CN117030893A - 长链脂肪酸分类标志物组合在制备诊断糖尿病的检测产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了长链脂肪酸分类标志物组合在制备诊断糖尿病的检测产品中的应用，其中长链脂肪酸分类标志物组合由oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA中至少两种以上组成，先检测受试者血清中长链脂肪酸分类标志物组合的浓度水平，然后进行ROC曲线统计，通过ROC曲线下面积判断分类标志物组合对2型糖尿病风险的预测价值；当ROC曲线下面积＞0.7时，提示分类标志物组合对2型糖尿病风险具有良好的预测效果，用于辅助糖尿病的早期临床诊断检测灵敏度高、成本低且重复性好，与传统临床诊断标志物空腹血糖和餐后血糖具有协同作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测领域，具体涉及长链脂肪酸分类标志物组合在制备诊断糖尿病的检测产品中的应用。
背景技术
随着社会经济的发展，我国人民的饮食、生活习惯发生了很大的改变，以高油高脂为特点的西式饮食的摄入量增加、体力活动减少和久坐时长的增加，使我国糖尿病、高血脂等慢性代谢性疾病的发病率持续上升。代谢性疾病作为人体代谢障碍所导致的疾病，种类繁多，其中如2型糖尿病、肥胖、代谢综合征以及非酒精性脂肪肝等已经成为全球性的主要健康问题，因此对代谢性疾病的防治刻不容缓。近年来，代谢组学技术的快速发展为糖尿病精细代谢谱研究提供可能，并为深入剖析疾病发生发展规律提供重要方法和途径。
2型糖尿病是糖脂代谢紊乱相互作用最重要的临床表现之一，其临床特征表现为高血糖、胰岛素抵抗和胰岛素的分泌受损，同时约有60％-70％的2型糖尿病患者会出现脂代谢异常。目前，糖尿病的诊断主要依据血浆葡萄糖的水平，但由于血糖检测易受药物、饮食、情绪等因素影响，波动较大，其诊断具有一定的局限性，且早期糖尿病起病隐匿，缺乏或无典型临床症状，一经发现往往为时已晚。因此，开发具有潜力的新型诊断检测方法用于预测早期糖尿病的发生，对于降低糖尿病的发病率和死亡率具有重要意义。
长链脂肪酸(LCFA)是一类碳原子数大于12的饱和或不饱和脂肪酸，一般饮食中的脂肪酸大多为LCFA。LCFA摄入机体后参与LCFA代谢，维持细胞膜的正常结构和基本功能，在机体能量代谢、糖脂代谢及免疫炎症反应中都发挥着重要作用。研究表明，LCFA可通过上调GPR120蛋白的表达，诱导脂肪内质网应激反应、炎症反应和胰岛素抵抗(中华全科医学，2017年9月，第15卷第9期)。LCFA作为饮食中重要成分和人体重要代谢产物，从调节能量代谢、糖代谢、脂质代谢、免疫及炎症反应等多途径调控机体，可能是防治T2DM、肥胖、MetS、NAFLD等代谢性疾病的重要靶点(沈阳药科大学学报，第39卷第8期，2022年8月)。但是，目前尚无将长链脂肪酸用于新发糖尿病检测生物标志物的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供长链脂肪酸分类标志物组合在制备诊断糖尿病的检测产品中的应用，为临床上筛查早期糖尿病提供新的辅助检测方法。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供长链脂肪酸分类标志物组合在制备诊断糖尿病的检测试剂中的应用，所述长链脂肪酸分类标志物组合由奇数链饱和脂肪酸(oSFA)、偶数链饱和脂肪酸(eSFA)、奇数链单不饱和脂肪酸(oMUFA)、偶数链单不饱和脂肪酸(eMUFA)、奇数链多不饱和脂肪酸(oPUFA)和偶数链多不饱和脂肪酸(ePUFA)中的两种或两种以上组成。
作为优选，所述长链脂肪酸分类标志物组合由oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA组成。
作为更优选，oSFA选自FA13:0、FA15:0、FA17:0、FA19:0、FA21:0、FA23:0、FA25:0中的一种或两种以上组合；eSFA选自FA14:0、FA16:0、FA18:0、FA20:0、FA22:0、FA24:0、FA26:0中的一种或两种以上组合；oMUFA选自FA15:1、FA17:1、FA19:1、FA21:1、FA25:1中的一种或两种以上组合；eMUFA选自FA14:1、FA16:1、FA18:1、FA20:1、FA22:1、FA24:1、FA26:1中的一种或两种以上组合；oPUFA选自FA17:2、FA19:2、FA25:2、FA25:3中的一种或两种以上组合；ePUFA选自FA14:2、FA16:2、FA16:3、FA18:2、FA18:3、FA18:4、FA20:2、FA20:3、FA20:4、FA20:5、FA20:6、FA22:2、FA22:3、FA22:4、FA22:5、FA22:6、FA24:2、FA24:3、FA24:4、FA24:5、FFA26:2、FFA26:3、FFA26:4中的一种或两种以上组合。
作为优选，所述糖尿病为2型糖尿病。
作为优选，所述检测产品为血液检测试剂。
本发明还提供检测长链脂肪酸分类标志物组合的试剂在制备诊断糖尿病的检测产品中的应用，所述长链脂肪酸分类标志物组合由oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA组成，其中oSFA选自FA13:0、FA15:0、FA17:0、FA19:0、FA21:0、FA23:0、FA25:0中的一种或两种以上组合；eSFA选自FA14:0、FA16:0、FA18:0、FA20:0、FA22:0、FA24:0、FA26:0中的一种或两种以上组合；oMUFA选自FA15:1、FA17:1、FA19:1、FA21:1、FA25:1中的一种或两种以上组合；eMUFA选自FA14:1、FA16:1、FA18:1、FA20:1、FA22:1、FA24:1、FA26:1中的一种或两种以上组合；oPUFA选自FA17:2、FA19:2、FA25:2、FA25:3中的一种或两种以上组合；ePUFA选自FA14:2、FA16:2、FA16:3、FA18:2、FA18:3、FA18:4、FA20:2、FA20:3、FA20:4、FA20:5、FA20:6、FA22:2、FA22:3、FA22:4、FA22:5、FA22:6、FA24:2、FA24:3、FA24:4、FA24:5、FFA26:2、FFA26:3、FFA26:4中的一种或两种以上组合。
作为优选，所述检测产品为试剂盒，所述试剂盒中包含oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA，作为分别用于对应的血清代谢物选自oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA定性的标准品。
本发明还提供一种评估早期2型糖尿病患病风险的方法，包括以下步骤：
步骤1：通过超高效液相色谱-串联四级杆静电场轨道阱高分辨质谱联用仪检测受试者血清中长链脂肪酸分类标志物组合的浓度水平，所述长链脂肪酸分类标志物组合由oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA组成；其中：oSFA选自FA13:0、FA15:0、FA17:0、FA19:0、FA21:0、FA23:0、FA25:0中的一种或两种以上组合；eSFA选自FA14:0、FA16:0、FA18:0、FA20:0、FA22:0、FA24:0、FA26:0中的一种或两种以上组合；oMUFA选自FA15:1、FA17:1、FA19:1、FA21:1、FA25:1中的一种或两种以上组合；eMUFA选自FA14:1、FA16:1、FA18:1、FA20:1、FA22:1、FA24:1、FA26:1中的一种或两种以上组合；oPUFA选自FA17:2、FA19:2、FA25:2、FA25:3中的一种或两种以上组合；ePUFA选自FA14:2、FA16:2、FA16:3、FA18:2、FA18:3、FA18:4、FA20:2、FA20:3、FA20:4、FA20:5、FA20:6、FA22:2、FA22:3、FA22:4、FA22:5、FA22:6、FA24:2、FA24:3、FA24:4、FA24:5、FFA26:2、FFA26:3、FFA26:4中的一种或两种以上组合；
步骤2：基于受试者血清中所述长链脂肪酸分类标志物组合的浓度水平进行ROC曲线统计，通过ROC曲线下面积判断所述长链脂肪酸分类标志物组合对2型糖尿病风险的预测价值；当ROC曲线下面积＞0.7时，提示所述长链脂肪酸分类标志物组合对2型糖尿病风险具有良好的预测效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：长链脂肪酸分类标志物组合可用于预测2型糖尿病的发生，为临床上筛查早期糖尿病提供新的辅助检测方法和理论依据。
附图说明
图1为实施例中发现组长链脂肪酸分类标志物组合用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图。
图2为验证组吉林中心长链脂肪酸分类标志物组合用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图。
图3为验证组广州中心长链脂肪酸分类标志物组合用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图。
图4为验证组山东省立中心长链脂肪酸分类标志物组合用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
糖尿病的定义：空腹血糖(FPG)≥126mg/dL或餐后2小时血糖(2-h PG)≥200mg/dL，或研究对象自报之前由专业医师诊断过糖尿病和正在服用降糖药物。
实施例1
先从发现人群(n＝106)中，采用Q Exactive组合型四极质谱仪，采用液相色谱-质谱联用仪LC-MS分析血清中不同脂肪酸，经过校正相关混杂因素(包括年龄、性别、BMI、FPG、吸烟及饮酒状态、糖尿病家族史、教育水平、体育活动和2hPG等)，发现6种长链脂肪酸分类标志物组合与糖尿病的发生具有显著统计学意义：oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA；其中：
oSFA由FA13:0、FA15:0、FA17:0、FA19:0、FA21:0、FA23:0、FA25:0组成；
eSFA由FA14:0、FA16:0、FA18:0、FA20:0、FA22:0、FA24:0、FA26:0组成；
oMUFA由FA15:1、FA17:1、FA19:1、FA21:1、FA25:1组成；
eMUFA由FA14:1、FA16:1、FA18:1、FA20:1、FA22:1、FA24:1、FA26:1组成；
oPUFA由FA17:2、FA19:2、FA25:2、FA25:3组成；
ePUFA由FA14:2、FA16:2、FA16:3、FA18:2、FA18:3、FA18:4、FA20:2、FA20:3、FA20:4、FA20:5、FA20:6、FA22:2、FA22:3、FA22:4、FA22:5、FA22:6、FA24:2、FA24:3、FA24:4、FA24:5、FFA26:2、FFA26:3、FFA26:4组成。
再在来自全国不同省份的3个验证中心(吉林、广州和山东省立)人群(n＝474)中对结果进行验证，发现以上6类长链脂肪酸对糖尿病的发病风险仍具有显著相关性，如图2-4所示。
然后在ROC模型中显示，与传统诊断标志物FPG和2-h PG相比，当加上上述长链脂肪酸分类标志物组合后，其对2型糖尿病的诊断灵敏度和特异度显著增高，曲线下面积从0.6796增加到0.8092，如图1所示。
具体操作过程为：
(1)血清样品收集和处理
所有纳入研究的志愿者在血清样品采集前均签署知情同意书。在相同条件下收集106例(发现组)和654例(验证组)研究对象的血液标本，采集后静置60分钟后直接取血清，储存于-80℃的冰箱中保存备用。
(2)研究对象
采用病例对照研究方法，发现组从全国队列4C研究人群中纳入符合标准的基线葡萄糖耐量正常(NGR)者共106例，其中包括随访后53例新发糖尿病者和53例NGR者，发现组人群的基线特征如表1所示。验证组从4C队列人群中纳入基线NGR者共474例，其中包括237随访后例新发糖尿病者和237例保持NGR者。
纳入标准：1)研究对象年龄≥40岁，2)接受口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。
排除标准：基线时已患有糖尿病或糖调节功能受损。
此外，所有受试者均接受标准的问卷调查和体格检查。采用空腹静脉血浆标本检测FPG、OGTT-2h静脉血浆标本检测2-h PG。使用ADVIA-1650化学自动分析仪(BayerDiagnostics，Tarrytown，NY，USA)测量FPG和2-h PG的浓度。
表1：发现组人群的基线特征
| Control | Case | Pvalue | |
| N,％ | 53(50.00) | 53(50.00) | |
| Male,no.(％) | 15(28.30) | 15(28.30) | 1.0000 |
| Age,years | 58.88±7.36 | 59.19±6.70 | 0.8214 |
| BMI,kg/m2 | 23.96±3.31 | 24.85±3.55 | 0.1806 |
| Physically active,no.(％) | 14(26.42) | 14(26.42) | 1.0000 |
| Highschool or above education,no.(％) | 20(37.74) | 21(39.62) | 0.8419 |
| Current smoking,no.(％) | 7(13.21) | 7(13.21) | 0.8997 |
| Current drinking,no.(％) | 6(11.32) | 1(1.89) | 0.0366 |
| Family history of diabetes,no.(％) | 11(20.75) | 14(26.42) | 0.4925 |
| FPG,mmol/L | 5.09±0.47 | 5.27±0.43 | 0.0383 |
| 2-h PG,mmol/L | 6.10±0.92 | 6.24±1.05 | 0.4669 |
从表1结果表明，两组间基线水平匹配良好，年龄、性别、BMI、糖尿病家族史和2-hPG等基线特征在两组间没有统计学差异。与NGR者相比，糖尿病患者基线时仅饮酒状态和FPG存在显著差异。
(3)脂肪酸组学分析
1、试剂
oSFA(FA13:0、FA15:0、FA17:0、FA19:0、FA21:0、FA23:0、FA25:0)、eSFA(FA14:0、FA16:0、FA18:0、FA20:0、FA22:0、FA24:0、FA26:0)、oMUFA(FA15:1、FA17:1、FA19:1、FA21:1、FA25:1)、eMUFA(FA14:1、FA16:1、FA18:1、FA20:1、FA22:1、FA24:1、FA26:1)、oPUFA(FA17:2、FA19:2、FA25:2、FA25:3)和ePUFA(FA14:2、FA16:2、FA16:3、FA18:2、FA18:3、FA18:4、FA20:2、FA20:3、FA20:4、FA20:5、FA20:6、FA22:2、FA22:3、FA22:4、FA22:5、FA22:6、FA24:2、FA24:3、FA24:4、FA24:5、FFA26:2、FFA26:3、FFA26:4)均购自天津阿尔塔科技有限公司；甲醇、乙腈购自德国Merk公司；异丙醇、二氯甲烷购自Sigma-aldrich公司；甲基叔丁基醚(MTBE)购自Spectrum chemical公司；氯仿购自陇西科学股份有限公司。
2、样品预处理
取血液样品30μL，加入180μL含内标(各内标浓度为FFA12:0-d23 1.5μg/mL，FFA16:0-d31.5μg/mL，FFA20:0-d3 1.5μg/mL，FFA24:0-d47 0.375μg/mL)甲醇，提取目标化合物并沉淀蛋白，涡旋，加入600μL MTBE，再加入150μL离心超纯水，震荡10min，离心，吸取上清氮吹干。仪器分析前，依次向样品中加入20μL溶液A氯仿/甲醇(v:v＝2:1)，再加入40μL溶液B乙腈/异丙醇/MilliQ水(v:v:v＝65:30:5)，涡旋混匀后离心，取上清分析。
3、仪器方法
仪器采用Vanquish UHPLC-Q Exactive(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL,USA)。
色谱柱为ACQUITY UPLC C8色谱柱(100×2.1mm，1.7m)，柱温为55℃，流速为0.2mL/min，进样室温度为10℃，进样体积为5L。流动相A相为25％乙腈/MilliQ水溶液(含10mM乙酸铵)，B相为20％/75％/5％乙腈/异丙醇/水溶液(含10mM乙酸铵)。流动相梯度条件：流动相B起始比例为15％，保持1.5min；在接下来0.5min内升高到100％，并维持6min；在接下来0.5min内恢复到15％并平衡1.5min。
质谱离子源鞘气流速为45arb，辅助气流速为10arb，喷雾电压分别为3.0kV(ESI-)，毛细管温度为320℃，辅助气温度为350℃，分辨率为7e4，采用全扫描模式，扫描范围分别为70-600m/z。
4、实验部分
(1)数据分析稳定性
为监测仪器稳定性，利用的混合样品作为质控样品，质控样品预处理过程同实际样品，每运行10个样品运行一个质控样品，每次清洗仪器要运行3个QC查看仪器的稳定性，更换新色谱柱或是清洗仪器平衡后要运行线性曲线，以保证定量的准确性，多数质控样品中的脂肪酸检测值RSD％小于30％，可见仪器稳定，状态良好。
(2)检测限、定量限及线性曲线
准确称量并用氯仿/甲醇溶液配制脂肪酸母液，根据实际样品含量及仪器灵敏度情况，选择线性范围绘制线性曲线，线性范围最低点即为定量限。以浓度作为橫坐标，以各脂肪酸峰面积与相应内标的比值作为纵坐标，得到线性方程，脂肪酸线性相关系数R2均大于0.99。
用多元Logistic回归方程对测量的长链脂肪酸进行与新发2型糖尿病的风险评估，发现在校正年龄、性别、体质量指数、吸烟、饮酒、体育活动、教育水平、糖尿病家族史和FPG后，发现6种长链脂肪酸分类标志物组合分类指标与2型糖尿病的发生风险增加显著相关：oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA。
用数据统计软件SAS进一步将6种长链脂肪酸分类标志物组合作为脂肪酸分类指标，通过ROC曲线判断其对2型糖尿病的检测效果，结果如图1-4所示。
发现组中，与传统风险因素及FPG和2-h PG相比，长链脂肪酸分类标志物组合显著提高了2型糖尿病风险的预测价值(表2)。
表2：ROC对比估计和逐行检验结果
图1中，发现组结果显示，与传统风险因素及FPG和2-h PG对预测糖尿病发生风险的ROC曲线下面积0.6796相比，当长链脂肪酸分类标志物组合用于糖尿病的预测预测时，得到ROC曲线下面积值增高到0.8092。
图2中，验证组吉林中心的ROC曲线下面积由0.6798增高到0.7809。
图3中，验证组广州中心的ROC曲线下面积由0.6910增高到0.7973。
图4中，验证组山东省立中心的ROC曲线下面积由0.7221增高到0.7644。
结果表明，本发明中长链脂肪酸分类标志物组合具有较好的糖尿病诊断潜力，同时与临床诊断指标FPG和2-h PG具有较好的协同作用，可见由oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA组成的长链脂肪酸分类标志物组合可以作为2型糖尿病的新型血清标志物，用于糖尿病的早期筛查与诊断，为临床上评估糖尿病的发生风险提供辅助检测途径。
以上所述为本发明的较佳实施例，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
Claims (8)
1.长链脂肪酸分类标志物组合在制备诊断糖尿病的检测试剂中的应用，所述长链脂肪酸分类标志物组合由oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA中的两种或两种以上组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述长链脂肪酸分类标志物组合由oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA组成。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，oSFA选自FA13:0、FA15:0、FA17:0、FA19:0、FA21:0、FA23:0、FA25:0中的一种或两种以上组合；eSFA选自FA14:0、FA16:0、FA18:0、FA20:0、FA22:0、FA24:0、FA26:0中的一种或两种以上组合；oMUFA选自FA15:1、FA17:1、FA19:1、FA21:1、FA25:1中的一种或两种以上组合；eMUFA选自FA14:1、FA16:1、FA18:1、FA20:1、FA22:1、FA24:1、FA26:1中的一种或两种以上组合；oPUFA选自FA17:2、FA19:2、FA25:2、FA25:3中的一种或两种以上组合；ePUFA选自FA14:2、FA16:2、FA16:3、FA18:2、FA18:3、FA18:4、FA20:2、FA20:3、FA20:4、FA20:5、FA20:6、FA22:2、FA22:3、FA22:4、FA22:5、FA22:6、FA24:2、FA24:3、FA24:4、FA24:5、FFA26:2、FFA26:3、FFA26:4中的一种或两种以上组合。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖尿病为2型糖尿病。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为血液检测试剂。
6.检测长链脂肪酸分类标志物组合的试剂在制备诊断糖尿病的检测产品中的应用，所述长链脂肪酸分类标志物组合由oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA组成，其中：oSFA选自FA13:0、FA15:0、FA17:0、FA19:0、FA21:0、FA23:0、FA25:0中的一种或两种以上组合；eSFA选自FA14:0、FA16:0、FA18:0、FA20:0、FA22:0、FA24:0、FA26:0中的一种或两种以上组合；oMUFA选自FA15:1、FA17:1、FA19:1、FA21:1、FA25:1中的一种或两种以上组合；eMUFA选自FA14:1、FA16:1、FA18:1、FA20:1、FA22:1、FA24:1、FA26:1中的一种或两种以上组合；oPUFA选自FA17:2、FA19:2、FA25:2、FA25:3中的一种或两种以上组合；ePUFA选自FA14:2、FA16:2、FA16:3、FA18:2、FA18:3、FA18:4、FA20:2、FA20:3、FA20:4、FA20:5、FA20:6、FA22:2、FA22:3、FA22:4、FA22:5、FA22:6、FA24:2、FA24:3、FA24:4、FA24:5、FFA26:2、FFA26:3、FFA26:4中的一种或两种以上组合。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测产品为试剂盒，所述试剂盒包含oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA，作为分别用于对应的血清代谢物oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA定性的标准品。
8.一种评估早期2型糖尿病患病风险的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：通过超高效液相色谱-串联四级杆静电场轨道阱高分辨质谱联用仪检测受试者血清中长链脂肪酸分类标志物组合的浓度水平，所述长链脂肪酸分类标志物组合由oSFA、eSFA、oMUFA、eMUFA、oPUFA和ePUFA组成，其中：oSFA选自FA13:0、FA15:0、FA17:0、FA19:0、FA21:0、FA23:0、FA25:0中的一种或两种以上组合；eSFA选自FA14:0、FA16:0、FA18:0、FA20:0、FA22:0、FA24:0、FA26:0中的一种或两种以上组合；oMUFA选自FA15:1、FA17:1、FA19:1、FA21:1、FA25:1中的一种或两种以上组合；eMUFA选自FA14:1、FA16:1、FA18:1、FA20:1、FA22:1、FA24:1、FA26:1中的一种或两种以上组合；oPUFA选自FA17:2、FA19:2、FA25:2、FA25:3中的一种或两种以上组合；ePUFA选自FA14:2、FA16:2、FA16:3、FA18:2、FA18:3、FA18:4、FA20:2、FA20:3、FA20:4、FA20:5、FA20:6、FA22:2、FA22:3、FA22:4、FA22:5、FA22:6、FA24:2、FA24:3、FA24:4、FA24:5、FFA26:2、FFA26:3、FFA26:4中的一种或两种以上组合；
步骤2：基于受试者血清中所述长链脂肪酸分类标志物组合的浓度水平进行ROC曲线统计，通过ROC曲线下面积判断所述长链脂肪酸分类标志物组合对2型糖尿病风险的预测价值；当ROC曲线下面积＞0.7时，提示所述长链脂肪酸分类标志物组合对2型糖尿病风险具有良好的预测效果。
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