样品中如上所述的生物标志物组合水平的试剂。

本发明的第五方面，提供一种筛选具有子痫前期治疗活性的药物的方法，包括以下步骤：

A)检测子痫前期的对象的血液、血清或血浆中如上所述的生物标志物组合水平；

B)将待测药物给予所述对象；

C)检测给药后所述对象的血液、血清或血浆中如上所述的生物标志物组合水平；

D)比较步骤A)和C)得到的生物标志物水平，如果步骤A)所得生物标志物胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)水平高于步骤C)所得的生物标志物水平，lysoPC(P-18:1/0:0)、lysoPC(18:0/0:0)水平低于步骤C)所得的生物标志物水平，则将所述待测药物判定为具有子痫前期治疗活性的药物。

本发明的第六方面，提供一种评估待测对象的子痫前期患病风险或待测对象子痫前期诊断的方法，包括以下步骤：

a)提供来源于待测对象的血液、血清或血浆样品，并检测样品中如上所述的生物标志物组合水平；

b)将步骤a)测得的生物标志物水平与参考数据集或参考值(如正常妊娠者的参考值)进行比较；如果步骤a)测得的生物标志物胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)高于该参考值，lysoPC(P-18:1/0:0)、lysoPC(18:0/0:0)低于该参考值则判定该对象具有子痫前期患病风险或诊断该对象患有子痫前期。

在具体的实施方式中，所述的参考数据集包括来源于子痫前期患者和正常妊娠者的如上所述的生物标记物的水平。

本文所用的术语的含义与本领域技术人员常规理解的相同或相似。为了更好地理解本发明，对一些术语定义如下。但需要说明的是，在此提供术语的解释仅为了使本领域技术人员更好地理解本发明，并非对本发明限制。

子痫前期

子痫前期(preeclampsia)指妊娠20周以后，出现血压升高和蛋白尿，并可出现头痛、眼花、恶心、呕吐、上腹不适等症状。子痫是由子痫前期发展成更为严重的症状，引起抽搐发作或昏迷。病因至今尚不清楚，可导致严重的母儿并发症。除终止妊娠外，无有效治疗方法。现有的治疗是为了控制病情，争取延长孕周。

生物标志物

本文所用的术语“生物标志物”，也称为“生物学标志物”，是指个体的生物状态的可测量指标。这样的生物标记物可以是在个体中的任何物质，只要它们与被检个体的特定生物状态(例如，疾病)有关系，例如，核酸标志物(例如DNA)，蛋白质标志物，代谢物标志物，细胞因子标记物，趋化因子标记物，碳水化合物标志物，抗原标志物，抗体标志物，物种标志物(种/属的标记)和功能标志物(KO/OG标记)等。生物标志物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程，致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有应用的。

本发明收集了30例子痫前期患者、30例正常妊娠对照和30例健康妇女的血浆样本。使用基于代谢组学的综合液相色谱-质谱法作血液非靶标代谢物分析。共90例血液样本进行了预备实验。

采用PLS-DA筛选组间差异代谢物。与健康妊娠样本相比，共有135种代谢物在子痫前期显著改变。这些代谢物主要由几种形式的脂类(脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、甘油脂、甘油磷脂和鞘脂)、氨基酸和核苷酸代谢物组成，主要与甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、三羧酸循环有关。最后，将lysoPC(P-18:1/0:0)、胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)和lysoPC(18:0/0:0)作为区分PE与正常妊娠的生物标志物。

本发明的检测方法能够把血液中的子痫前期血液生物标志物lysoPC(P-18:1/0:0)、胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)和lysoPC(18:0/0:0)全部予以检测，这些检测值则由医师之类的医疗专家用来判断子痫前期罹患与否、子痫前期发展程度及/或子痫前期治疗经过。

在本发明中，提供用于检测或诊断待测对象的子痫前期或评估待测对象的子痫前期患病风险的生物标志物，所述生物标志物是lysoPC(P-18:1/0:0)、胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)和lysoPC(18:0/0:0)。在优选的实施方式中，本发明的生物标志物是lysoPC(P-18:1/0:0)、胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)和lysoPC(18:0/0:0)的组合。

磷脂是维持细胞膜完整性和功能的主要脂质成分。一些脂质/代谢组学分析显示PE受试者的母体血液或胎盘中磷脂含量增加(Anand等人2016；Austdal et al.2015)。在另一种妊娠复杂综合征(小于胎龄(SGA))中也报道了类似的趋势(Horgan et al.2011；Horgan et al.2010)。有人提出磷脂水平的增加是由于细胞损伤和裂解，反映缺氧和随后的胎盘中的脂质氧化(Anand等人2016；Horgan et al.2010)。在我们的数据集中，少数磷脂酰乙醇胺(PEs)在PE组增加，而大多数磷脂酰胆碱(PCs)在PE组减少。然而，考虑到我们研究中的胆碱水平在PE中明显升高，我们假设PC水平下降很可能是过度磷脂代谢的结果。值得注意的是，发育中的胎儿在产前期间对卵磷脂合成有更高的胆碱需求(Jiang等，2013)。较高的胆碱摄入量对孕妇产生有益的影响，包括改善后代的认知功能，下调胎盘和循环的抗血管生成因子fms样酪氨酸激酶-1(sFLT1)(Jiang等，2013；Langley et al.2015)。胆碱通过胎盘从母体血液迅速转移到胎儿(Baumgartner et al.2015)。在我们的研究中，参与者没有接受任何额外的胆碱补充，因此PE产妇血浆中胆碱水平的增加可能意味着由于胎盘功能障碍，胆碱转运到胎儿和磷脂合成受损。

质谱

在本发明中，可采用质谱(MS)技术检测本发明的生物标志物。质谱有离子阱质谱、四极杆质谱、轨道阱质谱、飞行时间质谱等。在本发明中，利用四极杆飞行时间联用质谱获得MS数据。质谱包含的信息主要有质量数和电荷比值(质荷比m/z)和离子强度。在本发明中，生物标志物质的水平通过MS峰面积指示。

本文所用的术语“参考集”是指训练集。

根据本发明，由现有技术可知，训练集和验证集具有相同的含义。在本发明的一个实施方式中，训练集指子痫前期患者和健康孕妇对照生物样品中的生物标志物水平的集。在本发明的一个实施方式中，验证集是指用于测试训练集性能的数据集。在本发明的一个实施方式中，生物标志物的水平可以根据测定的方法代表为绝对值或相对值。例如，当用质谱来测定生物标记物的水平时，峰的峰面积可以代表生物标记物水平，这是一个相对值的水平；当用PCR来测定生物标志物的水平时，基因的拷贝数或基因片段的拷贝数可以代表的生物标志物的水平。

本文所用的术语“个体”指动物，特别是哺乳动物，如灵长类动物，最好是人。

本文所用的术语“血浆”指的是全血的液体成分。根据所使用的分离方法，血浆可能完全不含细胞成分，也可能含有不同量的血小板和/或少量其它细胞成分。

本文所用的术语如“一”、“这”和“该”不仅指单数的个体，而是包括可以用来说明特定实施方式的通常的一类。

本发明优点在于：

1、本发明以血浆代谢物作为生物标志物用于子痫前期的早期筛查、预判、防治，具有高灵敏性、高特异性的优点，具有重要的应用价值；

2、血浆作为生物标志物检测样本具有取材方便、操作步骤简单和可连续体外检测等优点；

3、本发明的生物标志物用于子痫前期的早期筛查、预判、防治具有重复性好的特点。

4、本发明的生物标志物的检测结果能由医师之类的医疗专家有效地用来判断子痫前期罹患与否，发展程度，治疗经过，尤其是能够有效地适用于子痫前期的早期诊断并为该病的发病机制提供新的见解。

附图说明

图1为30例子痫前期孕妇、30例健康孕妇对照和30例健康非孕妇对照的PLS-DA得分图。图中每个点代表一个样品，其中蓝色菱形点代表子痫前期孕妇。根据VIP>1，p值<0.05得到子痫前期孕妇、健康孕妇对照和健康非孕妇对照的血浆样品的代谢谱存在明显差异。

图2为MetaboAnalyst平台下健康孕妇对照组和子痫前期组之间135种显著代谢物的功能影响，以分析子痫前期组可能涉及的途径。

图3为135种显著代谢物用于鉴别健康孕妇对照组和子痫前期组ROC曲线，其中仅5种代谢物的模型1表现良好。示出了模型1的5个特征面板中代谢物的相对重要性排序，其中选择lysoPC(P-18:1/0:0)、胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)、lysoPC(18:0/0:0)这五个代谢物为子痫前期潜在的诊断生物标志物并示出了5个显著生物标志物的ROC曲线，其中AUC为0.992，敏感性为93.33％，特异性为96.67％。

图4为已鉴定的5种潜在的血浆生物标志物的水平变化趋势，用于鉴别健康孕妇对照组和子痫前期组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例：

1.材料与方法

1.1样品收集

从罗店医院招募90位志愿者。其中，30位为子痫前期单胎妊娠，30名为无并发症健康妊娠，其他30位为无药物使用、慢性高血压或糖尿病、肾脏或心血管疾病史的未怀孕妇女,并按年龄进行匹配。子痫前期的诊断标准是:在24小时内有明显蛋白尿≥300mg的情况下，两次间隔4小时测量血压≥140/90mmHg，或在现场尿检中尿试纸≥++。将外周静脉血(约5mL)收集到BD EDTA-采血管中，收集志愿者血液样品，并于1小时内以4℃下，3000转/分离心15分钟，得到血浆样品，保存于-80℃备用。本实验得到了罗店医院伦理审查委员会批准。并且样品收集前，得到了所有志愿者的书面同意。

1.2材料与试剂

甲醇和乙腈，均为质谱级，购自Honeywell Burdick和Jackson(Muskegon，MI，USA)。

甲酸(MS级)产自瑞士布克斯的Fluka公司。

所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)。

去离子水的生产采用Milli-Q水净化系统(Millipore，MA，USA)。

所用分析柱为Agilent Eclipse+C18色谱柱(1.8μm，3.6mm×100mm)

1.3样本处理和LC-Q-TOF-MS分析

冷冻的血浆样品在室温下解冻。轻轻地涡旋后，100μL血浆加入300μL甲醇，涡旋30s。4℃，12000rpm离心10min后，将脱蛋白上清转移至1.5mL样品瓶中。

样品使用LC-Q-TOF-MS平台进行分析。采用高效液相色谱(HPLC)系统(1290系列，安捷伦技术公司)，配合电喷雾电离(ESI)源和安捷伦-6530Q-TOF质谱仪(安捷伦技术公司，CA，美国)，以及MassHunter采集软件(B.02.00版本)。电喷雾电离分别在正离子(ESI+)和负离子(ESI-)模式下实现。

样品随机放置于4℃自动进样器中，进样2μL，采用Eclipse+C18色谱柱(1.8μm，3.6mm×100mm，安捷伦)进行色谱分离。柱温度保持在45℃，0.1％甲酸水溶液(溶剂A)和0.1％甲酸乙腈(溶剂B)洗脱，流速为0.35mL/min，线性梯度洗脱程序为：0-9min，2％-100％B；9-11分钟，100％ B；11-15分钟，100％-85％ B；15-17分钟，85％ B；17-23min，85％-2％B，系统平衡3min。

质谱参数设置如下：干燥气体氮气(N₂)，8L/h；气体温度，330℃；喷雾器压力：35psig；毛细管电压，4100V(ESI+)，3900V(ESI-)；碎片电压：130V；skimmer电压：65V。序列前和每6个血浆样品之间设置质量控制(QC)样本。以全扫描方式(m/z范围为50-1000)采集数据。

1.4统计分析

使用Agilent mass Hunter定性分析和mass Profiler软件(AgilentTechnologies，CA，USA)对原始LC-MS数据进行峰提取，对齐，积分。将所有质量数、保留时间和强度等预处理数据矩阵上传到SIMCA-P版本11.0(Umetrics，Umea，瑞典)进行多元统计分析。最后，利用免费数据库(如Metlin(https://metlin.scripps.edu/)，HMDB(http://www.hmdb.ca/))根据准确的质量和保留时间对潜在生物标志物进行推定或确定的识别。当测量质量和精确质量之间的差异小于5ppm时，代谢物是匹配的。

2.实验结果

2.1志愿者临床信息

研究人群的人口学和临床特征的全部细节总结在表1中。

表1.研究患者和健康对照者的临床特征

N/A：不适用，N.S.：无明显不同，BP：血压，a：百分比，b：中位数(四分位距)，c：P<0.01，BMI：体重指数。

2.2多元统计分析

我们检测到5869个(ESI+模式)和3204个(ESI-模式)代谢物特征。三组PLS-DA得分图如图1所示。得分图揭示了PE、HP和NP之间的明显区别，疾病状态不同于怀孕和正常生理条件。采用OPLS模型选择PE与HP、HP与NP、PE与NP之间的差异特征(VIP>1，p值<0.05)。

2.3潜在生物标志物鉴定

在PE组和HP组之间，我们一共发现了135个显著改变的代谢物，见表2。其中，HP组与NP组间差异显著的代谢物有126种，PE组与NP组间差异显著的代谢物有32种。三组间发生显著变化的代谢产物共162个。这些代谢物主要可以分为8类(根据Human MetabolomeDatabase)，包括氨基酸相关代谢物、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油磷脂、鞘脂、甘油脂、吲哚及其衍生物、类固醇及其衍生物。在135种PE与HP之间的差异代谢物中，与HP组相比，PE升高的代谢物有99种，PE降低的代谢物有36种。根据这些代谢物在HP与NP比较时的相对峰面积是否存在显著差异，我们可以很容易地将其分为两组:一组是HP相对于NP增加/减少，但PE相对于HP的变化相反，另一组是HP相对于NP没有显著差异。我们使用MetaboAnalyst平台(http://www.metaboanalyst.ca)对这135种代谢物进行了途径富集分析，以分析PE可能涉及的途径(图2)。

2.4所选代谢物在PE中的诊断性能

为了筛选子痫前期的生物标志物，将HP和PE之间的135个差异代谢物上传到MetaboAanlyst(https://www.metaboanalyst.ca)，采用随机森林模型进行多变量ROC曲线探索性分析。图3显示了5-100个代谢物创建的所有模型的ROC曲线。仅含5种代谢物的模型1表现良好。用5种最显著的代谢物(lysoPC(P-18:1/0:0)、胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)、lysoPC(18:0/0:0))组合来区分PE和HP，AUC为0.992，敏感性为93.33％，特异性为96.67％。然后选择lysoPC(P-18:1/0:0)、胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)、lysoPC(18:0/0:0)作为子痫前期潜在的诊断生物标志物。PE组和HP组的5种代谢物变化趋势如图4所示。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

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Claims (6)

1.一种检测待测对象的子痫前期或评估待测对象的子痫前期患病风险的生物标志物组合，其特征在于，所述的生物标志物组合为lysoPC(P-18:1/0:0)、胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)和lysoPC(18:0/0:0)。

2.一种如权利要求1所述的生物标志物组合在制备检测待测对象的子痫前期或评估待测对象的子痫前期患病风险的检测试剂或检测试剂盒中的应用。

3.检测生物样品中如权利要求1所述的生物标志物组合水平的试剂在制备检测待测对象的子痫前期或评估待测对象的子痫前期患病风险的检测试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的生物样品为来源于待测对象的血液、血清或血浆样品。

5.一种检测待测对象的子痫前期或评估待测对象的子痫前期患病风险的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中包含检测生物样品中如权利要求1所述的生物标志物组合水平的试剂。

6.一种筛选具有子痫前期治疗活性的药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)检测子痫前期的对象的血液、血清或血浆中如权利要求1所述的生物标志物组合水平；

B)将待测药物给予所述对象；

C)检测给药后所述对象的血液、血清或血浆中如权利要求1所述的生物标志物组合水平；

D)比较步骤A)和C)得到的生物标志物水平，如果步骤A)所得生物标志物胆碱、lysoPS(18:2/0:0)、lysoPE(16:0/0:0)水平高于步骤C)所得的生物标志物水平，lysoPC(P-18:1/0:0)、lysoPC(18:0/0:0)水平低于步骤C)所得的生物标志物水平，则将所述待测药物判定为具有子痫前期治疗活性的药物。